JP2018537414A - ゲルマイクロスフェアの作製及び使用のためのシステム及び方法 - Google Patents

Abstract

本発明は概して、マイクロ流体小滴、特に、多重エマルジョンのマイクロ流体小滴に関する。ある態様では、ゲル粒子などの粒子は、水性小滴から水性キャリア（又は非水性小滴からの非水性キャリア）の中に調製され得る。例えば、いくつかの実施形態では、キャリア流体中に含まれる第２の流体によって囲まれた、第１の流体のダブルエマルジョン小滴が調製されてもよく、そこで第１の流体はゲルを形成し、第２の流体は除去される。例えば、第２の流体はキャリア流体中に溶解されてもよく、又は第２の流体を硬化して、次に例えばｐＨの変化により除去されてもよい。本発明の他の実施形態は概して、そのようなマイクロ流体小滴を含むキット、そのようなマイクロ流体小滴を作製するためのマイクロ流体デバイス等を対象とする。

Description

（関連出願）
本出願は、Ｗｅｉｔｚらによる「ゲルマイクロスフェアの作製及び使用のためのシステム及び方法」と題する２０１５年１０月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／２４１，０７９号に基づく優先権を主張し、参照によりその全体を本明細書に組み込む。

（政府資金）
本発明は、米国国立科学財団によって付与された許可番号ＮＭＲ−１３１０２６６による政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

（技術分野）
本発明は概して、マイクロ流体小滴(microfluidic droplets)、特に、多重（又は複数の:multiple)エマルジョンマイクロ流体小滴に関する。

ダブルエマルジョン（又は二重乳化:Double emulsions）は、実質的に非混和の第２の流体からなる少なくとも１つのより小さい液滴を含む液滴である。これらのコア−シェル構造の流体は、例えば、カプセルを生成するためのテンプレートとして使用することができる。すなわち、外部の液滴は、カプセルのシェルを最終的に形成する材料を含み、内部の液滴は、カプセル内部のコアを構成する。これらのカプセルは、食品、医薬品、化粧品などの多くの分野で有効成分を輸送するための媒体として使用することができる。しかし、これらのカプセルをうまく適用するには、それらの浸透性（又は透過性:permeability）及び機械的安定性、カプセルシェルの組成及び厚さで調整できるパラメータの良好な制御が必要とされ得る。これは、ダブルエマルジョンの寸法及び組成の制御を含み得る。これらの従来の手法は典型的に、しばしば複数の内部小滴を含んでいるサイズの異なるダブルエマルジョン液滴を生成するため、この制御は、機械的攪拌又は膜乳化によってダブルエマルジョン液滴を生成する場合には達成するのが困難であることが多い。

本発明は概して、マイクロ流体小滴(microfluidic droplets)、特に、多重（又は複数の:multiple)エマルジョンマイクロ流体小滴に関する。本発明の主題は、いくつかのケースでは、相互に関係する製品、特定の問題に対する代替解決策、及び／又は１つ以上のシステム及び／又は物品の複数の異なる使用を含む。

一態様では、本発明は概して方法に関する。一連の実施形態では、前記方法は、キャリア流体中に含まれる第２の流体によって囲まれた、ポリマーを含む第１の流体の小滴を供給する工程と、前記第２の流体を固化させる工程と、前記第１の流体中の前記ポリマーでゲルを形成する工程と、固化した第２の流体を除去する工程であって、それは前記キャリア流体中に前記ゲルの懸濁液を形成し得る、除去する工程と、を含む。

別の一連の実施形態では、本方法は、キャリア流体中に含まれる溶媒とポリマーとを含む小滴を供給する工程と、前記ポリマーでゲルを形成する工程と、前記溶媒を前記ゲルから除去する工程であって、それは前記キャリア流体中に前記ゲルの懸濁液を形成し得る、除去する工程と、を含む。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載する１つ以上の実施形態、例えば、ゲルマイクロスフェアを作製する方法を包含する。さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載する１つ以上の実施形態、例えば、ゲルマイクロスフェアを使用する方法を包含する。

本発明の他の利点及び新規な特徴は、添付の図面と併せて考慮すると、本発明の様々な非限定的な実施形態の、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。本明細書及び参考文献として組み込む文書が、矛盾する及び／又は不一致の開示を含む場合、本明細書を優先するものとする。参照により組み込む２つ以上の文書に、互いに矛盾する及び／又は不一致の開示が含まれている場合、より後の有効日を有する文書を優先するものとする。

本発明の非限定的な実施例は、例として、概略図であり、かつスケールを示す意図はない添付図を参照して記載されるだろう。図では、図示した各々同一又はほぼ同一の構成は、典型的に単一の数字によって表される。明瞭化のため、図で当業者が発明を理解できるようにする必要がない場合、全ての図における全ての構成にラベルを付けず、また本発明の各実施形態の全ての構成を示していない。

図１Ａ−１Ｅは、本発明の一実施形態におけるゲル小滴の生成方法を示す。 図２Ａ−２Ｃは、本発明の別の実施形態によるゲル小滴の生成方法を示す。 図３Ａ−３Ｃは、本発明の別の実施形態におけるゲル小滴の生成方法を示す。

（詳細な説明）
本発明は概して、マイクロ流体小滴、特に、多重エマルジョンマイクロ流体小滴に関する。ある態様では、ゲル粒子などの粒子は、水性小滴から水性キャリア（又は非水性小滴から非水性キャリア）の中に調製することができる。例えば、いくつかの実施形態では、キャリア流体中に含まれる、第２の流体によって囲まれた第１の流体のダブルエマルジョン小滴が調製されてもよく、そこでは第１の流体がゲルを形成し、第２の流体が除去される。例えば、第２の流体をキャリア流体中に溶解させてもよく、又は、例えばｐＨの変化により第２の流体を硬化させてから除去してもよい。本発明の他の実施形態は概して、そのようなマイクロ流体小滴を含むキット、そのようなマイクロ流体小滴を作製するためのマイクロ流体デバイス等を対象とする。

本発明のある態様は、概して、水性キャリア中のゲル粒子などの粒子を作製するためのシステム及び方法を対象とする。ゲル粒子は、例えば、実質的に非混和の油性キャリア中に含まれる水性小滴を重合又はゲル化して粒子を形成したエマルジョンから作製することができるが、そのようなゲル粒子は、典型的に、水性キャリア中で作製されていなかった。

従って、本発明の一態様において、ゲル粒子などの粒子は、水性小滴から水性キャリア中に調製することができる。一連の実施形態では、ダブルエマルジョン小滴を調製してもよい。例えば、図１Ｃにおいて、ダブルエマルジョン液滴は、当業者に周知のように、ダブルエマルジョン小滴を生成するように同軸に配置され得る複数のマイクロ流体のチャネルを使用して調製される。しかし、図１Ｃは、ダブルエマルジョン小滴を生成する技術の単に１つの非限定的な実例であると理解すべきである。すなわち、ダブルエマルジョン液滴を生成するための様々な他の技術も使用することができる。例えば、米国特許第７，７７６，９２７号、又は米国特許第９，０３９，２７３号、国際公開第２００６／０９６５７１号、国際公開第２００８／１２１３４２号、国際公開第２０１０／１０４６０４号、国際公開第２０１１／０２８７６０号、国際公開第２０１１／０２８７６４号、又は国際公開第２０１２／１６２２９６号、米国特許出願公開第２００９／００１２１８７号、米国特許出願公開第２００９／０１３１５４３号、米国特許出願公開第２０１２／０１９９２２６号、米国特許出願公開第２０１２／０２１１０８４号、又は米国特許出願公開第２０１３／００４６０３０号、国際特許第１５／２５９２１号、又は米国特許第６１／９８０，５４１号、又は米国特許第６２／０８３，７２１を参照。その各々が参照により本明細書に組み込まれる。

一連の実施形態では、キャリア（又は第３の）流体に含まれる、外部（又は第２の）流体に囲まれた内部（又は第１の）流体を含む、ダブルエマルジョン小滴を調製することができる。いくつかのケースでは、外部流体は、例えば、少なくともダブルエマルジョン小滴を形成する時間スケールにおいて、内部流体とキャリア流体は実質的に非混和であり得る。内部流体でゲルを形成することができ、さらに、第２の流体を硬化して、例えば内部流体の周りに形成することができる。これらは、任意の順序で、例えば同時に又は連続して行うことができる。ゲルが形成された後、硬化された第２の流体は、その後、何らかの方法で除去され、それによってキャリア流体中にゲルが残る。

例えば、一連の実施形態では、ダブルエマルジョン小滴が調製された後、例えば紫外光又は温度変化を加えることによって、内部流体内のポリマーを重合又はゲル化させることができる。例えば、内部流体は、アガロースゲル（例えば、温度変化を伴って固化することができる）を含んでもよい。例えば、小滴は、高温（例えば、室温より上、約２５℃）で形成され、次いで（例えば、室温又は室温より低い温度に）冷却されてもよい。又は室温で小滴を形成した後、室温より低い温度に冷却等して内部流体に重合又はゲル化を生じさせてもよい。

