CN103769057A - 一种高强度多糖类凝胶微球、制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高强度多糖类凝胶微球及其制备方法，主要用于层析分离领域。首先使用一种双功能交联剂对多糖原料进行修饰，然后将其与未修饰原料混合，乳化成球后，经后期活化，实现微球内部的交联。修饰多糖链通过在凝胶纤维束内部以及纤维束之间形成共价交联键，大大提高了凝胶微球的机械强度；而未修饰多糖链上含有大量羟基，有利于凝胶化过程中氢键的形成，起到骨架支撑的作用，维系凝胶固化形成的大孔网络结构，有效避免微球的收缩和变形。所得凝胶微球不但具有天然多糖赋予的优良性能，而且在骨架刚性和操作流速上具有显著优势，是一种理想的工业化层析分离填料。
Description
技术领域
本发明属于层析分离材料领域，涉及一种高强度多糖类凝胶微球、制备方法及其用途。
背景技术
天然多糖富含羟基，亲水性很强，与生物大分子具有良好的相容性，在生物大分子分离领域占据核心地位。尤其是凝胶类的多糖分离介质，其在溶胀状态下具有大孔网络结构，对于生物大分子的分离纯化具有特殊的优越性。然而多糖凝胶的骨架结构主要由氢键维系，虽然有一定的机械强度，但与无机物微球和其他有机聚合物微球相比颗粒相对较软，因此被称为“软基质”。当用作分离介质时，在压力较大的情况下，这类“软基质”容易出现压紧和堵塞层析柱造成流动困难的现象，尤其在大规模层析，要求流速很高的时候，这一缺点更为明显。化学交联是增加多糖凝胶骨架刚性的有效方法，通过向凝胶微球中引入具有一定链长的交联剂分子，将氢键作用转化为共价键作用，使得凝胶骨架刚性和化学稳定性大幅度提高。分离介质的机械强度越高，有利于在高流速下高负载量地分离目标产物，可以大大提高生产效率。
有关交联方法的专利和文献报道很多，常用的交联剂都是一些含有活泼的双官能基团的化合物（如环氧氯丙烷、2,3-二溴丙醇、丁二醇双缩水甘油醚）及分子两端带有活泼Cl、Br等基团的物质。Porath J（Proath J,et al.Agar derevativesfor chromatography，electrophoresis and gel-bound enzymes Ⅰ.Desulphated andreduced cross-linked agar and agrarose in spherical bead form.J Chromatography.1971,60:167）用环氧氯丙烷交联琼脂糖微球介质的方法如下：将琼脂糖微球分散于水中，与含有NaOH、环氧氯丙烷以及硼氢化钠的溶液混合，边搅拌边在60℃条件下反应1h，得到交联的琼脂糖微球。为了进一步提高软凝胶的机械强度，Pernemalm（Pernemalm et al.Polysaccharide crosslinked separation material andits preparation.US 4665164,1987）等提出了一种两步交联的方法，即先向多糖链的两个结合位点间引入长链交联剂，实现多糖纤维束之间的初步捆绑；在此基础上，再引入短链交联剂，进行纤维束内部的交联，所得多糖微球的最大操作流速有了进一步提高。上述传统交联方法的共同点在于，首先制备凝胶微球，将其分散于水中充分溶胀，然后加入交联剂进行交联。由于交联剂一般为油溶性的，在水中溶解度很低，而且交联剂要靠扩散进入已经形成的凝胶网络结构内部才能与多糖链上的羟基发生反应，因此反应速度很慢，交联度很难进一步提升，无法满足大规模生产对介质骨架刚性方面的要求。在油相中交联有利于提高反应体系中交联剂的溶解度，但是多糖凝胶在油相中难以溶胀，即微球在收缩状态下交联，虽然交联度很高，但所得凝胶微球不再具有大孔网络结构，在生物大分子的分离纯化中应用受限。
US 4665164A公开了一种新型的高交联多糖微球的制备方法。该方法使用一种特殊的交联剂，他的两端分别含有一个活泼基团和一个惰性基团。根据交联剂的结构特点，该法直接向多糖溶液中加入交联剂，然后凝胶化成球，得到交联剂修饰的多糖微球；之后活化交联剂的惰性端基，实现微球内部的交联。该法于凝胶化之前引入交联剂，提高了交联剂在微球内部的相对浓度，有利于增加交联度。但是，研究发现，如果预引入的交联剂浓度过高，过量的交联剂占据了多糖链上大量的羟基，影响凝胶化过程中氢键的形成，破坏了凝胶骨架结构，导致微球发生剧烈的收缩和变形，严重影响了其在层析分离中的应用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种多糖类凝胶微球，具体地，本发明的目的之一在于提供一种可用做层析分离填料的高强度多糖类凝胶微球，所述凝胶微球解决了现有多糖类软凝胶介质流速低、不耐压的问题。
所述可用于层析分离填料的高强度多糖类凝胶微球，具有半刚性的骨架结构，最大流速为1000-6000cm/h。
所述半刚性意指：所述多糖类凝胶微球机械强度大幅度提高，能够在流速大于1000cm/h的情况下正常操作和实现快速高效层析分离。
所述多糖类凝胶微球作为层析分离填料时最大流速可达到1000-6000cm/h，远远大于现有填料的最大流速。
所述多糖优选天然多糖，典型但非限制性的多糖例如有淀粉、糖元、壳多糖、菊糖、琼脂糖、葡聚糖、魔芋葡甘聚糖和露聚糖，作为优选方案，所述多糖进一步优选琼脂糖、葡聚糖或魔芋葡甘聚糖中的任意一种，更进一步优选琼脂糖。
本发明的目的之二在于提供一种如上所述的多糖类凝胶微球的制备方法，所述方法包括：
（1）多糖原料的修饰：配制多糖溶液，并加入双功能交联剂，在碱性条件下，其一端的活性基团与多糖链上的羟基反应，然后调节pH至中性，终止反应，加入过量乙醇，亲水性的多糖链沉淀析出，将离心得到的沉淀干燥，得到修饰的多糖原料；
