CN105153440B - 一种葡聚糖微球凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葡聚糖微球凝胶的制备方法，其步骤如下：分别配制分散相葡聚糖溶液和连续相溶液；将分散相溶液匀速滴加至连续相溶液中，同时利用均质乳化设备使混合物充分乳化；加入交联剂，机械搅拌使混合物充分交联，制得葡聚糖微球凝胶。本发明的葡聚糖微球凝胶选择常见国产原料，其价格低廉，供应周期短，工艺简易可大规模生产，无安全生产和环境污染隐患，广泛应用于不同的检测技术，尤其大大促进微柱凝胶检测技术在国内的普及应用，提高医疗水平。

Description

一种葡聚糖微球凝胶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种水凝胶微球的制备方法，具体涉及一种特定孔径交联葡聚糖微球凝胶的制备方法。

背景技术

微柱凝胶技术是1986年由法国人Dr.Yves Lappierre发明的可用于血型血清学检测的检验技术，1994年获得美国FDA认证，目前在许多发达国家已经作为常规技术应用于临床。属于尺寸排除色谱法(size exclusion chromatography)，其主要原理是利用不同生物大分子具有不同的流体动力学体积，通过具有一定孔径的凝胶(凝胶空隙)来达到分离的目的。以使用微柱凝胶法测定血型为例，在微柱管中，注入微球凝胶作为填充物，微球与微球之间的缝隙形成特定均一的孔径，形成凝胶分子筛，待检红细胞与相应的抗体在凝胶上层结合，经低速离心后，凝集的红细胞块由于体积大，无法通过凝胶分子筛而被阻隔于凝胶中，呈阳性反应，而未与抗体结合的单个游离红细胞则可以通过凝胶分子筛沉积到管底，呈阴性反应，由此判断待检血液的血型。

微柱凝胶法的最大优点就是结果客观，它规定了统一的离心力和离心时间，操作可标准化，红细胞在凝胶中稳定存在，不会产生漂移现象，重复性好，几乎没有人为干扰，方法简单易行。检测后标本(血型卡)图像及实物可以较长时间保存，便于复查。另外，由于所需样本量少，该法特别适合于样本不易抽取的患者(如大面积烧伤者及婴幼儿等)。目前，微柱凝胶技术在欧美等发达国家输血领域已作为常规技术引入到血型定型中。由于正常人红细胞直径为7.0-7.6μm，平均为7.33μm，被相应的抗体结合后，会形成太小不一的凝集块，必须精确控制微柱凝胶间隙在14-20μm之间，以保证筛分出单个红细胞与凝集红细胞块，间隙的大小由微球的粒径大小及均匀度决定，故精确控制微球凝胶的粒径大小及粒径分布范围是微柱凝胶检测技术核心所在。

国内至今仍缺乏对微珠凝胶的合成工艺研究，目前临床应用中主要依赖进口，进口的不同型号微珠凝胶干胶价格高达2.5-3.5万元/公斤，以微珠凝胶与保存液按7：3比例配制成的湿胶，高达2000-3000元/升，货期一般长达6-8周，成本高、货期长等因素严重制约着微柱凝胶技术在国内的普及应用，导致微柱凝胶技术在国内的普及程序低。

除直接应用进口微柱凝胶外，目前可检索到的凝胶合成技术(杨振平，韩杰，荣瑶君，交联葡聚糖凝胶微珠的制备Ⅰ.微珠表面形态的影响因素与控制)主要是：在标准六叶涡轮搅拌釜中，以甲苯等有机溶剂作为连续相，聚乙酸乙烯酯(PVAc)为分散剂，葡聚糖的水溶液为分散相，环氧氯丙烷(ECH)为交联剂，通过反相悬浮聚合的方式得到交联葡聚糖的微球凝胶。以标准六叶涡轮搅拌釜仪器结构复杂，难以标准化控制反应条件，不利于工业化生产；此外，甲苯等有机溶剂大多具是有毒性，会对操作员工和自然环境造成重大的污染，在目前提倡职业健康及环境保护的大趋势下不可以大量使用。

由于甲苯的粘度低，容易造成预分散好的葡聚糖小液滴不同程度的团聚，难以控制微球的粒径大小及分布范围，所制得的微球直径分布在5-300μm之间，而各种应用领域对粒径的要求不一致，粒径分布范围过广导致各种领域应用效果均欠佳。这种方法制得的微球凝胶粒径大小分布范围在5-300μm之间，大小不一，分布不均，不能很好的满足应用需求。

