一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法
技术领域
本发明属于纳米材料和生物技术工程的结合领域,具体涉及一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法。
背景技术
传统分离核酸法主要有盐析法、二氧化硅法,有机法等,费时费力且会用到有机溶剂。
生物磁珠是涉及纳米材料科学和生物科学的一种新型功能化材料。其表面易于改性修饰,通过外加磁场便可快速实现固液分离,操作简便。生物磁珠在微量核酸提取、细胞筛选等方面有着良好的应用前景。快速高效地分离得到高纯度核酸是现代分子生物学领域进行各种科学研究的重要先决条件。
但目前存在以下问题:进口磁珠价格高昂,绝大部分国产磁珠粒径为亚微米级,粒径不够均一,比表面积小,静置悬浮性差,黏壁,重分散性差。导致与血浆中的小片段游离DNA结合能力弱,再提取过程中容易丢失,导致得率低,使检测灵敏度降低。
发明内容
为解决上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法。本发明方法工艺简单,制备的磁珠呈核壳壳结构,粒径均匀且单分散无团聚,磁响应性能强,表面粗糙,形貌丰富,比表面积大,表面羟基含量丰富,可用于纯化游离DNA样品。
本发明采取的具体技术方案是:
一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一:采用分散聚合法合成模板微球;
步骤二:对模板微球表面进行浓硫酸处理,得到表面含磺酸基团的模板微球;
步骤三:在水相中原位沉积法在模板微球表面包裹一层四氧化三铁;
步骤四:通过溶胶凝胶法在四氧化三铁表面包覆一层二氧化硅,得到微米级生物磁珠。
作为对上述方案的进一步优化,上述的制备方法,具体包括以下步骤:
步骤一:将有机溶剂、超纯水、分散剂依次倒入容器中,搅拌至溶液澄清,然后再向容器中依次加入聚合单体、交联剂、引发剂,搅拌数分钟至混合液澄清后,水浴升温进行聚合反应,反应结束后冷却至室温,用有机溶剂和水依次离心洗涤,得模板微球,将模板微球分散至超纯水中,得模板微球悬浮液;
步骤二:取模板微球悬浮液,离心弃上清液,缓慢滴加入浓硫酸,同时冰浴处理,防止放出大量热量,导致暴沸和粒径模板微球结块,待浓硫酸完全加入后,机械搅拌反应1-2h,加入与浓硫酸等体积的冰水稀释浓硫酸,超纯水反复离心洗涤至溶液呈中性,得到表面带磺酸基团的模板微球;
步骤三:将表面带磺酸基团的模板微球分散于超纯水中,配制成悬浮液,然后向悬浮液中依次加入分散剂、三价铁化合物和亚铁化合物,配制成铁盐溶液,升温搅拌进行耦合反应老化10-30min,缓慢加入沉淀剂至溶液完全变黑,继续反应熟化0.5-2h后,冷却至室温,超纯水洗涤,得表面包覆有一层四氧化三铁的磁性微球;
步骤四:将步骤三得到的表面包覆有一层四氧化三铁的磁性微球均匀分散在乙醇/水体系内,加入氨水,搅拌数分钟后加入正硅酸四乙酯,室温反应不少于12h,反应结束后用醇和水溶液依次交替洗涤,分散于水溶液后,得到表面包覆一层二氧化硅的微米级生物磁珠。
作为对上述方案的进一步优化,步骤一中所述有机溶剂为水溶性一元醇溶剂;和/或
步骤一中所述分散剂为聚乙烯吡咯烷酮;和/或
步骤一中所述聚合单体为苯乙烯或者甲基丙烯酸甲酯;和/或
步骤一中所述交联剂为二乙烯基;和/或
步骤一中所述引发剂为偶氮二异丁氰;和/或
步骤一中所述分散聚合法的聚合反应温度为65℃-80℃,反应时间为125-24h;和/或
步骤一中制得的粒径模板微球悬浮液固含量为10%-50%;和/或
步骤二中所述浓硫酸的浓度为95%-98%;和/或