別の例として、内部流体を化学的に重合又はゲル化させてもよい。例えば、化学反応又は架橋反応を内部流体に誘発し、重合又はゲル化を起こしてもよい。いくつかの実施形態では、重合は、フリーラジカル重合(free-radical polymerization)であり、例えばそれは、熱及び／又は紫外線（ＵＶ）光などの光に、及び／又は光照射でフリーラジカルを（例えば、分子開裂を介して）生成できる光開始剤などの開始剤に反応物を曝露することによって、開始することができる。例として、イルガキュア２５５９、２−ヒドロキシ−４−（３−トリエトキシシリルプロポキシ）−ジフェニルケトン、又はテトラメチルエチレンジアミンを含むが、これらに限定されない。そのようなポリマーの例として、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）又はポリ（エチレングリコール）ジアクリレートを含むが、これらに限定されない。他の種も同様に存在してもよい。

外部流体は、（例えば外部流体とキャリア流体の）化学反応を誘発すること、（例えば、外部流体中の溶媒が、その後周囲のキャリア流体に入って固化するポリマーを残す場合に）沈殿を起こさせること、温度変化等によって、硬化させることができる。例えば、一連の実施形態では、流体小滴内の第１の反応物を、流体小滴を囲む液体内の第２の反応物と反応させて固体を生成することができ、いくつかのケースでは、それによって固体の「シェル」内の流体小滴を被覆することができる。固化反応の非限定的な例は、塩化ジアシル及びジアミンからのナイロン（例えば、ポリアミド）の生成を含む重合反応である。他の例としては、ポリスチレン、ポリカプロラクトン、ポリイソプレン、ポリ乳酸、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリイソプレン（ＰＩＰ）、ポリ乳酸、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリイミド、ポリアミド及び／又はこれらの及び／又は他のポリマーの混合物及び又はコポリマーを含む。

別の例として、外部流体は、酢酸エチル中に含まれるメタクリレート（重合形態、すなわちポリメタクリレートであってもよい）を含んでもよく、その酢酸エチルは、（例えばキャリア流体及び／又は内部流体中）水に可溶であり、固化することができるメタクリレート（又はポリメタクリレート）を残して除去可能である。メタクリレートの非限定的な例として、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、エチルメタクリレート、メチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレートなど（これらのポリマー形態を含む）を含む。さらに別の例として、外部流体はアガロースゲルを含んでもよく、アガロースゲルを固化させて内部小滴の周囲に「シェル」を形成させるように（例えば上述のように）温度を下げてもよい。

これらは任意の順序で起こり得ることを理解すべきである。例えば、内部流体は、外部流体がシェルを形成する前又は後にゲル化されてもよく、又は両方が同時に起きてもよい。

外部流体がシェルに硬化し、内部流体がゲルを形成した後、外部シェル(outer shell)は例えば機械的に、適切な溶媒への暴露、又は他の条件変化（例えば、ｐＨの変化）により除去されてもよい。例えば、外部シェルがポリマーを含む場合、ポリマーは、加水分解で、酵素で、光分解で、機械的に、等で分解可能であり得る。
For example, if the outer shell comprises a polymer, the polymer may be degradable hydrolytically, enzymatically, photolytically, mechanically, etc.
別の例として、ポリマーは、その融点を超える温度でポリマーを加熱することによって液化され得る。例えば、外部シェルはアガロースゲルを含んでもよい。さらに別の例では、メタクリレートは、例えば酸性条件（例えば、ｐＨが７未満、６未満、５未満、４未満、３未満など）までのｐＨ変化で除去することができ、それによってキャリア流体中に含まれるゲルを残す。ｐＨは、例えば適切な酸又は塩基を加えることによって変えることができる。ｐＨは、例えば、少なくとも約２、３、４又はそれ以上のｐＨ単位で変化されてもよい。適切な酸の非限定的な例として、任意の適切な希釈又は濃度で、酢酸、ＨＣｌ、Ｈ_２ＳＯ_４、ＨＮＯ_３などを含む。適切な塩基の非限定的な例として、ＮａＯＨ又はＫＯＨを含む。

従って、固化した第２の流体を除去することによって、キャリア流体中に含まれるゲル粒子の懸濁液を得ることができる。上記のように、一連の実施形態では、ゲル粒子を形成する内部流体は水性であり得るが、キャリア流体は、非水性（例えば、油）の代わりに水性であってもよい（さらに、別の一連の実施形態では、キャリア流体及び内部流体の両方が、各々非水性であってもよく、一方で、外部流体は代わりに水性であってもよい）。

しかし、本発明はダブルエマルジョン小滴だけに限定されないことを理解すべきである。別の一連の実施形態では、キャリア流体内に含まれる単一のエマルジョン小滴から粒子を作ることができ、粒子を形成する流体及びキャリア流体の両方が水性である（又は代わりに、その両方が非水性であってもよい）。例えば、一態様では、第１の相（例えば、油相）の単一エマルジョン小滴をキャリア相（例えば、水性の相又は水の相）の中で生成することができ、その第１の相は、ポリマー又はキャリア相内のゲルを形成させる。いくつかのケースにおいて、第１の相は、周囲のキャリア流体に入ることができる溶媒を含んでもよく、及び／又は溶媒は、その後除去することができ、例えば、その結果としてキャリア流体内に含まれるポリマー粒子又はゲル粒子をもたらす。

第１の流体は、粒子を生成するように固化してもよい。例えば、第１の流体は、例えば上述のように、化学的に重合された又はゲル化された流体でもよい。例えば、重合又はゲル化を引き起こすように、第１の流体中に温度変化、化学反応、又は架橋反応が誘発されでもよい。第１の流体は、例えば、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、又はポリ（エチレングリコールジアクリレート）、イルガキュア２５５９などの開始剤、２−ヒドロキシ−４−（３−トリエトキシシリルプロポキシ）−ジフェニルケトン、又はテトラメチルエチレンジアミン等、本明細書で検討される材料のいずれかを含んでもよい。

いくつかのケースでは、第１の流体は、例えば周囲の流体に曝されたときに除去することができる溶媒を含んでもよい。溶媒は、例えば、粒子の形成に続いて又は同時に除去することができる。いくつかのケースでは、溶媒の除去により、第１の流体中でゲル化又は重合を引き起こして粒子を形成することができる。ある実施形態では、周囲の流体が水性流体である場合、溶媒は、当所分離相（例えば、第１の流体）を形成するように、水中で比較的低い溶解度を有し得るが、その後溶媒は徐々に周囲の流体に溶解する。そのような溶媒の例には、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、１−ブタノール、ジエチルエーテル、酢酸エチル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）などが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかのケースでは、溶媒は、約１ｇ／ｍｌ未満、約０．５ｇ／ｍｌ未満、約０．４ｇ／ｍｌ未満、約０．３ｇ／ｍｌ未満、約０．２ｇ／ｍｌ未満、約０．１ｇ／ｍｌ未満、約０．０５ｇ／ｍｌ未満、約０．０４ｇ／ｍｌ未満、約０．０３ｇ／ｍｌ未満、約０．０２ｇ／ｍｌ未満、約０．０１ｇ／ｍｌ未満、又は約０．００５ｇ／ｍｌ未満の水溶解度(water solubility)を有してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、例えば抽出、溶解又は他の技術を介して、溶媒を少なくとも部分的に除去することができる周囲の流体に、固化した粒子を曝すことによって、溶媒を除去することができる。例えば、周囲のキャリア流体から粒子を回収することができ、固化した粒子から溶媒を少なくとも部分的に除去するように、（例えば、同じ又は異なる組成の）別の流体でそれを置き換えることができる。

ある態様によれば、本明細書に記載のシステム及び方法は、複数の用途で使用することができる。例えば、本明細書に記載の粒子及び複数のエマルジョンが有用であり得る分野には、食品、飲料、健康及び美容補助剤、塗料及びコーティング、化学的分離、農業用途、及び薬及びドラッグデリバリーが含まれるが、これらに限定されない。例えば、特定の条件下でその内容物を放出するように設計された小滴又は粒子の中に、正確な量の流体、薬、医薬品、又は他の種を含むことができる。いくつかの例では、小滴内又は粒子内に細胞を含むことができ、その細胞を、例えば対象内の、例えば標的の媒体に保存する、及び／又は運ぶことができる。小滴内又は粒子内に含むことができ、標的の媒体に運ぶことができる他の種には、例えば、ＳｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＲＮＡ、及びＤＮＡなどの核酸、タンパク質、ペプチド、又は酵素などの生化学種を含む。小滴内又は粒子内に含むことができるさらなる種には、コロイド粒子、磁性粒子、ナノ粒子、量子ドット、香料、タンパク質、指示薬、色素、蛍光種、化学物質などが含まれるが、これらに限定されない。標的の媒体は、例えば、水、生理食塩水、水性媒体、疎水性媒体など、どの適した媒体でも良い。

