KR101602305B1 - 게놈 획득 및 소실에 대한 다중 분석법 - Google Patents

게놈 획득 및 소실에 대한 다중 분석법 Download PDF

Info

Publication number
KR101602305B1
KR101602305B1 KR1020107014915A KR20107014915A KR101602305B1 KR 101602305 B1 KR101602305 B1 KR 101602305B1 KR 1020107014915 A KR1020107014915 A KR 1020107014915A KR 20107014915 A KR20107014915 A KR 20107014915A KR 101602305 B1 KR101602305 B1 KR 101602305B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
signal
encoded
particles
amplicon
Prior art date
Application number
KR1020107014915A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100120641A (ko
Inventor
칼 에드윈 아들러
맥 제이. 셔머
Original Assignee
퍼킨엘머 헬스 사이언시즈, 아이엔씨.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 퍼킨엘머 헬스 사이언시즈, 아이엔씨. filed Critical 퍼킨엘머 헬스 사이언시즈, 아이엔씨.
Publication of KR20100120641A publication Critical patent/KR20100120641A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101602305B1 publication Critical patent/KR101602305B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/625—Detection means characterised by use of a special device being a nucleic acid test strip device, e.g. dipsticks, strips, tapes, CD plates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은, BAC DNA와 같이 복잡하고 큰 주형 DNA 소스를 프로브 물질로 이용하는 이점을 제공하지만 비드 네트워킹이나 그외 분석 성능에는 문제가 없는, 염색체 획득 및 소실에 대한 인코딩 비드 다중 분석 방법을 제공한다. 본 발명에서는 주형 DNA 서열로부터 증폭된 부착된 앰플리콘을 가진 복수개의 인코딩 입자들을 포함하는 DNA 분석용 시약을 제공한다. 부착된 앰플리콘 각각은 주형 DNA 서열의 랜덤 부분과 동일한 핵산 서열을 포함하며, 상기 앰플리콘은 모두 합하여 실질적으로 전체 주형 DNA를 나타내며, 각각의 상기 앰플리콘에서 상기 주형 DNA 서열의 랜덤 부분과 동일한 핵산 서열은 상기 전체 주형 DNA 보다 짧다.

