CN112725328A - 诊断磁珠的大规模制造方法及其生物应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于本发明属于生物磁珠技术领域,本发明公开了一种诊断磁珠的大规模制造方法及其生物应用。包括如下步骤:1)制备磁性交联聚维酮颗粒;2)将所述的磁性交联聚维酮修饰多孔无机二氧化硅层以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒;3)将所述的硅基磁性交联聚维酮颗粒修饰有机硅层以制备双层硅基磁性交联聚维酮颗粒。
Description
技术领域
本发明涉及生物磁珠技术领域,具体涉及一种诊断磁珠的大规模制造方法及其生物应用。
背景技术
本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术,仅仅是用于说明和便于理解本发明的发明内容,不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。
生物磁珠由于具有超顺磁性、比表面积大且生物相溶性等特点,在生物分离工程中具有广泛的应用,特别在核酸提取中具有应用前景。现在分子诊断中在核酸提取的前处理过程中使用的磁珠主流为“二氧化硅磁珠”、“磁性硅颗粒”和“硅基磁珠”等,上述名称者本质上都是以磁性原料为核芯,以二氧化硅修饰在外表面的磁性颗粒,商品化的磁性颗粒也大都数是通过溶胶-凝胶法(sol-gel)制备。
现有技术已经可以实现实验室生产几十克至几百克的核酸提取磁珠的实验室生产,但其步骤繁琐或使用大量有机溶剂或使用特定设备,难以实现规模化的制造。
发明内容
本发明所要解决的技术问题再与针对上述现有技术中的不足,提供一种诊断磁珠的大规模制造方法及其生物应用。所述诊断磁珠可以实现公斤级至数十公斤级的规模化生产,无需特定设备,有机溶剂消耗少,无磁性物质泄露,可以用于核酸提取或者纯化的关键性原料。
本发明第一方面的实施例提供了一种诊断磁珠的大规模制造方法,包括如下步骤:
1)制备磁性交联聚维酮颗粒;
2)将所述的磁性交联聚维酮修饰多孔无机二氧化硅层以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒;
3)将所述的硅基磁性交联聚维酮颗粒修饰有机硅层以制备双层硅基磁性交联聚维酮颗粒。
进一步的,所述制备磁性交联聚维酮颗粒包括如下步骤:
1-1)100-500质量份的交联聚维酮颗粒、200-500质量份的甘油、200-1000质量份的乙醇和200-1000质量份的水混合并机械搅拌0.5-1小时至分散;
1-2)通入氮气1小时后,加入100-200质量份的二价铁盐、200-400质量份的三价铁盐和10-100质量份的分散剂;
1-3)加入50-600质量份的弱碱性溶液,升温至40-70℃,反应2-10小时,降至室温得磁性交联聚维酮颗粒。
所述的交联聚维酮颗粒为含有吡咯烷酮结构的多孔状的结构的固体粉末颗粒。
进一步的,所述交联聚维酮颗粒的粒径为2-50μm。
所述的的二价铁盐为硫酸亚铁铵、氯化亚铁、硫酸亚铁和/或其组合,三价铁盐为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁和/或其组合。
进一步的,所述的分散剂为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、聚乙烯吡咯烷酮、吐温20、Brij 56、Brij 58、聚乙二醇辛基苯基醚、Span-80、Span-20、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基硫酸锂、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、聚乙二醇8000、聚乙烯亚胺和/或其组合。
进一步的,弱碱性溶液为氨水、甲酰胺和/或其组合。
进一步的,所述的硅基磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤如下:步骤1的反应器中继续加入100-500质量份的硅酸钠和100-600质量份的冰乙酸溶液,室温下继续搅拌1-5小时,以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒;
硅酸钠在冰乙酸以及分散剂和甲酰胺作用下,会缓慢水解分解成纳米级二氧化硅颗粒沉淀于硅基磁性交联聚维酮颗粒表面以形成多孔无机二氧化硅层。
进一步的,所述双层硅磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
3-1)继续在步骤2中的反应器下加入20-400质量份的多元醇,室温搅拌1小时;
3-2)以流速为1-100mL/min的滴加速度,加入100-400质量份的有机硅源/乙醇混合物,滴加完毕后,继续在室温下搅拌反应2-10小时;