（2）共混制备双功能交联剂修饰的多糖微球：将步骤（1）得到的修饰的多糖原料和未修饰的多糖原料混合溶于水，得到共混多糖溶液，将其分散在溶解有乳化剂的油相中，乳化，固化得到双功能交联剂修饰的多糖微球；
（3）双功能交联剂修饰的多糖微球的活化和交联：将步骤（2）得到的双功能交联剂修饰的多糖微球溶于水中，加入活化剂活化双功能交联剂的惰性基团，然后调节pH至碱性条件，双功能交联剂的惰性基团和多糖链上的羟基反应，得到高强度多糖类凝胶微球。
作为优选技术方案，步骤（3）得到多糖类凝胶微球后还可任选进行：
（4）采用交联剂对步骤（3）得到的多糖类凝胶微球继续交联至少一次，优选一次或两次。
通过步骤（4）对凝胶微球的进一步交联，可进一步提高所述微球的交联度，使所述微球的强度得以进一步的提高。
步骤（1）首先配制多糖溶液，所述溶液的溶剂本领域技术人员可根据溶解性的知识进行选择，本发明中优选采用水作为溶剂。步骤（1）中多糖溶液的浓度为0.1~20%（w/v），例如1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、18%、19%，优选1~20%（w/v），进一步优选2~15%（w/v）。因为，当将少量的多糖放入溶剂中时，所述溶剂的体积基本不变，所述多糖溶液的体积即为溶剂的体积。因此，本发明所述多糖溶液的浓度为0.1~20%（w/v），意指多糖的质量与溶液溶剂的体积比，例如多糖的质量与水的体积比。
优选地，所述双功能交联剂至少含有一个活性基团和一个惰性基团，所述活性基团可以直接和多糖链上羟基反应，所述惰性基团经活化后可以和多糖链上羟基反应。所述活性基团例如卤素基团或/和环氧基团，所述惰性基团例如烯丙基和/或乙烯基。与羟基可以发生反应的基团为本领域技术人员所应掌握的专业知识，其完全有能力根据现有技术或新技术明了哪些基团可以直接和羟基反应，哪些基团在活化之前不能与羟基反应，需经活化后才可以和羟基进行反应。因此，本领域技术人员完全可以根据自己所掌握的知识以及现有技术或新技术所公开的技术内容自行选择活性基团和惰性基团，进而确定需要选择的双功能交联剂。作为优选技术方案，本发明所述双功能交联剂选自烯丙基缩水甘油醚、烯丙基溴、甲基丙烯酸缩水甘油醚、4-乙烯基环氧环己烷或肉桂酰氯中的任意一种，作为优选技术方案，所述双功能交联剂更进一步优选为烯丙基缩水甘油醚或烯丙基溴。
所述惰性基团烯丙基或者乙烯基的活化为已有技术，本发明在此不再赘述，本领域技术人员可以根据自己掌握的知识以及现有技术或者新技术公开的内容具体选择如何进行所述活化反应。
优选地，所述交联剂的体积占多糖溶液体积的1~50%，例如5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%，优选5~25%，进一步优选10~20%。
步骤（1）所述反应在碱性条件下进行反应，其中，OH-的浓度为0.05~5mol/L，例如0.25mol/L、0.5mol/L、1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L、3.5mol/L、4mol/L、4.5mol/L、4.8mol/L、4.9mol/L，优选0.2~2mol/L，进一步优选1mol/L。所述碱性条件可以通过添加KOH、NaOH、Ca(OH)2、Ba(OH)2或氨水中的一种或者至少两种的混合物等碱性物质实现。
优选地，步骤（1）所述反应的温度为40~100℃，例如45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、95℃、96℃、98℃，优选50~90℃，进一步优选55~80℃。
优选地，步骤（1）所述反应的时间为0.5~10h，例如0.8h、1.2h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h，优选1~9h，进一步优选2~8h。
所述反应优选在搅拌条件下进行。
达到反应时间后，调节pH至中性，终止反应。例如可以通过添加酸性物质来调节pH值，本发明优选通过加入冰醋酸调节pH至中性，所述调节pH至中性意指调节pH至7~8，优选7。所述冰醋酸优选60%冰醋酸，所述60%为质量分数。
终止反应后，加入过量乙醇，以得到亲水性的多糖链沉淀。所述过量意指当沉淀5min内不再增加时，即可停止加入乙醇。例如可以添加4~6倍溶液的体积的量的乙醇。
将离心得到的沉淀进行干燥，即可得到修饰的多糖原料。优选地，步骤（1）中所述干燥选自真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥中的任意一种，优选冷冻干燥。
优选地，所述冷冻干燥的方法为：将沉淀在-70℃下预冻2小时，然后在真空状态下干燥至少24小时。所述真空状态的真空度本发明对此不作限制，只需要满足在给定的空间内，压强低于101325帕斯卡即可。
步骤（2）首先将步骤（1）得到的修饰的多糖原料和未修饰的多糖原料混合溶于水，得到共混多糖溶液。其中，步骤（2）中修饰的多糖原料质量占共混多糖总质量的10~95wt%，例如15wt%、20wt%、30wt%、40wt%、50wt%、60wt%、70wt%、80wt%、90wt%，优选40~90wt%，进一步优选50~80wt%。所述共混多糖总质量即为修饰的多糖原料和未修饰的多糖原料的质量之和。
优选地，步骤（2）中所述共混多糖溶液的浓度为0.1~20%（w/v），例如1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%，优选1~15%（w/v），进一步优选2~10%（w/v）。所述浓度即为修饰的多糖原料和未修饰的多糖原料的总质量与此时多糖溶液的体积之比，所述多糖溶液的体积即为水的体积。