Description

게놈 획득 및 소실에 대한 다중 분석법{MULTIPLEXED GENOMIC GAIN AND LOSS ASSAYS}
본 출원은, 2007년 12월 5일자 미국 가출원번호 60/992,489에 대한 우선권 주장을 수반하는 2008년 3월 26일자 미국 출원번호 12/055,919에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원들은 전체 내용이 원용에 의해 본원에 포함된다.
본원에 기술된 기술은 일반적으로 핵산을 검출하기 위한 방법과 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 게놈 DNA의 다중 분석을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
게놈 획득(genomic gain) 및 소실(loss)을 검출하기 위한 분석법은, 질병, 행동 및 인지 상태 및 그외 유전자적 병태의 근원일 수 있는 유전자 이상의 검출과 진단을 가능하게 한다. 비드 네트워킹이나 다른 분석 성능 문제 없이, 프로브 물질로서 BAC DNA의 이점을 제공하는 염색체 획득 및 소실에 대한 인코딩된 비드 다중 분석법(encoded bead multiplex assay)이 요구된다.
발명의 개요
DNA 샘플을 분석하는 방법은, 부착된 앰플리콘(amplicon)들을 가지고 있는 인코딩 입자를 포함하는 제1 인코딩 입자 세트를 제공하는 것을 포함한다. 앰플리콘들은, 모두 합하여 실질적으로 전체 제1 주형 DNA 서열을 나타내는 랜덤 핵산 서열을 포함한다. 상기 제1 인코딩 입자 세트의 앰플리콘들은 검출가능하게 표지된 샘플 DNA와, 그리고 검출가능하게 표지된 기준 DNA와 혼성화된다. 상기 제1 인코딩 입자 세트의 앰플리콘들과 검출가능하게 표지된 샘플 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는, 제1 신호를 검출한다. 상기 제1 인코딩된 입자 세트의 앰플리콘들과 검출가능하게 표지된 기준 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는, 제2 신호를 검출한다. 상기 제1 및 제2 신호를 비교하여, 제1 신호와 제2 신호 간의 차이를 검출하며, 이러한 차이는 샘플 DNA와 기준 DNA 간의 차이를 의미한다.
선택적으로, 상기 부착된 앰플리콘의 길이는 포괄적으로, 약 500 - 1200 개의 뉴클레오티드 길이이다.
상기 검출가능하게 표지된 샘플 DNA는 게놈 DNA와 같이 개별 개체로부터 수득되는 DNA일 수 있다. 상기 개체는 본원에 기술된 방법의 특정 구현예에서 인간이다.
본원에 기술된 방법의 구현예는, 부착된 앰플리콘을 가지는 인코딩 입자들을 포함하는 제2 인코딩된 입자 세트를 제공하는 것을 포함한다. 상기 제2 인코딩 입자 세트의 앰플리콘들은, 모두 합하여 실질적으로 전체 제2 주형 DNA 서열을 나타내는 DNA 서열을 포함한다. 상기 제2 인코딩 입자 세트의 앰플리콘들은, 검출가능하게 표지된 샘플 DNA와, 그리고 검출가능하게 표지된 기준 DNA와 혼성화된다. 상기 제2 인코딩 입자 세트의 앰플리콘들과 검출가능하게 표지된 샘플 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는, 제1 신호를 검출한다. 상기 제2 인코딩된 입자 세트의 앰플리콘들과 검출가능하게 표지된 기준 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는, 제2 신호를 검출한다. 상기 제1 및 제2 신호를 비교하여, 제1 신호와 제2 신호 간의 차이를 검출하며, 이러한 차이는 샘플 DNA와 기준 DNA 간의 차이를 의미한다.
특정 구현예에서, 상기 제1 및 제2 인코딩 입자 세트들은 혼합물로 제공된다. 인코딩 입자 세트들의 혼합물을 이용하는 방법에 대한 구현예는, 상기 개별 입자 세트들의 인코딩과 검출되는 신호를 조합(association)하여, 특정 주형 DNA에 대한 신호를 샘플 DNA와 기준 DNA 간의 차이와 조합(association)하는 단계를 더 포함한다.
각 인코딩 입자 세트에 부착된 앰플리콘들은, 모두 합하여 실질적으로 전체 주형 DNA 서열을 나타내는 랜덤 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 주형 DNA 서열 전체는 각각의 상기 부착된 앰플리콘 보다 더 크다. 특정 예에서, 상기 주형 DNA 서열 전체의 길이는 포괄적으로 약 20 - 300 kb이고, 각각의 부착된 앰플리콘은 주형 DNA 서열의 일부분과 동일한 핵산 서열을 포함하며, 그 길이는 포괄적으로 약 500 - 1200개의 뉴클레오티드 길이이다.
DNA 분석용 인코딩 비드 세트의 제조 방법은, a) DNA 주형과 제1 반응 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 제1 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함한다. 이러한 반응에서, 복수개인 상기 제1 반응 프라이머의 각각은 가변적이고 비특이적 축퇴(degenerate) DNA 서열과 인접한 불변(constant) DNA 서열을 포함한다. 제1 반응의 반응 산물은 제1 앰플리콘들을 포함하며, 제1 앰플리콘들의 각각은 상기 DNA 주형의 랜덤 부분과 동일한 DNA 서열과 상기 제1 반응 프라이머의 불변 DNA 서열과 동일한 DNA 서열을 포함한다. 또한, 상기 방법은, b) 주형 DNA로서 제1 앰플리콘의 일정 부분 이상과 제2 반응 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 제2 증폭 반응을 수행하는 단계를 더 포함한다. 상기 제2 반응 올리고뉴클레오티드 프라이머는 제1 반응 프라이머의 불변 DNA 서열을 포함하며, 상기 제2 증폭 반응에 의해 제2 앰플리콘들을 포함하는 제2 반응 산물이 만들어진다. 제2 앰플리콘들의 각각은 상기 DNA 주형의 랜덤 부분과 동일한 DNA 서열과 제1 반응 프라이머의 불변 DNA 서열과 동일한 DNA 서열을 포함한다. 상기 방법은, 또한, c) 상기 제2 앰플리콘들을 복수개의 제1 인코딩 입자에 결합시켜, DNA 분석용 인코딩 입자 세트를 제조하는 단계를 더 포함한다.
선택적으로, 상기 제2 반응 올리고뉴클레오티드 프라이머는 인코딩 입자와 반응하기 위한 관능기를 더 포함한다. 예컨대, 5' 말단 아민이 포함될 수 있다.
다른 구현예에서, a) - c)를 제2 DNA 주형을 이용하여 반복 실시하며, 그로부터 수득되는 제2 앰플리콘들을 상기 복수개의 제1 인코딩 입자와 상이하게 검출가능한, 복수개의 제2 인코딩 입자와 결합시킨다. DNA 분석용 제2 인코딩 입자 세트는 이러한 과정으로 제조된다. 또다른 구현예에서, 제3, 제4, 제5 또는 다음 차수의 게놈 DNA 주형을 이용하여 a) - c)를 반복 실시하고, 그로부터 제조되는 상기 제3, 제4, 제5 또는 다음 차수의 앰플리콘들을, 복수개의 제3, 제4, 제5 또는 다음 차수의 인코딩 입자와 결합시켜, DNA 분석용 제3, 제4, 제5 또는 그 이상 차수의 인코딩 입자 세트를 제조하며, 각각 상기 복수개의 제3, 제4, 제5 또는 그 이상 차수의 코딩 입자들은 서로 다른 복수개의 코딩 입자와 상이하게 검출가능하다. 여러가지 DNA 주형을 이용하여 제조할 수 있는 인코딩 입자 세트의 수에는 제한이 없는 것으로 기술된다. 임의 갯수의 인코딩 입자 세트를 제조할 수 있다. 또한, 적절한 임의 수의 인코딩 입자 세트를 혼합하여, 다중 DNA 분석 시약을 만들 수 있다.
DNA 분석용 시약은 본원에 기술되어 있으며, 이는 주형 DNA 서열로부터 증폭된 부착된 앰플리콘들을 가진 복수개의 인코딩 입자를 포함한다. 부착된 앰플리콘들의 각각은 주형 DNA 서열의 랜덤 부분과 동일한 DNA 서열을 포함하며, 이때 앰플리콘들은 모두 합하여 실질적으로 전체 주형 DNA를 나타내며, 앰플리콘들의 각각에서 주형 DNA 서열의 랜덤 부분과 동일한 DNA 서열은 전체 주형 DNA 보다 짧다. 예를 들어, 구체적인 구현예에서, 전체 주형 DNA 서열의 길이는 포괄적으로 약 20- 300 kb 길이일 수 있으며, 부착된 앰플리콘들의 각각은 주형 DNA 서열의 랜덤 부분과 동일한 DNA 서열을 포함하며, 포괄적으로 약 500 - 1200개의 뉴클레오티드 길이이다.
DNA 분석용 다중 시약은 본원에 기술되어 있으며, 각각의 복수개의 입자들의 입자들이 서로 다른 복수개의 입자들의 입자들과 구별 검출가능하게 인코딩된 복수개의 인코딩 입자들 2종 이상의 혼합물을 포함한다. 상기 인코딩 입자는 주형 DNA 서열로부터 증폭된 부착된 앰플리콘들을 포함하며, 복수개의 인코딩 입자 각각은 서로 다른 복수개의 인코딩 입자들과 비교하여 상이한 주형 DNA 서열로부터 증폭된 부착된 앰플리콘들을 포함한다. 또한, 상기 부착된 앰플리콘의 각각은 주형 DNA 서열의 랜덤 부분과 동일한 DNA 서열을 포함한다.
DNA 분석 키트를 제공하며, 이는 하나의 인코딩 입자 세트 및/또는 인코딩 입자 세트 2종 이상의 혼합물을 포함한다.
도 1은 2가지의 증폭 반응을 이용하여 주형 DNA로부터 앰플리콘을 제조하는 단계 및 인코딩 비드 세트 상에 프로브로서 앰플리콘을 고정하는 단계를 포함하는, 구현예가 기술된 플로우차트이며, 세트에서 비드는 모두 동일한 ID 코드를 가진다.
도 1A는 하나의 BAC 클론으로부터 BAC 앰플리콘을 제조하는 단계 및 인코딩 비드 세트 상에 프로브로서 상기 앰플리콘을 고정시켜 비드 세트를 제조하는, 구현예가 기술된 플로우차트이며, 세트에서 비드는 모두 동일한 ID 코드를 가진다.
도 2는 m개의 여러가지 인코딩 비드 세트를 혼합하는 단계를 포함하는 구현예를 나타낸 플로우차트로서, 각각에 개개의 고정된 BAC-앰플리콘 프로브 DNA가 있으며, 함께 다중 인코딩 비드 세트를 형성한다.
도 3은 다중 인코딩 비드 세트를 이용하여 n 개의 샘플에 대한 다중 게놈 획득 및 소실 분석을 실시하는 구현예를 나타낸 플로우차트이다.
도 3A는 다중 인코딩 비드 세트를 이용한 n 개의 샘플에 대한 다중 게놈 획득 및 소실 분석을 수행하는 단계를 포함하는 구현예를 나타낸 플로우차트이다.
도 4는 46개의 샘플의 동시 분석에서, 이배수 기준물(duplicate reference)과 이배수 샘플들의 예시적인 위치를 나타낸, 96웰 SBS-표준 마이크로플레이트의 도식도이다.
도 5는 남성의 13번 염색체에 3염색체성(trisomy)을 가지고 있는 Coriell DNA 샘플을 이용하여 수득한 데이타의 예이다.
도 6은 남성의 18번 염색체에 3염색체성(trisomy)을 가지고 있는 Coriell DNA 샘플을 이용하여 수득한 데이타의 예이다.
도 7은 여성의 21번 염색체에 3염색체성(trisomy)을 가지고 있는 Coriell DNA 샘플을 이용하여 수득한 데이타의 예이다.
도 8은 X 염색체의 5-카피 증폭이 있는 Coriell DNA 샘플을 이용하여 수득한 데이타의 예이다.
도 9는 예시적인 분석에서 인코딩 비드 상에 고정된 앰플리콘 제조에 사용한 BAC 클론, 이의 염색체 및 염색체 위치(cytoband), 음성 대조군 올리고뉴클레오티드의 서열, 및 각 앰플리콘 프로브가 고정된 비드 세트의 비드 ID(루미넥스 비드 영역)를 나타낸 표이다.
본 발명은 염색체 획득 및 소실에 대한 인코딩 입자 다중 분석에 대한 방법 및 조성물을 제공한다.
본원에 사용되는 과학적 및 기술적 용어들은 당해 분야의 당업자들에게 인지되는 통상적인 의미인 것으로 의도된다. 이들 용어들은, 예를 들어 J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Ed., 2001; F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th Ed., 2002; B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4th Ed., Garland, 2002; D.L. Nelson and M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Ed., W.H. Freeman & Company, 2004; and Herdewijn, P. (Ed.), Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2004 등의 다양한 표준 문헌들에서 정의되고 사용되는 의미를 확인할 수 있다.
용어 "핵산"은 본원에서 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥, 이중 가닥, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 등의 임의 형태의 RNA 또는 DNA 분자이다.
시약 조성물
게놈 DNA 분석용 시약은, 프로브로서 부착된 앰플리콘들을 포함하는 복수의 인코딩 입자를 포함하는 것으로 제공된다. 상기 복수의 인코딩 입자에 부착된 앰플리콘들은 주형 게놈 핵산의 일부분과 동일하거나 또는 완전히 상보적인 핵산 서열을 포함하며, 상기 앰플리콘들은 모두 합하여 실질적으로 전체 주형 게놈 핵산을 나타낸다.
도 1은 게놈 DNA 분석용 시약의 제조 과정의 일 구현예를 예시하고 있다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 주형 핵산을 제공한다(1). 제1 증폭 반응에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머(DOP)를 이용하여 주형을 증폭함으로써(2), 제1 증폭 산물을 제조한다.
주형 핵산은 핵산 증폭 방법을 이용하여 복제할 수 있는 모든 핵산일 수 있다.
이러한 제1 증폭 반응을 위한 주형 DNA는, 선택적으로 게놈 DNA, 전형적으로 약 20 - 300 kb 크기의 게놈 DNA이지만, 주형은 더 크거나 작을 수 있다. 용어 "게놈"은 세포 또는 유기체의 게놈 DNA이며, 미세절단된 염색체 DNA와 같이, 세포나 유기체로부터 직접 분리된 DNA 뿐만 아니라 클로닝된 DNA 등의 세포나 유기체의 게놈 DNA의 복제 DNA를 포함한다. 주형 DNA는 세포나 유기체의 게놈 전체 또는 일부분을 포함할 수 있다. 주형 DNA는 하나 이상의 염색체, 염색체의 일부분, 유전자좌(genetic locus), 유전자 또는 유전자의 일부분을 나타내는 DNA를 포함할 수 있다. 주형 DNA는, 예시적으로 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 인간 인공 염색체, 코스미드, 플라스미드, 파지미드, 파지 DNA 또는 포스미드 등의 벡터내 삽입체와 같은 모든 형태일 수 있다. 주형 DNA는 미세절단된 염색체 DNA 형태일 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 구체적인 예들에서는 주형 DNA의 소스로서 BAC가 언급되어 있지만, PAC, YAC, 코스미드, 포스미드, cDNA 등의 다른 타입의 클론도 사용할 수 있다.
주형 게놈 DNA는 당해 분야에 공지된 방법들, 예컨대 J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Ed., 2001 or F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th Ed., 2002에 기술된 방법에 의해 수득된다. 또한, 주형 DNA는 상업적으로 수득하거나 및/또는 게놈 DNA 분리용 시판 키트를 이용하여 수득할 수 있다.