3-3)产物使用乙醇和去离子水反复沉淀清洗3-10次,在40-60℃鼓风干燥箱中烘干;
3-4)将产物加入DEPC处理的无菌水中,磁珠浓度配置为10-200mg/mL,以制备核酸提取磁珠悬浮液(即本发明所述诊断磁珠)。
进一步的,所述多元醇为聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇800、聚乙二醇1000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、季戊四醇、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,4-丁二醇、新戊二醇、二缩二乙二醇、一缩二丙二醇、三羟甲基丙烷、一缩二乙二醇和/或其组合;
所述多元醇为聚乙二醇8000、季戊四醇、三羟甲基乙烷、一缩二乙二醇和/或其组合;
所述的有机硅源为硅酸四乙酯、四(三甲基硅氧基)硅烷、硅酸四丁酯、四甲氧基硅烷、四丙氧基硅烷、正硅酸四异丙酯和/或其组合;有机硅源/乙醇混合物的质量比为1:1-1:5。
本发明第二方面的实施例提供了一种诊断磁珠的应用方法,所述的诊断磁珠为上述的诊断磁珠;应用于新鲜动物组织、动物组织石蜡切片、植物叶片、植物种子、全血、血浆、血清、毛发、指甲、烟蒂、唾液、拭子、细菌或病毒等生物检材中的核酸提取及纯化。
进一步的,包括制作以诊断磁珠为核酸纯化载体的核酸提取或纯化试剂盒,通过该试剂盒从生物检材中提取高纯度和高得率的核酸;其中,所述试剂盒除了诊磁珠外还包括蛋白酶K、裂解液、结合液、清洗液、70-80%乙醇以及洗脱液;所述裂解液为2-8M胍盐、0.5-20%表面活性剂和10-100mM缓冲液;所述结合液为具有1-6个碳原子的短链、支链或直链烷醇;所述清洗液为具有中等离子强度的缓冲液和醇溶液的混合物;所述洗脱液为低离子强度的缓冲液,如5mM Tris-HCl,pH8.0或无核酸水。
本发明提供一种诊断磁珠的大规模制造方法及其生物应用,具有以下优点:
1.在一个反应器中即可得到核酸提取用诊断磁珠。
2.合成步骤简单易规模化应用,产量高且成本低。
3.双层硅修饰使诊断磁珠的磁性物质泄露少,并形成多孔结构,比表面积大。
4.制备诊断磁珠磁性速度分离快,核酸提取载量高。
5.制备诊断磁珠对于痕量样本分离回收率高。
附图说明
图1为交联聚维酮颗粒的结构示意图。
图2是本发明实施例6中稀释PEDV病毒通过本发明提供的核酸提取或纯化试剂盒与不同磁珠配合后提取RNA并通过RT-PCR检测的扩增曲线图,从左到右分别诊断磁珠M1、M2、MagneSil和Dynabeads MyOneTMSilane提取RNA后通过RT-PCR检测的扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,在下述说明中,不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施方式,但本领域技术人员应当明白,这些实施方式只是以实例的方式提供的。在不背离本发明的情况下,本领域技术人员现在将会想到许多变更、变化和替换。应当理解,本文描述的本发明实施方式的许多备选方案可用于实践本发明。
在详细描述本教导之前,应理解本公开不限于具体的组合物或工艺步骤,因为这些可以变化。应当注意,如本说明书和所附权利要求中所使用的,单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代,除非上下文另有明确说明。
本文使用的术语“样本”或“样品”将被理解意为任何这样的样品:可能包含目标核酸物质的样品,术语“样本”或“样品”或可包括溶液,如水溶液、细胞、组织、活检、粉末、或其中一种或多种的组合。样本可以是生物学样本,如唾液、痰、口腔拭子样品、血清、血浆、血液、血沉棕黄层、咽部、鼻部/鼻咽部或鼻窦拭子或分泌物、喉部拭子或刮出物、尿液、粘液、粪便排泄物、直肠拭子、呕吐物、胃液、胃肠道液、精液、精子、尿道拭子和分泌物、脑脊液、哺乳期或经期产物、卵黄、羊水、房水、玻璃体液、宫颈分泌物、阴道液、分泌物、拭子或刮出物、骨髓样本和抽取物、胸膜液和渗出液、汗液、脓、眼泪、淋巴液、支气管或肺灌洗液或抽取物、细胞培养物和细胞悬浮液、结缔组织、上皮、上皮拭子和涂片、粘膜、肌肉组织、胎盘组织、活检、渗出物、器官组织、神经组织、毛发、皮肤、或指甲,其中前述的样本可得自例如脊椎动物,包括哺乳动物。
应当理解,在本公开中讨论的温度、质量、重量、体积比、浓度、时间等之前存在暗示的“约”,使得轻微和非实质性的偏差在本文的教导的范围内。通常,术语“约”表示组合物的组分量的非实质性变化,其对组合物的效果或稳定性没有任何显著影响。而且,“包含”、“含有”、和“包括”的使用不旨在是限制性的。应理解,前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的,并不是对本教导的限制。就通过引用并入的任何材料与本公开的表述内容不一致的程度,则以表述内容为准。