优选地，步骤（2）中所述乳化剂优选油溶性乳化剂，例如可以选择司班类乳化剂或者吐温类乳化剂，作为优选技术方案，本发明所述乳化剂进一步优选自Span80，Arlacel83，PO-500或PO-310中的一种或者至少两种的混合物。所述混合物例如PO-310和PO-500的混合物，Arlacel83和Span80的混合物，PO-310和Arlacel83的混合物，PO-500和Span80的混合物，PO-310、PO-500和Arlacel83的混合物，Span80、PO-310、PO-500和Arlacel83的混合物。
优选地，所述乳化剂的浓度为1~10%（w/v），例如2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%，优选1~8%（w/v），进一步优选2~6%（w/v）。所述乳化剂的浓度即为乳化剂的质量与油相的体积之比。
优选地，所述油相选自液体石蜡、石油醚、棉籽油、橄榄油或蓖麻油中的一种或者至少两种的混合物，所述混合物例如蓖麻油和橄榄油的混合物，棉籽油和石油醚的混合物，液体石蜡和蓖麻油的混合物，橄榄油和棉籽油的混合物，石油醚和液体石蜡的混合物，蓖麻油、橄榄油和棉籽油的混合物，石油醚、液体石蜡、蓖麻油和橄榄油的混合物，优选液体石蜡和石油醚的混合物，进一步优选液体石蜡和石油醚的体积比为11:1的混合物。
优选地，步骤（2）所述乳化方法选自微孔膜乳化法，机械搅拌法或喷射法中的任意一种，优选为微孔膜乳化法。所述微孔膜乳化法、机械搅拌法和喷射法均为已有技术，本领域技术人员可以自行查阅具体乳化方法，并进行所述乳化。
优选地，所述微孔膜优选疏水膜及表面修饰为疏水性的亲水膜，进一步优选聚乙烯微孔膜和/或SPG微孔膜，更优选SPG微孔膜。
优选地，所述SPG微孔膜孔径为0.5-100μm，例如2μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、95μm，优选为5-50μm，进一步优选10~40μm。
优选地，步骤（2）所述固化方法为冷却固化法或交联固化法。所述交联固化法和冷却固化法均为已有技术，本领域技术人员可以自行查阅具体固化方法，本发明在此不再赘述。
优选地，当所述多糖为琼脂糖时，采用冷却固化法，当所述多糖为葡聚糖或魔芋葡甘聚糖时，采用交联固化法。
上述步骤（2）中，所述双功能交联剂修饰的多糖微球，是指双功能交联剂修饰的多糖原料和未修饰多糖原料混合后乳化形成的微球。
优选地，当所述双功能交联剂为烯丙基缩水甘油醚或烯丙基溴时，步骤（2）得到的双功能交联剂修饰的多糖微球为烯丙基化的多糖微球，所述烯丙基的浓度为10~500μmol/每克多糖微球，优选为20~200μmol/每克多糖微球，进一步优选30~100μmol/每克多糖微球，此处所述多糖微球即为烯丙基化的多糖微球。
优选地，步骤（3）中将步骤（2）得到的双功能交联剂修饰的多糖微球溶于水中，使每ml水中含有0.05~1g的步骤（2）得到的双功能交联剂修饰的多糖微球，例如0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g，优选0.1~0.8g，进一步优选0.2~0.6g。
优选地，步骤（3）所述活化剂为溴水。优选地，所述溴水的加入量为：滴加溴水至溶液呈深黄色，持续1min不变色。当反应结束，可加入甲酸钠使溴水褪色，得到白色凝胶微球。
步骤（3）加入活化剂，双功能交联剂的惰性基团活化后，然后再调节pH至碱性条件，双功能交联剂的惰性基团便可以进一步和多糖链上的羟基反应。
优选地，步骤（3）所述碱性条件下，OH-的浓度为0.05~5mol/L，例如0.5mol/L、1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L、3.5mol/L、4mol/L、4.5mol/L、4.9mol/L，优选0.25~2.5mol/L，进一步优选1mol/L。
为了防止糖环在碱性条件下发生裂解，步骤（3）中可加入NaBH4。
优选地，步骤（4）所述方法为：将步骤（3）得到的多糖微球溶于水中，在碱性条件下，加入交联剂，进行交联反应。
优选地，步骤（4）中将步骤（3）得到的多糖微球溶于水中，使每ml水中含有0.1~1g的步骤（3）得到的多糖微球，例如0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g，优选0.1~0.8g，进一步优选0.2~0.6g。
优选地，通过添加碱性物质实现碱性条件，优选添加KOH、NaOH、Ca(OH)2、Ba(OH)2或氨水中的一种或者至少两种的混合物，所述混合物例如氨水和Ba(OH)2的混合物，Ca(OH)2和NaOH的混合物，KOH和氨水的混合物，Ba(OH)2、Ca(OH)2和NaOH的混合物，进一步优选NaOH。
优选地，所述碱性条件下，OH-的浓度为0.2~2mol/L，例如0.3mol/L、0.6mol/L、0.9mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L，优选0.25~1.5mol/L，进一步优选1mol/L。
优选地，步骤（4）中所述交联剂选自环氧氯丙烷、1,4-丁二醇双缩水甘油醚、二溴丙醇或二乙烯砜中的一种或者至少两种的混合物，所述混合物例如二乙烯砜和二溴丙醇的混合物，1,4-丁二醇双缩水甘油醚和环氧氯丙烷的混合物，二乙烯砜、二溴丙醇和1,4-丁二醇双缩水甘油醚的混合物，环氧氯丙烷、二乙烯砜、二溴丙醇和环氧氯丙烷的混合物，优选环氧氯丙烷。
