CN114191848B

CN114191848B - 琼脂糖微球的清洗方法

Info

Publication number: CN114191848B
Application number: CN202111516131.1A
Authority: CN
Inventors: 余曾成; 高双双; 庄晓慧; 张磊; 王业富
Original assignee: Wuhan Refine Medical Devices Co ltd
Current assignee: Wuhan Refine Medical Devices Co ltd
Priority date: 2021-12-06
Filing date: 2021-12-06
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2041-12-06
Also published as: CN114191848A

Abstract

本发明提供了一种琼脂糖微球的清洗方法，将乳化‑冷却法得到的琼脂糖微球乳液静置分层，将上层油相分离出来，得到下层琼脂糖微球乳化层；然后向琼脂糖微球乳化层中加入水，静置分层，分离得到上层乳化层和下层琼脂糖微球水相层，从下层水相层中分离得到琼脂糖微球；将上层乳化层反复加水分层分离，将每一次分离得到的琼脂糖微球混合，水洗得到高纯度琼脂糖微球。本发明首先将乳化液静置，使大部分油相分离出，大大减少了待清洗乳化层的体积，故而能提高单次可实现的最大清洗量，节省设备的运行成本；同时乳化层体积的减少也必将减少清洗液的用量，进一步减少清洗成本，适合工业化生产；所得微球在交联反应完成后具备良好的理化性质。

Description

琼脂糖微球的清洗方法

技术领域

本发明涉及固液分离技术领域，尤其涉及一种琼脂糖微球的清洗方法。

背景技术

琼脂糖微球具备极高的附加价值，主要用于分离纯化病毒、蛋白质、酶等大分子生物活性物质，在生物医药、血液制品及疫苗等行业得到广泛应用。琼脂糖微球作为一种天然多糖型生物填料，具备生物相容性良好、多孔、亲水及不含带电基团等优点，被广泛应用于分离层析领域。同时琼脂糖微球表面含有大量羟基，易与很多基团发生化学反应，因此较容易对其表面进行修饰，键合不同功能的基团，使其适用于不同的分离对象及分离要求。

目前，琼脂糖微球的主要制备方法有乳化-冷却法、喷射法、微流控液滴生成法及无机分散剂乳化法。其中，乳化-冷却法是最早用于琼脂糖微球的制备方法，主要利用琼脂糖加热溶解后，遇冷固化的特点来制备琼脂糖微球。此法工艺流程简单，生产效率高，至今仍是最主要的琼脂糖微球制备方法。

现有技术是通过反相乳液聚合法制备琼脂糖微球，主要步骤是将琼脂糖在水中加热溶解作为水相，乳化剂加入有机溶剂中加热搅拌作为油相，将水相滴入油相中乳化成液滴微球，然后降温固化即得琼脂糖微球。但此种方法得到的微球存在于油包水乳化液中，需要将其分离清洗收集纯净的琼脂糖微球。由于为油包水乳化液，如果直接采用抽滤，虽然能够减少后续洗涤液的用量，但容易堵塞滤纸，而且会破坏微球结构，因此不便使用。如果采用离心分离再清洗，如附图1所示，离心后分层三层，微球上层为含油乳化液，分离出的微球表面仍吸附有较多油相，需要有机试剂清洗去除，而且离心力也容易破坏微球结构，导致聚集，不便于直接使用。因此，目前主流的分离清洗方法是直接以水和/或乙醇交替清洗乳化液，以使水相微球逐渐从油相中分离出来，并清洗净表面的油相。专利CN 102233254 A中表明琼脂糖喷雾冷却固化成球后，依次使用石油醚、丙酮、乙醇和水进行洗涤。专利CN109225177 A表明所得微球用石油醚和异丙醇的混合洗涤剂洗涤后，再分别用石油醚和水清洗。上述微球的清洗方法在实际生产中会使用大量的有机试剂，使用过程中的回收成本高，且生产过程中易造成环境污染。