此外，其交联反应的原理为：葡聚糖在碱性条件下，以环氧氯丙烷为交联剂可以得到交联葡聚糖，反应方程式为：

从交联反应机理中可以看出，碱是可以中和交联过程中生成的盐酸，从而使交联反应顺利的进行。当碱性不够强，就会使的交联不完全，从而得到的微球容易造成粘连和机械强度不够，导致微球碎片产生，影响使用效果。而在碱性条件下PVAc会水解成PVA，水解反应方程式为：

根据水解程度的不同，会使-Ac基的残余量不同。当PVAc的水解程度过大时，生成的PVA是水溶性的，就使其失去了作为分散相保护膜的作用，容易造成葡聚糖小液滴发生团聚。因此，在碱性条件下，聚乙酸乙烯酯(PVAc)的分解和葡聚糖的交联反应是个竞争反应。必须要找到一个合适的碱性点，要既利于葡聚糖的交联，又不能使PVAc发生过度的水解，此过程要考虑的影响因素太多，工艺难控制，不利于工业化生产。

发明内容

针对上述问题，本发明提出一种以国产原料为基础，合成价格低廉，工艺可控，安全环保，且粒径大小分布范围窄，机械强度高的交联葡聚糖微珠凝胶的制备方法。

一种葡聚糖微球凝胶的制备方法，其步骤如下：分别配制分散相葡聚糖溶液和连续相溶液；将分散相溶液匀速滴加至连续相溶液中，同时利用均质乳化设备使混合物充分乳化；加入交联剂，机械搅拌使混合物充分交联，制得葡聚糖微球凝胶。

进一步地，所述分散相葡聚糖溶液为葡聚糖的氢氧化钠溶液；所述连续相为加入乳化剂的油；所述交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺。

进一步地，所述氢氧化钠溶液为2.5M氢氧化钠溶液。

进一步地，所述油为蓖麻油、矿物油、橄榄油或大豆油。

进一步地，所述的方法具体包括以下步骤：

1)配制分散相：称取葡聚糖3.0～6.0±0.3g，加入至2.5M氢氧化钠溶液里，置均质乳化设备下搅拌，搅拌参数为600±100rpm，至葡聚糖完全溶解成无色透明溶液，作为分散相，备用；

2)配制连续相：称取司盘802.5±0.3g，加入至60±5g油中，置均质乳化设备下搅拌，搅拌参数为600±100rpm，至司盘80完全溶解至油内；

3)在相同的搅拌速度下，把上述步骤1)制得的分散相滴加至上述步骤2)制得的连续相内，以蠕动泵控制滴加速度为5.0±0.5ml/h；

4)分散乳化反应：控制温度在25±5℃滴加，滴加完成后，保持温度在25±5℃，调节均质乳化设备参数为600～1200±100rpm，25-30min，以充分分散乳化；

5)交联反应：分散乳化完成后，加入交联剂，控制室内温度在25±5℃，切换机械搅拌设备，参数为600±50rpm，14±1h，以充分交联。

进一步地，所述步骤5)中，交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，质量为2.5±0.3g。

进一步地，所述步骤2)中，所述油为蓖麻油、矿物油、橄榄油或大豆油。

进一步地，所述步骤4)和5)中，控制反应温度在20～30℃

进一步地，所述的方法还包括以下步骤：

6)静置：交联反应完成后，静置0.5±0.1h，吸弃上清液，收集微球凝胶。

7)洗涤：以30％乙醇溶液洗涤上述微球凝胶4-5次后，按3：7的比例将乙醇溶液与微球凝胶混合保存，得到所述葡聚糖微球凝胶。

8)干燥：置真空冷冻干燥机内，干燥24±1h形成干粉，收集微球凝胶干粉，得到葡聚糖微球凝胶干粉。

本发明的内容还包括上述制备方法得到的葡聚糖微球凝胶。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

1)采用国产原料为基础，原料易得且成本低，供应周期短，可大幅降低微珠凝胶的价格。

2)采用均质乳化设备作为分散的设备，可控范围大(100-23000rpm)，精确度高(±100rpm)，可以标准化控制分散乳化条件。分散乳化速度对微球大小和分布影响较大，原因是乳化速度越大，越能有足够的切剪力在乳化过程中把大的分散相葡聚糖液滴打成小液滴，合成的微球就会越小。本技术对反应温度无严格要求，在20-30℃温度范围内反应，结果无显著性差异，常温反应有利标准化生产、安全生产及节能减耗。