优选地，步骤（4）中所述交联剂的体积占步骤（4）中多糖微球溶于水形成的溶液的体积的1~20%，例如2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、19%，优选2~18%，进一步优选3~15%。
优选地，所述交联反应的温度为25~50℃，例如28℃、32℃、35℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、49℃，优选30~50℃，进一步优选40℃。
优选地，所述交联反应的时间为4~24h，例如5h、7h、9h、11h、13h、15h、17h、19h、21h、22h、23h，优选5~20h，进一步优选10~20h，更优选16h。
所述交联反应可以重复一次或多次，一次交联反应结束后，可继续按照如上所述步骤（4）所述的方法进行下一次的交联反应，所述交联反应的次数为至少1次，例如2次、3次、4次，优选1次或2次。进行多次交联反应后，所述凝胶微球的交联度更高，强度更大，性能更加优异。
本发明的目的之三在于提供如上所述的高强度多糖类凝胶微球的用途，所述多糖类凝胶微球经活化后，可以连接不同的功能基团，制备成疏水介质、离子交换介质、金属螯合介质以及亲和介质，作为层析分离填料。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明提出一种新型的共混制备高强度多糖类凝胶微球的方法，即先向多糖溶液中预引入交联剂，制备修饰的多糖原料；然后将其与未修饰原料按一定比例混合后凝胶化成球，然后经过后期活化交联，得到高强度的多糖微球；
（2）与现有技术相比，本发明提供的高强度多糖类凝胶微球制备方法具有以下优点：在凝胶化之前预引入交联剂，可以有效避免传统方法中交联剂在凝胶网络结构中扩散缓慢的问题。但是过量的交联剂会占据多糖链上大量的羟基位点，阻碍了凝胶化过程中氢键的形成，破坏了凝胶化过程中自发形成的有序结构，导致微球表面出现褶皱和变形。为了解决这一问题，本发明提出了新型的共混制备高强度多糖凝胶微球的方法，即将双功能交联剂修饰的多糖原料与未修饰原料按照一定比例混合后再进行微球化。其中，双功能交联剂修饰的多糖链经后期活化后，在凝胶纤维束内部以及纤维束之间形成刚性的共价连接，大大增加了多糖微球的机械强度。而未修饰的多糖链在共混溶液中均匀分散，为凝胶化过程中氢键的形成提供了足够的羟基，起到骨架支撑的作用，使得产品的球形以及凝胶网络结构得以很好的保持。而通过调节修饰多糖原料中交联剂的浓度，以及共混配方中修饰原料所占比例，可以方便地实现对凝胶微球强度的调控，满足不同的生产需求；
（3）与现有商品化多糖类分离介质相比，本发明提供的多糖微球不但具有多孔性、亲水性、电中性以及可衍生化等优良特性，同时具有高流速和良好的机械强度，使用过程中操作流速可达1000-6000cm/h，是一种半刚性的层析分离填料，可以满足生物大分子大规模分离纯化的需求。
附图说明
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
图1为实施例1制备的浓度4wt%的高强度琼脂糖微球的扫描电子显微镜照片；
图2为实施例2和对比例1制备的浓度4wt%的交联琼脂糖微球的压力-流速曲线对比图；
图3为对比例2制备的浓度4wt%的交联琼脂糖微球的扫描电子显微镜照片；
图4为实施例6制备的浓度12wt%的高强度葡聚糖微球的扫描电子显微镜照片；
图5为实施例7制备的浓度8wt%的高强度魔芋葡甘聚糖微球的扫描电子显微镜照片。
具体实施方式
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
实施例1共混法制备浓度4wt%的高强度琼脂糖微球
（1）琼脂糖原料的修饰
称取4g琼脂糖粉，加入40mL水，加热溶解，得到10%的琼脂糖溶液，降温至65℃左右，向其中缓慢加入40%NaOH溶液0.5mL和双功能交联剂烯丙基缩水甘油醚6mL。其中，烯丙基缩水甘油醚在水相中的浓度为15%，OH-的浓度为0.21mol/L。在65℃下搅拌反应8h后，用60%的冰醋酸溶液调节pH值7～8终止反应，得到了烯丙基化的琼脂糖溶液。向溶液中加入4倍体积的乙醇，离心收集沉淀，-70℃下预冻2小时，冷冻干燥72小时得到修饰的琼脂糖原料。
（2）共混制备交联剂修饰的琼脂糖微球
准确称取修饰的琼脂糖原料1.20g（占共混原料总质量的50%），未修饰琼脂糖原料1.20g（占共混原料总质量的50%），共同加热溶解于60mL去离子水中，配成4%的共混琼脂糖溶液作为分散相。向600mL液体石蜡/石油醚的混合溶液中（V液体石蜡：V石油醚=11:1），加入6%的油溶性乳化剂Span80，作为连续相。将油相预热至60℃，在自身重力作用下，分散相缓慢通过平均孔径25.9μm的疏水性SPG微孔膜进入到连续相中，形成均一的W/O型乳液。整个乳化过程在60℃下完成，制备期间用磁力搅拌使乳液保持均匀分散。膜乳化过程结束后，将乳液转入三口瓶中，在90rpm的搅拌转速下，将所得W/O型乳液缓慢降温至20℃以下，使其固化形成微球，并依次用石油醚、乙醇及蒸馏水洗涤得到浓度为4%的修饰琼脂糖微球。
（3）琼脂糖微球内部交联
将20g修饰琼脂糖微球分散于40g水中，加入2gNaAc，搅拌5min，滴加溴水至溶液呈深黄色，持续1min不变色，继续反应15min。然后，加入甲酸钠至凝胶呈白色，水洗三次。将该溴化凝胶重新分散于20mL水中，加入2gNa2SO4，搅拌15min后，加入40%NaOH溶液2mL（含有5%NaBH4），反应2h。然后转入恒温水浴振荡器中，37.5℃振荡反应12h后，水洗至中性，得到浓度为4%的高交联琼脂糖微球。采用上述共混法制备的琼脂糖微球球形圆整（扫描电子显微镜如图1所示），平均粒径85.33μm。
（4）琼脂糖微球强度的评价