주형 DNA의 증폭은 시험관내 증폭 방법을 이용하여 이루어진다. 용어 "증폭 방법"은 주형 핵산을 복제하는 방법 또는 기법을 의미하는 것으로, 이로써 주형 핵산의 전체 또는 일부분의 카피 등의 핵산이 제조되며, 제조되는 핵산을 앰플리콘이라고 칭한다.
앰플리콘은 선택적으로 프라이머에 존재하는 핵산 서열을 포함하며, 오리지날 DNA 주형에 존재하지 않는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 프라이머-유래 핵산은 부가적인 증폭 반응에 대한 프라이머 결합부 및/또는 기질에 대한 화학적 결합을 위한 관능기로서 기능적으로 추가된다.
증폭 방법은 예시적으로 PCR, 라이게이션-매개 PCR(LM-PCR), phi-29 PCR, 및 그외 핵산 증폭 방법, 예컨대 C.W. Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003; and V. Demidov et al., DNA Amplification: Current Technologies and Applications, Taylor & Francis, 2004에 기술된 방법이 있다.
특정 DNA 주형과 핵산 증폭 방법의 여러 조합을 사용할 수 있다.
용어 "올리고뉴클레오티드 프라이머"는 적절한 반응 조건에서 프라이머 연장 산물의 합성 개시 부위로서 작용할 수 있는 핵산이다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 그 길이가 전형적으로 약 10 내지 30개의 인접한 뉴클레오티드 길이이다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는, 혼성화 조건에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 주형 핵산의 상보적인 영역에 어닐링하도록, 주형 핵산의 영역에 완전히 또는 실질적으로 상보적이다. 프라이머 연장 산물 합성을 위한 적절한 반응 조건은, 비제한적으로 중합효소 및 뉴클레오티드 트리포스페이트 등의 적합한 반응 물질들의 존재를 포함한다. 증폭 반응에 사용하기 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 설계는 당해 분야에, 예컨대 A. Yuryev et al., PCR Primer Design, Humana Press, 2007에 기술된 바와 같이 잘 알려져 있다.
용어 "축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머"는 랜덤 또는 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산을 포함하는 프라이머를 지칭한다. 특정 핵산 증폭 반응에 적합한 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 설계는 A. Yuryev et al., PCR Primer Design, Humana Press, 2007에 기술된 바와 같이 당해 분야에 잘 알려져 있다. 약 5-8개의 뉴클레오티드를 가진 랜덤 또는 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열을 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 랜덤 또는 세미-랜덤 뉴클레오티드 헥사머가 제1 증폭에 사용되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 포함된다.
특정 구현예에 사용되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머 각각은 예컨대 Fiegler et al., Genes Chromosomes Cancer, 36(4):361-74, 2003; and Telenius, et al., Genomics 13:718-25, 1992에 기술된 바와 같이, 5' 불변 DNA 세그먼트, 중간 랜덤 DNA 세그먼트 및 3' 앵커 세그먼트를 포함한다. 5' 불변 DNA 세그먼트는 선택적으로 모든 DOP에서 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진다. 3' 앵커 세그먼트는 선택적으로 주형 핵산에 바람직한 발생 빈도를 보이는 것으로 결정된 뉴클레오티드 서열을 가진다. 특정 핵산 서열의 발생 빈도 분석은, 예컨대 Milosavljevic, A. and Jurka, J., 1993, Comput. Applic. Biosci., 9:407-411; Pesole, G. et al., 1992, Nucleic Acids, Res., 20 :2871-2875 ; 및 Hutchinson, G. B., 1996, Comput. Appl. Biosci., 12 :391-398에 기술된 바와 같이 당해 분야에 잘 알려져 있다.
특정 구현예에서, DOP는, 약 7-12개의 인접 뉴클레오티드가 5' 불변 DNA 세그먼트에 포함되고, 약 5-8개의 인접 뉴클ㄹ레오티드가 랜덤 DNA 세그먼트에 포함되고, 약 5-8개의 인접 뉴클레오티드가 3' 앵커 세그먼트에 포함되는, 약 17-25개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
제1 증폭 반응으로 복수의 앰플리콘들을 포함하는 제1 반응 산물이 만들어진다. 제1 반응 산물의 앰플리콘들의 각각에는 DNA 주형의 랜덤 부분과 동일하거나 또는 완전히 상보적인 DNA 서열과, 제1 반응 프라이머의 5' 불변 DNA 서열과 동일한 DNA 서열이 포함된다.
본원에서, 용어 "상보적인"은 뉴클레오티드 간의 왓슨-크릭 염기 페어링을 의미하며, 구체적으로는 2개의 수소 결합에 의해 티민 또는 우라실 잔기가 아데닌 잔기와 연결되고, 3개의 수소 결합에 의해 시토신과 구아닌이 연결되는 서로 간의 뉴클레오티드 수소 결합을 의미한다. 통상적으로, 핵산은 특정한 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 "상보성%"을 가지는 것으로 기술된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예컨대, 뉴클레오티드 서열은 특정한 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 80%, 90% 또는 100% 상보적일 수 있으며, 이는, 10개의 뉴클레오티드로 구성된 서열의 경우, 8개, 9개 또는 10개의 뉴클레오티드가 상기 특정한 제2 뉴클레오티드 서열과 상보적임을 의미한다. 예로, 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-AGCT-3'와 100% 상보적이다. 또한, 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'은 뉴클레오티드 서열 5'-TTAGCTGG-3'의 영역과 100% 또는 완전히 상보적이다.
도 1을 참조하면, 제2 증폭 반응(3)을 주형 DNA로서 제1 반응 산물을 이용하여 수행한다. 제2 증폭 반응(3)은 "유니버셜" 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는데, 이는 상기 유니버셜 프라이머는 제1 증폭 반응에서 사용된 DOP의 5' 불변 DNA 세그먼트와 동일하거나 또는 완전히 상보적이기 때문이다. 유니버셜 올리고뉴클레오티드 프라이머는 유니버셜 프라이머의 3' 말단에 위치한 제1 증폭 반응에서 사용된 DOP의 5' 불변 DNA 세그먼트를 포함한다. 유니버셜 올리고뉴클레오티드 프라이머는 선택적으로 프라이머의 5' 말단에 추가적인 인접 뉴클레오티드들을 포함한다.
특정 옵션으로, 유니버셜 올리고뉴클레오티드 프라이머는 인코딩 입자 등의 인코딩 고형 또는 반고형 물질에 제2 증폭 반응으로 생긴 앰플리콘을 부착시키기 위해, 프라이머의 5' 말단에 관능기를 포함한다. 예컨대, 상기 유니버셜 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프라이머의 5' 말단에 아민기를 포함한다. 다른 옵션으로, 제2 증폭 반응으로 생기는 앰플리콘을, 고형 또는 반고형 물질에 결합시키기 위한 관능기를 포함하도록 변형시킬 수 있다. 고형 또는 반고형 물질에 결합시킬 수 있는 관능기를 포함하도록 하는 핵산의 변형은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
특정 구현예로, 입자에 부착된 각각의 앰플리콘은 주형 DNA 서열의 랜덤 영역과 동일한 DNA 세그먼트를 포함한다. 또한, 각각의 앰플리콘은 주형 DNA 서열의 랜덤 영역과 동일한 DNA 세그먼트와 인접하는 불변 DNA 세그먼트를 포함한다. 상기 앰플리콘의 불변 DNA 세그먼트는, 선택적으로 인코딩 입자에 앰플리콘을 부착하기 위한 말단 관능기를 포함한다. 특정 구현예에서, 앰플리콘의 불변 DNA 세그먼트는, 인코딩 입자에 앰플리콘을 부착하기 위해, 5' 말단 아민기를 포함한다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 제2 반응 산물인 앰플리콘들을 복수의 제1 인코딩 입자 상에 고정한다(4). 제2 증폭 반응의 앰플리콘들을 상기 인코딩 입자에 결합시키는 방법은, 예시적으로 흡착 및 화학 결합 등의, 고형 또는 반고형 물질에 핵산을 결합시킬 수 있는 다양한 임의 방법들에 의해 달성된다. 앰플리콘은 인코딩 입자의 물질에 직접, 또는 예컨대 입자 상에 증착된 코팅 또는 링커 결합을 통해 인코딩 입자에 간접적으로 결합될 수 있다. 앰플리콘은 입자에 앰플리콘 결합시 사용가능한 관능기를 포함하도록 합성하거나 또는 합성 후 변형시킬 수 있다. 예로, 앰플리콘에는, 카르복시, 아민, 아미노, 카르복실레이트, 할라이드, 에스테르, 알코올, 카바마이드, 알데하이드, 클로로메틸, 황 산화물, 질소 산화물, 에폭시 및/또는 토실 관능기가 포함될 수 있다.
앰플리콘이 결합되는 입자는, 앰플리콘이 부착될 수 있는 모든 고형 또는 반고형 입자일 수 있으며, 이는 혼성화 및 검출 조건에서 안정적이며 불용성이며, 다중 분석에 적합한 것이다. 상기 입자는 실린더형, 구형 등의 임의의 형태, 크기, 조성 또는 생리화학적 특징을 가진 것일 수 있다. 입자의 크기나 조성은 입자가 특정 포어(pore) 크기를 갖는 필터 상에서 유체로부터 분리되거나 또는 일부 다른 물리적 특성, 예컨대 자기 특성에 의해 분리될 수 있도록 선택할 수 있다.
사용되는 미세입자, 예컨대 마이크로비드는 직경이 1 mm 미만, 예컨대 약 0.1 내지 약 1,000 ㎛ 직경일 수 있으며, 예로, 직경 약 3-25 ㎛ 또는 직경 약 5-10 ㎛일 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 나노비드 등의 사용되는 나노입자는 직경이 약 1 나노미터(nm) 내지 약 100,000 nm일 수 있으며, 예로 약 10 - 1,000 nm, 또는 예로 200 - 500 nm일 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 사용되는 입자는 비드, 특히 마이크로비드 및 나노비드이다.
입자는, 예를 들어 유리 또는 금속 등의 유기 또는 무기 입자이며, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 실리콘, 나일론, 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란 및 폴리아크릴아미드 등의 합성 또는 천연 폴리머로 이루어진 입자일 수 있다. 입자는 특정 구현예에서 라텍스 비드이다.
사용되는 입자는 특정 구현예에서 앰플리콘 결합용 관능기를 포함한다. 예로, 입자는 카르복시, 아민, 아미노, 카르복실레이트, 할라이드, 에스테르, 알코올, 카바미드, 알데하이드, 클로로메틸, 황 산화물, 질소 산화물, 에폭시 및/또는 토실 관능기를 포함할 수 있다. 입자의 관능기, 이의 변형 및 핵산 등의 화학적 모이어티의 결합은 예컨대 Fitch, R. M., Polymer Colloids: A Comprehensive Introduction, Academic Press, 1997에 기술된 바와 같이, 당해 분야에 공지되어 있다. 미국 특허 6,048,695에는 앰플리콘과 같은 핵산 프로브를 입자 등의 기질에 부착하는 예시적인 방법이 기술되어 있다. 다른 구체적인 예로, 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 하이드로클로라이드, EDC 또는 EDAC 화합물을 사용하여 앰플리콘을 인코딩 입자에 부착할 수 있다.
인코딩 입자는 예시적으로 색, 반사 지수 및/또는 임프린팅 또는 선택적으로 검출가능함 패턴 등의 광학 특성 등의 특징들을 기초로 다른 입자들과 구분할 수 있는 입자이다. 예로, 입자는 광학, 화학, 물리적 또는 전기적 테그(tag)를 이용하여 인코딩할 수 있다. 인코딩 입자는 예컨대 여기 및/또는 방사 파장, 방사 강도, 여기 상태에서의 수명 또는 이들의 조합 또는 그외 다른 광학 특징들에 의해, 구별가능한 하나 이상의 플루오로포어(fluorophore)를 포함하거나 여기에 부착될 수 있다. 광학 바 코드를 인코딩 입자에 사용할 수 있다.
특정 구현예에서, 하나의 입자 세트에서 각각의 입자는, 다른 입자 세트의 각 입자와 구분가능하도록, 동일한 코드로 인코딩된다. 다른 구현예에서, 2가지 이상의 코드를 하나의 입자 세트에 사용할 수 있다. 각 입자는 예컨대 고유 코드를 포함할 수 있다. 임의 구현예에서, 입자의 인코딩은, 입자와 게놈 DNA에 특이적인 핵산 프로브의 조합 이외에도 또는 조합이 아닌 다른 코드를 포함한다.
특정 구현예에서, 코드는 예컨대 입자의 내부에 박히거나(embedding), 또는 혼성화 및 분석시 안정적인 방식으로 입자에 부착된다. 코드는 홀로그래피 인코딩, 플루오레센스 특성, 색, 형태, 크기, 빛 방출, 퀀텀 돗트 방출 등에 의해서와 같이, 임의의 검출가능한 방식으로 제공되어 입자를 식별할 수 있으며, 따라서 여기에 포착 프로브를 고정시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 코드는 핵산에 의해 제공되는 코드 이외의 다른 코드이다.
예시적인 플랫폼은 특이적인 포착 프로브가 고정되어 있는 하나의 입자 세트에서 각각의 입자를 식별하기 위한 수단으로서 폴리머 입자에 함유시킨 형광 염료 혼합물을 활용한다. 다른 예시적인 플랫폼은 홀로그래피 바코드를 이용하여 실린더형의 유리 입자를 식별한다. 예컨대, Chandler et al.(미국 특허 5,981,180)에서는, 여러가지 입자 타입들이 폴리머 입자에 함유된 2종 이상의 다양한 비율의 형광 염료 혼합물에 의해 인코딩된된, 입자-기반 시스템을 기술하고 있다. Soini(미국 특허 5,028,545)에서는, 색 및/또는 크기로 구분가능한 입자를 이용하는 방법의 예를 개시하고 있다. 미국 특허 공개공보 20040179267, 20040132205, 20040130786, 20040130761, 20040126875, 20040125424, 및 20040075907에는 홀로그래피 바코드에 의해 인코딩된 입자들이 예시되어 있다. 미국 특허 6,916,661에는, 입자에 대한 코드를 제공하는 염료를 가진 나노입자와 조합된 폴리머 미세입자가 개시되어 있다.