除非特别指出,否则描述为“包含”各种组分的说明书中的实施方式也被认为是“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”;描述为“由各种组分组成”的说明书中的实施方式也被认为是“包含”或“基本上由所述组分组成”。
“核酸”是指包含两个或更多个共价键合的核苷或具有含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷类似物的多聚化合物,其中核苷通过磷酸二酯键或其他键连接在一起,以形成多核苷酸。核酸包括RNA、DNA或嵌合DNA-RNA聚合物或寡核苷酸及其类似物。核酸“骨架”可以由多种连接组成,包括糖-磷酸二酯键、肽-核酸键中的一种或多种。核酸可以包括修饰的碱基以改变核酸的功能或行为,例如添加3'-末端双脱氧核苷酸以阻止另外的核苷酸被添加到核酸中。用于体外制备核酸的合成方法在本领域中是公知的,尽管可以使用常规技术从天然来源纯化核酸。
在本申请中,“提取”、“分离”或“纯化”是指样品的一个或多个组分被除去或与其它样品组分分离。样品组分包含常处于通常水性溶液相中的目标核酸,其也可以包含细胞片段、蛋白质、碳水化合物、脂质、盐离子、金属离子和其它核酸。“提取”、“分离”或“纯化”并不意味着任何程度的纯化。通常,分离或纯化从其它样品组分中去除至少70%或至少80%或至少90%的目标核酸。
一种诊断磁珠的大规模制造方法,所述诊断磁珠的大规模制造方法包括如下步骤:
1)制备磁性交联聚维酮颗粒;
2)对步骤1所述磁性交联聚维酮修饰多孔无机二氧化硅层以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒;
3)对步骤2所述硅基磁性交联聚维酮颗粒修饰有机硅层以制备双层硅基磁性交联聚维酮颗粒。
其中,步骤1)所述磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
1-1)交联聚维酮颗粒、甘油、乙醇和水混合并机械搅拌0.5-1小时至分散;
1-2)通入氮气1小时后,加入二价铁盐、三价铁盐和分散剂;
1-3)加入弱碱性溶液,升温至40-70℃,反应2-10小时,降至室温得磁性交联聚维酮颗粒。
在本发明的一些实施例中,所述步骤1)中的交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
1-1)100-500质量份的交联聚维酮颗粒、200-500质量份的甘油、200-1000质量份的乙醇和200-1000质量份的水混合并机械搅拌0.5-1小时至分散;
1-2)通入氮气1小时后,加入100-200质量份的二价铁盐、200-400质量份的三价铁盐和10-100质量份的分散剂;
1-3)加入50-600质量份的弱碱性溶液,升温至40-70℃,反应2-10小时,降至室温得磁性交联聚维酮颗粒。
在本发明的一些实施例中,所述步骤1)中的交联聚维酮颗粒为含有吡咯烷酮结构的多孔状的结构的固体粉末颗粒。如图1所示。
在本发明的一些实施例中,所述交联聚维酮颗粒的粒径为2-50μm。
在本发明的一些实施例中,所述交联聚维酮颗粒的粒径为5-25μm。
在本发明的一些实施例中,所述步骤1)中的二价铁盐为硫酸亚铁铵、氯化亚铁、硫酸亚铁和/或其组合,三价铁盐为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁和/或其组合。
在本发明的一些实施例中,在本发明的一些实施例中所述步骤1)中的二价铁盐为硫酸亚铁铵,三价铁盐为氯化铁。
在本发明的一些实施例中,所述步骤1)的分散剂为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、聚乙烯吡咯烷酮、吐温20、Brij 56、Brij 58、聚乙二醇辛基苯基醚、Span-80、Span-20、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基硫酸锂、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、聚乙二醇8000、聚乙烯亚胺和/或其组合。
在本发明的一些实施例中,所述步骤1)的分散剂为柠檬酸三钠、聚乙烯吡咯烷酮、Brij 58、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵、聚乙二醇8000、聚乙烯亚胺和/或其组合。
在本发明的一些实施例中,弱碱性溶液可以是氨水、甲酰胺和/或其组合。
在本发明的一些实施例中,弱碱性溶液是甲酰胺,甲酰胺可以提供碱性,并且自身在高温下进行分解导致其pH值下降。