交联后的微球进行机械强度的检测，评价指标为压力-流速曲线。实验方法如下：取8mL上述高交联琼脂糖微球，装于1.0cm×10cm的层析柱中。柱床稳定后，通过逐步间隔式增大流速，观察压力的变化。当流速增大到一定程度时，压力在这一流速点上不再恒定，而是不断上升，此时停止测定。以流速对压力作图，绘制压力-流速曲线。观察曲线的线性范围，最高点即为凝胶所能承受的最大流速。样品所能达到的流速越高，说明交联后微球的机械强度越好。采用上述共混法制备的琼脂糖微球在线性范围内所承受的最大流速为1834cm/h。
实施例2共混法制备浓度4wt%的高强度琼脂糖微球
为了进一步增加琼脂糖凝胶微球的强度，在实施例1所述交联工艺的基础上，采用传统方法继续交联一次。即，取实施例1步骤（3）所得交联琼脂糖微球20g，分散于40mL去离子水中，逐渐升温至47.5℃，持续2h。之后，向体系中缓慢滴加1.6mL环氧氯丙烷和2.4mL 40%NaOH溶液（含有3%NaBH4），于恒温水浴振荡器中继续反应12h。交联结束后，水洗至中性，所得4wt%高交联琼脂糖微球平均粒径86.41μm，在线性范围内所承受的最大流速为2980cm/h。压力流速曲线如图2所示。
对比例1传统方法制备浓度4wt%的交联琼脂糖微球
采用传统交联方式制备交联琼脂糖微球。首先配制4%琼脂糖溶液，以此为分散相，按照实施例1步骤（2）中的工艺采用SPG膜乳化法制备琼脂糖微球，然后按照实施例2中的交联方法对所得琼脂糖微球进行交联，得到交联琼脂糖微球。产品平均粒径89.95μm，在线性范围内所承受的最大流速仅为153cm/h。压力流速曲线如图2所示。
对比例2预引入交联剂制备浓度4wt%的交联琼脂糖微球
采用和实施例1相同的配方，但是不采用共混的方法，直接以实施例1步骤（1）中所述烯丙基化的琼脂糖溶液为分散相，SPG膜乳化制备交联剂修饰的琼脂糖微球，活化后实现微球内部交联。具体操作如下：
（1）交联剂修饰的琼脂糖微球的制备
配制10%的琼脂糖溶液，加热溶解后降温至60℃左右，向其中缓慢加入40%NaOH溶液和烯丙基缩水甘油醚，使得碱和交联剂在体系中的浓度与实施例1相同。搅拌反应8h后，用60%的冰醋酸溶液调节pH值7～8终止反应，得到了烯丙基化的琼脂糖溶液，以此作为分散相。连续相配方和膜乳化操作条件同实施例1，得到交联剂修饰的琼脂糖微球。
（2）琼脂糖微球内部交联
修饰琼脂糖微球的活化和交联操作条件同实施例1。
所得高交联琼脂糖微球在线性范围内所承受的最大流速为1917cm/h，与实施例1接近；但是产品发生严重的收缩和变形，平均粒径仅为41.90μm，而且微球表面出现大量不规则的凹陷（扫描电子显微镜照片如图3所示）。
实施例3共混法制备浓度6wt%的高强度琼脂糖微球
（1）琼脂糖原料的修饰
配制40mL浓度为18%的琼脂糖溶液，降温至80℃左右，向其中缓慢加入40%NaOH溶液3mL和交联剂烯丙基缩水甘油醚8mL。其中，烯丙基缩水甘油醚在水相中的浓度为20%，OH-的浓度为1.25mol/L。在80℃下搅拌反应3h后，用60%的冰醋酸溶液调节pH值7～8终止反应，得到了烯丙基化的琼脂糖溶液。向溶液中加入4倍体积的乙醇，离心收集沉淀，-70℃下预冻2小时，冷冻干燥72小时得到修饰的琼脂糖原料。
（2）共混制备交联剂修饰的琼脂糖微球
准确称取修饰琼脂糖原料3.24g（占共混原料总质量的90%），未修饰琼脂糖原料0.36g（占共混原料总质量的10%），共同加热溶解于60mL去离子水中，配成6%的共混琼脂糖溶液作为分散相。向240mL液体石蜡和石油醚的混合溶液中加入2.5%的油溶性乳化剂Span80，作为连续相。采用机械搅拌法制备W/O型乳液，其中，转速600rpm，乳化时间15min，其余同实施例1。固化、洗球后，经后期筛分得到粒径均一的修饰琼脂糖微球。
（3）琼脂糖微球内部交联
修饰琼脂糖微球的活化和交联操作条件同实施例1步骤（3）。
为了进一步增加琼脂糖微球的机械强度，以二溴丙醇为交联剂继续交联一次，交联步骤和参数同实施例2，得到浓度为6%的高交联琼脂糖微球。产品球形圆整，平均粒径93.04μm，在线性范围内所承受的最大流速为4509cm/h。
实施例4共混法制备浓度8wt%的高强度琼脂糖微球
（1）琼脂糖原料的修饰
配制40mL浓度5%的琼脂糖溶液，降温至70℃左右，向其中缓慢加入40%NaOH溶液4.0mL和交联剂烯丙基溴10mL。其中，烯丙基溴在水相中的浓度为25%，OH-的浓度为1.66mol/L。在70℃下搅拌反应1.5h后，用60%的冰醋酸溶液调节pH值7～8终止反应，得到了烯丙基化的琼脂糖溶液。向溶液中加入4倍体积的乙醇，离心收集沉淀，-70℃下预冻2小时，冷冻干燥72小时得到修饰的琼脂糖原料。
（2）共混制备交联剂修饰的琼脂糖微球
准确称取修饰琼脂糖原料3.36g（占共混原料总质量的70%），未修饰琼脂糖原料1.44g（占共混原料总质量的30%），共同加热溶解于60mL去离子水中，配成8%的共混琼脂糖溶液作为分散相。采用机械搅拌法制备W/O型乳液，乳化步骤同实施例3。固化、洗球后，经后期筛分得到粒径均一的修饰琼脂糖微球。
（3）琼脂糖微球内部交联
修饰琼脂糖微球的活化和交联操作条件同实施例1步骤（3）。
为了进一步增加琼脂糖微球的机械强度，分别以1,4-丁二醇双缩水甘油醚和环氧氯丙烷为交联剂，采用两步交联的方法继续交联，具体步骤如下。取实施例4步骤（2）中所得交联琼脂糖微球20g，分散于20mL去离子水中，加入长链交联剂1,4-丁二醇双缩水甘油醚4mL，室温下于恒温水浴摇床中震荡2h，静置过夜。缓慢升温至30℃，向体系中缓慢滴加1.0mL40%NaOH溶液（含有3%NaBH4），交联反应5h后，逐渐升温至47.5℃。向体系中滴加4mL短链交联剂环氧氯丙烷并补加1.6mL40%NaOH溶液（含有3%NaBH4），继续反应12h。交联结束后，水洗至中性，得到浓度为8%的高交联琼脂糖微球。产品球形圆整，平均粒径76.92μm，在线性范围内所承受的最大流速为4739cm/h。