有鉴于此，有必要设计一种改进的琼脂糖微球的清洗方法，以解决上述问题。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种琼脂糖微球的清洗方法。首先将乳化液静置，使大部分油相分离出，大大减少了待清洗乳化层的体积，故而能提高单次可实现的最大清洗量，节省设备的运行成本；同时乳化层体积的减少也必将减少清洗液的用量，进一步减少清洗成本。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种琼脂糖微球的清洗方法，包括以下步骤：

S1.将琼脂糖热的水溶液分散于热的油相中，混合均匀后按预设降温速率降温固化，得到琼脂糖微球乳液；

S2.将步骤S1得到的所述琼脂糖微球乳液静置分层，将上层油相分离出来，得到下层琼脂糖微球乳化层；

S3.向步骤S2得到的所述琼脂糖微球乳化层中加入水，搅拌预设时间，然后静置分层，分离得到上层乳化层和下层琼脂糖微球水相层，从所述下层琼脂糖微球水相层中分离得到琼脂糖微球；

S4.将步骤S3得到的所述乳化层进行多次步骤S3的分离操作，将每一次分离得到的所述琼脂糖微球混合，水洗得到高纯度琼脂糖微球。

作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，所述静置分层的时间大于6h。

作为本发明的进一步改进，所述静置分层的时间为12-30h，所述上层油相的体积大于所述琼脂糖微球乳液体积的1/3。

作为本发明的进一步改进，在步骤S3中，所述加入的水与所述琼脂糖微球乳化层的体积比为(0.5-3):1。

作为本发明的进一步改进，所述搅拌预设时间为5-20min，搅拌速度为50-200rpm，所述静置分层的时间为10-60min。

作为本发明的进一步改进，在步骤S4中，将步骤S3得到的所述乳化层进行3-5次步骤S3的分离操作。

作为本发明的进一步改进，在步骤S1中，所述琼脂糖热的水溶液的浓度为0.02-0.1g/mL，所述琼脂糖热的水溶液和所述热的油相的体积比为1:(2-10)。

作为本发明的进一步改进，在步骤S1中，所述琼脂糖热的水溶液和所述热的油相的温度为60-100℃，所述降温速率为2-5℃/min，降温至20℃以下。

作为本发明的进一步改进，在步骤S1中，所述油相为液体石蜡、石油醚、环己烷、甲苯中的一种或多种。

作为本发明的进一步改进，所述油相中还添加有表面活性剂Span 80。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的琼脂糖微球的清洗方法，通过改进优化了现有琼脂糖微球的清洗方法，首先将乳化液静置，使大部分油相分离出，大大减少了待清洗乳化层的体积，故而能提高单次可实现的最大清洗量，节省设备的运行成本；同时乳化层体积的减少也必将减少清洗液的用量，进一步减少清洗成本。

2、乳化层中油相的存在，极大程度的阻碍了洗球过程的效率，容易堵住滤网，使乳化层难以抽滤，本发明相较于现有的琼脂糖微球的清洗方法，由于存在静置分离油相步骤，使乳化层中的油相大量减少，故而微球的清洗过程会更加容易；同时，乳化层加纯水搅拌分层后，微球存在于水相中，更有利于清洗操作。

3、本发明利用琼脂糖微球液滴的亲水性质，通过加水以达到琼脂糖微球的收集及清洗，清洗过程不依赖于有机试剂，使用纯化水即可洗净琼脂糖微球，减小了有机试剂易造成环境污染的隐患，安全环保；本方法涉及的清洗工艺简单，所得琼脂糖微球的收率高且稳定，适合于大规模工业化生产，所得微球在交联反应完成后具备良好的理化性质。

附图说明

图1为实施例1和对比例3、4的乳液分离分层结构示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在具体实施例中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。

另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

本发明提供的琼脂糖微球的清洗方法，包括以下步骤：

S1.将琼脂糖热的水溶液分散于热的油相中，混合均匀后按预设降温速率降温固化，得到琼脂糖微球乳液。

在步骤S1中，琼脂糖热的水溶液的浓度为0.02-0.1g/mL，琼脂糖热的水溶液和热的油相的体积比为1:(2-10)。琼脂糖热的水溶液和热的油相的温度为60-100℃，降温速率为2-5℃/min，降温至20℃以下。油相为液体石蜡、石油醚、环己烷、甲苯中的一种或多种。油相中还添加有表面活性剂Span 80。