步骤二中浓硫酸的用量为粒径模板微球悬浮液体积的2倍-10倍;和/或
步骤三中所述悬浮液固含量为1%-10%;和/或
步骤三中所述分散剂选自柠檬酸钠、聚乙烯亚胺或聚丙烯酸中的一种;和/或
步骤三中所述三价铁化合物为六水合氯化铁,所述亚铁化合物为七水合硫酸亚铁;和/或
步骤三所述反应温度为65-85℃;和/或
步骤三所述沉淀剂为氨水或者5M氢氧化钠溶液;
步骤四中所述乙醇/水体系中,所述醇为甲醇、乙醇、异丙醇、丙三醇中的一种或几种;和/或
步骤四中所述乙醇/水体系中,所述醇与水的体积比例为4:1;和/或
步骤四中所述磁性微球与乙醇/水体系的比例为(3-10)g/1000ml;
步骤四中加入的氨水与乙醇/水体系的体积比为:0.01-1:5-100;
步骤四中所述正硅酸四乙酯与模板微球的质量比为0.1-1.0:1,得到不同厚度二氧化硅壳层。
作为对上述方案的进一步优化,步骤一中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇中一种或者几种;和/或
步骤一中醇/水体(水溶性一元醇溶剂+超纯水)系中超纯水的体积分数为2%-10%;和/或
步骤一中所述聚乙烯吡咯烷酮的平均分子量为58K;和/或
步骤一中所述分散剂与(有机溶剂+超纯水)的比例为(2-8)g/100ml;和/或
步骤一中所述聚合单体与(有机溶剂+超纯水)的比例为(5-12)g/100ml;和/或
步骤一中所述交联剂的用量为聚合单体的质量的0.5%-3%;和/或
步骤一中所述引发剂的用量为聚合单体的质量的1%-6%;和/或
步骤二中冰浴处理温度为0℃,冰浴处理时间为1-3h。
步骤三中所述悬浮液中分散剂用量与磺酸基团改性的模板微球质量比为0.03-0.08:1;和/或
步骤三中沉淀剂与三价铁离子和二价铁离子对应生成的四氧化三铁摩尔比为8-10:1;和/或
步骤三中三价铁离子和二价铁离子对应生成的四氧化三铁的质量与表面带磺酸基团的模板微球的质量比为1:5-1.5:1;和/或
步骤三中所述聚丙烯酸的平均分子量为3000;和/或
步骤三中配制的铁盐溶液摩尔比为2:1。
作为对上述方案的进一步优化,步骤一中搅拌至溶液澄清后先通入高纯氮10-30min除溶液中氧气,然后再向容器中依次加入聚合单体、交联剂、引发剂;和/或
步骤一中所述的聚合单体为经5%-12%减压蒸馏后除水除阻聚剂的聚合单体;
步骤一中所述的搅拌速率为120-250rpm;
步骤一中有机溶剂和水依次离心洗涤3次,离心转速9000rpm,每次离心时间15min。
作为对上述方案的进一步优化,步骤一制备的模板微球粒径为1-5μm。
相应地,本发明还提供了一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠,由上述的制备方法制备得到。
作为对上述方案的进一步优化,所制备的微米级磁珠结构为核壳壳结构。
作为对上述方案的进一步优化,所述核壳壳结构:内层模板微球为核,中间层为磁性四氧化三铁,外层为改性层二氧化硅。
作为对上述方案的进一步优化,所述制备的微米级磁珠粒径在1-5μm之间,优选在在1-3μm。
本发明的有益效果:本发明方法所制备的微米级生物磁珠,粒径均一且单分散;表面形貌粗糙,相较于平滑表面,表面积更大,核酸结合量更大,结合效率更高,盐残留量低。同时在醇/水体系中悬浮性好,且易重悬,不黏壁。
附图说明
图1为通过实施例1、2、3得到的纯化游离DNA的微米级生物磁珠结构示意图:整体结构为核壳壳结构,其中1:内核聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸甲酯模板微球;2:中间层为磁性四氧化三铁;3:最外层为二氧化硅改性层;