例えば、一連の実施形態では、粒子の表面内及び／又は表面上に種を含むことができる。いくつかのケースでは、例えば、種は、粒子に結合（例えば、共有結合）されてもよく、及び／又は粒子内に（例えば、物理的に）含まれてもよい。種は、例えば、ＤＮＡ又は上記の他の種のいずれかでもよい。いくつかのケースでは、種は（例えば、粒子の形成の前に）小滴内に存在してもよく、又は粒子の形成中又は形成後に添加されてもよい。例えば、一連の態様では、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）又は他の適切なカップリング反応を使用して、ＤＮＡを粒子に付着させることができる。しかし、他のケースでは、ＤＮＡ（又は他の種）は、粒子内に物理的に含まれていてもよい。

一態様では、本発明は概して、二重（又はそれ以上）の多重エマルジョンを対象とする。一般的には、ダブルエマルジョンにおいて、第１の流体を含む第１の（又は内部の）流体小滴は、連続流体、キャリア流体又は第３の流体内に含まれる第２流体を含む第２の（又は中間の）流体小滴によって囲まれる。典型的には、流体は隣接する流体と実質的に非混和であるが、隣接しない流体は非混和である必要はなく、いくつかのケースでは混和性（又は、さらに同一）でもよい。従って、例えば、第１の流体は、第２の流体とは非混和であり得るが、第３の流体とは混和性又は非混和性でもよい。同様に、第２の流体は、第３の流体と非混和でもよい。しかし、すべての実施形態において、非混和性は必ずしも必要ではないことを理解すべきである。すなわち、いくつかのケースでは、２つの隣接する流体は非混和性ではないが、他の方法で、例えば動力学的に又は短い曝露時間(exposure times)を通じて、分離を保持し得る。

従って、非限定的な例として、ダブルエマルジョン小滴において、第１の流体（最も内部の流体）は水性又は親水性流体（「水」相）でもよく、第２の流体（中間の流体）は、水性液体と実質的に非混和の親油性又は疎水性又は「油」相でもよく、及び第３の（又はキャリアの）流体は、第２の流体と実質的に非混和の水性流体（「水」流体）でもよい。これは、（水／油／水に対して）Ｗ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョン小滴と一般的に呼ばれることがあるが、これは主に便宜上のためであることを理解すべきである。すなわち、例えば、第１の流体は、任意の適切な水性流体とすることができ、純粋な水である必要はない。例えば、水性流体は、水、生理食塩水、水溶液、エタノールなど、又は水中で混和性の他の任意の流体でもよい。対照的に、油は、少なくとも周囲条件(ambient conditions)下で静置されるとき、水中で非混和性であり得る。同様に、Ｏ／Ｗ／Ｏダブルエマルジョン小滴も同様に規定され得る。さらに、これらの原理は、高次の多重エマルジョン小滴に及び得る。さらに、他の配列も可能であることを理解すべきである。例えば、１つの実施形態では、第１の流体、第２の流体、及び第３の流体は、すべて相互に非混和性でもよい。

本明細書中で使用されるように、２つの流体は、エマルジョンが生成される温度及び条件下で、一方が他方の中で少なくとも１０ｗｔ％のレベルまで不溶であるとき、互いに非混和である、又は混和性ではない。例えば、２つの流体は、流体小滴の形成の時間枠内で非混和であるように選択されてもよい。いくつかの実施形態では、２つの流体（例えば、多重エマルジョンのキャリア流体及び内部小滴流体は相溶性又は混和性であるが、外部小滴流体はキャリア流体及び内部液滴流体の一方又は両方と非相溶性又は非混和性である。しかし、他の実施形態では、３つ（又はそれ以上）の流体は全て相互に非混和でもよく、あるケースでは、流体の全ては、必ずしも全て水溶性である必要はない。さらなる他の実施形態では、述べたように、追加の第４、第５、第６等の流体が加えて小滴内のますます複雑な小滴を生成してもよく、例えば、キャリア流体は、第１の流体を囲んでもよく、次にそれは第２の流体を囲んでもよく、次にそれは第３の流体を囲んでもよく、次にそれは第４の流体を囲んでもよい、等である。さらに、流体小滴の各入れ子の(nesting)層の物理的特性は、例えば、各入れ子のレベルの組成にわたる制御によって各々独立して制御されてもよい。

小滴は、いくつかの例では、マイクロ流体の小滴でもよい。例えば、外部小滴は、約１ｍｍ未満、約５００マイクロメートル未満、約２００マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約７５マイクロメートル未満、約５０マイクロメートル未満、約２５マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満、又は約５マイクロメートル未満、又はいくつかのケースでは、約５０マイクロメートル〜約１ｍｍ、約１０マイクロメートル〜約５００マイクロメートル、又は約５０マイクロメートル〜約１００マイクロメートルの直径を有してもよい。しかし、いくつかのケースでは、小滴はより大きくてもよい。例えば、三重又は他の多重エマルジョン小滴の内部液滴（又は中間小滴）は、約１ｍｍ未満、約５００マイクロメートル未満、約２００マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約７５マイクロメートル未満、約５０マイクロメートル未満、約２５マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満、又は約５マイクロメートル未満、又はいくつかのケースでは、約５０マイクロメートル〜約１ｍｍ、約１０マイクロメートル〜約５００マイクロメートル、又は約５０マイクロメートル〜約１００マイクロメートルの直径を有してもよい。

本明細書に記載される粒子（例えば、ゲル粒子）又は小滴は、任意の適切な平均断面直径を有してもよい。当業者は、例えば、レーザー光散乱、顕微鏡検査、又は他の既知の技術を用いて、単一及び／又は複数の粒子又は小滴の平均断面直径を決定することができるであろう。非球状粒子又は小滴中の単一粒子又は小滴の平均断面直径は、非球状粒子又は小滴と同じ体積を有する完全球体の直径である。粒子又は小滴（及び／又は複数の又は一連の粒子又は小滴）の平均断面直径は、例えば、約１ｍｍ未満、約５００マイクロメートル未満、約２００マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約７５マイクロメートル未満、約５０マイクロメートル未満、約２５マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満、又は約５マイクロメートル未満、又はいくつかのケースでは、約５０マイクロメートル〜約１ｍｍ、約１０マイクロメートル〜約５００マイクロメートル、又は約５０マイクロメートル〜約１００マイクロメートルでもよい。また、平均断面直径は、あるケースでは、少なくとも約１マイクロメートル、少なくとも約２マイクロメートル、少なくとも約３マイクロメートル、少なくとも約５マイクロメートル、少なくとも約１０マイクロメートル、少なくとも約１５マイクロメートル、又は少なくとも約２０マイクロメートルでもよい。いくつかの実施形態では、複数の粒子又は小滴内の粒子又は小滴の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％は、本段落で概説した範囲のいずれか以内の平均断面直径を有する。

ある実施形態では、複数の粒子（例えば、ゲル粒子）又は小滴は、比較的均一な断面直径を有してもよい。比較的均一な断面直径を有する粒子又は小滴の使用により、それが粒子及び／又は小滴からの流体及び／又は種の粘度、標的に運ばれる種の量、運搬の他のパラメータを制御することが可能になり得る。いくつかの実施形態では、粒子又は粒子の小滴は単分散であるか、または、複数の粒子又は小滴は、全体平均直径を有し、及び粒子又は小滴の約５％以下、約２％以下、又は約１％以下が、複数の粒子又は小滴の全体平均直径の約９０％未満（又は約９５％未満、又は約９９％未満）及び／又は約１１０％超（又は約１０５％超、又は約１０１％超）の直径を有するような直径分布を有する。

いくつかの実施形態では、複数の粒子又は小滴は、全体平均直径を有し、粒子又は小滴の断面直径の変動係数が約１０％未満、約５％未満、約２％未満、約１％〜約１０％、約１％〜約５％、又は約１％〜約２％であるような直径分布を有する。変動係数は、当業者によって決定することができ、以下のように規定することができる。

σは標準偏差であり、μは平均値である。

本発明のある態様では、検討したように、例えば図１Ｃに示すように、流体を１つ以上のチャネルに流すことによって多重エマルジョンが形成される。システムは、マイクロ流体システムでもよい。本明細書で使用される「マイクロ流体」は、約１ミリメートル（ｍｍ）未満の断面寸法を有する少なくとも１つの流体のチャネルを含むデバイス、装置、又はシステムを指し、いくつかのケースでは、長さ対最大断面寸法の比が少なくとも３：１である。システムの１つ以上のチャネルは、キャピラリーチューブで もよい。いくつかのケースでは、複数のチャネルが提供され、いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるように、少なくともいくつかが入れ子式にされる（又はネストされる:nested）。チャネルは、マイクロ流体のサイズの範囲内にあってもよく、例えば、約１ミリメートル未満、約３００マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約３０マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満、約３マイクロメートル未満、又は約１マイクロメートル未満の平均内径又は内径を有する部分を有してもよく、それにより同等の平均直径を有する小滴を与える。１つ以上のチャネルは、断面において、同じ点における幅と実質的に同じ高さを有してもよい（ただし、必ずしもそうである必要はない）。断面において、チャネルは、矩形、又は円形又は楕円形などの実質的に非矩形でもよい。