在此步骤中，琼脂糖热的水溶液在油相中乳化，得到油包水乳液，其中水相为琼脂糖水溶液，琼脂糖以小液滴的形式分散于油相中，形成无数个液滴单元。降温时，液滴中的琼脂糖逐渐析出固化(琼脂糖仅溶于热水)，每个液滴形成一个琼脂糖微球，水分子存在于微球表面和内部孔隙中，整个乳液仍以油包水形式存在。

S2.将步骤S1得到的所述琼脂糖微球乳液静置分层，将上层油相分离出来，得到下层琼脂糖微球乳化层。

在步骤S2中，静置分层的时间大于6h。静置分层的时间优选为12-30h，上层油相的体积大于琼脂糖微球乳液体积的1/3。通过静置分离，由于乳液中油相体积远大于水相体积，又由于水相的密度大于油相，因此静置一定时间后，部分油相浮于上层，又由于油包水乳液本身的液滴张力作用，使得下层液体仍以油包水的乳化层形式存在，但油相含量已经显著降低。

S3.向步骤S2得到的所述琼脂糖微球乳化层中加入水，搅拌预设时间，然后静置分层，分离得到上层乳化层和下层琼脂糖微球水相层，从所述下层琼脂糖微球水相层中分离得到琼脂糖微球。

加入的水与琼脂糖微球乳化层的体积比为(0.5-3):1。搅拌预设时间为5-20min，搅拌速度为50-200rpm，静置分层的时间为10-60min。

在此步骤中，在乳化层中加入水后，整个液体中水的含量与油相含量相当，或逐渐大于油相含量，又由于琼脂糖微球液滴的亲水性，在搅拌过程中，使得微球周围逐步聚集更多水相，将油相挤出，再次静置后，即可得到下层仅含琼脂糖微球的水相层，油相含量极少。上层乳化层为仍含有少量琼脂糖微球的油包水乳液，再通过步骤S4的重复加水分离，逐步提取出剩余的琼脂糖微球。如此即可得到高收率和高纯的琼脂糖微球，而且琼脂糖微球粒径分布均匀，具备良好的理化性质。

S4.将步骤S3得到的所述乳化层进行多次步骤S3的加水分离操作，将每一次分离得到的所述琼脂糖微球混合，水洗得到高纯度琼脂糖微球。

在步骤S4中，将步骤S3得到的乳化层进行3-5次步骤S3的分离操作。

实施例1

S1：琼脂糖微球的制备：称取4.0g琼脂糖粉于100mL纯化水中，加热使其完全溶解，即为水相；称取12g Span 80于300mL液体石蜡中，搅拌均匀并控温60～80℃，作为油相。将水相滴入油相中，60～80℃下搅拌30～60min后，2～5℃/min冷却降温至20℃以下，静置固化1h使微球成形。

S2：将冷却固化成球后的乳化液于常温下静置16～24h，静置分层后的乳化液上层为澄清油相，约200mL，下层为乳化层；将上层油相吸出后得到含微球的乳化层。

S3：向所得乳化层中加入等体积的纯化水后，在150rpm下匀速搅拌10min后，静置15分钟使水相与乳化层分离开，其中上层为乳化层，下层为水相，且微球沉在水相底部；抽取上层乳化层并收集，下层水相直接抽滤并收集琼脂糖微球。

S4：重复3次步骤S3，将3次收集的微球混合后以纯化水清洗干净。表1中记录了步骤S1中析出的油相体积随静置时间的变化。可以看出，随着静置时间的增加，上层油相的体积逐渐增大，当静置时间达到16h后，油相体积基本不再大幅度增加，24h后油相体积为200mL，为原始油相体积的2/3。说明由于油包水乳液本身的稳定性，无法通过静置将所有油相直接分离出来，静置时间过长也会增加制造成本。

