CN116078358A - 一种核酸提取羧基磁珠的制备方法 - Google Patents
一种核酸提取羧基磁珠的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116078358A CN116078358A CN202310091673.1A CN202310091673A CN116078358A CN 116078358 A CN116078358 A CN 116078358A CN 202310091673 A CN202310091673 A CN 202310091673A CN 116078358 A CN116078358 A CN 116078358A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- carboxyl
- nucleic acid
- magnetic beads
- acid extraction
- steps
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
- B01J20/103—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate comprising silica
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
- B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
- B01J20/262—Synthetic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. obtained by polycondensation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
- B01J20/28009—Magnetic properties
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Soft Magnetic Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,包括以下步骤:完成Fe3O4磁性微球的制备;完成Fe3O4磁性微球的包覆及改性;完成羧基磁珠的制备;该一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,本发明采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性微球,制备工艺简单、时间短、易于操作、适用于大批量生产;本发明在Fe3O4磁性微球表面包覆SiO2壳层,克服了Fe3O4易氧化的缺点;减小磁性微球之间的磁偶极相互作用,阻止微球团聚;具有优良的生物相容性、亲水性、化学稳定性;制备的羧基磁珠在应用于病毒中的核酸提取时,性能优异。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取磁珠制备技术领域,具体为一种核酸提取羧基磁珠的制备方法。
背景技术
磁珠是一种具有超顺磁性的纳米颗粒,其主要结构为具有超顺磁性的中心磁核和具有功能性修饰的外层包覆材料。磁珠在外磁场的作用下能够迅速聚集,离开磁场后又可以恢复原来的状态,具有较强的磁响应性,可以使复杂的液固分离技术变得快捷简便。与传统的分离方法相比,把磁珠用于生化样品复杂组分的分离,能够实现分离和富集的同时进行,有效地提高了分离速度和富集效率,同时也使分析检测的灵敏度大大提升。近些年来,磁珠对核酸样本进行分离纯化方法在科学研究领域应用广泛,它主要是利用表面含有特殊修饰的磁珠对样本中的核酸进行富集提取,通过磁吸的方式进行磁分离后,洗脱得到纯化的核酸,该方法具有分离速度快、溶剂量小、回收率高、操作简单等特点。
纳米Fe3O4是目前应用最广泛的磁珠材料之一,具有超顺磁性、生物相容性、制备简单、表面易于修饰等特点。但是,由于纳米Fe3O4的纳米尺寸效应、磁偶极子引力等作用,磁性纳米粒子易于团聚,且化学稳定性不高易受氧化,表面基团不足,导致其难以直接应用到生物领域。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足之处,提供一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,以解决背景技术中所提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,包括以下步骤:
步骤一;完成Fe3O4磁性微球的制备,其具体步骤如下:
子步骤一:将六水合氯化铁、七水合硫酸亚铁以及分散剂均匀分散在去离子水中,以300rmp/min的转速进行搅拌分散;
子步骤二:当其温度升至70摄氏度时,加入氨水,并再次升温至80摄氏度,持续1h后结束反应;