3)因为油类物质不溶于水，种类繁多，且安全环保易得，本技术采用油类物质可以做为连续相，可以避免甲苯等有机溶剂带来的安全生产及环境污染隐患。

4)油类物质有一定的粘度可以降低预分散好的葡聚糖小液滴的团聚。不同油有着不同的粘度，通过油的种类和配比调节连续相的粘度，可有效控制微球的粒径大小及分布范围，针对性的合成特定粒径的微球凝胶。

5)利用在碱性条件下稳定有效的表面活性剂(如司盘80)作为分散剂，形成油包水的乳化体系，有效的阻住预分散好的葡聚糖小液滴的团聚，可有效控制微球的粒径大小及分布范围。

6)以N,N'-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，固化微球大小，提升微球的机械强度。交联反应仅起到固化、提升微球机械强度的作用，不会对微球的大小产生影响。

7)产品有两个形式，可以是湿胶，也可以通过选择性增加干燥的步骤，将所述葡聚糖微球凝胶干燥成葡聚糖微球凝胶干粉，这样更方便储存和运输。

本发明的葡聚糖微球凝胶的制备方法，通过在一定速度的均质乳化过程中，把葡聚糖水溶液滴加到连续相中，这样葡聚糖水溶液就被打散成小液滴状，小液滴的大小和均质乳化的速度有很大的关系。分散好的小滴液在交联剂MBAM的作用下，固化成有一定机械强度的水凝胶，工艺示意图见图1。在碱性条件下，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺交联葡聚糖是通过葡聚糖上面的羟基和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺上氨基上的侧链反应而完成的，反应化学方程式为：

不同浓度的葡聚糖溶液有着不同的粘度，增加葡聚糖的浓度，就可以增加分散相的粘度，可以得到直径较大的球。主要原因是增加溶液中葡聚糖的浓度，从而会使每滴葡聚糖溶液的粘度增加。分散相粘度增加会减小乳化过程中液滴破碎速率，从而增加乳化液液滴的体积，最后便得到直径大的微球。本发明通过调整不同浓度的葡聚糖溶液，得到不同粒径大小及分布的微球，浓度越大，就可以得到直径分布较大的球。

以不同的乳化速度作用，可以分散成不同粒径大小的微球，乳化过程中的乳化速度越高，可以得到的微球直径就会越小。主要原因是当把乳化时的乳化速度增加，就有足够的切剪力在乳化过程中把大的分散相葡聚糖液滴打碎成小液滴；本发明选择乳化时间为25-30分钟，经过这种条件乳化后，分散好的葡聚糖小液滴在连续相中达到一个半稳定的状态，乳化完成后，加入N,N'-亚甲基双丙烯酰胺交联剂，对打碎的小液滴实施交联反应，不会对最终得到微球的直径产生剧烈的影响，因此可排除交联速度对直径的影响。

不同油有着不同的粘度，通过油的种类和配比调节连续相的粘度，可有效控制微球的粒径大小及分布范围，针对性的合成特定粒径的微球凝胶。增加连续相的粘度可以得到粒径较小的球。这要归因于当连续相有较大的粘度时，乳化时连续相传递给分散相就有很多的能量，分散相得到更多的能量就会得到直径更小的球。另外，当连续相的粘度增加时，在乳化过程中打碎分散好的小液滴碰撞成大液滴的可能性下降，从而也可以得到直径较小的球。本发明以不同的油相为连续相，而得到不同直径分布的微球；蓖麻油的粘度较大，从而可以得到直径更小的微球凝胶。