图2为微米级生物磁珠(1.3微米)的扫描电子显微镜图片;
图3为微米级生物磁珠(2.3微米)的扫描电子显微镜图片;
图4为微米级生物磁珠(1.5微米)的扫描电子显微镜图片;
图5为琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果,以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
本发明实施例提供了一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法。其特征在于:包括以下步骤:
步骤一:采用分散聚合法合成聚苯乙烯微球或聚甲基丙烯酸甲酯微球作为粒径模板微球;
分别量取100-2000mL无水乙醇、2%-10%(v/v,超纯水/(无水乙醇+超纯水))d的超纯水、2%-8%(g/100ml,分散剂/(无水乙醇+超纯水))聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量58K)至250-2000mL三口烧瓶,搅拌至溶液澄清,通入高纯氮10-30min除溶液中氧气,加入5%-12%(g/100ml,聚合单体/(无水乙醇+超纯水))减压蒸馏后除水除阻聚剂的苯乙烯/甲基丙烯酸甲酯,0.5%-3%(g/g,交联剂/聚合单体)二乙烯基苯,1%-6%(g/g,引发剂/聚合单体)偶氮二异丁氰,转速设定为120-250rpm,搅拌数分钟至混合液澄清后,水浴升温至65℃-80℃,反应24小时。反应结束后冷却至室温,用乙醇和水依次离心洗涤3次,离心转速9000rpm,离心时间15min,洗涤结束后分散至超纯水中,得1-5μm聚苯乙烯模板微球悬浮液,测定悬浮液中固含量。
步骤二:对模板微球表面进行浓硫酸处理,得到表面含磺酸基团的模板微球;
取5-50g模板微球悬浮液,离心弃上清液,缓慢滴加入2倍-10倍体积浓硫酸,同时冰浴处理,防止放出大量热量,导致暴沸和模板微球结块,待浓硫酸完全加入后,机械搅拌反应1-2小时,加入等体积冰水稀释浓硫酸,超纯水反复离心洗涤至溶液呈中性,得到表面带磺酸基团的模板微球悬浮液,测定其固含量;
步骤三:在水相中原位沉积法在模板微球表面包裹一层四氧化三铁;
取1-50g磺酸基团改性的模板微球分散于一定体积超纯水中,配制成1%-10%固含量的悬浮液,加入为磺酸基团改性的模板微球质量的3%-8%的分散剂柠檬酸钠,通入高纯氮10-30min除溶液中氧气,加入一定量六水合氯化铁和七水合硫酸亚铁,配制成摩尔比为2:1的铁盐溶液,搅拌转速设定为300rpm,水浴升温至65-85℃后,老化10-30min,缓慢加入氨水/5M氢氧化钠溶液至溶液完全变黑,继续反应熟化1h,后冷却至室温,超纯水洗涤三次,得表面包覆有一层四氧化三铁的磁性微球
步骤四:通过溶胶凝胶法在四氧化三铁表面包覆一层二氧化硅,得到微米级生物磁珠。
取适量((3-10)g/1000ml,磁性微球/(乙醇/水体系))步骤三制得的磁性微球均匀分散在250-5000mL乙醇/水体系内,乙醇和水的体积比为4:1,加入0.5-50mL氨水,搅拌数分钟后加入1-100g正硅酸四乙酯,室温反应不少于12h后,用醇和水溶液依次交替洗涤,分散于水溶液后,得到表面包覆一层二氧化硅的微米级生物磁珠(结构如图1所示)。下面以具体的实施例对其进行进一步阐述。
实施例1:
一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法。其特征在于:包括以下步骤:
步骤一:采用分散聚合法合成聚苯乙烯微球作为粒径模板微球;