本明細書で使用されるように、「流体」という用語は、一般的に、流動し、その容器の輪郭に適合する傾向がある物質、すなわち液体、気体、粘弾性流体などを指す。１つの実施形態では、流体は液体である。典型的には、流体は静的せん断応力(static shear stress)に耐えられない材料であり、せん断応力が加えられるとき、流体は継続的且つ永久的な歪みを受ける。流体は、流動を可能にする任意の適切な粘度を有してもよい。２つ以上の流体が存在する場合、各流体は、流体間の関係を考慮することによって、当業者によって本質的に任意の流体（液体、気体など）の中から独立して選択され得る。

本発明のある態様に係る様々な材料及び方法を使用して、本明細書に記載されるような物品又は構成、例えばマイクロ流体のチャネル、チャンバーなどのチャネルを形成することができる。例えば、様々な物品又は構成を固体材料から形成することができ、そのうちチャネルは、微細加工、スピンコート及び化学蒸着などの膜堆積処理、レーザー加工、フォトリソグラフィ技術、湿式化学処理又はプラズマ処理を含むエッチング方法、３Ｄプリンターなどを介して形成することができる。例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４８：４４−５５，１９８３（Ａｎｇｅｌｌら）を参照。

一連の実施形態では、本明細書に記載される物品の様々な構造又は構成は、ガラス又はポリマー、例えばポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」、ポリテトラフルオロエチレン（「ＰＴＦＥ」又はテフロン（登録商標））、エポキシ、ノーランド光学接着剤などのエラストマーポリマーから形成され得る。例えば、一実施形態によれば、マイクロ流体のチャネルは、ガラス管又はキャピラリーから形成されてもよい。さらに、いくつかのケースでは、マイクロ流体のチャネルは、ＰＤＭＳ又は他のソフトリソグラフィ技術を使用して別個に流体システムを加工することによって実施されてもよい（この実施形態に適したソフトリソグラフィ技術の詳細は、Ｙｏｕｎａｎ ｘｉａ及びＧｅｏｒｇｅ Ｍ． Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ著、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、２８巻、１５３−１８４頁で公開された「ソフトリソグラフィ」、及びＧｅｏｒｇｅ Ｍ． Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、Ｅｍａｎｕｅｌｅ Ｏｓｔｕｎｉ、Ｓｈｕｉｃｈｉ Ｔａｋａｙａｍａ、Ｘｉｎｇｙｕ Ｊｉａｎｇ及びＤｏｎａｌｄ Ｅ． Ｉｎｇｂｅｒ著、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００１年、３巻、３３５−３７３頁で公開された「生物学及び生化学におけるソフトリソグラフィ」の参考文献で検討されており、これらの参考文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の物品の様々な構造又は構成は、金属、例えばステンレス鋼から形成することができる。

潜在的に適切なポリマーの他の例には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化ポリマー、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン、ポリビニリデンクロライド、ビスベンゾシクロブテン（「ＢＣＢ」）、ポリイミド、ポリイミドのフッ素化誘導体などを含むが、これらに限定されない。また、上記のものを含むポリマーを含む組み合わせ、コポリマー又は混合物も想定される。またデバイスは、複合材料、例えば、ポリマーと半導体材料との複合物から形成されてもよい。

いくつかの実施形態では、物品の様々な構造又は構成は、ポリマーの及び／又はフレキシブルの及び／又はエラストマーの材料から加工され、成形（例えば、レプリカ成形、射出成形、キャスト成形など）を介した加工を容易にする、硬化性流体から便宜的に形成することができる。硬化性流体は、固化が誘発されて、又は自発的に凝固して流体ネットワークの中で及び流体ネットワークと共に使用することが企図される流体を含有する及び／又は輸送することができる固体になり得る、本質的に任意の流体であり得る。一実施形態では、硬化性流体は、ポリマー液体又は液体ポリマー前駆体（すなわち、「プレポリマー」）を含む。適切なポリマー液体には、例えば、それらの融点以上に加熱した熱可塑性ポリマー、熱硬化性ポリマー、ワックス、又はそれらの混合物又は複合物が含まれ得る。別の例として、適切なポリマー液体には、適切な溶媒中の１つ以上のポリマーの溶液を含んでもよく、その溶液は、溶媒の除去時に、例えば蒸発によって固体ポリマー材料を形成する。そのようなポリマー材料は、例えば溶融状態から又は溶媒蒸発によって固化することができ、当業者には周知である。型又は元型(mold masters)の一方又は両方がエラストマー材料で構成されている実施形態では、その多くがエラストマーである様々なポリマー材料が適しており、型又は元型を形成するのにも適している。そのようなポリマーの例の非限定的なリストには、シリコーンポリマー、エポキシポリマー及びアクリレートポリマーの一般的なクラスのポリマーが含まれる。エポキシポリマーは、一般にエポキシ基、１，２−エポキシド又はオキシランと呼ばれる３員環状エーテル基の存在を特徴とする。例えば、芳香族アミン、トリアジン及び脂環式骨格に基づく化合物に加えて、ビスフェノールＡジグリシジルエーテルを使用することができる。別の例は、周知のノボラックポリマーを含む。本発明に係る使用に適したシリコーンエラストマーの非限定的な例には、メチルクロロシラン、エチルクロロシラン、フェニルクロロシラン、ドデシルトリクロロシランなどのクロロシランを含む前駆体から形成されるものが含まれる。

ある実施形態では、シリコーンポリマー、例えばシリコーンエラストマーのポリジメチルシロキサンが使用される。 ＰＤＭＳポリマーの非限定的な例には、ミシガン州ミッドランドのダウ・ケミカル社により商標Ｓｙｌｇａｒｄで販売されているもの、特にＳｙｌｇａｒｄ １８２、Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、及びＳｙｌｇａｒｄ １８６が含まれる。ＰＤＭＳを含むシリコーンポリマーは、本発明の様々な構造の加工を単純化する様々な有益な特性を有する。例えば、そのような材料は安価であり、容易に入手可能であり、熱硬化を介してプレポリマー液体から固化することができる。例えば、ＰＤＭＳは、例えば約１時間、約３時間、約１２時間などの暴露時間の間、例えば約６５℃〜約７５℃の温度にプレポリマー液体を暴露することによって典型的に硬化可能である。又、ＰＤＭＳなどのシリコーンポリマーは、エラストマーでもよく、したがって、本発明のある実施形態において必要な、比較的高いアスペクト比を有する非常に小さい特徴を形成するのに有用であり得る。この点に関して、フレキシブルな（例えばエラストマーの）型又は元型が有利であり得る。

ＰＤＭＳなどのシリコーンポリマーからマイクロ流体の構造又はチャネルなどの構造体を形成する１つの利点は、例えばエアプラズマなどの酸素含有プラズマに曝すことによって、そのようなポリマーを酸化させる能力であり、その酸化された構造は、それらの表面に、他の酸化シリコーンポリマー表面又は様々な他のポリマー及び非ポリマー材料の酸化表面と架橋することができる化学基を含む。従って、別の接着剤又は他のシール手段を必要とすることなく、構造体を加工することができ、それから酸化することができ、他のシリコーンポリマー表面又は酸化シリコーンポリマー表面と反応する他の基板表面に、本質的に不可逆的にシールすることができる。ほとんどのケースでは、補助圧力を加えてシールを形成する必要なしに、酸化されたシリコーン表面を別の表面に単に接触させることにより、シールを完成することができる。すなわち、予め酸化されたシリコーン表面は、適切な接着面に対してコンタクト接着剤として機能する。具体的には、酸化されたＰＤＭＳなどの酸化されたシリコーンは、それ自体以外の、（例えば、酸素含有プラズマへの曝露を介して）ＰＤＭＳ表面と同様に酸化された、例えばガラス、シリコン、酸化ケイ素、石英、窒化ケイ素、ポリエチレン、ポリスチレン、ガラス状炭素及びエポキシポリマーを含む様々な酸化された材料と不可逆的にシールすることもできる。本発明の背景で有用な酸化及びシール方法、ならびに全体的な成形技術は、当技術分野、例えば、参照により本明細書に組み込まれている「マイクロ流体システム及びポリジメチルシロキサンのラピッドプロトタイピング」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７０：４７４−４８０，１９９８（Ｄｕｆｆｙら）と題する論文に記載されている。