实施例5共混法制备浓度2wt%的高强度琼脂糖微球
（1）琼脂糖原料的修饰
配制40mL浓度为10%的琼脂糖溶液，降温至60℃左右，向其中缓慢加入40%NaOH溶液2.5mL和交联剂烯丙基溴5mL。其中，烯丙基溴在水相中的浓度为12.5%，OH-的浓度为1.0mol/L。在60℃下搅拌反应2h后，用60%的冰醋酸溶液调节pH值7～8终止反应，得到了烯丙基化的琼脂糖溶液。向溶液中加入4倍体积的乙醇，离心收集沉淀，-70℃下预冻2小时，冷冻干燥72小时得到修饰的琼脂糖原料。
（2）共混制备交联剂修饰的琼脂糖微球
准确称取修饰琼脂糖原料0.96g（占共混原料总重量的80%），未修饰琼脂糖原料0.24g（占共混原料总重量的20%），共同加热溶解于60mL去离子水中，配成2%的共混琼脂糖溶液作为分散相。采用微孔膜乳化法制备W/O型乳液，膜乳化压力7.5kPa，SPG微孔膜孔径15.0μm，其余工艺参数同实施例1，得到浓度为2%的修饰琼脂糖微球。
（3）琼脂糖微球内部交联
修饰琼脂糖微球的活化和交联操作条件同实施例1步骤（3）。
为了进一步增加琼脂糖微球的机械强度，采用两步交联的方法继续交联，交联剂分别选用1,4-丁二醇双缩水甘油醚和二溴丙醇，具体交联工艺同实施例4。
所得浓度为2%的高交联琼脂糖微球球形圆整，平均粒径49.12μm，在线性范围内所承受的最大流速为3286cm/h。
实施例6共混法制备浓度12wt%的高强度葡聚糖微球
（1）葡聚糖的修饰
配制40mL浓度为15%的葡聚糖溶液，降温至70℃左右，向其中缓慢加入40%NaOH溶液2mL和交联剂烯丙基溴10mL。其中，烯丙基溴在水相中的浓度为25%，OH-的浓度为0.84mol/L。在70℃下搅拌反应3h后，用60%的冰醋酸溶液调节pH值7～8终止反应，得到了烯丙基化的葡聚糖溶液。向溶液中加入4倍体积的乙醇，离心收集沉淀，-70℃下预冻2小时，冷冻干燥72小时得到修饰的葡聚糖原料。
（2）共混制备交联剂修饰的葡聚糖微球
准确称取修饰葡聚糖原料5.40g（占共混原料总重量的75%），未修饰葡聚糖原料1.80g（占共混原料总重量的25%），共同加热溶解于60mL去离子水中，配成12%的共混葡聚糖溶液作为分散相。采用机械搅拌法制备W/O型乳液，乳化步骤同实施例3。乳化结束后，采用交联固化的方式制备葡聚糖凝胶微球，即向乳液体系中缓慢滴加双功能交联剂环氧氯丙烷12mL，滴加时间控制在1.5小时左右，滴加结束后继续反应8小时，乳滴在交联过程中逐渐固化。洗去油相，经后期筛分得到粒径均一的修饰葡聚糖微球。
（3）葡聚糖微球内部交联
修饰葡聚糖微球的活化和交联操作条件同实施例1步骤（3）。所得12%的高交联葡聚糖微球球形圆整（扫描电子显微镜如图4所示），平均粒径79.12μm，在线性范围内所承受的最大流速为2464cm/h。
实施例7共混法制备浓度8wt%的高强度魔芋葡甘聚糖微球
（1）魔芋葡甘聚糖的修饰
准确称取2g魔芋葡甘聚糖，加入20mL的稀酸溶液，110℃下高温降解0.5h，然后加入20mL10%的NaOH溶液使完全溶解，得到浓度为5%的魔芋葡甘聚糖溶液（其中，OH-在水相中的浓度为1.38mol/L）。将体系降温至85℃左右，向其中缓慢加入交联剂烯丙基缩水甘油醚4mL，使其在体系中的浓度为10%。85℃下搅拌反应2h后，用60%的冰醋酸溶液调节pH值7～8终止反应，得到烯丙基化的魔芋葡甘聚糖溶液。向溶液中加入4倍体积的乙醇，离心收集沉淀，-70℃下预冻2小时，冷冻干燥72小时得到修饰的魔芋葡甘聚糖原料。
（2）共混制备交联剂修饰的魔芋葡甘聚糖微球
将51mL浓度为8wt%的修饰魔芋葡甘聚糖浆液，与9mL浓度为8wt%的未修饰魔芋葡甘聚糖浆液混合，得到8wt%的共混魔芋葡甘聚糖溶液60mL。即，修饰魔芋葡甘聚糖原料占共混配方总质量的85%，未修饰魔芋葡甘聚糖原料占共混配方总质量的15%。以此共混溶液为分散相，采用微孔膜乳化法制备W/O型乳液，膜乳化压力10kPa，SPG微孔膜孔径19.6μm，其余工艺参数同实施例1。乳化结束后，采用交联固化的方式制备魔芋葡甘聚糖凝胶微球，其中交联剂环氧氯丙烷用量24mL，其余同实施例6。洗去油相，经后期筛分得到粒径均一的修饰魔芋葡甘聚糖微球。
（3）魔芋葡甘聚糖微球内部交联
修饰魔芋葡甘聚糖微球的活化和交联操作条件同实施例1步骤（3）。所得8%的高交联魔芋葡甘聚糖微球球形圆整（扫描电子显微镜如图5所示），平均粒径66.20μm，在线性范围内所承受的最大流速为2090cm/h。
实施例8
（1）琼脂糖原料的修饰
称取4g琼脂糖粉，加入4000mL水，加热溶解，得到0.1%的琼脂糖溶液，降温至65℃左右，向其中缓慢加入40%NaOH溶液0.5mL和双功能交联剂烯丙基缩水甘油醚40mL。其中，烯丙基缩水甘油醚在水相中的浓度为1%，OH-的浓度为0.05mol/L。在40℃下搅拌反应10h后，用60%的冰醋酸溶液调节pH值7～8终止反应，得到了烯丙基化的琼脂糖溶液。向溶液中加入4倍体积的乙醇，离心收集沉淀，-70℃下预冻2小时，冷冻干燥72小时得到修饰的琼脂糖原料。
（2）共混制备交联剂修饰的琼脂糖微球