分别量取1400mL无水乙醇、100mL超纯水、50g聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量58K)至2L三口烧瓶,搅拌至溶液澄清,通入高纯氮15min除溶液中氧气,加入120g减压蒸馏后除水除阻聚剂的苯乙烯,2.4g二乙烯基苯,3.6g引发剂偶氮二异丁氰,转速设定为150rpm,搅拌数分钟至混合液澄清后,水浴升温至70℃,反应24小时。反应结束后冷却至室温,用乙醇和水依次离心洗涤3次,离心转速9000rpm,离心时间15min,洗涤结束后分散至超纯水中,得1.2μm聚苯乙烯模板微球悬浮液,测定悬浮液中固含量。
步骤二:对模板微球表面进行浓硫酸处理,得到表面含磺酸基团的模板微球;
取50g模板微球悬浮液,离心弃上清液,缓慢滴加入200mL95%浓硫酸,同时冰浴处理,防止放出大量热量,导致暴沸和模板微球结块,待浓硫酸完全加入后,机械搅拌反应2小时,加入200ml冰水稀释浓硫酸,超纯水反复离心洗涤至溶液呈中性,得到表面带磺酸基团的模板微球悬浮液,测定其固含量;
步骤三:在水相中原位沉积法在模板微球表面包裹一层四氧化三铁;
取10g磺酸基团改性的模板微球分散于1200mL超纯水中,加入0.5g表面改性剂柠檬酸钠,通入高纯氮15min除溶液中氧气,加入23.4g六水合氯化铁和12g七水合硫酸亚铁,配制成摩尔比为2:1的铁盐溶液,搅拌转速设定为300rpm,水浴升温至70℃后,老化20min,缓慢加入氨水至溶液完全变黑,继续反应熟化1h,后冷却至室温,超纯水洗涤三次,得表面包覆有一层四氧化三铁的磁性微球
步骤四:通过溶胶凝胶法在四氧化三铁表面包覆一层二氧化硅,得到微米级生物磁珠。
将步骤三得到的黑色固体均匀分散在2500mL乙醇/水体系内,乙醇和水的体积比为4:1,加入5mL氨水,搅拌数分钟后加入10g正硅酸四乙酯,室温反应不少于12h后,用醇和水溶液依次交替洗涤,分散于水溶液后,得到表面包覆一层二氧化硅的微米级生物磁珠。
所制备的二氧化硅的微米级生物磁珠,从图2上可以看出粒径均一,约为1.3μm,且单分散;表面形貌粗糙,相较于平滑表面,表面积更大,核酸结合量更大,结合效率更高,盐残留量低。同时在醇/水体系中悬浮性好,且易重悬,不黏壁。
实施例2:
一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法。其特征在于:包括以下步骤:
步骤一:采用分散聚合法合成聚苯乙烯微球作为粒径模板微球;
分别量取1400mL无水乙醇、80mL超纯水、35g聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量58K)至2L三口烧瓶,搅拌至溶液澄清,通入高纯氮15min除溶液中氧气,加入120g减压蒸馏后除水除阻聚剂的苯乙烯,2.4g二乙烯基苯,3.6g引发剂偶氮二异丁氰,转速设定为150rpm,搅拌数分钟至混合液澄清后,水浴升温至70℃,反应24小时。反应结束后冷却至室温,用乙醇和水依次离心洗涤3次,离心转速8000rpm,离心时间15min,洗涤结束后分散至超纯水中,得3.0μm聚苯乙烯模板微球悬浮液,测定悬浮液中固含量。
步骤二:对模板微球表面进行浓硫酸处理,得到表面含磺酸基团的模板微球;
取50g模板微球悬浮液,离心弃上清液,缓慢滴加入200mL97%浓硫酸,同时冰浴处理,防止放出大量热量,导致暴沸和模板微球结块,待浓硫酸完全加入后,机械搅拌反应2小时,加入200ml冰水稀释浓硫酸,超纯水反复离心洗涤至溶液呈中性,得到表面带磺酸基团的模板微球悬浮液,测定其固含量;