本发明可以合成粒径分布范围窄、性质稳定的交联葡聚糖微球凝胶，通过紧密聚集在一起，球与球之间形成大小均一的孔隙，作为分子筛，分离血液有形成分、蛋白等，并可以通过调节物料配比及反应条件，控制粒径大小及分布范围，广泛应用到不同的领域。如合成直径分布在30-80μm之间的交联葡聚糖微球凝胶，可应用于临床诊断领域，作为目前最先进的微柱凝胶血型检测卡的核心技术成分，其应用原理是：当一定量直径30-80μm的微球凝胶紧密聚集在一起时，形成约10-20μm凝胶间隙，在凝胶上方加入血型检测试剂及待检血液的红细胞悬液，混匀充分反应后，低速离心，红细胞与相应的抗体发生特异性反应凝集成血块，由于血块体积大，直径远大于20μm，无法通过凝胶间隙而悬浮于凝胶表面，表现为阳性结果；而未与抗体结合的红细胞则以仍以单个游离红细胞的形式存在，正常人红细胞直径为7.0-7.6μm，平均为7.33μm，可以通过凝胶间隙沉积到管底，表现为阴性结果，由此判断待检血液的血型，此方法较传统的玻片凝集法具有准确度高，重复性好，操作简便，无人为因素干扰，结果可保存备查等优点，是目前公认最先进、最安全、最有效的血型分析方法。又如按实际应用需求，合成其他粒径范围的微球凝胶，应用于临床诊断领域微柱凝胶检测法检测各种传染病标记物、癌证标记物等物质，扩展应用于不同分子量的蛋白质、多糖、核酸、氨基酸、多酞、脂类化合物、脂肪酸、甘油脂、类固醇和维生素等物质的分离纯化，也可分离黄酮、蒽醌和色素类有机化合物等。

本发明的葡聚糖微球凝胶选择常见国产原料，其价格低廉，供应周期短，工艺简易可大规模生产，无安全生产和环境污染隐患，广泛应用于不同的检测技术，尤其大大促进微柱凝胶检测技术在国内的普及应用，提高医疗水平。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为本发明的制备方法的流程图。

图2为实施例1制备的葡聚糖微球微球的显微观察照片及部分放大图，随机选取三个微球测量，得其半径分别为37.50μm、17.83μm、26.87μm。

图3为实施例1制备的葡聚糖微球微球粒径范围分布图。

图4为实施例2制备的葡聚糖微球微球的显微观察照片及部分放大图，随机选取三个微球测量，得其半径分别为39.62μm、23.08μm、48.40μm。

图5为实施例2制备的葡聚糖微球微球粒径范围分布图。

图6为实施例3制备的葡聚糖微球微球的显微观察照片及部分放大图，随机选取三个微球测量，得其半径分别为23.60μm、33.94μm、49.81μm。

图7为实施例3制备的葡聚糖微球微球粒径范围分布图。

图8为实施例4制备的葡聚糖微球微球的显微观察照片及部分放大图，随机选取三个微球测量，得其半径分别为62.95μm、63.50μm、85.25μm。

图9为实施例4制备的葡聚糖微球微球粒径范围分布图。

具体实施例

【实施例1】

本实施例包括一种特定孔径交联葡聚糖微球凝胶的合成技术，包括以下步骤：

1)配制2.5M氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠10g，加入100ml蒸馏水，搅拌至无色透明。称取6.0±0.5g至于洁净容器内；

2)配制分散相：称取葡聚糖3.0±0.3g，加入至上述2.5M氢氧化钠溶液里，置均质乳化设备下搅拌，搅拌参数为600±100rpm，3-5min，此时葡聚糖完全溶解成无色透明溶液，作为分散相，备用。

3)称取蓖麻油60±5g，置洁净容器内，备用。

4)配制连续相：称取司盘802.5±0.3g，加入至上述蓖麻油中，置均质乳化设备下搅拌，搅拌参数为600±100rpm，3-5min，此时司盘80完全溶解至蓖麻油内，此为连续相。