准确称取修饰的琼脂糖原料1.20g（占共混原料总质量的10%），未修饰琼脂糖原料10.8g（占共混原料总质量的90%），共同加热溶解于12000mL去离子水中，配成0.1%的共混琼脂糖溶液作为分散相。向600mL棉籽油溶液中加入1%的油溶性乳化剂Span80，作为连续相。将油相预热至60℃，在膜乳化压力20KPa作用下，分散相缓慢通过平均孔径0.5μm的疏水性SPG微孔膜进入到连续相中，形成均一的W/O型乳液。整个乳化过程在60℃下完成，制备期间用磁力搅拌使乳液保持均匀分散。膜乳化过程结束后，将乳液转入三口瓶中，在90rpm的搅拌转速下，将所得W/O型乳液缓慢降温至20℃以下，使其固化形成微球，并依次用石油醚、乙醇及蒸馏水洗涤得到浓度为0.1%的修饰琼脂糖微球。
（3）琼脂糖微球内部交联
将2g步骤（2）得到的修饰琼脂糖微球分散于40g水中，使每ml水中含有0.05g步骤（2）得到的修饰琼脂糖微球，然后加入2gNaAc，搅拌5min，滴加溴水至溶液呈深黄色，持续1min不变色，继续反应15min。然后，加入甲酸钠至凝胶呈白色，水洗三次。将该溴化凝胶重新分散于20mL水中，加入2gNa2SO4，搅拌15min后，加入40%NaOH溶液2mL（含有5%NaBH4），OH-浓度为0.05mol/L，反应2h。然后转入恒温水浴振荡器中，37.5℃振荡反应12h后，水洗至中性，得到浓度为0.1%的高交联琼脂糖微球。采用上述共混法制备的琼脂糖微球球形圆整，平均粒径4.56μm。
（4）为了进一步增加琼脂糖凝胶微球的强度，在实施例8所述交联工艺的基础上，采用传统方法继续交联一次。即，取实施例8步骤（3）所得交联琼脂糖微球4g，分散于40mL去离子水中，使ml水中含有步骤（3）所得交联琼脂糖微球0.1g，逐渐升温至47.5℃，持续2h。之后，向体系中缓慢滴加0.4mL环氧氯丙烷和2.4mL 40%NaOH溶液（含有3%NaBH4），OH-浓度为0.2mol/L，于25℃恒温水浴振荡器中继续反应24h。交联结束后，水洗至中性，所得0.1wt%高交联琼脂糖微球平均粒径86.41μm，在线性范围内所承受的最大流速为97cm/h。
实施例9
（1）琼脂糖原料的修饰
称取4g琼脂糖粉，加入20mL水，加热溶解，得到20%的琼脂糖溶液，降温至65℃左右，向其中缓慢加入40%NaOH溶液0.5mL和双功能交联剂烯丙基缩水甘油醚10mL。其中，烯丙基缩水甘油醚在水相中的浓度为50%，OH-的浓度为5mol/L。在100℃下搅拌反应0.5h后，用60%的冰醋酸溶液调节pH值7～8终止反应，得到了烯丙基化的琼脂糖溶液。向溶液中加入4倍体积的乙醇，离心收集沉淀，-70℃下预冻2小时，冷冻干燥72小时得到修饰的琼脂糖原料。
（2）共混制备交联剂修饰的琼脂糖微球
准确称取修饰的琼脂糖原料4g（占共混原料总质量的95%），未修饰琼脂糖原料0.2g（占共混原料总质量的5%），共同加热溶解于21mL去离子水中，配成20%的共混琼脂糖溶液作为分散相。向600mL蓖麻油溶液中加入10%的油溶性乳化剂Span80，作为连续相。将油相预热至60℃，用机械搅拌法制备W/O型乳液，其中，转速1000rpm，乳化时间15min。乳化过程结束后，将乳液转入三口瓶中，在90rpm的搅拌转速下，将所得W/O型乳液缓慢降温至20℃以下，使其固化形成微球，并依次用石油醚、乙醇及蒸馏水洗涤筛分后得到浓度为20%的修饰琼脂糖微球。
（3）琼脂糖微球内部交联
将20g步骤（2）得到的修饰琼脂糖微球分散于20g水中，使每ml水中含有1g步骤（2）得到的修饰琼脂糖微球，然后加入2gNaAc，搅拌5min，滴加溴水至溶液呈深黄色，持续1min不变色，继续反应15min。然后，加入甲酸钠至凝胶呈白色，水洗三次。将该溴化凝胶重新分散于20mL水中，加入2gNa2SO4，搅拌15min后，加入40%NaOH溶液2mL（含有5%NaBH4），OH-浓度为5mol/L，反应2h。然后转入恒温水浴振荡器中，37.5℃振荡反应12h后，水洗至中性，得到浓度为20%的高交联琼脂糖微球。采用上述共混法制备的琼脂糖微球球形圆整，平均粒径92.11μm。
（4）为了进一步增加琼脂糖凝胶微球的强度，在实施例9所述交联工艺的基础上，采用传统方法继续交联一次。即，取实施例9步骤（3）所得交联琼脂糖微球20g，分散于20mL去离子水中，使ml水中含有步骤（3）所得交联琼脂糖微球1g，逐渐升温至47.5℃，持续2h。之后，向体系中缓慢滴加4mL环氧氯丙烷和2.4mL 40%NaOH溶液（含有3%NaBH4），OH-浓度为2mol/L，于50℃恒温水浴振荡器中继续反应4h。交联结束后，水洗至中性，所得20%高交联琼脂糖微球平均粒径90.09μm，在线性范围内所承受的最大流速为5520cm/h。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种可用于层析分离填料的高强度多糖类凝胶微球，其特征在于，所述凝胶微球具有半刚性的骨架结构，最大流速为1000-6000cm/h。
2.如权利要求1所述的凝胶微球，其特征在于，所述多糖优选天然多糖，进一步优选琼脂糖、葡聚糖或魔芋葡甘聚糖中的任意一种，更进一步优选琼脂糖。
3.一种如权利要求1或2所述的凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）多糖原料的修饰：配制多糖溶液，并加入双功能交联剂，在碱性条件下，其一端的活性基团与多糖链上的羟基反应，然后调节pH至中性，终止反应，加入过量乙醇，亲水性的多糖链沉淀析出，将离心得到的沉淀干燥，得到修饰的多糖原料；
（2）共混制备双功能交联剂修饰的多糖微球：将步骤（1）得到的修饰的多糖原料和未修饰的多糖原料混合溶于水，得到共混多糖溶液，将其分散在溶解有乳化剂的油相中，乳化，固化得到双功能交联剂修饰的多糖微球；
（3）双功能交联剂修饰的多糖微球的活化和交联：将步骤（2）得到的双功能交联剂修饰的多糖微球溶于水中，加入活化剂活化双功能交联剂的惰性基团，然后调节pH至碱性条件，双功能交联剂的惰性基团和多糖链上的羟基反应，得到高强度多糖类凝胶微球。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）后任选进行：