본원에 상세하게 기술된 구현예들은 루미넥스(luminex) 인코딩 비드 플랫폼을 사용하고 있지만, 다른 타입의 인코딩 입자 분석 플랫폼도 사용할 수 있으며, 그 예로는 VeraCode beads 및 BeadXpress 시스템(Illumina Inc., San Diego CA), xMAP 3D (Luminex) 등이 있다. 자기 루미넥스 비드를 사용하여, 필터 플레이트 및 진공 매니폴드를 이용하는 방법에 비해 플레이트 마그넷 및 파이펫팅으로 세척 단계를 수행할 수 있다. 이러한 플랫폼 각각은 전형적으로 카르복시 비드로서 제공되지만, 또한 아미노-실란과 같이 여러가지 커플링 화합물을 포함하도록 구성될 수 있다.
일반적으로, 제2 증폭 반응의 산물인 앰플리콘은 이중 가닥이며, 이중 가닥 앰플리콘이 입자에 부착된다. 따라서, 이중 가닥 앰플리콘의 양 가닥은 각각의 입자 상에 있게 된다. 앰플리콘은 분석 방법의 특정 구현예에서 사용하기위한 제조에 있어서, 입자에 고정한 다음 변성시켜 단일 가닥으로 만든다. 선택적으로, 이중 가닥 앰플리콘을 고정화 전에 변성시키고, 그런 후 단일 가닥 앰플리콘을 입자에 결합시킨다.
기술된 바와 같이, 1차 및 제2 증폭 반응 둘다에서의 각각의 앰플리콘들은 주형 DNA 서열의 랜덤 영역과 동일한 핵산 서열을 포함하며, 제1 증폭 반응에 의해 제조된 앰플리콘들은 모두 합쳐 실질적으로 전체 주형 DNA 서열을 나타내게 되고, 제2 증폭 반응에 의해 제조된 앰플리콘들은 모두 합쳐 실질적으로 전체 주형 DNA 서열을 나타내게 된다.
제2 증폭 반응의 산물이며 모두 합쳐 실질적으로 제1 증폭 반응에서 주형으로서 사용된 전체 게놈 DNA 서열을 나타내는, 앰플리콘들이 결합되어 있는, 인코딩 입자는, 게놈 DNA 분석을 위한 제1 입자 세트 및 제1 시약이다.
특정 구현예에서, 입자에 부착된 각 개별 앰플리콘의 길이는 비제한적으로 약 500 - 1200개의 뉴클레오티드 길이이다. 따라서, 비교적 큰 주형 핵산은 인코딩 입자의 세트 상에 주형으로부터 증폭된 부착된 비교적 소형인 앰플리콘들에 의해 실질적으로 그 전체가 제시된다.
전술한 바와 같이, 각각의 입자 세트는, 제2 증폭 반응의 산물이며 합하여 실질적으로 제1 증폭 반응에서 주형으로 사용되는 전체 게놈 DNA 서열을 나타내는, 앰플리콘들이 결합된 인코딩 입자들을 포함한다. 합하여, 실질적으로 제1 증폭 반응에서 주형으로서 사용되는 전체 게놈 DNA 서열을 나타내기에 충분한, 앰플리콘들을 포함하는 입자의 수는, 주형의 크기, 앰플리콘의 크기, 입자 상에 앰플리콘 결합에 이용가능한 결합부의 수 등의 다수의 인자들에 의해 결정된다. 통상, 함께 제1 증폭 반응에 주형으로서 사용되는 전체 게놈 DNA 서열을 실질적으로 나타내기에 충분한 입자의 수는 포괄적으로 약 1 - 10,000개이다.
부가적인 입자 세트들을, 제2 게놈 DNA 주형을 이용한 증폭 및 전술한 바와 같이 제2 증폭 반응의 반응 산물인 앰플리콘들을 복수의 제2 인코딩 입자에 결합시켜 제조한다. 상기 복수의 제2 인코딩 입자는 상기 복수의 제1 인코딩 입자와 상이하게 검출할 수 있으며, 그로 인해 제2 인코딩 입자 세트와 게놈 DNA 분석용 제2 시약이 제조된다.
마찬가지로, 제3 또는 다음 차수의 게놈 DNA 주형을 이용하여 증폭 반응의 반응 산물을 제조하고, 상기 반응 산물을 복수의 제3 또는 다음 차수의 인코딩 입자에 결합시킨다. 상기 복수의 제3 또는 다음 차수의 인코딩 입자들의 각각은 서로 다른 복수의 인코딩 입자들과 상이하게 검출할 수 있으며, 게놈 DNA 분석을 위한 제3 또는 다음 차수의 인코딩 입자 세트와 제3 또는 다음 차수의 시약이 제조된다.
다중 시약
특정 구현예에 따라, 입자 세트들 2종 이상의 혼합을 포함하는 게놈 DNA 분석용 다중 시약을 제공한다. 인코딩 입자 세트 각각의 인코딩 입자 각각은 특정 구현예에서, 다른 인코딩 입자 세트의 개별 인코딩 입자와 구분가능하게 검출할 수 있다. 인코딩 입자 각각에는, 전술한 바와 같이 제2 증폭 반응의 산물이며, 모두 합하여 제1 증폭 반응에 주형으로서 사용되는 전체 게놈 DNA 서열을 실질적으로 나타내는, 앰플리콘이 부착되어 있으며, 여러가지 게놈 주형은 서로 다른 인코딩 입자 세트에 부착된 앰플리콘들에 의해 표시된다.
구체적인 구현예에 따른 다중 시약은, 함께 제1 박테리아 인공 염색체에 삽입된 전체 주형 DNA 서열을 실질적으로 나타내는 앰플리콘들 부착된 제1 인코딩 입자 세트와, 함께 제2 박테리아 인공 염색체에 삽입된 전체 주형 DNA 서열을 실질적으로 나타내는 앰플리콘들이 부착된 제2 인코딩 입자 세트를 포함한다.
예컨대, 제1 인코딩 입자 세트는 인간 염색체 13번 DNA의 일부분과 동일한 핵산 서열을 포함하는 부착된 앰플리콘들을 포함하며, 제2 인코딩 입자 세트는 인간 염색체 18번 DNA의 일부분과 동일한 핵산 서열을 포함하는 부착된 앰플리콘들을 포함한다. 제3 또는 다음 차수의 인코딩 입자 세트는 다른 염색체 또는 염색체의 중복되지 않는 영역의 인간 DNA와 동일한 핵산 서열을 포함하는 부착된 앰플리콘들을 포함한다.
본원에 기술된 다중 시약은 단일 분석으로 다중 게놈 좌(genomic loci) 등의 다중 타겟의 동시 분석이 가능하다.
게놈 DNA 분석용 다중 시약은 적어도 제1 인코딩 입자 세트와 제2 인코딩 입자 세트를 혼합하여 제조한다.
도 2는 다중 시약의 제조 방법에 대한 구현예를 설명한다. 도에서 나타낸 바와 같이, 임의의 수 "m"개의 인코딩 입자 세트가 다중 시약에 포함될 수 있다. 따라서, 예를 들어, "m"은 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 또는 200개의 상이한 인코딩 입자 세트일 수 있다. 결합된 앰플리콘을 포함하는 인코딩 입자들로 구성된 세트를, 결합된 앰플리콘을 포함하는 인코딩 입자들로 구성된 하나 이상의 부가적인 세트와 조합하여, 샘플내 게놈 획득 및 소실 분석을 위한 다중 시약을 제조한다.
분석 방법
게놈 DNA 분석 방법은, 합하여 실질적으로 전체 주형 게놈 핵산을 나타내는 부착된 앰플리콘들을 가진 인코딩 입자들을 제공하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 실질적으로 전체 주형 게놈 핵산의 2 카피 이상을 함께 나타내는, 부착된 앰플리콘들을 가진 인코딩 입자들을 제공한다.
게놈 획득 및/또는 소실에 대해 분석할 게놈 DNA 샘플은 검출가능한 표지물로 표지한다. 기준 DNA는 또한 샘플 DNA 대비 검출가능한 표지물로 표지한다. 샘플 및 기준 DNA는 사용되는 샘플 구성에 따라 동일하거나 상이한 검출가능한 표지물로 표지할 수 있다. 예를 들어, 여러가지 검출가능한 표지물로 표지된 샘플 DNA 및 기준 DNA를, 특정 구현예에서 인코딩 입자에 부착된 앰플리콘들과 혼성화하기 위해, 동일한 용기에서 함께 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 검출가능한 동일 표지물로 표지된 샘플 DNA 및 기준 DNA는 입자에 부착된 앰플리콘들과의 혼성화를 위해 분리된 용기에서 사용될 수 있다.
용어 "검출가능한 표지물"은 핵산에 부착될 수 있으며, 검출가능한 신호를 제공할 수 있는, 임의의 원자 또는 모이어티를 의미한다. 이러한 검출가능한 표지물의 예로는, 플루오레센트 모이어티, 화학발광 모이어티, 생발광 모이어티, 리간드, 자기 입자, 효소, 효소 기질, 방사선 동위원소 및 발색단이 있다.
샘플 DNA 및 기준 DNA를 표지하는 임의의 다양한 방법들을 본 분석에서 사용할 수 있으며, 그 예로는 닛 트랜슬레이션 또는 DNA의 화학적 표지가 있다. 예컨대, 검출가능한 표지물은, 바이오틴, 디그옥시게닌, 플루오레세인 또는 시아닌을 포함하도록 변형된 뉴클레오티드 등의, 적어도 일부 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드를 이용한 중합에 의해 도입할 수 있다. 일부 구현예에서, 검출가능한 표지물은 랜덤-프라이밍 및 중합에 의해 도입한다. 다른 예로는, 닛 트랜슬레이션(Roche Applied Science, Indianapolis Ind.; Invitrogen, Carlsbad Calif.) 및 화학적 표지(Kreatech ULS, Amsterdam NL)가 있다. 핵산의 검출가능한 표지는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 게놈 DNA를 표지하는데 적합한 임의의 표지 방법을 이용할 수 있다.
또다른 구현예에서, 샘플 DNA 및 기준 DNA 각각에 검출가능한 표지물의 공유결합에 의한 표지는 피한다. 예컨대, 비표지된 게놈 DNA 샘플을 인코딩 입자에 고정된 앰플리콘과 혼성화한다. 미리 표지한 리포터 서열도 앰플리콘의 포획 프로브의 서열과 인접되어 있지만 중복되지 않는 서열에서 앰플리콘-샘플 DNA 복합체 및 앰플리콘-기준 DNA 복합체와 혼성화한다. 이들 표지된 리포터 서열은 동일한 또는 상이한 혼성화 반응으로 혼성화할 수 있다. 이러한 방식으로, 표지된 리포터 서열은 대규모 조건에서 벌크로 제조할 수 있어, 분석시에 각 샘플을 개별적으로 표지하는 방법에 비해, 분석 단가를 낮출 수 있다.
"샘플" 및 "기준" 게놈 DNA는 임의의 적합한 소스로부터 수득할 수 있다. 본원에 기술된 특정 방법은 개별 개체로부터 유래된 샘플 게놈 DNA를 이용하는 단계를 포함한다. 게놈 샘플 및/또는 기준 DNA는, 임의의 조직 대부분으로부터 추출할 수 있으며, 상기 조직의 예로는 혈액, 양수, 고형 종양, 장기 생검, 구강 면봉 채취물(cheek swab), 융모막 융모(cheek swab), 배반포, 할구, 임신 산물, 타액 및 뇨 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 포르말린-고정된, 파라핀-포매(FFPE) 병리 샘플로부터 추출한 보관된 샘플도 본 방법에 의한 게놈 DNA 분석의 샘플 소스가 된다. 또한, 샘플 및/또는 기준 게놈 DNA는 세포주와 동일한 시험관내 소스로부터 수득할 수 있다. 이들 소스 또는 다른 소스들로부터 게놈 DNA를 수득하는 방법들은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
특정 구현예에서, 기준 DNA는 분석할 샘플 DNA의 특징적인 특성에 대해 특정화되어 있다. 예컨대, 샘플 DNA를 특정 유전자좌 또는 염색체좌의 이배수성(duplication)을 검출하기 위해 분석할 예정인 경우, 기준 DNA에 포함된 카피의 유전자 또는 유전자좌 갯수를 알 수 있도록 기준 DNA를 특정화한다. 대게, 동일 종으로부터 유래된 샘플 및 기준 DNA가 이용된다.
본원에 기술된 분석을 이용하여, 염색체 획득 또는 소실과 관련있는 장애를 검출 또는 특정할 수 있다. 본질적인 또는 선천적인 장애로는, 전체 염색체의 3염색체성, 더 작은 게놈좌(약 200 kb - 20 메가베이스)의 증폭 또는 결손, 및 텔로미어(telomere) 또는 센트로미어 영역내 증폭 또는 결손을 포함한다. 또한, 다양한 암들이, 유형, 등급, 약물 내성 또는 치료 반응과 상호 관련있을 수 있는 염색체 획득 및 소실로 특정화된다. 줄기 세포주 등의 실험 세포주를 본 발명의 방법을 이용하여 염색체 안정성에 대해 특정화할 수 있다.
주로 인간 유래 핵산을 참조하여 방법 및 조성물들이 본원에 기술되어 있지만, 본원에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여, 비제한적으로 인간을 제외한 영장류, 설치류, 토끼, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소 및 양 등의 다양한 임의 유기체로부터 유래된 샘플 게놈 DNA를 분석할 수 있다. 샘플 DNA의 포유류를 제외한 소스도 분석할 수 있는데, 그 예로는 어류 및 그외 수생 유기체들, 새, 가금, 박테리아, 바이러스, 식물, 곤충, 파충류, 양서류, 진균 및 미코박테리아가 있다.
인코딩 입자들에 부착된 앰플리콘들을, 앰플리콘 DNA와 검출가능하게 표지된 샘플 게놈 DNA 간의 특이적인 혼성화를 달성하기 위해, 개별 개체의 검출가능하게 표지된 샘플 게놈 DNA와 혼성화한다. 또한, 인코딩 입자에 부착된 DNA 서열을, 앰플리콘 DNA와 검출가능하게 표지된 기준 게놈 DNA 간의 특이적인 혼성화를 달성하기 위해, 검출가능하게 표지된 기준 게놈 DNA와 혼성화한다.
용어 "혼성화" 및 "혼성화된"은 상보적인 핵산의 페어링(pairing) 및 결합을 의미한다. 혼성화는, 당해 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이, 핵산의 상보성 정도, 핵산의 융점, Tm 및 혼성화 조건의 엄격성 등의 인자에 따라 2종의 핵산들 간에 다양한 수준으로 이루어진다. 용어 "혼성 조건의 엄격성"은, 포름아미드 및 덴하르트 용액 등의 특정 일반적인 첨가제와 관련된 혼성화 매질의 온도, 이온 세기 및 조성 조건을 의미한다. 명시된 핵산에 대한 특정 혼성화 조건의 결정은 일상적인 것이며, 예컨대 J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Ed., 2001; and F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th Ed., 2002에 언급된 바와 같이 당해 분야에 잘 알려져 있다. 고엄격성 혼성화 조건은 실질적으로 상보적인 핵산만 혼성화되게 하는 조건이다. 전형적으로, 상보성이 약 85-100%인 핵산은 상보성이 높은 것으로 간주되며, 고엄격 조건에서 혼성화가 이루어진다. 중등의 엄격 조건은, 약 50-84%의 중등의 상보성을 가진 핵산 뿐만 아니라 상보성 수준이 높은 핵산이 혼성화되는 조건으로 예시된다. 반면, 저엄격 혼성화 조건은 상보성 수준이 낮은 핵산이 혼성화되는 조건이다. 용어 "특이적인 혼성화" 및 "특이적으로 혼성화한다"는 특정 핵산이 타겟 핵산에 혼성화되고, 샘플에서 타겟 핵산 이외의 다른 핵산에는 실질적으로 혼성화되지 않는 것을 의미한다.
기술된 분석은 임의의 적합한 용기에서 수행할 수 있다. 특정 구현예에서, 예컨대, 복수의 샘플을 분석할 경우, 멀티-챔버 용기를 사용할 수 있다. 멀티-챔버 용기는 예시적으로 슬라이드, 실리콘 칩 또는 트레이와 같이 멀티-침하(depression) 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, 각 샘플을 멀티-웰 플레이트의 다른 웰에 둔다. 예컨대, 멀티-웰 플레이트는 96웰, 384웰 또는 1024웰 분석 플레이트일 수 있다.
또한, 부착된 DNA 서열과 개별 개체의 검출가능하게 표지된 게놈 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는 제1 신호의 검출과, 부착된 DNA 서열과 검출가능하게 표지된 기준 게놈 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는 제2 신호의 검출을 더 포함한다.
예시적으로, 스펙트로스코피, 광학, 광화학, 생화학, 효소, 전기적 및/또는 면역화학적 방법 등의 임의의 적합한 방법을 이용하여, 인코딩 입자에 결합된 앰플리콘에 혼성화되는 샘플 및 기준 DNA의 검출가능한 표지물을 검출한다.