在本发明的一些实施例中,所述步骤1)中的交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
1-1)100-500质量份的5-25μm粒径的交联聚维酮颗粒、200-500质量份的甘油、200-1000质量份的乙醇和200-1000质量份的水混合并机械搅拌0.5-1小时至分散;
1-2)通入氮气1小时后,加入100-200质量份的硫酸亚铁铵、200-400质量份的氯化铁和10-100质量份的辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵;
1-3)加入50-600质量份的甲酰胺,升温至40-70℃,反应2-10小时,降至室温得磁性交联聚维酮颗粒。
其中,步骤2)所述硅基磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤如下:在步骤1的反应器中继续加入硅酸钠和冰乙酸溶液,室温下继续搅拌1-5小时,以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒。
其中,所步骤2)中的硅酸钠在冰乙酸以及步骤1)中的分散剂和甲酰胺作用下,会缓慢水解分解成纳米级二氧化硅颗粒沉淀于硅基磁性交联聚维酮颗粒表面以形成多孔无机二氧化硅层。
在本发明的一些实施例中,步骤2)所述硅基磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤如下:步骤1的反应器中继续加入100-500质量份的硅酸钠和100-600质量份的冰乙酸溶液,室温下继续搅拌1-5小时,以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒。
其中,步骤3)所述双层硅磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
3-1)继续在步骤2中的反应器下加入多元醇,室温搅拌1小时;
3-2)以流速为1-100mL/min的滴加速度,加入有机硅源/乙醇混合物,滴加完毕后,继续在室温下搅拌反应2-10小时;
3-3)产物使用乙醇和去离子水反复沉淀清洗3-10次,在40-60℃鼓风干燥箱中烘干;
3-4)将产物加入DEPC处理的无菌水中,磁珠浓度配置为10-200mg/mL,以制备核酸提取磁珠悬浮液。
在本发明的一些实施例中,步骤3)所述双层硅磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
3-1)继续在步骤2中的反应器下加入20-400质量份的多元醇,室温搅拌1小时;
3-2)以流速为1-100mL/min的滴加速度,加入100-400质量份的有机硅源/乙醇混合物,滴加完毕后,继续在室温下搅拌反应2-10小时;
3-3)产物使用乙醇和去离子水反复沉淀清洗3-10次,在40-60℃鼓风干燥箱中烘干;
3-4)将产物加入DEPC处理的无菌水中,磁珠浓度配置为10-200mg/mL,以制备核酸提取磁珠悬浮液(即本发明所述诊断磁珠)。
在本发明的一些实施例中,所述多元醇为聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇800、聚乙二醇1000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、季戊四醇、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,4-丁二醇、新戊二醇、二缩二乙二醇、一缩二丙二醇、三羟甲基丙烷、一缩二乙二醇和/或其组合。
在本发明的一些实施例中,所述多元醇为聚乙二醇8000、季戊四醇、三羟甲基乙烷、一缩二乙二醇和/或其组合。
在本发明的一些实施例中,所述步骤3)中的滴加速度为2-50mL/min。
在本发明的一些实施例中,所述步骤3)中的有机硅源为硅酸四乙酯、四(三甲基硅氧基)硅烷、硅酸四丁酯、四甲氧基硅烷、四丙氧基硅烷、正硅酸四异丙酯和/或其组合。
在本发明的一些实施例中,所述步骤3)中有机硅源/乙醇混合物的质量比为1:1-1:5。
在本发明的一些实施例中,所述步骤3)中有机硅源/乙醇混合物的质量比为1:1-1:3。
在本发明的一些实施例中,所述步骤3)中磁珠浓度配置为为50-150mg/mL。
在本发明的一些实施例中,步骤3)所述双层硅磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
3-1)继续在步骤2中的反应器下加入20-400质量份的聚乙二醇8000、季戊四醇、一 缩二乙二醇和/或其组合,室温搅拌1小时;
3-2)以流速为2-50mL/min的滴加速度,加入100-400质量份的硅酸四乙酯/乙醇混合物(1:2,w/w),滴加完毕后,继续在室温下搅拌反应2-10小时;