（4）采用交联剂对步骤（3）得到的多糖类凝胶微球继续交联至少一次，优选一次或两次。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中多糖溶液的浓度为0.1~20%（w/v），优选1~20%（w/v），进一步优选2~15%（w/v）；
优选地，所述双功能交联剂至少含有一个活性基团和一个惰性基团，所述活性基团可以直接和多糖链上羟基反应，所述惰性基团经活化后可以和多糖链上羟基反应，进一步优选所述双功能交联剂选自烯丙基缩水甘油醚、烯丙基溴、甲基丙烯酸缩水甘油醚、4-乙烯基环氧环己烷或肉桂酰氯中的任意一种，更进一步优选为烯丙基缩水甘油醚或烯丙基溴；
优选地，所述双功能交联剂的体积占多糖溶液体积的1~50%，优选5~25%，进一步优选10~20%；
优选地，步骤（1）所述碱性条件下，OH-的浓度为0.05~5mol/L，优选0.2~2mol/L，进一步优选1mol/L；
优选地，步骤（1）所述反应的温度为40~100℃，优选50~90℃，进一步优选55~80℃；
优选地，步骤（1）所述反应的时间为0.5~10h，优选1~9h，进一步优选2~8h。
6.如权利要求3-5之一所述的方法，其特征在于，通过加入冰醋酸调节pH至中性，优选60%冰醋酸；
优选地，步骤（1）所述干燥选自真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥中的任意一种，优选冷冻干燥；
优选地，所述冷冻干燥的方法为：将沉淀在-70℃下预冻2小时，然后在真空状态下干燥至少24小时；
优选地，步骤（2）修饰的多糖原料质量占共混多糖总质量的10~95wt%，优选40~90wt%，进一步优选50~80wt%；
优选地，步骤（2）所述共混多糖溶液的浓度为0.1~20%（w/v），优选1~15%（w/v），进一步优选2~10%（w/v）；
优选地，步骤（2）所述乳化剂优选油溶性乳化剂，进一步优选自Span80，Arlacel83，PO-500或PO-310中的一种或者至少两种的混合物；
优选地，所述乳化剂的浓度为1~10%（w/v），优选1~8%（w/v），进一步优选2~6%（w/v）。
7.如权利要求3-6之一所述的方法，其特征在于，所述油相选自液体石蜡、石油醚、棉籽油、橄榄油或蓖麻油中的一种或者至少两种的混合物，优选液体石蜡和石油醚的混合物，进一步优选液体石蜡和石油醚的体积比为11:1的混合物；
优选地，步骤（2）所述乳化方法选自微孔膜乳化法，机械搅拌法或喷射法中的任意一种，优选为微孔膜乳化法；
优选地，所述微孔膜优选疏水膜及表面修饰为疏水性的亲水膜，进一步优选聚乙烯微孔膜和/或SPG微孔膜，更优选SPG微孔膜；
优选地，所述SPG微孔膜孔径为0.5-100μm，优选为5-50μm，进一步优选10~40μm；
优选地，步骤（2）所述固化方法为冷却固化法或交联固化法；
优选地，当所述多糖为琼脂糖时，采用冷却固化法，当所述多糖为葡聚糖或魔芋葡甘聚糖时，采用交联固化法。
8.如权利要求3-7之一所述的方法，其特征在于，当所述双功能交联剂为烯丙基缩水甘油醚或烯丙基溴时，步骤（2）得到的双功能交联剂修饰的多糖微球为烯丙基化的多糖微球，所述烯丙基的浓度为10~500μmol/每克多糖微球，优选为20~200μmol/每克多糖微球，进一步优选30~100μmol/每克多糖微球；
优选地，步骤（3）中将步骤（2）得到的双功能交联剂修饰的多糖微球溶于水中，使每ml水中含有0.05~1g的步骤（2）得到的双功能交联剂修饰的多糖微球，优选0.1~0.8g，进一步优选0.2~0.6g；
优选地，步骤（3）所述活化剂为溴水；
优选地，所述溴水的加入量为：滴加溴水至溶液呈深黄色，持续1min不变色；
优选地，步骤（3）所述碱性条件下，OH-的浓度为0.05~5mol/L，优选0.25~2.5mol/L，进一步优选1mol/L。
9.如权利要求3-8之一所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述方法为：将步骤（3）得到的多糖微球溶于水中，在碱性条件下，加入交联剂，进行交联反应；
优选地，步骤（4）中将步骤（3）得到的多糖微球溶于水中，使每ml水中含有0.1~1g的步骤（3）得到的多糖微球，优选0.1~0.8g，进一步优选0.2~0.6g；
优选地，通过添加碱性物质实现碱性条件，优选添加KOH、NaOH、Ca(OH)2、Ba(OH)2或氨水中的一种或者至少两种的混合物，进一步优选NaOH；
优选地，所述碱性条件下，OH-的浓度为0.2~2mol/L，优选0.25~1.5mol/L，进一步优选1mol/L；
优选地，步骤（4）所述交联剂选自环氧氯丙烷、1,4-丁二醇双缩水甘油醚、二溴丙醇或二乙烯砜中的一种或者至少两种的混合物，优选环氧氯丙烷；
优选地，步骤（4）所述交联剂的体积占步骤（4）多糖微球溶于水形成的溶液的体积的1~20%，优选2~18%，进一步优选3~15%；
优选地，所述交联反应的温度为25~50℃，优选30~50℃，进一步优选40℃；
优选地，所述交联反应的时间为4~24h，优选5~20h，进一步优选10~20h，更优选16h。
10.一种如权利要求1或2所述的高强度多糖类凝胶微球的用途，其特征在于，所述多糖类凝胶微球经活化后，可以连接不同的功能基团，制备成疏水介质、离子交换介质、金属螯合介质以及亲和介质，作为层析分离填料。
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