혼성화 정도를 나타내는 신호는, 하나 이상의 검출가능한 표지물로부터 신호를 조사함으로써, 각 입자에서 검출할 수 있다. 입자는 전형적으로 개별적으로 조사된다. 예컨대, 입자를 유세포 측정기에 통과시킬 수 있다. 예시적인 유세포 측정기로는 Beckman Coulter, Inc. (Fullerton Calif.) 사의 Coulter Elite-ESP 유세포 측정기 또는 FACScan.TM. 유세포 측정기, 및 Cytomation, Inc., Fort Collins, Colo 사의 MOFLO.TM. 유세포 측정기이다. 유세포 측정 외에도, 입자를 분리 및 분류하기 위한 장치로서 원시분리기를 사용할 수 있다. 적합한 시스템은 미국 특허 5,926,387에 기술된 시스템이다. 유세포 측정 및 원심분리 외에도, 자유-유도 전기영동 장치를 입자를 분리 및 분류하기 위한 장치로서 사용할 수 있다. 적합한 시스템은 미국 특허 4,310,408에 기술되어 있다. 또한, 입자를 표면 상에 위치시켜 스캐닝 또는 이미지 촬영할 수 있다.
제1 신호이 검출되면, 이는 인코딩 입자에 부착된 DNA 서열과 검출가능하게 표지된 개별 개체의 게놈 DNA 간에 특이적인 혼성화가 있음을 의미한다. 또한, 제2 신호가 검출되면, 이는 인코딩 입자에 부착된 DNA 서열과 검출가능하게 표지된 기준 게놈 DNA 간의 특이적인 혼성화가 있음을 의미한다.
제1 신호 및 제2 신호를 비교하여, 기준 게놈 DNA 대비 개별 개체의 게놈 DNA의 정보를 입수한다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 입자 세트의 앰플리콘들에 혼성화되는 기준 DNA 및 샘플 DNA의 검출가능한 표지물로부터 수득되는 신호의 비율을 이용하여, 예컨대 게놈 획득 및/또는 소실을 의미하는, 샘플 및 기준 DNA 간의 차이를 평가한다. 특정 구현예에서, 기준 DNA 및 샘플 DNA를, 멀티-웰 플레이트의 웰 등의 동일한 용기내에서 하나 이상의 입자 세트들의 앰플리콘들과 혼성화한다. 혼성화한 후, 2종의 표지물을 함께 분석하며, 즉 검출가능한 2가지 표지물을 혼성화된 물질에서 검출하거나, 또는 혼성화된 물질을 2(또는 그 이상) 영역으로 나누고, 각 영역을 독립적으로 평가하여 검출가능한 표지물을 검출한다. 평가 검출 결과를 이용하여, 2종의 검출가능한 표지물로부터의 신호의 비를 제공할 수 있다. 이러한 방법은, 경쟁적인 혼성화를 사용하여 분석 간의 임의 편차를 정규화할 수 있게 하며, 기준 및 실험 샘플들을 모두 동시에 동일 입자들과 혼합된 동일 바셀에서 동시에 분석할 수 있다.
선택적으로, 검출가능하게 표지된 기준 DNA 및 검출가능하게 표지된 샘플 DNA를, 멀티-웰 플레이트의 상이한 웰 등의 상이한 용기에서, 하나 이상의 입자 세트와 혼성화한다. 샘플 DNA 및 기준 DNA 간의 차이를 평가하기 위해, 검출가능한 2종의 표지물로부터 수득되는 신호의 비를 구할 수 있다. 이러한 방법을 이용하는 경우, 하나의 기준 샘플을 수종의 또는 다수의 실험 샘플들에서 공유할 수 있다. 하루에 샘플 여러개를 사용하는 실험에서는, 다중 이배수 정상 샘플의 표지를 방지할 수 있어, 시약 비용과 노동력을 절약할 수 있다. 또한, 독립적인 분석에 대한 여러가지 영역을 수득하기 위한 샘플 조작이 불필요하다. 각 샘플은 한번만 분석할 수 있다.
특정 구현예에서, 입자의 인코딩을 제1 신호 및 제2 신호와 조합하기 위해, 이의 인코딩 정보에 의해 인코딩 입자를 식별한다. 즉, 예컨대, 제1 및 제2 신호를 인간 염색체 13번 DNA를 포함하는 제1 인코딩 입자 세트의 인코딩 입자들과 조합한다. 제1 인코딩 입자 세트와 조합된 제1 및 제2 신호를 비교하고, 염색체 13번의 기준 DNA와 비교하여, 개별 개체의 염색체 13번 DNA에 대한 정보를 수득한다. 마찬가지로, 제1 및 제2 신호를 인간 염색체 18번 DNA를 포함하는 제2 인코딩 입자 세트와 조합한다. 제2 인코딩 입자 세트와 조합된 제1 및 제2 신호를 비교하고, 염색체 18번의 기준 DNA와 비교하여 개별 개체의 염색체 18번 DNA에 대한 정보를 수득한다.
본원에 기술된 도면 및 설명은 최상의 형태를 나타내지만, 다수의 대체 물질 및 프로세스로 치환할 수 있다. 당업자라면 적합한 대체 물질과 프로세스를 인지할 것이며, 과도한 실험없이도 기술된 조성물 및 방법을 제조 및 이용할 수 있을 것이다.
다양한 완충제 및 다른 분석 성분들의 구성을 치환할 수 있다.
배양, 정제, 증폭, 변성, 커플링, 혼성화, 리포터 결합, 세정 및 비드 취급의 조건은 사용자가 특정 타입의 세포, 주형 게놈 DNA, 샘플, 선택한 리포터 등에 맞게 변경시킬 수 있을 것이다.
본원의 실시예의 분석은 샘플 DNA 30 ng으로 적게 사용하여 원활하게 수행한다. 생물학적 소스에 전술한 분석을 위한 DNA가 불충분한 경우, DOP PCR 또는 phi-29 PCR 등의 다양한 전체-게놈 증폭(WGA) 방법들에 의해 샘플을 증폭시킬 수 있다. WGA-처리된 샘플 이용시, 기준 DNA도 동일한 방법으로 처리하여, 임의의 서열-특이적인 증폭 편향을 샘플/기준 신호 비율에 의해 대게 보정할 수 있을 것이다.
DNA 분석용 키트를 제공한다. 특정 구현예에서, 인코딩 입자 세트 및/또는 2종 이상의 인코딩 입자 세트 혼합물을 포함하는 키트를 제공한다. 인코딩 입자 세트 및/또는 2종 이상의 인코딩 입자 세트 등의 다중 시약의 사용 지침서도 선택적으로 키트에 포함된다. 완충액, 효소, 세정 용액, 혼성화 용액, 검출가능한 표지물, 검출 시약 등의 보조 시약도 선택적으로 포함된다.
분석 조성물 및 방법에 대한 구현예들을 하기 실시예에서 설명한다. 이들 실시예들은 예시의 목적으로 제공되며, 조성물 및 방법의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않는다.
실시예
실시예 1
게놈 DNA 분석용 비드 세트 시약의 제조
도 1A는 단일 BAC 클론 유래의 BAC 앰플리콘의 제조와 인코딩 비드의 세트 상에 프로브로서의 앰플리콘의 고정화를 나타낸 플로우차트이다. 본 실시예에서, 세트내 비드는 모두 동일한 ID 코드를 가진다.
출발 물질은 100-200 kb 길이의 살아있는 BAC 클론 물질(10)로, E. coli 박테리아 세포의 게놈에 인간 DNA 서열이 삽입된 것이다. 냉동시킨 BAC 글리세롤 스톡 물질의 소형 칩을 입수하여, 이를 표준 박테리아 세포 배양 프로세스를 위한 출발 물질로서 사용하였다(11). 세포를 선택 항생제와 함께 37℃에서 밤새 50 ml 시험관내에서 35 ml 배지 중에 표준 BAC 배양 프로토콜에 따라 배양하였다. 그런 후, 배양된 세포를 4℃에서 20분간 원심분리하여 시험관 바닥으로 가라앉히고, 상층액을 취하여 버렸다. 세포 펠렛을 RNase가 포함된 완충액으로 재현탁한 다음, LyseBlue (Qiagen, Valencia CA) 및 SDS로 세포 용혈하였다. 용혈물(12)을 약 20,000 g에서 30분간 원심분리(13)하고, 용액에 DNA에 함유된 상층액을 취하고 펠렛을 버렸다. 상층액을 대상으로 원심분리를 15분간 반복하였다. 용해된 BAC DNA가 함유된 맑은 상층액을 모우고, 세포 찌꺼기, 단백질 및 그외 불순물들은 시험관 바닥으로 가라앉힌 후 버렸다. BAC DNA를 상층액으로부터 Qiagen Genomic-Tip 20/G 컬럼 정제 키트를 이용하여 추출 및 정제(17)하였다. 키트는 정제 컬럼(15)을 포함하며, 이를 완충액으로 세정 및 용리하였다(16). 용리 후, 고도로 정제된 BAC DNA를 이소프로판올(19) 침전에 의해 침전 및 펠렛화하였다. 정제된 BAC DNA(18)의 수율은 전형적으로 20 - 200 ng이었다. 이 BAC DNA는 건조 펠렛으로 저장하거나 또는 다음 단계에 바로 사용하기 위해 물에 재현탁할 수 있다.
각 BAC DNA의 전체 서열 내용을 실질적으로 나타내는 상당량의 PCR 앰플리콘을, 2번의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭으로 제조하였다. 1차 PCR(20)은, DOP 프라이머 믹스(21), DOP PCR 중합효소(22) 및 DOP PCR 완충액(23)과 상기에서 제조한 주형으로서의 BAC DNA(18)를 이용한, 비특이적인 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머(DOP) PCR이다. 2차 PCR 증폭(25)에는, DOP 프라이머의 공지된 서열 모티프에 대한 단일 프라이머를 사용하였다. 2번의 PCR을 실시하여, 이후 인코딩 비드(30)에 앰플리콘(29)을 커플링(32)하기 위한, 최종 앰플리콘 산물(29) 약 20 ㎍을 수득하였다.
앰플리콘은 다음과 같이 제조한다.
각 BAC DNA에 대해, 하기 물질로 구성된 1차 50 ㎕ DOP PCR 믹스를 제조한다:
10X DOP PCR 완충액 5.0 ㎕
10mM dNTP(각각) 1.0 ㎕
50mM MgCl 5.0 ㎕
10uM DOP 프라이머 믹스(각각) 10.0 ㎕
20 - 50 ng BAC DNA 주형 2.0 ㎕
플라티늄 텍 중합효소 0.5 ㎕
물 21.5 ㎕
총 부피 50.0 ㎕
DOP PCR 완충액(23)에는 20 mM Tris HCl(pH 8.4), 50 mM KCl 및 5 mM MgCl이 포함된다. dNTP(Amersham Biosciences, Piscataway NJ)의 농도는 200 μM이다. 플라티늄 텍 중합효소(Applied BioSystems)의 농도는 5 units/㎕이다. DOP 프라이머 믹스(21)(Fiegler et al. 2003, Genes Chromosomes Cancer, 36(4):361-74)에는, 하기 22 mer 서열(Operon Biotechnologies, Huntsville AL)의 축퇴 올리고뉴클레오티드 3세트가 포함되며, 서열에서 N은 랜덤 뉴클레오티드이다:
5' CCGACTCGAGNNNNNNCTAGAA 3' 서열번호 1
5' CCGACTCGAGNNNNNNTAGGAG 3' 서열번호 2
5' CCGACTCGAGNNNNNNTTCTAG 3' 서열번호 3
상기에서, N은 랜덤 뉴클레오티드임.
물에 용해시킨 BAC DNA 주형(18)을 Qiagen Genomic-Tip 20/G 컬럼 정제 키트를 이용하여 컬럼 정제(17)에 의해 정제하였다. 플라티늄 텍 중합효소(22)(Invitrogen, Carlsbad CA)의 농도는 5 units/㎕이다.
제1 증폭(20)은 하기 온도/시간 프로파일에 따라 GeneAmp 9700 써모사이클러(Applied BioSystems, Foster City CA)에서 수행하였다:
3.0 min 94℃
1.5 min 94℃
2.5 min 30℃ 9 회
0.10C/sec 72℃ (ramp)
3.0 min 72℃
1.0 min 94℃
1.5 min 62℃ 30 회
2.0 min 72℃
8.0 min 72℃
4.0℃ (안정기)
1차 DOP PCR(2)의 앰플리콘 산물(24)을 2차 PCR(25)의 주형으로 사용하였다. 2차에서, 단일 프라이머(26)는 1차(20)에서 사용된 DOP 프라이머(21)의 공통 서열 영역에 특이적이다. 이 프라이머(26)는 아민 변형되어, 제조되는 앰플리콘(29) 역시 이후 단계(32)에서 인코딩 비드에 간단한 커플링을 촉진시키기 위해 한쪽 말단에 아민기를 가지게 될 것이다.
2차 PCR을 다음과 같이 수행하였다.
각 BAC 앰플리콘 주형에 대해 하기를 포함하는 제2 PCR 믹스 100 ㎕를 제조하였다:
10X PCR 완충액 10.0 ㎕
10mM dNTP(각각) 2.0 ㎕
50mM MgCl 10.0 ㎕
10uM 아민 프라이머 15.0 ㎕
주형(PCR #1의 산물) 2.0 ㎕
플라티늄 텍 중합효소 0.5 ㎕
물 58.5 ㎕
총 부피 100.0 ㎕
PCR 2 완충액(28)에는 20 mM Tris HCL (pH 8.4), 50 mM KCl 및 5 mM MgCl이 포함되어 있다. dNTP(Amersham Biosciences, Piscataway NJ)의 농도는 200 μM이다. 플라티늄 텍 중합효소(Applied BioSystems)의 농도는 5 units/㎕이다.
아민-연결된 프라이머(Operon)는 하기 서열을 포함한다.
5'-GGAAACAGCCCGACTCGAG-3' 서열번호 4
반응(25)에서 주형은 선행된 DOP PCR(20)에서 제조된 DOP 앰플리콘(24)이다. 제2 증폭(25)은 하기 온도/시간 프로파일에 따라 GeneAmp 9700 써모사이클러(Applied BioSystems)에서 수행하였다:
10 min 95℃
1.0 min 95℃
1.5 min 60℃ 35 사이클
7.0 min 72℃
10 min 72℃
4.0℃ (안정기)
이러한 2차 PCR 산물(29)을 자기-비드 키트(9)(PCR Clean Beads, Agencourt Bioscience Corp., Beverley MA)로 제조사의 프로토콜에 따라 정제하였다. 정제된 앰플리콘(29)을 물 40 ㎕에 재현탁한 후, 후술되는 비드 커플링 단계에 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다.
인코딩 비드의 표면 상에 프로브 DNA로서 앰플리콘 산물(29)를 고정하기 위한 인코딩 비드 커플링 프로세스(32)를, 약 650,000개인 표준 비드 농도 50 ㎕ 규모에서 루미넥스 카르복시 비드(30)(Luminex, Austin TX)에서 수행하였다. 비드는 직경 약 5.6 ㎛로 폴리스티렌으로 구성되며, 특수 제작된 유세포 측정 판독기에서 비드 ID 검출을 용이하게 하기 위해 조절된 양의 2 또는 3종의 형광 염료로 코딩한다. 모두 하나의 비드 ID 또는 영역인 현탁시킨 비드(30) 50 ㎕을 이동된 루미넥스 튜브에서 커플링(32)을 위한 1.5 ml 에펜도르프 튜브로 옮기고, 현탁 유지를 위해 볼텍싱과 음파 처리를 실시하였다. 그런 후, 비드를 3분간 12,000 rpm에서 회전 다운시키고, 비드 펠렛을 그대로 둔 상태로 비드 완충액 상층액을 제거하였다. 각 비드 튜브에 25 ㎕의 MES 완충액을 첨가하고, 볼텍싱과 음파 처리를 실시하였다. 독립적으로, 각각의 BAC의 PCR 2 앰플리콘(29) 10 ㎍을 1.5 ml 원심분리관 제2 세트에 넣고, 각 관내 DNA를 SpeedVac(ThermoFisher Scientific, Waltham MA)을 이용하여 완전히 건조시켰다. 그런 후, 하나의 비드 현탁물을 각 DNA 튜브에 넣고, 볼텍싱 및 음파 처리를 각각 5초간 하여 혼합하고, 각 BAC와 조합된 비드 ID(영역)의 트랙을 추적하였다.
다음으로, 금방 용해한 10 mg/ml의 EDC(31, 1-에틸-3-[디메틸아미노프로필]-카르보디이미드 하이포클로라이드, Pierce, Rockford IL) 1.5 ㎕를 각 튜브에 넣고, 바로 볼텍싱한 다음 실온의 어두운 곳(루미넥스 비드의 형광 암호를 유지하기 위함)에서 30분간 인큐베이션하였다. 15분에 다시 재혼합하였다. EDC 첨가, 인큐베이션 및 재혼합을 2번째에도 반복하였다.
500 ㎕의 TNT 완충액(0.1M Tris pH 7.5, 0.15M NaCl, 0.02% Tween 20)을 각 튜브에 첨가하여 볼텍싱하였다. 그런 후, 튜브를 4분간 원심분리기에서 12,000 rpm으로 스핀 다운시켜, 비드를 바닥쪽에 있게 하고, 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 그 후, 500 ㎕의 0.1% SDS를 첨가하고, 다시 비드를 4분간 12,000 rpm으로 스핀 다운한 후, 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 마지막으로, 1x TE 완충액(10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA) 50 ㎕를 각 튜브에 넣고, 볼텍싱하였다.
앰플리콘 프로브(29)들이 고정된 비드 세트(33)는 게놈 DNA 분석에 사용하기 위한 다중 비드 세트의 구성 성분으로서 포함될 수 있다.
실시예 2
DNA 분석용 다중 인코딩 비드 세트 시약의 제조