步骤三:在水相中原位沉积法在模板微球表面包裹一层四氧化三铁;
取10g磺酸基团改性的模板微球分散于1200mL超纯水中,加入0.5g表面改性剂聚丙烯酸(平均分子量3000),通入高纯氮15min除溶液中氧气,加入18.72g六水合氯化铁和9.6g七水合硫酸亚铁,配制成摩尔比为2:1的铁盐溶液,搅拌转速设定为300rpm,水浴升温至70℃后,老化20min,缓慢加入氨水至溶液完全变黑,继续反应熟化1h,后冷却至室温,超纯水洗涤三次,得表面包覆有一层四氧化三铁的磁性微球
步骤四:通过溶胶凝胶法在四氧化三铁表面包覆一层二氧化硅,得到微米级生物磁珠。
将步骤三得到的黑色固体均匀分散在2500mL乙醇/水体系内,乙醇和水的体积比为4:1,加入5mL氨水,搅拌数分钟后加入8.0g正硅酸四乙酯,室温反应不少于12h后,用醇和水溶液依次交替洗涤,分散于水溶液后,得到表面包覆一层二氧化硅的微米级生物磁珠。
所制备的二氧化硅的微米级生物磁珠,从图3上可以看出粒径均一,约为2.3μm,且单分散;表面形貌粗糙,相较于平滑表面,表面积更大,核酸结合量更大,结合效率更高,盐残留量低。同时在醇/水体系中悬浮性好,且易重悬,不黏壁。
实施例3:
一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法。其特征在于:包括以下步骤:
步骤一:采用分散聚合法合成聚甲基丙烯酸甲酯微球作为粒径模板微球;
分别量取1400mL无水乙醇、40mL超纯水、60g聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量58K)至2L三口烧瓶,搅拌至溶液澄清,通入高纯氮15min除溶液中氧气,加入120g减压蒸馏后除水除阻聚剂的甲基丙烯酸甲酯,1.5g二乙烯基苯,2.4g引发剂偶氮二异丁氰,转速设定为150rpm,搅拌数分钟至混合液澄清后,水浴升温至70℃,反应24小时。反应结束后冷却至室温,用乙醇和水依次离心洗涤3次,离心转速9000rpm,离心时间15min,洗涤结束后分散至超纯水中,得2.5μm聚甲基丙烯酸甲酯模板微球悬浮液,测定悬浮液中固含量。
步骤二:对模板微球表面进行浓硫酸处理,得到表面含磺酸基团的模板微球;
取50g模板微球悬浮液,离心弃上清液,缓慢滴加入200mL98%浓硫酸,同时冰浴处理,防止放出大量热量,导致暴沸和模板微球结块,待浓硫酸完全加入后,机械搅拌反应2小时,加入200ml冰水稀释浓硫酸,超纯水反复离心洗涤至溶液呈中性,得到表面带磺酸基团的模板微球悬浮液,测定其固含量;
步骤三:在水相中原位沉积法在模板微球表面包裹一层四氧化三铁;
取15g磺酸基团改性的模板微球分散于1200mL超纯水中,加入0.75g表面改性剂柠檬酸钠,通入高纯氮15min除溶液中氧气,加入31.59g六水合氯化铁和16.2g七水合硫酸亚铁,配制成摩尔比为2:1的铁盐溶液,搅拌转速设定为300rpm,水浴升温至70℃后,老化20min,缓慢加入5M氢氧化钠溶液至反应体系完全变黑,继续反应熟化1h,后冷却至室温,超纯水洗涤三次,得表面包覆有一层四氧化三铁的磁性微球
步骤四:通过溶胶凝胶法在四氧化三铁表面包覆一层二氧化硅,得到微米级生物磁珠。
将步骤三得到的黑色固体均匀分散在3500mL乙醇/水体系内,乙醇和水的体积比为4:1,加入10mL氨水,搅拌数分钟后加入25.65g正硅酸四乙酯,室温反应不少于12h后,用醇和水溶液依次交替洗涤,分散于水溶液后,得到表面包覆一层二氧化硅的微米级生物磁珠。
所制备的二氧化硅的微米级生物磁珠,从图4上可以看出粒径均一,约为1.5μm,且单分散;表面形貌粗糙,相较于平滑表面,表面积更大,核酸结合量更大,结合效率更高,盐残留量低。同时在醇/水体系中悬浮性好,且易重悬,不黏壁。