表1 油相体积随静置时间的变化

时间	1h	2h	3h	6h	9h	12h	16h	20h	24h
										油相体积/mL	30	50	70	130	160	180	195	198	200

实施例2

实施例2与实施例1相比，仅增加了步骤S3的重复次数。实施例2中步骤S4中S3的重复次数为4次，其余步骤均与实施例1相同，在此不再赘述。表2中记录了每次进行步骤S3后收集的微球的质量。

表2 步骤S3的操作次数对所得微球的质量的影响

操作次数	1	2	3	4	5
						每次微球质量/g	79.64	10.81	1.37	0.52	0.03
微球总质量/g	79.64	90.45	91.82	92.34	92.37
						占总质量百分比	86.22％	97.92％	99.40％	99.97％	——

从表2可以看出，步骤S3的操作次数在第4次时，几乎已获得所有微球，即步骤S4中的重复步骤S3的次数为3次时，已经能将乳化层中的所有微球分离出。且至少需要重复两次步骤S3，才能得到99％的琼脂糖微球。其中，第一次分离得到的微球质量最大，说明第一次加水后基本能将大部分微球静置分散于水相中。由此可见，本发明仅通过静置和加水分离，就能将琼脂糖微球从乳液中高效分离，实现低成本、低污染清洗回收。

实施例3～6

实施例3～6与实施例1相比，不同之处在于改变了步骤S3中涉及的纯化水添加量及搅拌速率，其余步骤均与实施例1相同，在此不再赘述。具体参数如表3所示。

表3 实施例3～6的参数变化及所得微球质量

实施例	纯化水与乳化层体积比	搅拌速率/rpm	微球质量/g
				3	0.5:1	150	70.73
4	3:1	150	92.17
				5	1:1	50	91.35
6	1:1	200	91.78

实施例3、4相比实施例1，仅改变了步骤S3中加入纯化水与乳化层的体积比。由表3可知，纯化水与乳化层的体积比会影响最终所得的微球质量，且体积比小时，所得微球的质量会减少。这可能是由于所加入的纯化水体积少时，搅拌静置后，水对油包水乳化层的破乳能力降低，使得沉降在水相中的琼脂糖微球与乳化层较接近，抽出乳化层的过程中，会有部分微球随之进入乳化层，进而影响所得微球质量。体积比大时，对所得微球的质量几乎无影响，但是过高的体积比会增加清洗液的用量，增加生产成本。

实施例5、6对比实施例1，仅改变了步骤S3中加入纯化水后的搅拌速率。由表3可得，搅拌速率对所得微球总质量影响不大。但搅拌速率过慢会减少乳化层中微球的分离；速率过快会使乳化层与水相混合，难以分层，形成新的乳化层。

对比例1

琼脂糖微球的制备：称取4.0g琼脂糖粉于100mL纯化水中，加热使其完全溶解，即为水相；称取12g Span 80于300mL液体石蜡中，搅拌均匀并控温60～80℃，作为油相。将水相滴入油相中，60～80℃下搅拌30～60min后，2～5℃/min冷却降温至20℃以下，静置固化1h使微球成形。

将所得乳化液以等体积乙醇和纯化水交替清洗并抽滤10次后，清洗液上无油相漂浮，收集所得琼脂糖微球，清洗干燥后共92.71g。

对比例2

将所得乳化液依次使用等体积石油醚、丙酮、乙醇和水进行6次洗涤后，清洗液上无油相漂浮，收集所得琼脂糖微球，清洗干燥后共92.21g。

对比例3

将所得乳化液以5000rpm条件下离心5min后，将上层清液及中间层乳化液与下层微球分离后，将微球以等体积乙醇和水进行洗涤8次后，清洗液上无油相漂浮，收集所得琼脂糖微球，清洗干燥后共83.64g。