도 2는 각각이 대응되는 고정된 BAC-앰플리콘 프로브 DNA를 가지고 있으며, 모두 합하여 다중 인코딩 비드 세트를 형성하는, m개의 여러가지 인코딩 비드 세트를 혼합하는 것을 나타낸 플로우차트이다.
인코딩 비드 세트들(34, 35, 36 및 37)을 음파 처리, 튜브 용기의 회전, 볼텍싱 또는 유사 방법에 의해 현탁 상태로 있게 하였다. 그런 후, 파이펫을 사용하여, 각 비드 세트의 분액을 각 비드 세트들이 조합 및 혼합되는 다른 바셀에 이동시킨 후, 변성(38)시켜, 분석에서 비드에 고정된 프로브 DNA에 대한 이후의 혼성화가 용이하게 이루어지도록 하였다.
상세한 예로, 각 개별 튜브에 있는, 각각 인코딩 비드 세트를, 프로브 DNA(33)가 고정되어 있는, 50 ㎕ 함량의 비드 세트 2가지 이상을, 1.5 ml 원심분리관에서 하나씩 조합하였다. 약 10개의 비드 세트들을 조합한 다음, 부피를 적게 유지하기 위해 튜브를 스핀 다운하고, 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 비드 세트들을 모두 조합할 때까지(최대 100개의 인코딩 비드 ID 또는 영역이 루미넥스 200 시스템에서 유지됨), 이러한 작업을 반복하였다.
비드 세트들 모두 다중 비드 세트로 조합한 후, 고정된 프로브 DNA를 변성시켰다. 비드를 스핀 다운하고 상층액을 제거한 다음, 0.1N NaOH 500 ㎕를 첨가하여 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 그런 후, 비드를 스핀 다운하고 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 10 mM Tris, 15 mM NaCL, 0.2% Tween 20 500 ㎕를 첨가하여 튜브를 볼텍싱한 다음, 비드를 스핀 다운하고 상층액을 제거하였다. 이러한 세정 단계를 반복하였다. 마지막으로, 1X TE 완충액으로 부피를 500 ㎕로 만들어, 다중 비드 세트(39)를 분석에 사용하기 전까지 어두운 곳에서 4℃에서 보관하였다.
실시예 3
다중 게놈 획득 및 소실 분석
도 3A는 다중 인코딩 비드 세트를 이용한 n개 샘플에 대한 다중 게놈 획득 & 소실 분석을 수행하는 것을 포함하는 일 구현예를 나타낸 플로우차트이다.
본 실시예에서, 2개의 DNA 샘플과 2개의 기준물을 함께 분석하였다. 실시에서, 수 십개의 샘플을 마이크로플레이트 포맷으로 함께 동시에 분석할 수 있다. 더 많거나 적은 수의 샘플과 기준물도 함께 분석할 수 있다.
본 실시예에서, 샘플 4종, 2개의 기준물인 40 및 41, 및 2개의 분석 샘플인 42 및 43을 바이오틴으로 효소적으로 표지하고, 정제하였다. 기준 샘플은, 전형적으로 인간 여성 게놈 DNA 및 인간 남성 게놈 DNA(Promega, Madison WI) 등의 정상적인 남성 및 여성 수집 샘플들이다. 각 DNA 샘플과 기준물을 바이오틴-표지된 뉴클레오티드(45)(PerkinElmer, Boston MA), 비표지 뉴클레오티드(49)(PerkinElmer), 랜덤 프라이머(47)(Operon, Biotechnologies, Huntsville AL) 및 클레나우 프레그먼트 중합효소(46)(Epicentre Biotechnologies, Madison WI)와 조합하였다. 인큐베이션(44)한 후, 반응 산물을 Purelink DNA Mini Kit (Invitrogen) 등의 DNA 컬럼 정제 키트(49)를 이용하여 정제하였다. 약 200 ng/㎕의 표지된 샘플 약 5 ㎕를 이후 분석의 혼성화에 사용하였다.
각각의 바이오틴-표지된 샘플 또는 기준물(51-54)을, 다중 인코딩 비드 세트(56)의 비드 상에 고정된 프로브와 혼성화하였다(55). 각 비드 세트(각 프로브 타입)의 비드 약 500개를 사용하였고, 이러한 55개 샘플에서, 혼성화 당 총 비드 약 55 x 500 = 27,500개를 사용하였다.
각각의 인코딩 비드 세트의 비드는, 인코딩으로 인해, 다른 인코딩 비드 세트의 각각의 비드들과 구분된다. 55개의 비드 세트 각각은 실질적으로 전체 주형 게놈 DNA 절편을 나타내는 부착된 앰플리콘을 가진, 복수개의 인코딩 비드를 포함한다.
Cot-1 DNA, 포름아미드, 덱스트란 설페이트 및 1.9x SSC를 포함하는 혼성화 완충액을 혼성화 반응에 포함시켰다. 총 부피는 약 15 ㎕이고, 반응은 Bio-Rad HSP 9631 (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)와 같은 리지드 PCR-타입의 마이크로플레이트 웰에서 수행하였다. 플레이트를 알루미늄 호일 실러(MSF 1001, Bio-Rad)를 이용하여 증발이 최소화되도록 단단히 밀폐하였다. 혼성화 인큐베이션(55)을 마이크로플레이트 교반 인큐베이터(Wallac NCS Incubator, PerkinElmer)에서 1150 rpm 및 50 ℃에서 밤새 수행하였다
혼성화 반응(55) 후, 4가지 샘플(58-61)과 혼성화된 4개의 다중 비드를 혼성화 세정(53)할 준비한 후, 플루오레센트 리포터(65)로 인큐베이션한 다음 리포터를 세정(67)하였다. 먼저, 100 ㎕의 세정 완충액(2X SSC, 50% formamide)을 각 웰에 넣고, 플레이트를 밀봉하여, 50 ℃에서 20분간 1150 rpm으로 교반하면서 교반 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 각 웰의 내용물을 Millipore 0.46 μM HT 필터 플레이트(Millipore, Billerica MA)로 옮겼다. 그 후, Millipore MSVMHTS00 진공 매니폴드를 이용하여 진공에 의해 각 웰에서 액체를 제거하였다. 그런 다음, 세정 완충액 b(2X SSC, 0.1% Igepal detergent) 100 ㎕를 각 웰에 넣고, 다시 20분간 50 ℃에서 교반 인큐베이션한 다음 진공 흡입하였다. 그 후, 세정 완충액 c(0.2X SSC) 100 ㎕를 각 웰에 넣고, 20 분산 50 ℃에서 교반 인큐베이션을 반복한 다음, 진공 흡입하였다.
100 ㎕의, 1X PhycoLink SA 용액, 스트렙트아비딘-피코에리트린 리포터(64)j를 각 웰에 넣었다. 이 리포터 용액은, 500X PhycoLink SA PJ13S (Prozyme, San Leandro CA) 2 ㎕를 1 ml의 리포터 희석물로 혼합하여 제조하며, 상기 희석물은 1X PBS, 0.1% BSA 및 0.05% Tween 20이다. 이 리포터 용액을 다중 비드 세트와 30분간 25 ℃에서 1050 rpm으로 교반하면서 교반 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 이전 세정 단계에서와 같이 진공 매니폴드를 이용하여 필터 플레이트의 웰로부터 용액을 흡입하였다.
그런 후, 비드를 0.01% Tween 20가 포함된 1X PBS인 세정 완충액 d(66)로 2회 세정(67)하였다. 필터 플레이트의 각 웰에 100 ㎕를 첨가한 다음, 플레이트 웰의 바닥에서 필터를 통해 액체를 진공 흡입하였다. 100 ㎕를 2번째로 첨가한 다음, 2분간 25℃에서 1050 rpm의 조건에서 교반 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 2번째 세정 단계에서는 흡입하지 않고, 판독을 위해 비드를 현탁하는데 사용하였다.
본 실시예에서, 4종의 비드 세트(68-71)를 Luminex 200 시스템(Luminex Corporation, Austin TX)에서 판독(72)할 준비를 하였다. 각 웰내 비드로부터 신호와 비드 ID를 연속하여 판독하고, 각 비드ID(비드 영역)의 1차 비드 50개의 중앙 형광 강도를 각 웰 또는 샘플에서 기록하였고, 데이타 파일(73)에 결과를 기록하였다. 비드 네트워킹의 증거는 없었고, 루미넥스 판독기를 설정하여 각 영역의 비드 50개를 분석하였고, 실패는 기록되지 않았다.
도 4는 46개의 샘플에 대한 동시 분석을 위한, 2카피의 기준물과 2카피의 샘플의 위치 예를 나타내는, 96웰 SBS-표준 플레이트(80)의 도식도이다. 각 표지 샘플의 2번의 반복 혼성화를 실시하여, 하나의 웰에서 시약을 증발시켜 산출한 웰-밀폐(well-sealing) 실패 경우에서의 데이타 생성을 확보할 수 있다. 2회 반복이 잘못되지 않은 경우, 데이타를 샘플에서 계속 생성하였다. 이러한 마이크로플레이트 및 인코딩 비드 방법을 이용하여, 한명의 실험 기술자가 예컨대 한번에 샘플 46개와 기준물 2개를 2배수로 분석할 수 있으며, 첫째날에 표지하고, 밤새 혼성화한 다음 이튿날 세정 & 판독을 실시할 수 있다. 분석은, 반복 없이 또는 3배수 이상으로도 또한 수행할 수 있다. 2개의 기준물(81 및 82)의 이배수, 샘플의 이배수, 즉 83을 나타낸다.
도 5는 남성의 13번 염색체에 3염색체성을 가진 Coriell DNA 샘플을 이용하여 생성한 데이타의 예이다. 도 5의 하단에 나타낸 숫자 1 - 55는 도 9에 나열되어 있다.
이러한 데이타는 루미넥스 판독기에 의해 수득한 각 비드 영역에 대한 형광 중앙값으로부터 계산되었다. 음성 대조군 비드(29, 54 및 56)의 평균값을 모든 다른 신호들에서 제하였다(도 9). 9개의 상염색체 클론으로부터 수득한 신호는 여성 및 남성의 기준 DNA로부터 수득한 대응되는 클론 신호로 비율을 조정하였다. 그런 다음, 정규화 인자(normalization factor)를 계산하여, 인자를 상염색체 클론 신호 모두에 적용하였을 때 상염색체의 평균비를 하나의 수치로 도출할 수 있게 하였다. 이러한 정규화 인자를 샘플의 신호 모두에 적용하였다.
수득되는 비를 그래프로 작성하여 도 5에 나타내었다. 13번 염색체 클론에 대한 비는 모두 1.3 내지 1.6이었으며, 18번 및 21번 염색체 뿐만 아니라 다른 상염색체 클론은 하나만 제외하고 모두 1.2 미만이었다. 13번 염색체에서의 3염색체성이 쉽게 확인되었다. 또한, 남성 기준(■) 대비 샘플의 비율 그래프는 X 및 Y 성 염색체 전체에서 대체적으로 평평하였다. 이는, 남성 샘플에서 예츨되는 반응이다. 여성 기준물(◆) 대비 샘플의 곡선은, 남성 샘플에서 예상된 바와 같이, X 염색체는 아래로, Y 염색체는 위쪽으로 이동되었다.
도 6은 남성의 18번 염색체에 3염색체성을 가진 Coriell DNA 샘프을 이용하여 생성한 데이타의 예이다. 데이타를 생성하여 도 5에서 기술된 바와 같이 그래프를 작성하였다.
도 7은 여성의 21번 염색체에 3염색체성을 가진 Coriell DNA 샘프을 이용하여 수득한 데이타의 예이다. 데이타를 수득하여 도 5에서 기술된 바와 같이 그래프를 작성하였다.
도 8은 X 염색체의 5-카피 증폭을 가진 Coriell DNA 샘플을 이용하여 생성한 데이타의 예이다. 데이타를 생성하여 도 5에서 기술된 바와 같이 그래프를 작성하였다.
도 9는 실시예 분석에서 앰플리콘 제조에 사용된 인간 게놈 DNA 삽입체를 가지고 있는 BAC 클론, 이의 염색체 및 염색체 위치, 음성 대조군 올리고뉴클레오티드의 서열 및 각각의 앰플리콘 프로브가 고정된 비드 세트에 대한 밴드 ID(루미넥스 비드 영역)가 표시된 표이다. 도 5-8의 x-축에 순서대로 번호를 매긴 지점은 도 9의 전체에 나열된 BAC와 같이 기재되어 있다. BAC RP11-186J16은 2가지 상이한 비드 영역(42 및 86)에 고정되어 있다.
음성 대조군으로서, 인간 게놈에 대한 서열 상동성이 없는 올리고뉴클레오티드를 선택하였다. 사용된 특이적인 음성 대조군의 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다:
5' GTCACATGCGATGGATCGAGCTC 3' 서열번호 5
5' CTTTATCATCGTTCCCACCTTAAT 3' 서열번호 6
5' CCACGGACGAGGCCGGTATGTT 3' 서열번호 7
음성 대조군 올리고뉴클레오티드가 부착된 3가지 비드 영역, 29, 54 및 56에서 나타난 신호는 평균를 산출하고, 비율 계산하기 전에 다른 비드 신호들 모두에서 제하였다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 또는 공개문헌들은 각각의 공개 문헌들이 원용에 의해 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 언급된 바와 동일한 수준으로 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 2006년 12월 22일자 미국 출원번호 11/615,739, 2008년 3월 26일자 미국 출원번호 12/055,919, 2007년 12월 5일자 미국 가출원번호 60/992,489, 2005년 12월 23일자 미국 가출원번호 60/753,584, 2005년 12월 23일자 미국 가출원번호 60/753,822, 2006년 2월 3일자 미국 가출원번호 60/765,311, 2006년 2월 3일자 60/765,355는 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원에 기술된 조성물 및 방법은 현재 특정 구현예에 대한 예이며, 본 발명의 범위에 대한 한정으로서 의도되지 않는다. 이의 대한 변형 및 그외 사용은 당해 분야의 당업자가 실시할 수 있을 것이다. 이러한 변형 및 그외 사용은 청구항에 기술된 바와 같은 본 발명의 범위내에서 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> PerkinElmer LAS, Inc. <120> MULTIPLEXED GENOMIC GAIN AND LOSS ASSAYS <130> NEN-23602/16 <140> 12/055,919 <141> 2008-03-26 <150> 60/992,489 <151> 2007-12-05 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degenerate oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 ccgactcgag nnnnnnctag aa 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degenerate oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 ccgactcgag nnnnnntagg ag 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degenerate oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 ccgactcgag nnnnnnttct ag 22 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggaaacagcc cgactcgag 19 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control oligonucleotide <400> 5 gtcacatgcg atggatcgag ctc 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control oligonucleotide <400> 6 ctttatcatc gttcccacct taat 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control oligonucleotide <400> 7 gcacggacga ggccggtatg tt 22