異なる構成部分は、異なる材料から加工され得る。例えば、底壁及び側壁を含むベース部分は、シリコン又はＰＤＭＳなどの不透明な材料から加工することができ、上部は、流体プロセスの観察及び／又は制御のために、ガラス又は透明ポリマーなどの透明な又は少なくとも部分的に透明な材料から加工することができる。構成部分は、ベース支持材料が正確な所望の機能性を有さない内部チャネル壁に接触する流体に所望の化学的機能性を曝すために、被覆され得る。構成部品は、例えば本明細書で検討されるように、別の材料で被覆された内部チャネル壁とともに、説明されるように加工することができる。本発明のシステム及びデバイスの様々な構成を加工するために使用される材料、例えば流体のチャネルの内壁を被覆するために使用される材料は、望ましくは、悪影響を及ぼさない又は流体システムを通して流れる流体により悪影響を及ぼされないだろうそれらの材料、例えば、デバイス内で使用される流体の存在下で化学的に不活性である材料の中から選択され得る。そのようなコーティングの非限定的な例を以下に開示し、追加の例はＷｅｉｔｚらにより２００９年２月１１日に出願され、２００９年１０月１日にＷＯ２００９／１２０２５４として公開された「制御された濡れ特性を有する、マイクロ流体のチャネルを含む表面」と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００８５０号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本発明のあるマイクロ流体構造（又は内部の、流体接触表面）は、ある酸化シリコーンポリマーから形成され得る。そのような表面は、エラストマーポリマーの表面より親水性であってもよい。したがって、そのような親水性表面は、より容易に水溶液で満たされ湿潤され得る。

いくつかの実施形態では、本発明のマイクロ流体デバイスの底部壁は、１つ以上の側壁又は上部壁又は他の構成部品と異なる材料で形成される。例えば、いくつかの実施形態では、底壁の内面は、シリコンウェハ又はマイクロチップ又は他の基板の、表面を含む。他の構成は、上述のように、そのような代替可能な基板にシールされてもよい。異なる材料の基材（底壁）にシリコーンポリマー（例えばＰＤＭＳ）を含む組成物をシールすることが望ましい場合、基板は、酸化シリコーンポリマーが不可逆的にシールすることができる材料の群（例えば、ガラス、シリコン、酸化ケイ素、石英、窒化ケイ素、ポリエチレン、ポリスチレン、エポキシポリマー、及びガラス状炭素、の酸化された表面）から選択されてもよい。あるいは、当業者にとって明らかなように、以下に限定されないが、別の接着剤、結合、溶剤接着、超音波溶接の使用などを含む他のシール技術が使用されてもよい。

従って、ある実施形態では、物品の設計及び／又は加工は、例えば、比較的周知のソフトリソグラフィ及び本明細書に記載されているものなどの他の技術を使用することによって、比較的単純であり得る。さらに、いくつかの実施形態では、物品の迅速な及び／又はカスタマイズされた設計は、例えば幾何学の観点で可能である。一連の実施形態では、例えば、物品が放射性、毒性(toxic)、有毒性(poisonous)、反応性、生体有害性などの物質と共に使用される実施形態、及び／又は物質のプロファイル（例えば、毒物学的プロファイル、放射能プロファイルなど）が不明である実施形態において、物品は使い捨てであるように製造されてもよい。酸化シリコーンポリマーからチャネル又は他の構造（又は内部の、流体接触表面）を形成する別の利点は、（親水性の内部表面が望まれる）これらの表面が典型的なエラストマーポリマーの表面よりはるかに親水性であり得ることである。従って、そのような親水性のチャネル表面は、典型的な酸化されていないエラストマーポリマー又は他の疎水性材料からなる構造がされ得るよりも、より容易に水溶液で満たされ及び湿潤され得る。

一連の実施形態では、デバイス内の１つ以上のチャネルは、例えば、固有に、及び／又はその表面又はチャネル壁の１つ以上を処理して、より疎水性又は親水性をそれらに付与することによって、比較的疎水性又は比較的親水性であり得る。一般的に、デバイス中に形成された小滴である流体は、少なくとも小滴を形成する時間スケールでは実質的に非混和性であり、流体は異なる程度の疎水性又は親水性を有することがあるだろう。従って、例えば、第１の流体は第２の流体と比較してより親水性（又はより疎水性）でもよく、第１及び第２の流体は実質的に非混和でもよい。従って、第１の流体は、例えば第１の流体と第２の流体とが実質的に混合することなしに（それにもかかわらずある程度の混合はいくつかの条件下で生じ得るが）第２流体内の不連続な小滴を形成することができる。同様に、第２の流体は、第３の流体（第１の流体と同じ又は異なってもよい）に対してより親水性（又はより疎水性）でもよく、第２及び第３の流体は実質的に非混和でもよい。

従って、いくつかのケースでは、チャネルの表面は、チャネル内に含まれる流体に依存して、比較的疎水性又は親水性でもよい。一連の実施形態では、チャネルの表面は、デバイス内の他の表面と比較して疎水性又は親水性である。さらに、いくつかの実施形態では、比較的疎水性の表面は約９０°より大きい水接触角を示すことができ、及び／又は比較的親水性の表面は約９０°より小さい水接触角を示すことができる。

いくつかのケースでは、比較的疎水性及び／又は親水性の表面は、例えば、特定の順序におけるチャネル内の複数の流体の入れ子を維持するように、チャネル内の流体の流れを容易にするのに使用され得る。そのような被覆及び他のシステムの追加の詳細は、Ａｂａｔｅらにより２００８年３月２８日に出願された「制御された濡れ特性を有するマイクロ流体のチャネルを含む表面」と題する米国仮特許出願第６１／０４０，４４２号、Ａｂａｔｅらにより２００９年２月１１日に出願された「制御された濡れ特性を有するマイクロ流体のチャネルを含む表面」と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００８５０号を参照することができ、各々は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明のある態様は、概して、本明細書で検討されるものなどのデバイスをスケールアップ又は「ナンバリングアップ（又は数を増やす: numbering up）」するための技術を対象とする。例えば、いくつかのケースでは、比較的多数のデバイスが平行して使用されてもよく、例えば、少なくとも約１０個のデバイス、少なくとも約３０個のデバイス、少なくとも約５０個のデバイス、少なくとも約７５個のデバイス、少なくとも約１００個のデバイス、少なくとも約２００個のデバイス、少なくとも約３００個のデバイス、少なくとも約５００個のデバイス、少なくとも約７５０個のデバイス、又は少なくとも約１，０００個又はそれ以上のデバイスを並行して操作されてもよい。いくつかのケースでは、そのようなデバイスのアレイは、デバイスを水平方向及び／又は垂直方向に積み重ねることによって形成されてもよい。デバイスは、共通に制御されてもよく、別々に制御されてもよく、用途に依存して、様々な流体の共通の又は別個の供給源を備えることができる。

当業者であれば、本明細書で検討されるものなどのデバイス又は物品のスケールアップ又はナンバリングアップに有用な他の技術を知っているであろう。例えば、いくつかの実施形態では、流体分配器を使用して、流体を１つ以上の入力から複数の出力に、例えば１つ以上のデバイスに分配することができる。例えば、複数の物品を３次元に接続することができる。いくつかのケースでは、並列デバイス内の圧力変動を実質的に低減することを可能にするチャネル寸法が選択される。適切な技術の他の例には、これに限定されないが、Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｙらにより２０１０年３月１２日に出願され、２０１０年１１月１６日にＷＯ２０１０／１０４５９７として公開された「マイクロデバイスのスケールアップ」と題する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０００７５３号に開示されているものが含まれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

以下の文献は全ての目的のためにその全体を参照により本明細書に組み込む；２０１４年４月１６日に出願された「比較的薄いシェルを有する小滴エマルジョンを生成するためのシステム及び方法」と題する米国仮特許出願第６１／９８０，５４１号；Ｌｉｎｋらにより２００４年４月９日に出願された「流体種の形成および制御」と題する国際公開公報ＷＯ２００４／０９１７６３号；Ｓｔｏｎｅらにより２００３年６月３日に出願された「流体分散のための方法及び装置」と題する国際公開公報ＷＯ２００４／００２２６７号；Ｗｅｉｔｚらにより２００６年３月３日に出願された「多重エマルジョンを形成するための方法および装置」と題する国際公開公報ＷＯ２００６／０９６５７１号；Ｌｉｎｋらにより２００４年８月２７日に出願された「流体種の電子制御」と題する国際公開公報ＷＯ２００５／０２１１５１号；Ｃｈｕらにより２００８年３月２８日に出願された「形成のためのエマルジョン及び技術」と題する国際公開公報ＷＯ２００８／１２１３４２号；Ｗｅｉｔｚらにより２０１０年３月１２日に出願された「多重エマルジョンを含むエマルジョンの制御された作製方法」と題する国際公開公報ＷＯ２０１０／１０４６０４号；Ｗｅｉｔｚらにより２０１０年９月１日に出願された「接合を用いた多重エマルジョン」と題する国際公開公報ＷＯ２０１１／０２８７６０号；Ｗｅｉｔｚらにより２０１０年９月１日に出願された「噴射及び他の技術を用いて作製された多重エマルジョン」と題する国際公開公報ＷＯ２０１１／０２８７６４号；Ｓｈｕｍらにより２００９年６月４日に出願された「小滴に関連するポリマーソーム、リン脂質、及び他の種」と題する国際公開公報ＷＯ２００９／１４８５９８号；Ｓｈｕｍらにより２０１１年３月１６日に出願された「溶融乳化(Melt Emulsification)」と題する国際公開公報ＷＯ２０１１／１１６１５４号；Ｓｈｕｍらにより２００９年６月４日に出願された「流体小滴と関連するポリマーソーム、コロイドソーム、リポソーム、及び他の種」と題する国際公開公報ＷＯ２００９／１４８５９８号；Ｒｏｔｅｍらにより２０１２年５月２２日に出願された「多重エマルジョンを含むエマルジョンの制御」と題する国際公開公報ＷＯ２０１２／１６２２９６号；Ｋｉｍらにより２０１２年７月５日に出願された「多重エマルジョン及び多重エマルジョンの形成のための技術」と題する国際公開公報第ＷＯ２０１３／００６６６１号；及びＷｅｉｔｚらにより２０１２年８月１５日出願された「シェルカプセル化のためのシステム及び方法」と題する国際公開公報ＷＯ２０１３／０３２７０９号。