3-3)产物使用乙醇和去离子水反复沉淀清洗3-10次,在50℃鼓风干燥箱中烘干;
3-4)将产物加入DEPC处理的无菌水中,磁珠浓度配置为100mg/mL,以制备核酸提取磁珠悬浮液(即本发明所述诊断磁珠)。
在一个实施方式中,所述诊断磁珠的大规模制造方法包括如下步骤:
1)制备磁性交联聚维酮颗粒;
2)对步骤1所述磁性交联聚维酮修饰多孔无机二氧化硅层以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒;
3)对步骤2所述硅基磁性交联聚维酮颗粒修饰有机硅层以制备双层硅基磁性交联聚维酮颗粒。
其中,所述步骤1)中的交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
1-1)100质量份的5-10μm粒径的交联聚维酮颗粒交联聚维酮颗粒、400质量份的甘油、600质量份的乙醇和1000质量份的水混合并机械搅拌1小时至分散;
1-2)通入氮气1小时后,加入100质量份的硫酸亚铁铵、200质量份的氯化铁和20质量份的辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵;
1-3)加入500质量份的甲酰胺,升温至70℃,反应2.5小时,降至室温得磁性交联聚维酮颗粒。
其中,步骤2)所述硅基磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤如下:步骤1的反应釜中继续加入250质量份的硅酸钠和300质量份的冰乙酸溶液,室温下继续搅拌3小时,以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒。
其中,步骤3)所述双层硅磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
3-1)继续在步骤2中的反应器下加入80质量份的一缩二乙二醇,室温搅拌1小时;
3-2)以流速为10mL/min的滴加速度,加入150质量份的硅酸四乙酯/乙醇混合物(1:2,w/w),滴加完毕后,继续在室温下搅拌反应5小时;
3-3)产物使用乙醇和去离子水反复沉淀清洗6次,在50℃鼓风干燥箱中烘干;
3-4)将产物加入DEPC处理的无菌水中,磁珠浓度配置为100mg/mL,以制备核酸提取磁珠悬浮液(即本发明所述诊断磁珠)。
本发明的第二方面提供了所述诊断磁珠的应用方法,其可以应用于新鲜动物组织、动物组织石蜡切片、植物叶片、植物种子、全血、血浆、血清、毛发、指甲、烟蒂、唾液、拭子、细菌或病毒等生物检材中的核酸提取及纯化。所述的应用方法,包括制作以诊断磁珠为核酸纯化载体的核酸提取或纯化试剂盒,通过该试剂盒从生物检材中提取高纯度和高得率的核酸;其中,所述试剂盒除了诊磁珠外还包括蛋白酶K、裂解液、结合液、清洗液、70-80%乙醇以及洗脱液。
其中,所述裂解液包含包括离液剂、表面活性剂和缓冲液。
在本发明的一些实施例中,所述裂解液为2-8M胍盐、0.5-20%表面活性剂和10-100mM缓冲液。
在本发明的一些实施例中,所述述裂解液为5M盐酸胍、10%Brij 58、0.05%SDS和50mM Tris,pH7.5。所述裂解液对裂解细菌、细胞和病毒特别有效。
所述结合液为具有1-6个碳原子的短链、支链或直链烷醇。
在本发明的一些实施例中,所述结合液为异丙醇。
所述清洗液为具有中等离子强度的缓冲液和醇溶液的混合物。
在本发明的一些实施例中,所述清洗液为50mM Tris,1M NaCl,pH7.0,60%乙醇溶液。
所述洗脱液为低离子强度的缓冲液,如5mM Tris-HCl,pH8.0或无核酸水。
实施例
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1:诊断磁珠M1的制备方法
1)制备磁性交联聚维酮颗粒;
2)对步骤1所述磁性交联聚维酮修饰多孔无机二氧化硅层以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒;
3)对步骤2所述硅基磁性交联聚维酮颗粒修饰有机硅层以制备双层硅基磁性交联聚维酮颗粒。
其中,所述步骤1)中的交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
1-1)100质量份的5-10μm粒径的交联聚维酮颗粒交联聚维酮颗粒、400质量份的甘油、600质量份的乙醇和1000质量份的水混合并机械搅拌1小时至分散;
1-2)通入氮气1小时后,加入100质量份的硫酸亚铁铵、200质量份的氯化铁和20质量份的辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵;
1-3)加入500质量份质量份的甲酰胺,升温至70℃,反应2.5小时,降至室温得磁性交联聚维酮颗粒。