Claims (26)

  1. DNA 샘플의 분석 방법으로서,
    부착된 앰플리콘(amplicon)들을 가진 인코딩 입자(encoded particle)들을 포함하는 제1 인코딩 입자 세트를 제공하는 단계로서, 여기서 상기 앰플리콘들은 합하여 전체 제1 주형 DNA 서열을 나타내는 랜덤 핵산 서열을 포함하고, 상기 전체 제1 주형 DNA 서열은 20 - 300 킬로베이스 범위의 길이를 가지는 것인, 단계;
    상기 제1 인코딩 입자 세트의 앰플리콘들을 검출가능하게 표지된 샘플 DNA와 혼성화하는 단계;
    상기 제1 인코딩 입자 세트의 앰플리콘들을 검출가능하게 표지된 기준 DNA와 혼성화하는 단계;
    상기 제1 인코딩 입자 세트의 앰플리콘들과 검출가능하게 표지된 샘플 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는 제1 신호, 및 상기 제1 인코딩 입자 세트의 앰플리콘들과 검출가능하게 표지된 기준 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는 제2 신호를 검출하는 단계; 및
    상기 제1 신호와 제2 신호를 비교하여, 제1 신호와 제2 신호 사이의 차이를 검출하고, 이러한 제1 신호와 제2 신호의 차이는 샘플 DNA와 기준 DNA 사이의 차이를 의미하는 것으로, DNA 샘플을 분석하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 앰플리콘의 길이는 500 - 1200개의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 검출가능하게 표지된 샘플 DNA는 개별 개체로부터 수득되는 검출가능하게 표지된 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 검출가능하게 표지된 샘플 DNA는 개별 개체로부터 수득되는 검출가능하게 표지된 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 검출가능하게 표지된 샘플 DNA는 인간 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법.
  6. 제1항에 있어서, 하기 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법:
    부착된 앰플리콘들을 가진 인코딩 입자들을 포함하는 제2 인코딩 입자 세트를 제공하는 단계로서, 상기 앰플리콘들은 합하여 전체 제2 주형 DNA 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 단계;
    상기 제2 인코딩 입자 세트의 앰플리콘과 검출가능하게 표지된 샘플 DNA를 혼성화하는 단계;
    상기 제2 인코딩 입자 세트의 앰플리콘과 검출가능하게 표지된 기준 DNA를 혼성화하는 단계;
    상기 제2 인코딩 입자 세트의 앰플리콘과 검출가능하게 표지된 샘플 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는 제1 신호, 및 상기 제2 인코딩 입자 세트의 앰플리콘과 검출가능하게 표지된 기준 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는 제2 신호를 검출하는 단계; 및
    상기 제2 인코딩 입자 세트의 앰플리콘의 특이적인 혼성화를 의미하는 제1 신호와, 상기 제2 인코딩 입자 세트의 앰플리콘의 특이적인 혼성화를 의미하는 제2 신호를 비교하여, 제1 신호와 제2 신호 사이의 차이를 검출하고, 이러한 제1 신호와 제2 신호의 차이는 샘플 DNA와 기준 DNA 사이의 차이를 의미하는 것인 단계.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 인코딩 입자 세트 및 제2 인코딩 입자 세트는 혼합물로서 제공되며, 하기 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법:
    상기 제1 인코딩 입자 세트의 인코딩을, 상기 제1 인코딩 입자 세트의 앰플리콘과 검출가능하게 표지된 샘플 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는 상기 제1 신호, 및 상기 제1 인코딩 입자 세트의 앰플리콘의 특이적인 혼성화를 의미하는 상기 제2 신호와 조합하는 단계; 및
    상기 제2 인코딩 입자 세트의 인코딩을, 상기 제2 인코딩 입자 세트의 앰플리콘과 검출가능하게 표지된 샘플 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는 상기 제1 신호, 및 상기 제2 인코딩 입자 세트의 앰플리콘의 특이적인 혼성화를 의미하는 상기 제2 신호와 조합하는 단계.
  8. DNA 샘플의 분석 방법으로서,
    인코딩 입자 세트의 각 입자가 서로 다른 인코딩 입자 세트의 각 입자와 구별 검출가능한, 2종 이상의 인코딩 입자 세트들의 혼합물을 포함하는 다중 시약을 제공하는 단계로서, 상기 인코딩 입자는 주형 DNA 서열로부터 증폭된 부착된 앰플리콘을 가지며, 각각의 상기 인코딩 입자 세트는 다른 인코딩 입자 세트와 비교하여 상이한 주형 DNA 서열로부터 증폭된 부착된 앰플리콘을 가지는, 단계;
    상기 부착된 앰플리콘을 검출가능하게 표지된 DNA와 혼성화하는 단계;
    상기 부착된 앰플리콘을 검출가능하게 표지된 기준 DNA와 혼성화하는 단계;
    상기 앰플리콘과 검출가능하게 표지된 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는 제1 신호를 검출하는 단계;
    상기 앰플리콘과 검출가능하게 표지된 기준 DNA의 특이적인 혼성화를 의미하는 제2 신호를 검출하는 단계;
    상기 인코딩 입자들을 식별하여 입자의 인코딩을 상기 제1 신호와 조합하하는 단계;
    상기 인코딩 입자들을 식별하여 입자의 인코딩을 상기 제2 신호와 조합하하는 단계;
    각각의 인코딩 입자 세트에 대한 제1 신호와 제2 신호를 비교하여, 제1 신호와 제2 신호의 차이는 샘플 DNA와 기준 DNA의 차이를 의미하는 것으로 DNA를 분석하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인코딩 입자 세트 각각에 부착된 앰플리콘들은 합하여 전체 주형 DNA 서열을 나타내는 랜덤 핵산 서열을 포함하며, 상기 전체 주형 DNA 서열은 부착된 각각의 앰플리콘 보다 큰 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 전체 주형 DNA 길이는 20 - 300 킬로베이스 길이이며, 각각의 상기 부착된 앰플리콘은 주형 DNA 서열의 일부분과 일치되는 DNA 서열을 포함하며, 그 길이는 500 - 1200 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 검출가능하게 표지된 샘플 DNA는 개별 개체로부터 수득되는 검출가능하게 표지된 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 검출가능하게 표지된 샘플 DNA는 개별 개체로부터 수득되는 검출가능하게 표지된 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 검출가능하게 표지된 샘플 DNA는 인간 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA 샘플의 분석 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
KR1020107014915A 2007-12-05 2008-11-24 게놈 획득 및 소실에 대한 다중 분석법 KR101602305B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US99248907P 2007-12-05 2007-12-05
US60/992,489 2007-12-05
US12/055,919 2008-03-26
US12/055,919 US7932037B2 (en) 2007-12-05 2008-03-26 DNA assays using amplicon probes on encoded particles