さらに、Ｗｅｉｔｚらにより２０１５年１０月１３日に出願された「ゲルマイクロスフェアの作製及び使用のためのシステム及び方法」と題する米国仮特許出願第６２／２４１，０７９号は、その全体を参照により本明細書に組み込む。

以下の実施例は、本発明のある実施形態を示すことを意図しているが、本発明の全範囲を例示するものではない。

本実施例は、ダブルエマルジョンをテンプレートとして使用して単分散ハイドロゲルマイクロスフェアを作製するためのマイクロ流体の手法を示す。重合可能な前駆体を、内相に加え、ダブルエマルジョン液滴の生成後に架橋する。使用する前駆体に依存して、外部相から内部相を一時的に分離するのに、異なる種類の中間相を使用してもよい。一例では、中間相は有機溶媒中のポリマー溶液である。ダブルエマルジョン液滴の形成後、溶媒を沈殿させて薄いポリマーシェルを形成するポリマーを有する水中に速やかに拡散させ、次いでポリマーシェルを、溶液のｐＨを調整することによって形成する。別の例では、油シェルを有するダブルエマルジョン液滴を調製し、次いで油を遠心分離によって除去する。これらの方法により、マイクロゲルを簡便に且つ効率的に得ることができる。実施例は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）及びポリアクリルアミド（ＰＡＭ）マイクロゲルの製造で続く。

ダブルエマルジョンからのポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）マイクロゲルはカプセルをテンプレートとした。単分散ＰＥＧＤＡマイクロゲルを製造するために、図１Ａに示すようなガラスキャピラリーベースのマイクロ流体デバイスを使用して、非常に薄い油層で水中−油中−水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）のダブルエマルジョン液滴を生成する。デバイスは、四角のキャピラリー中に同軸に組み立てられた２つの先細で(tapered)円形のキャピラリーを有する。別の細いキャピラリーを、内部相の入口として小オリフィスの先細キャピラリーに入れる（図１Ａ）。中間相は、小オリフィスの先細キャピラリーと細いキャピラリーとの間の隙間から注入される。外部相は、小オリフィスの先細キャピラリーと四角のキャピラリーとの間の隙間から注入される。内部相は細いキャピラリーの先端でまず液体スラグに分かれる。次に、各液体スラグは、先細のキャピラリーの接合部で中間相シェルとともに多くの単分散液滴に分かれる。内部相は、２０ｗｔ％のＰＥＧＤＡ（Ｍｗ約７００、シグマアルドリッチ社）の水溶液、２ｗｔ％のＰＶＡ（ポリビニルアルコール、Ｍｗ約１３，０００〜２３，０００、８７〜８９％ケン化(hydrolyzed)、シグマアルドリッチ社）、光開始剤として０．２ｗｔ％のＩｒｇａｃｕｒｅ ２９５９、可視化を容易にするために、少量のＦＩＴＣ−デキストラン（Ｍｗ約１０ｋ、シグマアルドリッチ社）を有するものとした。中間相は、酢酸エチルに溶解した１０ｗｔ％のＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＥＰＯとした。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＥＰＯは、ｐＨ５までの酸性溶液に可溶なカチオン性コポリマーである。外部相は、１０ｗｔ％のＰＶＡ溶液とした。ｐＨ１１のＢＤＨ（登録商標）緩衝液を添加することにより、内部相及び外部相のｐＨを７〜７．３に調整した。

図１Ａは、薄いシェルのマイクロゲルカプセルのマイクロ流体生成のためのスキームを示す。図１Ｂは、ｐＨ応答性のポリマーシェルを有するマイクロゲルの共焦点顕微鏡画像を示す。図１Ｃは、酸を添加することによってポリマーシェルを除去した後の清浄なマイクロゲルの共焦点顕微鏡画像を示す。図１Ｄは、押しつぶされた後にマイクロゲルが小片に粉砕され得ることを示す。

ダブルエマルジョン液滴を生成した後、酢酸エチルを速やかに水中に拡散させ、ＥＰＯを沈殿させて固体シェルを形成した。その間、コア中のＰＥＧＤＡを重合させるようにＵＶ光をチップ上に照射した。得られたコア−シェルカプセルをｐＨ７〜７．３の２ｗｔ％ＰＶＡ溶液中に収集した。 ＥＰＯシェルは、図１Ｂに示すように、重合中のＰＥＧＤＡの体積収縮によるしわを示すようであった。シェルの厚さ及びカプセルのサイズに依存して、シェルは、図１Ｅに示すように、いくつかの条件下で割れる可能性もある。

ＥＰＯシェルを除去するために、追加のｐＨ４の希釈酢酸をゲル懸濁液に加えた。図１Ｃに示すように、次にＥＰＯを酸性溶液により溶解し、結果としてＰＥＧＤＡマイクロゲルを得た。マイクロゲルは２枚のガラススライドの間で押しつぶされたとき、ゲルは蛍光色素を失うことなく多くの小片に粉砕され、ＰＥＧＤＡが完全に重合したことを示した（図１Ｄ）。

本実施例は、標準のダブルエマルジョンからポリアクリルアミドマイクロゲルを製造するための手法を示す。単分散のダブルエマルジョンを、図２Ａのようなガラスキャピラリーベースのマイクロ流体デバイスを用いて生成した。内部相は、２０ｗｔ％のアクリルアミド、０．２ｗｔ％のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、及び蛍光マイクロスフェア（０．１マイクロメートル、緑色）を有する０．２ｗｔ％のＩｒｇａｃｕｒｅ２９５９、の水溶液とした。中間相は、１ｗｔ％のクライトックス−ＰＥＯ界面活性剤を有するＨＦＥ７５００オイルとした。外部相は１０ｗｔ％のＰＶＡ溶液とした。バイアル中にそれらを収集する前に、チップ上のダブルエマルジョン液滴にＵＶ光を照射した。図２Ｂに示すように、ダブルエマルジョン液滴及び単一エマルジョンＨＦＥ液滴を、いくつかのケースでは、マイクロ流体のチャネル内に交互に生成し、ダブルエマルジョン液滴及び単一エマルジョン液滴の混合物を生じた。

マイクロゲルからＨＦＥオイルを除去するために、サンプルを１０００ｒｐｍの速度で遠心分離した。遠心分離後、ＨＦＥオイル液滴が底に沈降した。ポリアクリルアミドマイクロゲルはＨＦＥ液滴の上に留まり、上層は連続水相であった。マイクロゲルをピペットを用いて分離した。得られたマイクロゲルを図２Ｃに示す。ガラススライドを用いてマイクロゲルを押しつぶしたとき、ゲルは蛍光を全く失うことなしに、いくつかの小片に粉砕され、アクリルアミドの完全な重合を示した。

図２Ａは、ゲル−オイルダブルエマルジョンのマイクロ流体生成のスキームを示す。図２Ｂは、オイルシェルを有するポリアクリルアミドマイクロゲルの共焦点顕微鏡画像である。図２Ｃは、オイルシェルを除去した後の清浄なポリアクリルアミドマイクロゲルの共焦点顕微鏡画像である。

本実施例は、単一エマルジョンから調製されたＰＥＧＤＡハイドロゲルマイクロスフェアを示す。マイクロハイドロゲルを製造するために、ガラスキャピラリー装置を使用した。１：１の体積比を有するジクロロメタン（ＤＣＭ）中の異なる分子量（２５０、５７５、及び７００）を有するポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を内部相の液体として選択し、１０％ＰＶＡ水溶液を外部相の液体として選択した。内部相及び外部相の流量を、それぞれ１０００マイクロリットル／ｈ及び３５００マイクロリットル/ｈとした。図３Ａに示すように、水中−油型単一エマルジョン液滴が着実に生成され、次に安定な単分散球形液滴を得るように、コア中のＰＥＧＤＡを架橋させるのにＵＶ光を用いた。

