CN110038533A - 高磁性微粒径纳米磁珠及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法，包括：将氯化铁、氯化钴和氯化镍等比混合，得到金属盐混合物；将乙二醇与金属盐混合物在机械搅拌条件下充分混合，得到乙二醇与金属盐混合物；在乙二醇与金属盐混合物中加入乙酸钠，并继续进行搅拌，得到混合溶液；将混合溶液倒入非金属材质反应釜中；将反应釜放入控温烘箱，控制烘箱按预设程序工作，使混合溶液热反应，形成铁钴镍合金Fe‑Co‑NiOX磁性纳米颗粒；磁性分离所述铁钴镍合金Fe‑Co‑NiOX磁性纳米颗粒，并对其进行清洗和干燥；在铁钴镍合金Fe‑Co‑NiOX磁性纳米颗粒表层依次包覆碳层和二氧化硅层，并在最外层共价接枝聚乙二醇。本发明解决了现有技术中磁珠粒径较大，分布范围广，比表面积小，磁响应低的技术问题。

Description

高磁性微粒径纳米磁珠及其制备方法
技术领域
本发明涉及DNA检测领域，具体涉及一种高磁性微粒径纳米磁珠及其制备方法。
背景技术
游离DNA(核酸)研究是基因组分子诊断研究的一个热门领域，目前已被临床逐渐运用到了肿瘤的最初诊断到治疗、发展的各个阶段，包括：早期筛查，评估肿瘤的异质性，转移复发风险和预后评估、实时监控治疗反应和耐药，肿瘤分期分级和指导治疗方案选择等。
目前游离DNA的提取方法主要有磁珠法，磁珠法提取核酸技术其原理为：采用超顺磁性纳米颗粒，利用在高盐条件低pH下吸附核酸，然后在低盐高pH下分离核酸的原理进行样本核酸的分离纯化，因其只需要在磁场作用下就高效简易地将核酸分离纯化出来，故其能实现高通量自动化标准化操作。
目前市面上用于核酸提取的磁珠大部分采用传统溶胀法制备而得。基本思路为采用高分子微球(例如：聚苯乙烯微球)在特定有机溶剂环境中，微球发生溶胀，通透性变好。此条件下，Fe3O4磁性纳米颗粒(粒径一般在几十纳米左右)进入微球中。随着有机溶剂不断挥发，微球通透性恢复正常，磁性纳米颗粒镶嵌其中。虽然此种方法制备过程相对简单，但通过此方法制备的磁珠用于生物样品中游离DNA的富集应用中存在一些缺点：1、粒径为微米级，一般在1-4μm范围内，导致磁珠在溶液中的悬浮性较差，容易沉降，影响和样品中游离DNA的相互作用。2、此种磁珠的比表面积较小，可供于DNA的结合位点较少，需增大磁珠用量，才能达到有效分离样品中DNA的目的，增加了成本。3、嵌入高分子球中的Fe3O4磁性纳米粒子粒径太小，磁响应不强，影响磁性分离过程。4、高分子基底材质容易造成较强的非特异性吸附，容易引入杂质，影响下游DNA的检测。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种高磁性微粒径纳米磁珠及其制备方法，旨在解决现有技术中磁珠粒径较大，分布范围广，比表面积小，磁响应低的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出一种高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法，其包括以下步骤：
将氯化铁、氯化钴和氯化镍等比混合，得到金属盐混合物；
将乙二醇与所述金属盐混合物在机械搅拌条件下充分混合，得到乙二醇与金属盐混合物；
在乙二醇与金属盐混合物中加入乙酸钠，并继续进行搅拌，得到混合溶液；
将混合溶液倒入非金属材质反应釜中；
将反应釜放入控温烘箱中，控制烘箱按预设程序工作，使混合溶液热反应，形成铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒；
磁性分离所述铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒，并对其进行清洗和干燥。
优选地，在执行完所有步骤后还包括：
称量一份干燥后的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒，以重量计按1:18的比例配比葡萄糖，加入质量为200倍磁性纳米颗粒的超纯水并在机械搅拌条件下混合均匀；
将混和均匀的溶液倒入非金属材质反应釜中；
将非金属材质反应釜放入控温烘箱中，控制烘箱按预设程序工作，开始溶剂热反应，得到表层包覆有碳层的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C磁性纳米颗粒。
优选地，在执行完所有步骤后还包括：
用乙醇和氨水进行超声分散表层包覆有碳层的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C磁性纳米颗粒，对超声分散后形成的溶液进行机械搅拌，并在机械搅拌过程中加入酸乙酯；