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100120641A KR20100120641A (ko) 2010-11-16
KR101602305B1 true KR101602305B1 (ko) 2016-03-10

Family

ID=40722050

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107014915A KR101602305B1 (ko) 2007-12-05 2008-11-24 게놈 획득 및 소실에 대한 다중 분석법

Country Status (11)

Country Link
US (3) US7932037B2 (ko)
EP (3) EP2719775B1 (ko)
KR (1) KR101602305B1 (ko)
CN (1) CN101918596B (ko)
AU (1) AU2008335527B2 (ko)
BR (1) BRPI0819053B1 (ko)
CA (1) CA2707957C (ko)
ES (3) ES2587604T3 (ko)
HK (1) HK1148316A1 (ko)
MX (1) MX2010006061A (ko)
WO (1) WO2009076055A2 (ko)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100009373A1 (en) * 2005-12-23 2010-01-14 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Methods and compositions relating to multiplex genomic gain and loss assays
US9029085B2 (en) 2007-03-07 2015-05-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
WO2009085215A1 (en) 2007-12-21 2009-07-09 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for nucleic acid sequencing
US20110218123A1 (en) 2008-09-19 2011-09-08 President And Fellows Of Harvard College Creation of libraries of droplets and related species
EP2373812B1 (en) 2008-12-19 2016-11-09 President and Fellows of Harvard College Particle-assisted nucleic acid sequencing
RU2609630C2 (ru) * 2009-02-27 2017-02-02 Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. Геномный отбор и секвенирование с помощью кодированных микроносителей
US9056299B2 (en) 2009-03-13 2015-06-16 President And Fellows Of Harvard College Scale-up of flow-focusing microfluidic devices
US20120211084A1 (en) 2009-09-02 2012-08-23 President And Fellows Of Harvard College Multiple emulsions created using jetting and other techniques
AU2010315580B2 (en) 2009-10-27 2014-11-06 President And Fellows Of Harvard College Droplet creation techniques
CN103547362B (zh) 2011-05-23 2016-05-25 哈佛学院院长等 乳液、包括多重乳液的控制
EP2805279A2 (en) 2012-01-20 2014-11-26 Perkinelmer Cellular Technologies Germany GmbH Systems and methods for detection of chromosomal gains and losses
US9708660B2 (en) * 2012-02-19 2017-07-18 Nvigen, Inc. Uses of IDed nanostructures in nucleic acid technology
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9567631B2 (en) 2012-12-14 2017-02-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
CN111748607B (zh) 2012-08-14 2024-04-30 10X基因组学有限公司 微胶囊组合物及方法
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN108753766A (zh) 2013-02-08 2018-11-06 10X基因组学有限公司 多核苷酸条形码生成
WO2014171898A2 (en) 2013-04-17 2014-10-23 Agency For Science, Technology And Research Method for generating extended sequence reads
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
US20160279068A1 (en) 2013-11-08 2016-09-29 President And Fellows Of Harvard College Microparticles, methods for their preparation and use
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
KR102596508B1 (ko) 2014-04-10 2023-10-30 10엑스 제노믹스, 인크. 시약을 캡슐화 및 구획화하기 위한 유체 디바이스, 시스템, 및 방법, 및 이의 응용
AU2015279546B2 (en) 2014-06-26 2021-04-08 10X Genomics, Inc. Processes and systems for nucleic acid sequence assembly
CN106795553B (zh) 2014-06-26 2021-06-04 10X基因组学有限公司 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法
JP2017532042A (ja) 2014-10-29 2017-11-02 １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド 標的化核酸配列決定のための方法及び組成物
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
US10233490B2 (en) 2014-11-21 2019-03-19 Metabiotech Corporation Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations
CN104963000B (zh) * 2014-12-15 2021-04-06 杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司 一种快速构建单细胞dna测序文库的方法和试剂盒
KR102321863B1 (ko) 2015-01-12 2021-11-08 10엑스 제노믹스, 인크. 핵산 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 시스템 및 이를 이용하여 제조한 라이브러리
EP4092681A1 (en) 2015-01-13 2022-11-23 10X Genomics, Inc. Systems and methods for visualizing structural variation and phasing information
MX2017010142A (es) 2015-02-09 2017-12-11 10X Genomics Inc Sistemas y metodos para determinar variacion estructural y ajuste de fases con datos de recuperacion de variantes.
US10697000B2 (en) 2015-02-24 2020-06-30 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
BR112017018054A2 (pt) 2015-02-24 2018-07-24 10X Genomics Inc métodos para a cobertura de sequências de ácidos nucleicos direcionadas
JP2018537414A (ja) 2015-10-13 2018-12-20 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ゲルマイクロスフェアの作製及び使用のためのシステム及び方法
SG11201804086VA (en) 2015-12-04 2018-06-28 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
WO2017138984A1 (en) 2016-02-11 2017-08-17 10X Genomics, Inc. Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN117512066A (zh) 2017-01-30 2024-02-06 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统
EP3625715A4 (en) 2017-05-19 2021-03-17 10X Genomics, Inc. DATA SET ANALYSIS SYSTEMS AND METHODS
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
SG11201901822QA (en) 2017-05-26 2019-03-28 10X Genomics Inc Single cell analysis of transposase accessible chromatin
WO2019046288A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Massachusetts Institute Of Technology MULTIPLEX COMPOSITIONS AND ASSAYS FOR CHARACTERIZING ACTIVE PROTEASE AND THEIR INHIBITORS
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
CN112262218A (zh) 2018-04-06 2021-01-22 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050260665A1 (en) 2004-05-20 2005-11-24 Quest Diagnostics Investments Incorporated Single label comparative hybridization
WO2007022530A2 (en) * 2005-08-16 2007-02-22 The Children's Mercy Hospital Quantification of microsphere suspension hybridization and uses thereof

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4310408A (en) * 1980-02-20 1982-01-12 Mcdonnell Douglas Corporation Electrophoresis chamber
US4499052A (en) * 1982-08-30 1985-02-12 Becton, Dickinson And Company Apparatus for distinguishing multiple subpopulations of cells
SE458968B (sv) 1987-06-16 1989-05-22 Wallac Oy Biospecifikt analysfoerfarande foer flera analyter i vilket ingaar partikelraekning och maerkning med fluorescerande maerksubstanser
US5025545A (en) * 1988-07-21 1991-06-25 Haas Cabinet Co., Inc. Method of attaching and adjusting a cabinet drawer guide assembly
EP0834576B1 (en) 1990-12-06 2002-01-16 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Detection of nucleic acid sequences
US5965362A (en) 1992-03-04 1999-10-12 The Regents Of The University Of California Comparative genomic hybridization (CGH)
US5591908A (en) 1994-01-24 1997-01-07 Amtec Corporation Torque monitor for training bicyclists
US5670314A (en) * 1994-02-22 1997-09-23 Regents Of The University Of California Genetic alterations that correlate with lung carcinomas
US5830645A (en) * 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5635351A (en) * 1995-03-14 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Genetic gain and loss in gliomas
US5926387A (en) * 1995-06-30 1999-07-20 Beckman Instruments, Inc. Ultracentrifuge operation by computer system
US5981180A (en) * 1995-10-11 1999-11-09 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
EP2369007B1 (en) * 1996-05-29 2015-07-29 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US6277563B1 (en) * 1997-01-16 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Genetic alterations associated with cancer
IL131332A (en) * 1997-02-12 2003-07-31 Eugene Y Chan Methods and products for analyzing polymers
US6048695A (en) * 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
US6268147B1 (en) * 1998-11-02 2001-07-31 Kenneth Loren Beattie Nucleic acid analysis using sequence-targeted tandem hybridization
WO2000055368A2 (en) 1999-03-15 2000-09-21 Pe Corporation (Ny) Probe/mobility modifier complexes for multiplex nucleic acid detection
WO2001013120A1 (en) * 1999-08-17 2001-02-22 Luminex Corporation Microparticles with multiple fluorescent signals and methods of using same
AU7875600A (en) * 1999-10-08 2001-04-23 University Of Utah Research Foundation Particle analysis assay for biomolecular quantification
AU2001259586A1 (en) 2000-05-05 2001-11-20 Agilix Corporation Highly multiplexed reporter carrier systems
ATE458832T1 (de) * 2001-11-28 2010-03-15 Bio Rad Laboratories Paralleles scoring von polymorphismen mittels amplifikation und fehlerkorrektur
US6916621B2 (en) * 2002-03-27 2005-07-12 Spectral Genomics, Inc. Methods for array-based comparitive binding assays
JP2005536769A (ja) * 2002-08-20 2005-12-02 シヴェラ コーポレイション 回折格子をベースとする光学同定要素
US7164533B2 (en) * 2003-01-22 2007-01-16 Cyvera Corporation Hybrid random bead/chip based microarray
EP2261868A2 (en) * 2002-08-20 2010-12-15 Cyvera Corporation Diffraction grating-based optical identification element and its applications
US7399643B2 (en) * 2002-09-12 2008-07-15 Cyvera Corporation Method and apparatus for aligning microbeads in order to interrogate the same
US20040126875A1 (en) * 2002-09-12 2004-07-01 Putnam Martin A. Assay stick
WO2004025561A1 (en) * 2002-09-12 2004-03-25 Cyvera Corporation Chemical synthesis using diffraction grating-based encoded optical elements
AU2003278827A1 (en) * 2002-09-12 2004-04-30 Cyvera Corp. Method and apparatus for labelling using diffraction grating-based encoded optical identification elements
WO2004025563A1 (en) * 2002-09-12 2004-03-25 Cyvera Corporation Diffraction grating-based encoded micro-particles for multiplexed experiments
US7092160B2 (en) * 2002-09-12 2006-08-15 Illumina, Inc. Method of manufacturing of diffraction grating-based optical identification element
WO2004031408A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for genotyping thymidylate synthase gene
AU2003901671A0 (en) 2003-04-02 2003-05-01 The University Of Adelaide Comparative genomic hybridization
US7354706B2 (en) * 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
JP2007512811A (ja) * 2003-11-10 2007-05-24 インベスチゲン， インコーポレイテッド 検出のための核酸を調製する方法
US20060177850A1 (en) 2004-12-30 2006-08-10 Mack Schermer Particle-based multiplex assay system with three or more assay reporters
EP1869219A4 (en) 2005-03-31 2010-06-23 Perkinelmer Las Inc MULTIPLEX TEST SYSTEM
US20070264636A1 (en) * 2005-05-02 2007-11-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Capture and random amplification protocol for identification and monitoring of microbial diversity
AU2006331607B2 (en) * 2005-12-23 2012-11-29 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Comparative genomic hybridization on encoded multiplex particles
US20080076909A1 (en) * 2006-06-30 2008-03-27 Applera Corporation Emulsion pcr and amplicon capture
BRPI0721095B1 (pt) * 2006-12-13 2015-09-29 Luminex Corp Sistemas e métodos para a análise multíplex de pcr em tempo real

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050260665A1 (en) 2004-05-20 2005-11-24 Quest Diagnostics Investments Incorporated Single label comparative hybridization
WO2007022530A2 (en) * 2005-08-16 2007-02-22 The Children's Mercy Hospital Quantification of microsphere suspension hybridization and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Newkirk, H.L., et al., HUMAN MUTATION Vol.27(4), pp.376-386 (2006. 3. 15. 온라인 공개)
Tsubosa Y et al., Cancer Genet Cytogenet, VoI 158(2), pp.156-166, (2005. 4. 15.)

Also Published As

Publication number Publication date
MX2010006061A (es) 2011-04-11
AU2008335527A1 (en) 2009-06-18
EP2227564B1 (en) 2014-07-02
CA2707957A1 (en) 2009-06-18
EP3050976A1 (en) 2016-08-03
KR20100120641A (ko) 2010-11-16
AU2008335527B2 (en) 2014-08-14
EP2719775A1 (en) 2014-04-16
EP2227564A4 (en) 2011-01-19
BRPI0819053B1 (pt) 2017-02-07
EP3050976B1 (en) 2018-01-17
WO2009076055A3 (en) 2009-07-30
ES2666167T3 (es) 2018-05-03
US20090148841A1 (en) 2009-06-11
US9127307B2 (en) 2015-09-08
CN101918596A (zh) 2010-12-15
HK1148316A1 (en) 2011-09-02
US20130157899A1 (en) 2013-06-20
CN101918596B (zh) 2015-09-09
US7932037B2 (en) 2011-04-26
ES2587604T3 (es) 2016-10-25
EP2227564A2 (en) 2010-09-15
ES2511029T3 (es) 2014-10-22
CA2707957C (en) 2016-11-08
US8404463B2 (en) 2013-03-26
BRPI0819053A2 (pt) 2015-05-05
EP2719775B1 (en) 2016-04-06
US20110172117A1 (en) 2011-07-14
WO2009076055A2 (en) 2009-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101602305B1 (ko) 게놈 획득 및 소실에 대한 다중 분석법
US20050191636A1 (en) Detection of STRP, such as fragile X syndrome
JP7058502B2 (ja) ゲノム適用および治療適用のための、核酸分子のクローン複製および増幅のためのシステムおよび方法
AU2014279672A1 (en) Improved NGS workflow
WO2015189685A2 (en) Improved ngs workflow
CA2707958C (en) Methods and compositions relating to multiplex genomic gain and loss assays
WO2019005763A1 (en) METHOD FOR REGROUPING DNA SEQUENCES
AU2014203712B2 (en) Multiplexed genomic gain and loss assays
US20100009373A1 (en) Methods and compositions relating to multiplex genomic gain and loss assays

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190222

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200129

Year of fee payment: 5