液滴を、エタノール／水（ｖ／ｖ：１／１）で３回洗浄して内部のＤＣＭを除去し、次に純水に浸漬した。上澄を新鮮な純水で３回交換した。最後に、下図に示すように、ＰＥＧマイクロハイドロゲル液滴を純粋な脱イオン水中に懸濁し、共焦点顕微鏡を用いて特徴付けた。図３Ｂは初期状態を示し、図３Ｃは乾燥状態の光学像を示す。

本実施例は、Ｏ／Ｗ単一エマルジョンからのＤＮＡ含有ポリ（エチレングリコール）マイクロハイドロゲルの調製を示す。

ガラスキャピラリーのマイクロ流体デバイスの製造について。本実施例で使用する全てのマイクロハイドロゲルビーズを、ガラスキャピラリーのマイクロ流体装置を用いて調製した。デバイスを、四角のガラス管と２つの円筒形ガラス管とを用いて、ガラススライド上に組み上げた。簡単に述べると、２つの円筒状キャピラリーを、先細の先端を得るようにＦｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎ型マイクロピペットプラー（Ｍｏｄｅｌ Ｐ−９７、サッター社、米国）で引っ張り、次にそれらの先端を、それぞれ２０及び１４０マイクロメートルの最終直径になるように研磨した。小さな先端を有する先細キャピラリーを、次に第２の四角のキャピラリーに挿入し、注入キャピラリーとして使用した。大きい先端を有する別の先細キャピラリーを、注入先端近くの流れを制限するように反対側の四角のキャピラリーに挿入し、収集キャピラリーとして使用した。ＤＮＡ含有ＰＥＧマイクロハイドロゲルの調製の概略図を示す図４に示しているように、両方のキャピラリーを四角のキャピラリー内で同軸に整列した。

ＰＥＧマイクロハイドロゲルビーズの調製について。 ＰＥＧマイクロハイドロゲルビーズを、マイクロ流体デバイスを使用してＯ／Ｗ単一エマルジョン小滴から生成し、続いてＵＶ照射によりＰＥＧアクリレートモノマーを重合させた。油相は、分子量４８０を有するポリ（エチレングリコール）メチルエーテルアクリレート２０％、架橋剤として分子量５７５を有するポリ（エチレングリコール）ジアクリレート５％、及びハイドロゲルビーズ中にカルボキシル基を導入するためのアクリル酸２．５％、とした。溶媒はジクロロメタン（ＤＣＭ）とした。２，２−ジエトキシアセトフェノンを、４％の濃度で光開始剤として油相に添加した。水相は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）１０％水溶液とした。 油相及び水相の両方を、ハーバードポンプ（ハーバード・アパラタス社、ホリストン、米国）を用いてシリンジでガラスキャピラリーのデバイスにポンプで注入した。油相を、１２０マイクロリットル／ｈの流量で注入キャピラリーに注入し、水相を四角のキャピラリーの端部を通して注入し、３０００マイクロリットル／ｈの流量で連続相として使用した。Ｏ／Ｗ単一エマルジョン液滴を収集キャピラリー中に形成した。形成済の液滴を、３％ＰＶＡ溶液を有するガラス瓶に収集し、続いてＵＶ照射により架橋ＰＥＧハイドロゲルネットワークを生成した。調製済のマイクロハイドロゲルビーズを、水及びエタノールで数回洗浄して、マイクロハイドロゲル中のＤＣＭを除去した。最後に、マイクロハイドロゲルビーズをさらなる使用のために１％Ｔｗｅｅｎ ２０を有するＭＥＳ緩衝液中に懸濁した。

ＰＥＧマイクロハイドロゲルにＤＮＡを結合させるように、ＥＤＣカップリング法を用いた。２ｍＭのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）及び５ｍＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を１ｍｌのマイクロヒドロゲルビーズ懸濁液に添加した。１０分間ボルテックスにかけた(placed on vortex)後、５０マイクロリットルの１ｍＭ ＮＨ２−ＤＮＡを懸濁液に添加した。室温で一晩反応後、マイクロハイドロゲルビーズを、１％Ｔｗｅｅｎ ２０溶液で３回、毎回約３０分かけて洗浄した。最後に、マイクロハイドロゲルビーズをさらなる試験のために緩衝液に懸濁した。

マイクロハイドロゲルへのＤＮＡの取り込みの成功を確認するために、ＦＡＭ蛍光体溶液を有する相補的ＤＮＡをマイクロハイドロゲルビーズ懸濁液に添加した。４５分後、上澄溶液を除去し、マイクロヒドロゲルビーズを、１％Ｔｗｅｅｎ ２０溶液で３回洗浄した。次に、ＤＮＡでＰＥＧマイクロハイドロゲルを特徴付けるために共焦点蛍光顕微鏡を使用した。対照として、同じプロセスで処理されるように、ＤＮＡ機能化なしの調製済ＰＥＧマイクロハイドロゲルを選択した。図５Ａ〜５Ｂは、ＤＮＡで機能化されたＰＥＧマイクロハイドロゲルからの強い蛍光シグナルを示すが、図５Ｃ〜５Ｄは、ＤＮＡなしの対照サンプルでは検出可能な蛍光シグナルを示さない。これらの結果は、高い担持効率を有するＤＮＡの取り込みの成功を示す。

また、図５Ａ及び５Ｂは、ＦＡＭを有する相補的ＤＮＡで処理された後の、ＤＮＡを有するＰＥＧマイクロハイドロゲルの共焦点画像を示す。図５Ｃ及び５Ｄは、ＦＡＭを有する相補的ＤＮＡで処理された後の、対照としてＤＮＡなしのＰＥＧマイクロハイドロゲルの共焦点画像を示す。図５Ａ及び図５Ｃは、重なり合う透過画像及び蛍光画像である。図５Ｂ及び５Ｄは蛍光画像である。

本発明の様々な実施形態は本明細書で記載され、示されてきたが、当業者はその機能を実行するために、及び／又はその結果を得るために、及び／又は本明細書で記載した１つ以上の利点のために、様々な他の方法及び／又は構造体をすぐに想像するであろう。より一般的には、当業者は、本明細書で検討された全てのパラメータ、寸法、材料、及び形態は、代表的なものであり、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は形態は、特定の用途又は本発明の技術が使用される用途に依存すると、すぐに認識するであろう。そして、そのようなバリエーション及び又は変更の各々は本発明の範囲内であるとみなされる。当業者は、本明細書で検討された本発明の特定の実施形態と同等の多くのものを通常範囲内の実験で用いて認識する、又は確認することができるであろう。従って、前述の実施形態は例のためだけに示され、添付した請求項及びそれと同等の範囲内で、本発明は特に検討された及び請求された通り以外に実施され得ると理解すべきである。本発明は、本明細書で記載する各個別の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。さらに、もしそのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が互いに食い違うことがなければ、２つ以上のその特性、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法のいずれの組み合わせを本発明の範囲内に含まれる。

本明細書で規定される、及び用いられる全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文献中の定義、及び／又はその定義された用語の通常の意味よりも優先されると理解すべきである。

明細書中及び請求項中において、本明細書で使用される不定冠詞の“ａ”及び“ａｎ”は、明確に反対の指示がなければ、“少なくとも１つの”を意味すると理解すべきである。

明細書中及び請求項中において、本明細書で使用される“及び／又は(and/or)”という句は、要素の“一方又は両方(either or both)”、が結合されるように、すなわちいくつかのケースでは結合して存在し、他のケースでは分離して存在する要素を意味すると理解すべきである。“及び／又は(and/or)”で表された多くの要素は同様に、すなわち“１つ以上の(one or more)”の要素が結合されるように解釈すべきである。他の要素は、特に識別されたそれらの要素に関係するか否かに関わらず、“及び／又は(and/or)”の節によって特に識別される要素以外は任意に存在する。従って、非限定的な例として、“含む(comprising)”などの非限定の語を接続して使用されるときの“Ａ及び／又はＢ(A and/or B)”への言及は、ある実施形態ではＡのみに（任意にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態ではＢのみに（任意にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡにもＢにも（任意に他の要素を含む）等を指し得る。