对比例4

将所得乳化液以5000rpm条件下离心5min后，将上层澄清油相及中间层乳白色乳化液与下层微球分离后，将微球依次使用等体积石油醚、丙酮、乙醇和水进行洗涤4次后，清洗液上无油相漂浮，收集所得琼脂糖微球，清洗干燥后共84.36g。

对比例3、4较实施例1，所得微球质量低的原因可能是由于离心后其微球与乳化液直接紧靠，分离过程中的存在一定损失；且由于分离后微球与乳化液有接触，故微球的清洗过程依然存在障碍，需要使用有机试剂清洗。最终分离处理后的示意图见附图1。

性能测试

实施例与对比例中所得微球均经筛网获得100～300μm微球，按常规方法将所得微球交联：取抽干的琼脂糖微球20g，加入20mL纯化水及2mL环氧氯丙烷，室温下搅拌30min后，滴加5mol/L NaOH溶液6mL，于60min内滴加完。升温至60℃反应90min，抽滤洗净即得交联琼脂糖微球。

取上述交联微球，选用

的层析柱，堵住柱子出口，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，静置，控制介质床层高度为10.00cm±0.20cm，柱子上端充满水。打开柱子入口，以0.5mL/min的流速连续向柱中通入10个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。

将层析柱连人中低压层析系统。测定时，从零开始设定一定流速v_x(mL/min),保持该流速5min后，记录此时柱压p(MPa)。继续增加流速,并测定相应流速下的柱压。直到压力达到0.10MPa为止，此时对应流速记录为v_0.1。最高流速计算公式：F_max＝60v_0.1/S

式中:

Fmax——最高流速，单位为厘米每小时(cm/h)；

v_0.1——在0.10MPa压力下的体积流速，单位为毫升每分(mL/min)；

S——层析柱截面积，单位为平方厘米(cm²)；

60——分钟转化为小时的换算系数。

表4 实施例及对比例最高流速

实施例1与实施例2为同一次实验，故仅测实施例1所得微球的最高流速。由表4可知，实施例中所得微球的最高流速均较接近，且均高于对比例，即表明实施例所得微球的性能较好，孔隙通透性良好。

综上所述，本发明通过本清洗方法制备的微球，收率及最高流速均高于现有技术制备的微球。即本发明在维持现有微球性能的基础上，改进了微球的清洗方法，减少了有机试剂的使用及排放，节省了制球成本；且安全环保，操作简单，适合于大规模工业化生产。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种琼脂糖微球的清洗方法，其特征在于，包括以下步骤∶

S4.将步骤S3得到的所述乳化层进行多次步骤S3的分离操作，将每一次分离得到的所述琼脂糖微球混合，水洗得到高纯度琼脂糖微球；

步骤S2中，所述静置分层的时间为12-30h，所述上层油相的体积大于所述琼脂糖微球乳液体积的1/3；

步骤S3中，所述搅拌预设时间为5-20min，搅拌速度为50-200rpm，所述静置分层的时间为10-60min。

2.根据权利要求1所述的琼脂糖微球的清洗方法，其特征在于，在步骤S3中，所述加入的水与所述琼脂糖微球乳化层的体积比为(0.5-3)∶1。

3.根据权利要求1所述的琼脂糖微球的清洗方法，其特征在于，在步骤S4中，将步骤S3得到的所述乳化层进行3-5次步骤S3的分离操作。

4.根据权利要求1所述的琼脂糖微球的清洗方法，其特征在于，在步骤S1中，所述琼脂糖热的水溶液的浓度为0.02-0.1g/mL，所述琼脂糖热的水溶液和所述热的油相的体积比为1:(2-10)。

5.根据权利要求1所述的琼脂糖微球的清洗方法，其特征在于，在步骤S1中，所述琼脂糖热的水溶液和所述热的油相的温度为60-100℃，所述降温速率为2-5℃/min，降温至20℃以下。

6.根据权利要求1所述的琼脂糖微球的清洗方法，其特征在于，在步骤S1中，所述油相为液体石蜡、石油醚、环己烷、甲苯中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的琼脂糖微球的清洗方法，其特征在于，所述油相中还添加有表面活性剂Span 80。