磁性分离所生成的产物，得到表层包覆有无机二氧化硅的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2磁性纳米颗粒。
优选地，在执行完所有步骤后还包括：
在表层包覆有无机二氧化硅的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2磁性纳米颗粒表层共价接枝聚乙二醇。
优选地，所述在表层包覆有无机二氧化硅的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2磁性纳米颗粒表层共价接枝聚乙二醇的步骤包括：
将所述铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2磁性纳米颗粒用异丙醇进行超声分散；
在氮气保护下，对超声分散后的产物进行机械搅拌，并在搅拌过程中加入氨丙基三乙氧基硅烷；
磁性分离搅拌后的产物并用异丙醇和乙醇进行清洗，得到氨基铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2-NH2磁性纳米颗粒；
将所述氨基铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2-NH2磁性纳米颗粒超声分散在2-吗啉缓冲液中，并加入乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC和羧基聚乙二醇COOH-PEG，在机械搅拌条件下进行室温反应；
磁性分离机械搅拌后的产物，用超纯水和乙醇依次清洗得到聚乙二醇铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2-PEG磁性纳米颗粒。
优选地，所述在乙二醇与金属盐混合物中加入乙酸钠，并进行搅拌，得到混合溶液的步骤中：
搅拌速度为200-400转/分，搅拌时间为20-40分钟。
优选地，所述将反应釜放入控温烘箱中，控制烘箱按预设程序工作，使混合溶液热反应，形成铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒的步骤中包括：
在2小时内将温度从30℃提升至150℃，并维持在150℃进行6小时反应，最后在2小时内将温度降至室温。
本发明还提供一种用于高磁性微粒径纳米磁珠，其磁核为铁钴镍合金Fe-Co-NiOX，粒径分布在500-600nm之间。
优选地，前述高磁性微粒径纳米磁珠其表面由内到外依次至少包覆有碳层和无机二氧化硅层，且高磁性微粒径纳米磁珠的最外层共价接枝有聚乙二醇。
本发明通过将氯化铁、氯化钴和氯化镍等比混合并进行机械搅拌得到铁钴镍合金纳米磁珠磁核，具有强磁响应能力，能在外界磁场条件下从溶液环境中有效快速分离。另外，磁珠粒径小且均一，粒径分布在500-600nm之间，在溶液环境中具备良好的悬浮性，有利于磁珠和溶液中DNA的相互接触，促进分离富集过程。
附图说明
图1为本发明高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法一实施例的流程示意图；
图2为本发明高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法另一实施例的流程示意图；
图3为本发明高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法又一实施例的流程示意图；
图4为本发明高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法中在磁性纳米颗粒表层共价接枝聚乙二醇的流程示意图。
具体实施方式
下面将详细描述本发明的实施例，实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同标号表示相同的元件或具有相同功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为解决上述技术问题，本发明提出一种高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法。参照图1所示，该方法包括以下步骤：
步骤S10，将氯化铁、氯化钴和氯化镍等比混合，得到金属盐混合物；本发明一实施例中，可将氯化铁、氯化钴和氯化镍以总量5.4g投入反应，三种盐质量比为1:1:1。