其中,步骤2)所述硅基磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤如下:步骤1的反应器中继续加入250质量份的硅酸钠和300质量份的冰乙酸溶液,室温下继续搅拌3小时,以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒。
其中,步骤3)所述双层硅磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
3-1)继续在步骤2中的反应器下加入80质量份的一缩二乙二醇,室温搅拌1小时;
3-2)以流速为10mL/min的滴加速度,加入150质量份的硅酸四乙酯/乙醇混合物(1:2,w/w),滴加完毕后,继续在室温下搅拌反应5小时;
3-3)产物使用乙醇和去离子水反复沉淀清洗6次,在50℃鼓风干燥箱中烘干;
3-4)将产物加入DEPC处理的无菌水中,磁珠浓度配置为100mg/mL,以制备核酸提取磁珠悬浮液(即本发明所述诊断磁珠)。
本实施例提供了一种在100L反应器中产出6kg的核酸提取用诊断磁珠的制备方法,以平均每次使用1mg作为一次核酸提取的原料计算,单批次100L反应器中可以提供600万次的核酸提取原料,所述诊断磁珠通过粒径分析得平均粒径6.5um,磁含量为35.2%。
实施例2:诊断磁珠M2的制备方法
1)制备磁性交联聚维酮颗粒;
2)对步骤1所述磁性交联聚维酮修饰多孔无机二氧化硅层以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒;
3)对步骤2所述硅基磁性交联聚维酮颗粒修饰有机硅层以制备双层硅基磁性交联聚维酮颗粒。
其中,所述步骤1)中的交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
1-1)150质量份的10-20μm粒径的交联聚维酮颗粒、200质量份的甘油、500质量份的乙醇和800质量份的水混合并机械搅拌1小时至分散;
1-2)通入氮气1小时后,加入150质量份的硫酸亚铁铵、280质量份的氯化铁和50质量份的辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵;
1-3)加入250质量份的甲酰胺,升温至40-70℃,反应2-10小时,降至室温得磁性交联聚维酮颗粒。
其中,步骤2)所述硅基磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤如下:步骤1的反应器中继续加入120质量份的硅酸钠和120质量份的冰乙酸溶液,室温下继续搅拌3小时,以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒。
其中,步骤3)所述双层硅磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
3-1)继续在步骤2中的反应器下加入315质量份的季戊四醇,室温搅拌1小时;
3-2)以流速为15mL/min的滴加速度,加入120质量份的硅酸四乙酯/乙醇混合物(1:2,w/w),滴加完毕后,继续在室温下搅拌反应5小时;
3-3)产物使用乙醇和去离子水反复沉淀清洗6次,在50℃鼓风干燥箱中烘干;
3-4)将产物加入DEPC处理的无菌水中,磁珠浓度配置为100mg/mL,以制备核酸提取磁珠悬浮液(即本发明所述诊断磁珠)。
本实施例提供了一种在100L反应器中产出8.5kg的核酸提取用诊断磁珠的制备方法,以平均每次使用1mg作为一次核酸提取的原料计算,单批次在100L反应器中可以提供850万次的核酸提取原料,所述诊断磁珠通过粒径分析得平均粒径12.5um,磁含量为43.5%。
实施例3:诊断磁珠M1、M2和商品化磁珠的磁泄露测试
将实施例1提供的诊断磁珠M1、M2以及Promega公司MagneSil磁珠(货号MD1441)、Thermo公司的Dynabeads MyOneTMSilane(货号37002D)用无菌水稀释至10mg/mL,取1mL上述稀释过磁珠悬浮液,用去离子水反复清洗3次后,加入1mL 0.5M HCl,并在室温下1500rpm反应1小时,磁性分离吸取上清液通过原子吸收检测上清液中铁离子的含量,表1中显示诊断磁珠M1和M2具有较低的磁泄露,而商品化磁珠MagneSil和MyOneTMSilane的磁泄露都非常明显。
表1:不同磁珠的磁泄露测试
磁珠 | 铁离子(ppm) |
M1 | 2.4 |
M2 | 3.6 |
MagneSil | 235 |
MyOne<sup>TM</sup>Silane | 56 |
实施例4:诊断磁珠M1、M2和商品化磁珠的磁分离速度检测