明細書中及び請求項中において、本明細書で使用される“又は(or)”は上述に規定されるような“及び／又は(and/or)”と同様の意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト中の項目を分離するとき、“又は(or)”又は“及び／又は(and/or)”は包括的、すなわち、多くの要素の内の、又は要素のリストの内の、及び任意に追加のリストにない項目の内の１つ以上も含むが少なくとも１つを含むと解釈されるものとする。反対に“１つだけの(only one of)”又は“丁度１つの(exactly one of)”などの明確に指示された用語のみ又は請求項で“〜からなる(consisting of)”が使用されるときは、多くの要素の内の、又は要素のリストの内の丁度１つの要素を含むことを指すだろう。一般的に、本明細書で使用される“又は(or)”という用語は、“一方(either)”、“１つの(one of)”、“１つだけの(only one of)”又は“丁度１つの(exactly one of)”などの排他的な用語が先行されないとき、排他的な二者択一（すなわち“１つの又は他方の、しかし両方ではない(one or the other but not both)”）を指示するとしてのみ解釈され、特許法の分野でその通常の意味を有するものとする。

明細書中及び請求項中において、本明細書で使用されるように、１つ以上の要素のリストに関連する“少なくとも１つの(at least one)”という句は、要素のリスト内で特に示された各々及び全ての要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、及び要素のリスト中の要素のいずれの組み合わせを除かないが、要素のリスト中の要素のいずれの１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解すべきである。また、この定義により “少なくとも１つの(at least one)”という句が指す要素のリスト内で特に識別される要素以外は、特に識別されるそれらの要素に関連するか否かに関わらず、要素が任意に存在し得ることが可能となる。従って、非限定的な例として、“Ａ及びＢのうち少なくとも１つの(at least one of A and B)”（又は同等に“少なくとも１つのＡ又はＢ(at least one of A or B)”又は同等に“Ａ及び／又はＢの少なくとも１つの(at least one of A and/or B)”）は、１つの実施形態では、少なくとも１つの、任意に１つ以上のものを含む、Ａであって、Ｂは存在しない（及び任意のＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、少なくとも１つの、任意に１つ以上を含むＢであって、Ａは存在しない（及び任意にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、少なくとも１つの、任意に１つ以上を含むＡ、及び少なくとも１つの、任意に１つ以上を含むＢ（及び任意に他の要素を含む）等を指し得る。

“約(about)”という単語は数に関連して本明細書で使用されるとき、本発明のさらなる他の実施形態は、“約”という単語の存在によって変更されない数を含むと理解すべきである。

明確に反対の指示がなければ、１つ以上の段階又は反応を含む、本明細書で請求されるいずれの方法において、その方法の段階又は反応の順は、必ずしも記載された方法の段階又は反応の順に限定されないと理解すべきである。

請求項、並びに上述の明細書中では、“含む(comprising)”、“含む(including)”、“担持する(carrying)”、“有する(having)”、“含む(containing)”、“含む(involving)”、“保持する(holding)”、“〜を含む(composed of)”等の全ての移行句は非限定である、すなわち含むことを意味するが限定されないことを理解すべきである。“〜からなる(consist of)”及び“本質的に〜からなる(consisting essentially of)”という移行句のみ、米国特許庁審査手順書第２１１１．０３節に記載のように、それぞれ限定又は半限定の移行句である。

Claims (46)

1. キャリア流体中に含まれる第２の流体によって囲まれた、ポリマーを含む第１の流体の小滴を供給する工程と、
   前記第２の流体を固化させる工程と、
   前記第１の流体中のポリマーでゲルを形成する工程と、
   固化した第２の流体を除去する工程であって、それによって前記キャリア流体中に前記ゲルの懸濁液を形成する、除去する工程と、と含む方法。
2. 前記ポリマーでゲルを形成する工程は、前記ポリマーを架橋させて前記ゲルを形成させるために紫外線を照射することを含む請求項１に記載の方法。
3. 前記ポリマーでゲルを形成する工程は、前記キャリア流体にＴＥＭＥＤを適用することを含み、それによって前記ＴＥＭＥＤは前記第１の流体中に拡散することができる、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記第２の流体は、溶媒と第２のポリマーとを含み、
   前記第２の流体を固化させる工程は、前記第２のポリマーが固体を形成するように、前記溶媒を前記キャリア流体に入れることを含む請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
5. 前記第２の流体を固化させる工程は、前記第２の流体の温度を変更することによって前記第２の流体を固化させることを含む請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
6. 前記固化した第２の流体はゲルである請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
7. 前記固化した第２の流体を除去する工程は、前記固化した第２の流体を前記キャリア流体中に溶解させるように前記キャリア流体のｐＨを低下させることを含む請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
8. 前記キャリア流体のｐＨを変化させる工程は、前記キャリア流体の前記ｐＨを、少なくとも約２ｐＨの単位で低下させることを含む請求項７に記載の方法。
9. 前記キャリア流体のｐＨを変化させる工程は、前記キャリア流体の前記ｐＨを５以下まで低下させることを含む請求項７又は８に記載の方法。
10. 前記キャリア流体のｐＨを変化させる工程は、前記キャリア流体に酸を添加することを含む請求項７〜９のいずれか１つに記載の方法。
11. 前記固化した第２の流体を除去する工程は、前記固化した第２の流体を機械的に除去することを含む請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
12. 前記第１の流体は開始剤をさらに含む請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
13. 前記開始剤はイルガキュア２５５９を含む請求項１２に記載の方法。
14. 前記ポリマーはポリ（エチレングリコール）ジアクリレートを含む請求項１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
15. 前記第２の流体はアクリレート又はメタクリレートを含む請求項１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
16. 前記第２の流体はジメチルアミノエチルメタクリレートを含む請求項１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
17. 前記第２の流体はブチルメタクリレートを含む請求項１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
18. 前記第２の流体はメチルメタクリレートを含む請求項１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
19. 前記小滴は約１ｍｍ以下の平均直径を有する請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
20. 前記小滴は、前記小滴の少なくとも９０％が、前記小滴の前記平均直径の９０％よりも大きく１１０％よりも小さい直径を有するような直径分布を有する請求項１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
21. 前記キャリア流体は水性である請求項１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
22. 前記キャリア流体と前記第２の流体は実質的に非混和である請求項１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
23. 前記第１の流体と前記第２の流体は実質的に非混和である請求項１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
24. 種を前記ゲル中に取り込むために、前記種を前記ゲルにさらす工程をさらに含む請求項１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
25. 前記種を前記ゲルに結合させる工程を含む請求項２４に記載の方法。
26. 前記種を前記ゲルに共有結合させる工程を含む請求項２５に記載の方法。
27. 前記種は核酸を含む請求項２４〜２６のいずれか１つに記載の方法。
28. 前記種はＤＮＡを含む請求項２７に記載の方法。
29. ＥＤＣの結合反応を用いて前記ＤＮＡを前記ゲルに結合させる工程を含む請求項２７又は２８に記載の方法。
30. キャリア流体中に含まれる溶媒とポリマーとを含む小滴を供給する工程と、
    前記ポリマーでゲルを形成する工程と、
    前記ゲルからの前記溶媒を除去する工程であって、それによって前記キャリア流体中に前記ゲルの懸濁液を形成する、除去する工程と、を含む方法。
31. 前記ポリマーでゲルを形成する工程は、前記ポリマーを架橋させて前記ゲルを形成させるように紫外線を照射する工程を含む請求項３０に記載の方法。
32. 前記ポリマーでゲルを形成する工程は、キャリア流体にＴＥＭＥＤを適用することを含み、それによって前記ＴＥＭＥＤは前記第１の流体中に拡散することができる、請求項３０又は３０に記載の方法。
33. 前記小滴は開始剤をさらに含む請求項３０〜３２のいずれか１つに記載の方法。
34. 前記開始剤はイルガキュア２５５９を含む請求項３３に記載の方法。
35. 前記ポリマーはポリ（エチレングリコール）ジアクリレートを含む請求項３０〜３４のいずれか１つに記載の方法。
36. 前記溶媒は、前記キャリア流体にさらされたとき、分離相を形成することができる、請求項３０〜３５のいずれか１つに記載の方法。
37. 前記ゲルからの前記溶媒を除去する工程は、前記溶媒を前記キャリア流体に入れることを含む請求項３０〜３６のいずれか１つに記載の方法。
38. 前記キャリア流体は水性の流体である請求項３０〜３７のいずれか１つに記載の方法。
39. 前記キャリア流体は水である請求項３０〜３８のいずれか１つに記載の方法。
40. 前記溶媒は約１ｇ／ｍｌ未満の水溶解度を有する請求項３０〜３９のいずれか１つに記載の方法。
41. 種を前記ゲル中に取り込むために、前記種を前記ゲルにさらす工程をさらに含む請求項３０〜４０のいずれか１つに記載の方法。
42. 前記種を前記ゲルに結合させる工程を含む請求項４１に記載の方法。
43. 前記種を前記ゲルに共有結合させる工程を含む請求項４２に記載の方法。
44. 前記種は核酸を含む請求項３０〜４３のいずれか１つに記載の方法。
45. 前記種はＤＮＡを含む請求項４４に記載の方法。
46. ＥＤＣの結合反応を用いて前記ＤＮＡを前記ゲルに結合させる工程を含む、請求項４４又は４５に記載の方法。

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