步骤S20，将乙二醇与所述金属盐混合物在机械搅拌条件下充分混合，得到乙二醇与金属盐混合物；本发明实施例中，乙二醇的剂量可根据氯化铁、氯化钴和氯化镍以及搅拌容器的大小进行选择，例如，前述实施例中，可取170毫升乙二醇，和5.4g三种金属盐混合物在机械搅拌条件下充分混合均匀，搅拌速度可视混合物的多少选择200～400rpm(转/分)，搅拌时间可选择为20～40分钟(分钟)。前述实施例中，可选择转速为300rpm，搅拌时间为30分钟。
步骤S30，在乙二醇与金属盐混合物中加入乙酸钠，并继续进行搅拌，得到混合溶液；例如，前述实施例中，可向混合均匀后的液体中加入10g乙酸钠，并继续搅拌30分钟。
步骤S40，将混合溶液倒入非金属材质反应釜中；例如，可将混合后的溶液倒入300毫升容量的特氟龙反应釜中。
步骤S50，将反应釜放入控温烘箱中，控制烘箱按预设程序工作，使混合溶液热反应，形成铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒；本发明实施例中，温度可控制在150℃左右，具体温度程序可以为：2小时内将温度从30℃提升至150℃，并维持在150℃进行6小时反应，最后在2小时内将温度降至室温。
步骤S60，磁性分离所述铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒，并对其进行清洗和干燥。本发明实施例中，可用超纯水和乙醇依次清洗磁性纳米颗粒，用于洗去多余未反应的盐和有机溶剂，然后在60℃真空条件下干燥清洗后的磁性纳米颗粒。
本发明通过将氯化铁、氯化钴和氯化镍等比混合并进行机械搅拌得到铁钴镍合金纳米磁珠磁核，具有强磁响应能力，能在外界磁场条件下从溶液环境中有效快速分离。另外，磁珠粒径小且均一，粒径分布在500-600nm之间，在溶液环境中具备良好的悬浮性，有利于磁珠和溶液中DNA的相互接触，促进分离富集过程。进一步的，本发明磁珠制备过程中用到的反应步骤，属于溶剂热法和凝胶溶胶自组装，都是高度可控的材料制备技术，保证了磁珠生产的重复性。通过验证，此磁珠制备方法产量较大，一次制备能获得1～10克磁珠，可用将近200个核酸提取试剂盒的制备，能较好产业化。
参照图2所示，本发明一较佳实施例中，在执行完所有步骤后还可包括以下步骤：
步骤S70，称量1份干燥后的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒，以重量计按1:18的比例配比葡萄糖，加入质量为200倍磁性纳米颗粒的超纯水并在机械搅拌条件下混合均匀；本发明实施例中，1份铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒可以为1克，可加入18克葡萄糖和200克(200毫升)超纯水在机械搅拌条件下混合均匀，搅拌速度可按前述步骤S30中的搅拌速度。
步骤S80，将混和均匀的溶液倒入非金属材质反应釜中；
步骤S90，将非金属材质反应釜放入控温烘箱中，控制烘箱按预设程序工作，开始溶剂热反应，得到表层包覆有碳层的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C磁性纳米颗粒。程序升温条件可以为：2小时将温度从30℃提升至160℃，并维持在160℃进行4小时反应，最后在2小时内将温度降至室温。
本发明实施例中，通过在磁核-铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒的表层包覆一层惰性碳层，可以将磁核与外界环境分隔，避免外界化学环境对磁核的损坏，影响其磁响应能力。
参照图3所示，本发明一较佳实施例中，在执行完所有步骤后还可包括：
步骤S100，用乙醇和氨水进行超声分散，对超声分散后形成的溶液进行机械搅拌，并在机械搅拌过程中加入正硅酸甲酯；本发明实施例中，可称量1克Fe-Co-NiOX@C磁性纳米颗粒，超声均匀分散在40毫升水中；往上述溶液中加入160毫升乙醇，4毫升氨水(28–30％重量百分含量)，超声分散10分钟；机械搅拌条件下，逐滴加入3毫升正硅酸甲酯，室温反应5小时；
步骤S101，磁性分离所生成的产物，得到表层包覆有无机二氧化硅的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2磁性纳米颗粒。磁性分离生成产物，用超纯水和乙醇依次清洗产物，用于洗去多余未反应的正规酸乙酯和有机溶剂。然后，于60℃真空干燥清洗后的产物(Fe-Co-NiOX@C@SiO2)。
本发明实施例中，由于在磁珠表层包覆有无机二氧化硅，磁珠比表面积大，无机二氧化硅层能提供大量羟基活性位点，用于抓取样品中游离DNA组分，最大程度提高分离提取效率。