将实施例1提供的诊断磁珠M1、M2以及Promega公司MagneSil磁珠(货号MD1441)、Thermo公司的Dynabeads MyOneTMSilane(货号37002D)用无菌水稀释至1mg/mL,取5mL上述1mg/mL磁性悬浮液,并用去离子水反复3次,磁性分离后置于50%甘油溶液中装于5mL的离心管中,侧面放置一磁力架进行分离,以分离液的吸光度至0.1以下判断为基本分离完全,记录吸光度至0.1所需要的时间即为磁分离时间。从表2中我们发现本发明提供的诊断磁珠M1和M2都具有较快的磁分离时间,更有利于自动化高通量的设备中运用,减少在整个提取过程中因为样品的粘度、磁分离时间不够或者磁分离设备的磁场强度梯度低的问题导致磁性颗粒在流程中损失最终影响得量。不仅如此,更快的磁分离速度可以减少可能会在洗脱液中出现磁珠残留的现象,以降低下游检测失败的概率。
表2:不同磁珠的磁分离时间
磁珠 | 磁分离时间(s) |
M1 | 12 |
M2 | 6 |
MagneSil | 25 |
MyOne<sup>TM</sup>Silane | 110 |
实施例5:诊断磁珠M1、M2和商品化磁珠运用于全血中基因组DNA的提取
1)裂解:2mL离心管中加入200μLEDTA抗凝血、200μL裂解液(5M盐酸胍、10%Brij58、0.05%SDS和50mM Tris,pH7.5)以及20μL蛋白酶K溶液(20mg/mL),在56℃下孵育10min后冷却至室温。
2)结合:加入10μL不同的磁珠以及200μL异丙醇,在1000rpm下旋涡5min;
3)清洗:使用700μL清洗液(50mM Tris,1M NaCl,pH7.0,60%乙醇溶液)清洗1次,75%乙醇清洗2次;
4)洗脱:磁性分离后在室温下挥发除醇10min,加入100μL洗脱液(5mM Tris-HCl,pH8.0)在56℃下孵育5min,磁性分离,吸取上清液即为提取DNA产物。
DNA产物通过通过Nanodrop检测其质量(表3),我们我们发现本发明提供的诊断磁珠M1和M2相比商品化的MagneSil磁珠和Thermo公司的Dynabeads MyOneTMSilane具有更优异的提取得量,并且令人意外的,通过本发明第二方面提供的核酸提取或纯化试剂盒,诊断磁珠M1和M2具有较低的杂质吸附能力,A260/280数据显示M1和M2提取的DNA产物中蛋白残留低,A260/230数据显示M1和M2提取的DNA产物中盐离子残留低。
表3:全血基因组DNA提取
磁珠 | (ng/μL) | A260/280 | A260/230 |
M1 | 71.5 | 1.87 | 1.93 |
M2 | 68.1 | 1.88 | 1.89 |
MagneSil | 35.4 | 1.81 | 1.32 |
MyOne<sup>TM</sup>Silane | 41.0 | 1.75 | 1.01 |
实施例6:诊断磁珠M1、M2和商品化磁珠运用于病毒RNA的提取
1)裂解:在2mL离心管中200μL稀释的PEDV病毒样本,加入200μL裂解液(5M盐酸胍、10%Brij 58、0.05%SDS和50mM Tris,pH7.5)以及20μL蛋白酶K溶液(20mg/mL),在56℃下孵育10min后冷却至室温。
2)结合:加入10μL不同的磁珠以及200μL异丙醇,在1000rpm下旋涡5min;
3)清洗:使用700μL清洗液(50mM Tris,1M NaCl,pH7.0,60%乙醇溶液)清洗一次,75%乙醇清洗2次;
4)洗脱:磁性分离后在室温下挥发除醇10min,加入50μL无核酶水在56℃下孵育5min,磁性分离,取出上清液即为提取RNA产物。
使用NEB公司Lunauniversal probe one step RT-qPCR kit(Cat#E3006S),使用方法参考试剂盒说明书,取2μLRNA产物加入到20μLRT-PCR体系中,检测PEDV的S1基因片段的Ct值,从图1中我们发现诊断磁珠M1提供了更好的灵敏度(最低的Ct值)。其次分别是M2、MagneSil和Dynabeads MyOneTMSilane。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种诊断磁珠的大规模制造方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)制备磁性交联聚维酮颗粒;
2)将所述的磁性交联聚维酮修饰多孔无机二氧化硅层以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒;
3)将所述的硅基磁性交联聚维酮颗粒修饰有机硅层以制备双层硅基磁性交联聚维酮颗粒。
2.根据权利要求1所述的诊断磁珠的大规模制造方法,其特征在于,所述制备磁性交联聚维酮颗粒包括如下步骤:
1-1)100-500质量份的交联聚维酮颗粒、200-500质量份的甘油、200-1000质量份的乙醇和200-1000质量份的水混合并机械搅拌0.5-1小时至分散;