利用本发明实施例1-3得到的微米级生物磁珠用于游离DNA提取,具体步骤如下:
试剂配制:
(1)75%乙醇:取无水乙醇75mL,加入适量超纯水,搅拌混匀后,定容至100mL。
(2)本发明磁珠溶液(50mg/mL):称取50mg本实验制备的羟基磁珠,震荡混匀。
提纯步骤:
(1)取200μL样品加入400μL Buffer CL,漩涡震荡样品管以充分混匀,加入300μL异丙醇。
(2)充分混合震荡磁珠,使管内磁珠完全均匀悬浮起来,按照一定比率吸取磁珠加入样品管中,漩涡震荡该管1分钟使磁珠均匀悬浮于样品管中。
(3)样品管室温放置15分钟。注:放置期间如出现磁珠沉降现象应及时颠倒或是漩涡混匀,以保证磁珠对DNA的结合效率。
(4)将样品管置于磁力架上1分钟左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附,保持样品管在磁力架上静止,用移液枪吸取上清液并弃掉,操作过程中避免触碰到磁珠。
(5)将装有磁珠的离心管移开磁力架,并确保其中的上清液全部移除。向管中加入600μL的Buffer CW1用移液枪轻轻吹打混匀以防止产生气泡。
(6)将样品管置于磁力架上1分钟左右或待磁珠被磁力架装置完全吸附,保持样品管在磁力架上静止,用移液枪吸取上清液并弃掉,操作过程中避免触碰到磁珠团。
(7)将装有磁珠的离心管移开磁力架并确保其中的上清液全部移除,向管内加入600μL Buffer CW2用移液枪轻轻吹打混匀。
(8)将样品管置于磁力架上1分钟左右或待磁珠被磁力架完全吸附,保持样品管在磁力架上静止,用移液枪吸取上清液并弃掉,操作过程中避免触碰到磁珠团。
(9)重复步骤(7)-(8),将管内的液体全部吸除干净,并将样品管从磁力架上取出。
(10)将样品管于室温放置5-10分钟,使残留乙醇充分挥发。注:避免真空抽干,磁珠过于干燥将会降低DNA洗脱效率。
(11)向管内加入20-100μL EB并用移液枪轻轻吹打5-10次使磁珠充分重悬,操作过程中应避免产生气泡。
(12)室温放置2-5分钟以充分洗脱。
(13)将洗脱样品管放回磁力架上1分钟或待所有磁珠都被磁力架装置完全吸附。
(14)小心的将洗脱上清液转移到新的灭过菌的管子中,在转移过程不要碰到磁珠,如出现磁珠悬起现象重复步骤(13)-(14)。
琼脂糖凝胶电泳,实施例1-3得到的微米级生物磁珠提取游离DNA的效果如图5所示,由图1可以看出:和DNA原样的泳道条带亮度相比,重复制备提取(1号泳道-实施例1、2号泳道-实施例2、3号泳道-实施例3)得到的157bp DNA条带亮度相似,说明本发明实施例制备的微米级生物磁珠结合DNA能力很强,回收率高。
需要说明的是,在本文中,诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括……”或“包含……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外,在本文中,“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数;“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例做出另外的变更和修改,所以以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利保护范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围之内。