5)在相同的搅拌速度下，控制温度在25±5℃，把上述(2)分散相滴加至上述(4)连续相内，以蠕动泵控制滴加速度为5.0±0.5ml/h。

6)分散乳化反应：上述滴加(5)完成后，保持室内温度在25±5℃，调节均质乳化设备参数为1200±100rpm，25-30min，以充分分散乳化。

7)准备交联剂：称取N,N'-亚甲基双丙烯酰胺2.5±0.3g，置洁净容器内，作为交联剂，备用。

8)交联反应：上述分散乳化(6)完成后，控制室内温度在25±5℃，切换机械搅拌设备，参数为600±50rpm，14±1h，以充分交联。

9)静置：上述交联反应(8)完成后，静置0.5±0.1h，吸弃上清液，收集微球凝胶。

10)配制30％乙醇溶液：称取300g无水乙醇加入至700g蒸馏水中，得到1000g30％乙醇溶液，备用。

11)以上述30％乙醇溶液洗涤上述微球凝胶4-5次后，按3：7的比例将乙醇溶液与微球凝胶混合保存。

12)可进一步置真空冷冻干燥机内，干燥24±1h形成干粉，收集微球凝胶干粉保存。100倍生物显微镜观察本实施例的方法制备出的葡聚糖微球微球形态，如图2，随机选取三个微球测量，得其半径分别为37.50μm、17.83μm、26.87μm；取样对凝胶微球粒径范围进行测量统计，其粒径分布范围如图3，其为30-80μm，其中50±5μm微球占80％以上的微球，粒径均匀，弹性良好，可以应用于临床诊断领域中微柱凝胶法分析血型及交叉配血。

【实施例2】

本实施例的葡聚糖微球凝胶的与实施例1基本相同，其区别在于，改变了分散相浓度：本实施例中，步骤2)加入葡聚糖的质量为6.0±0.6g。

100倍生物显微镜观察本实施例的方法制备出的葡聚糖微球微球形态，如图4，随机选取三个微球测量，得其半径分别为39.62μm、23.08μm、48.40μm；，取样对凝胶微球粒径范围进行测量统计，其粒径分布范围如图5，，为40-120μm，可以应用于临床诊断领域中血清学检测，如微柱凝胶法检测特定大小的传染病标记物、癌证标记物等，及用于不同分子量的蛋白质、多糖、核酸、酶等物质的分离纯化。

【实施例3】

本实施例的葡聚糖微球凝胶的与实施例1基本相同，其区别在于，改变了分散乳化速度：本实施例中，步骤6)调节均质乳化设备参数为600±100rpm，25-30min。

100倍生物显微镜观察本实施例的方法制备出的葡聚糖微球微球形态，如图6，随机选取三个微球测量，得其半径分别为23.60μm、33.94μm、49.81μm取样对凝胶微球粒径范围进行测量统计，其粒径分布范围如图7，为40-120μm，可以应用于临床诊断领域中血清学检测，如微柱凝胶法检测特定大小的传染病标记物、癌证标记物等，及用于不同分子量的蛋白质、多糖、核酸、酶等物质的分离纯化。

【实施例4】

本实施例的葡聚糖微球凝胶的与实施例1基本相同，其区别在于，改变了连续相介质和分散乳化速度：本实施例中，步骤3)使用矿物油为连续相，步骤6)调节均质乳化设备参数为600±100rpm，25-30min。

100倍生物显微镜观察本实施例的方法制备出的葡聚糖微球微球形态，如图8，随机选取三个微球测量，得其半径分别为62.95μm、63.50μm、85.25μm取样对凝胶微球粒径范围进行测量统计，其粒径分布范围如图9，为100-180μm，可以应用于不同分子量的蛋白质、多糖、核酸、酶等物质的分离纯化。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims (4)

1.一种葡聚糖微球凝胶的制备方法，其具体包括以下步骤：

1)配制分散相：称取葡聚糖(3.0±0.3)～(6.0±0.3)g，加入至2.5M氢氧化钠溶液里，置均质乳化设备下搅拌，搅拌参数为600±100rpm，至葡聚糖完全溶解成无色透明溶液，作为分散相，备用；

2)配制连续相：称取司盘80 2.5±0.3g，加入至60±5g油中，置均质乳化设备下搅拌，搅拌参数为600±100rpm，至司盘80完全溶解至油内，所述油为蓖麻油、矿物油、橄榄油或大豆油；

3)在相同的搅拌速度下，把上述步骤1)制得的分散相滴加至上述步骤2)制得的连续相内，以蠕动泵控制滴加速度为5.0±0.5ml/h；

4)分散乳化反应：控制温度在25±5℃滴加，滴加完成后，保持温度在25±5℃，调节均质乳化设备参数为(600±100)～(1200±100)rpm，25-30min，以充分分散乳化；

5)交联反应：分散乳化完成后，加入交联剂，控制室内温度在25±5℃，切换机械搅拌设备，参数为600±50rpm，14±1h，以充分交联，所述交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，加入交联剂的质量为2.5±0.3g。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)和5)中，控制反应温度在20～30℃。

4.权利要求1～3任意一项所述制备方法得到的葡聚糖微球凝胶。