1-2)通入氮气1小时后,加入100-200质量份的二价铁盐、200-400质量份的三价铁盐和10-100质量份的分散剂;
1-3)加入50-600质量份的弱碱性溶液,升温至40-70℃,反应2-10小时,降至室温得磁性交联聚维酮颗粒。
所述的交联聚维酮颗粒为含有吡咯烷酮结构的多孔状的结构的固体粉末颗粒。
3.根据权利要求2所述的诊断磁珠的大规模制造方法,其特征在于,所述交联聚维酮颗粒的粒径为2-50μm。
所述的的二价铁盐为硫酸亚铁铵、氯化亚铁、硫酸亚铁和/或其组合,三价铁盐为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁和/或其组合。
4.根据权利要求2所述的诊断磁珠的大规模制造方法,其特征在于,所述的分散剂为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、聚乙烯吡咯烷酮、吐温20、Brij 56、Brij 58、聚乙二醇辛基苯基醚、Span-80、Span-20、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基硫酸锂、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、聚乙二醇8000、聚乙烯亚胺和/或其组合。
5.根据权利要求2所述的诊断磁珠的大规模制造方法,其特征在于,弱碱性溶液为氨水、甲酰胺和/或其组合。
6.根据权利要求5所述的诊断磁珠的大规模制造方法,其特征在于,所述的硅基磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤如下:步骤1的反应器中继续加入100-500质量份的硅酸钠和100-600质量份的冰乙酸溶液,室温下继续搅拌1-5小时,以制备硅基磁性交联聚维酮颗粒;
硅酸钠在冰乙酸以及分散剂和甲酰胺作用下,会缓慢水解分解成纳米级二氧化硅颗粒沉淀于硅基磁性交联聚维酮颗粒表面以形成多孔无机二氧化硅层。
7.根据权利要求5所述的诊断磁珠的大规模制造方法,其特征在于,所述双层硅磁性交联聚维酮颗粒的具体合成步骤包括:
3-1)继续在步骤2中的反应器下加入20-400质量份的多元醇,室温搅拌1小时;
3-2)以流速为1-100mL/min的滴加速度,加入100-400质量份的有机硅源/乙醇混合物,滴加完毕后,继续在室温下搅拌反应2-10小时;
3-3)产物使用乙醇和去离子水反复沉淀清洗3-10次,在40-60℃鼓风干燥箱中烘干;
3-4)将产物加入DEPC处理的无菌水中,磁珠浓度配置为10-200mg/mL,以制备核酸提取磁珠悬浮液(即本发明所述诊断磁珠)。
8.根据权利要求7所述的诊断磁珠的大规模制造方法,其特征在于,所述多元醇为聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇800、聚乙二醇1000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、季戊四醇、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,4-丁二醇、新戊二醇、二缩二乙二醇、一缩二丙二醇、三羟甲基丙烷、一缩二乙二醇和/或其组合;
所述多元醇为聚乙二醇8000、季戊四醇、三羟甲基乙烷、一缩二乙二醇和/或其组合;
所述的有机硅源为硅酸四乙酯、四(三甲基硅氧基)硅烷、硅酸四丁酯、四甲氧基硅烷、四丙氧基硅烷、正硅酸四异丙酯和/或其组合;有机硅源/乙醇混合物的质量比为1:1-1:5。
9.一种诊断磁珠的应用方法,其特征在于,所述的诊断磁珠为权利要求1-9任一项所述的诊断磁珠;应用于新鲜动物组织、动物组织石蜡切片、植物叶片、植物种子、全血、血浆、血清、毛发、指甲、烟蒂、唾液、拭子、细菌或病毒等生物检材中的核酸提取及纯化。
10.根据权利要求9所述的应用方法,其特征在于,包括制作以诊断磁珠为核酸纯化载体的核酸提取或纯化试剂盒,通过该试剂盒从生物检材中提取高纯度和高得率的核酸;其中,所述试剂盒除了诊磁珠外还包括蛋白酶K、裂解液、结合液、清洗液、70-80%乙醇以及洗脱液;所述裂解液为2-8M胍盐、0.5-20%表面活性剂和10-100mM缓冲液;所述结合液为具有1-6个碳原子的短链、支链或直链烷醇;所述清洗液为具有中等离子强度的缓冲液和醇溶液的混合物;所述洗脱液为低离子强度的缓冲液,如5mM Tris-HCl,pH8.0或无核酸水。
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GR01 | Patent grant | ||
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