进一步地，本发明实施例中，还可在表层包覆有无机二氧化硅的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2磁性纳米颗粒表层共价接枝聚乙二醇。聚乙二醇的引入可以增加磁珠的防聚集性，使得磁珠即使在极端盐浓度和pH环境中都能保持良好的悬浮性。同时，防非特异性吸附分子链聚乙二醇的引入，能有效减小其它分子杂质(例如：蛋白质，无机盐和糖等)非特异吸附干扰，提高分离提取后游离DNA纯度，可直接用于下游检测。
参照图4所示，本发明实施例中，在表层包覆有无机二氧化硅的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2磁性纳米颗粒表层共价接枝聚乙二醇的步骤包括：
步骤S110，将所述铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2磁性纳米颗粒用异丙醇进行超声分散；本发明实施例中，可称量0.5克Fe-Co-NiOX@C@SiO2，加入40毫升异丙醇，超声分散10分钟；
步骤S120，在氮气保护下，对超声分散后的产物进行机械搅拌，并在搅拌过程中加入氨丙基三乙氧基硅烷；可逐滴加入1毫升3-氨丙基三乙氧基硅烷。氮气保护下，以300转/分速度机械搅拌溶液，反应24小时；
步骤S130，磁性分离搅拌后的产物并用异丙醇和乙醇进行清洗，得到氨基铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2-NH2磁性纳米颗粒；磁性分离产物Fe-Co-NiOX@C@SiO2-NH2，异丙醇清洗三遍后，用乙醇清洗一遍。室温干燥Fe-Co-NiOX@C@SiO2-NH2。
步骤S140，将所述氨基铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2-NH2磁性纳米颗粒超声分散在2-吗啉缓冲液中，并加入乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC和羧基聚乙二醇COOH-PEG，在机械搅拌条件下进行室温反应；取上述干燥产物，超声均匀分散在2-吗啉缓冲液中(MES，pH＝4.5–6.5)，并加入20毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和100毫克羧基聚乙二醇(COOH-PEG)。在300转/分机械搅拌条件下，室温反应2小时；
步骤S150，磁性分离机械搅拌后的产物，用超纯水和乙醇依次清洗得到聚乙二醇铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2-PEG磁性纳米颗粒。磁性分离生成产物，用超纯水和乙醇依次清洗产物，用于洗去多余未反应碳酰二亚胺EDC、羧基聚乙二醇COOH-PEG和2-吗啉缓冲液MES。60℃真空干燥，得到最终产物Fe-Co-NiOX@C@SiO2-PEG。
本发明还提供一种用于高磁性微粒径纳米磁珠，其磁核为铁钴镍合金Fe-Co-NiOX，所述磁核采用前述方法制得。本发明通过将氯化铁、氯化钴和氯化镍等比混合并进行机械搅拌得到铁钴镍合金纳米磁珠磁核，具有强磁响应能力，能在外界磁场条件下从溶液环境中有效快速分离。另外，磁珠粒径小且均一，粒径分布在500-600nm之间，在溶液环境中具备良好的悬浮性，有利于磁珠和溶液中DNA的相互接触，促进分离富集过程。另外，本发明磁珠制备过程中用到的反应步骤，属于溶剂热法和凝胶溶胶自组装，都是高度可控的材料制备技术，保证了磁珠生产的重复性。进一步的，此磁珠制备方法产量较大，一次制备能获得1～10克磁珠，可用将近200个核酸提取试剂盒的制备，能较好产业化。
在一较佳实施例中，前述纳米磁珠其表面由内到外依次至少包覆有碳层和无机二氧化硅层，且最外层共价接枝有聚乙二醇。本发明实施例中，纳米磁珠表层包覆碳层、无机二氧化硅层、共价接枝聚乙二醇的方法可参照前述图2至图4所对应实施例，其作用在前面实施例已经详细阐述，在此不作赘述。
以上的仅为本发明的部分或优选实施例，无论是文字还是附图都不能因此限制本发明保护的范围，凡是在与本发明一个整体的构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明保护的范围内。

Claims (9)

1.一种高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将氯化铁、氯化钴和氯化镍等比混合，得到金属盐混合物；
将乙二醇与所述金属盐混合物在机械搅拌条件下充分混合，得到乙二醇与金属盐混合物；
在乙二醇与金属盐混合物中加入乙酸钠，并继续进行搅拌，得到混合溶液；
将混合溶液倒入非金属材质反应釜中；
将反应釜放入控温烘箱中，控制烘箱按预设程序工作，使混合溶液热反应，形成铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒；
磁性分离所述铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒，并对其进行清洗和干燥。
2.根据权利要求1所述的高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法，其特征在于，在执行完所有步骤后还包括：
称量1份干燥后的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒，以重量计按1:18的比例配比葡萄糖，加入质量为200倍磁性纳米颗粒的超纯水并在机械搅拌条件下混合均匀；
将混和均匀的溶液倒入非金属材质反应釜中；
将非金属材质反应釜放入控温烘箱中，控制烘箱按预设程序工作，开始溶剂热反应，得到表层包覆有碳层的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C磁性纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法，其特征在于，在执行完所有步骤后还包括：
用乙醇和氨水进行超声分散表层包覆有碳层的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C磁性纳米颗粒，对超声分散后形成的溶液进行机械搅拌，并在机械搅拌过程中加入酸乙酯；
磁性分离所生成的产物，得到表层包覆有无机二氧化硅的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2磁性纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法，其特征在于，在执行完所有步骤后还包括：
在表层包覆有无机二氧化硅的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2磁性纳米颗粒表层共价接枝聚乙二醇。
5.根据权利要求4所述的高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述在表层包覆有无机二氧化硅的铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2磁性纳米颗粒表层共价接枝聚乙二醇的步骤包括：
将所述铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2磁性纳米颗粒用异丙醇进行超声分散；
在氮气保护下，对超声分散后的产物进行机械搅拌，并在搅拌过程中加入氨丙基三乙氧基硅烷；
磁性分离搅拌后的产物并用异丙醇和乙醇进行清洗，得到氨基铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2-NH2磁性纳米颗粒；
将所述氨基铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2-NH2磁性纳米颗粒超声分散在2-吗啉缓冲液中，并加入乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC和羧基聚乙二醇COOH-PEG，在机械搅拌条件下进行室温反应；
磁性分离机械搅拌后的产物，用超纯水和乙醇依次清洗得到聚乙二醇铁钴镍合金Fe-Co-NiOX@C@SiO2-PEG磁性纳米颗粒。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述在乙二醇与金属盐混合物中加入乙酸钠，并进行搅拌，得到混合溶液的步骤中：
搅拌速度为200-400转/分，搅拌时间为20-40分钟。
7.根据权利要求6所述的高磁性微粒径纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述将反应釜放入控温烘箱中，控制烘箱按预设程序工作，使混合溶液热反应，形成铁钴镍合金Fe-Co-NiOX磁性纳米颗粒的步骤中包括：
在2小时内将温度从30℃提升至150℃，并维持在150℃进行6小时反应，最后在2小时内将温度降至室温。
8.一种高磁性微粒径纳米磁珠，用于富集核酸，其特征在于，其磁核为铁钴镍合金Fe-Co-NiOX，粒径分布在500-600nm之间。
9.根据权利要求8所述的高磁性微粒径纳米磁珠，其特征在于，所述磁核的表层由内到外依次至少包覆有碳层和无机二氧化硅层，且在最外层共价接枝有聚乙二醇。
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