子步骤三:将制备的混合物用去离子水多次清洗后制得Fe3O4磁性微球;
步骤二:完成Fe3O4磁性微球的包覆及改性,其具体步骤如下:
子步骤一:将无水乙醇、硅包覆物、Fe3O4磁性微球混合搅拌30min,随后加入氨水,并将温度升高至60摄氏度;
子步骤二:上述操作持续1h,随后加入硅烷偶联剂,持续反应6h;
子步骤三:将制备完成的混合物用去离子水多次清洗,以此制得包覆、改性后的Fe3O4磁性微球;
步骤三:完成羧基磁珠的制备,其具体步骤如下:
子步骤一:将一定量的氢氧化钠溶解在去离子水中,随后加入羧基单位反应10min,制得混合溶液1;
子步骤二:将去离子水、分散剂、包覆、改性Fe3O4磁性微球加入三口烧瓶,以200rmp/min转速搅拌分散,制得混合溶液2;
子步骤三:将混合溶液1加入混合溶液2,当温度达到75摄氏度时加入引发剂,并再次升温至85摄氏度,恒温8h反应完成;
子步骤四:随后将混合物用去离子水多次清洗,以此制得羧基磁珠。
作为本发明的优选技术方案,所述六水合氯化铁与七水合硫酸亚铁质量比为3:1-2,所述六水合氯化铁与七水合硫酸亚铁的总质量与去离子水的质量比为1:2-4,所述氨水质量为溶液总体积的0.5-2倍。
作为本发明的优选技术方案,所述分散剂可为PVP、REG、CMC中的一种或多种,所述分散剂质量是六水合氯化铁与七水合硫酸亚铁总质量的10%-40%。
作为本发明的优选技术方案,所述硅包覆物为硅酸钠、正硅酸四乙酯,所述无水乙醇、硅包覆物、Fe3O4磁性微球的质量比为20-40:1-4:1。
作为本发明的优选技术方案,所述氨水的用量为溶液总体积的1-10%,所述硅烷偶联剂的用量为磁核质量的5-30%。
作为本发明的优选技术方案,所述氢氧化钠的质量是羧基单体的0.5-1倍。
作为本发明的优选技术方案,所述羧基单体为丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯中的一种或多种,所述羧基单体的质量为Fe3O4磁性微球的1-5倍。
作为本发明的优选技术方案,所述分散剂选用柠檬酸钠,所述去离子水、柠檬酸钠、包覆、改性后Fe3O4磁性微球的质量比20-50:0.2-1:1。
作为本发明的优选技术方案,所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾,所述引发剂用量是羧基单体的0.1%-2%。
与现有技术相比,本发明提供了一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,具备以下有益效果:
1、该一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性微球,制备工艺简单、时间短、易于操作、适用于大批量生产;
2、该一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,在Fe3O4磁性微球表面包覆SiO2壳层,克服了Fe3O4易氧化的缺点;减小磁性微球之间的磁偶极相互作用,阻止微球团聚;具有优良的生物相容性、亲水性、化学稳定性;制备的羧基磁珠在应用于病毒中的核酸提取时,性能优。
附图说明
图1为本发明制备的核酸提取羧基磁珠的SEM照片示意图;
图2为本发明核酸提取羧基磁珠对病毒的提取性能数据示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例以及附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一:一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,包括以下步骤:
步骤一;完成Fe3O4磁性微球的制备,其具体步骤如下:将1KG六水合氯化铁、0.6七水合硫酸亚铁以及0.3KG分散剂均匀分散在1L去离子水中,以300rmp/min的转速进行搅拌分散;当其温度升至70摄氏度时,加入1.2L氨水,并再次升温至80摄氏度,持续1h后结束反应;将制备的混合物用去离子水多次清洗后制得Fe3O4磁性微球;
步骤二:完成Fe3O4磁性微球的包覆及改性,其具体步骤如下:
子步骤一:将1.5L无水乙醇、100ml正硅酸四乙酯、100gFe3O4磁性微球混合搅拌30min,随后加入300ml氨水,并将温度升高至60摄氏度;:上述操作持续1h,随后加入15ml硅烷偶联剂,持续反应6h;将制备完成的混合物用去离子水多次清洗,以此制得包覆、改性后的Fe3O4磁性微球;
步骤三:完成羧基磁珠的制备,其具体步骤如下:将100g氢氧化钠溶解在1L去离子水中,随后加入200ml丙烯酸反应10min,制得混合溶液1;将1.8L去离子水、25g柠檬酸钠、100g包覆、改性Fe3O4磁性微球加入三口烧瓶,以200rmp/min转速搅拌分散,制得混合溶液2;将混合溶液1加入混合溶液2,当温度达到75摄氏度时加入2g过硫酸铵,并再次升温至85摄氏度,恒温8h反应完成;随后将混合物用去离子水多次清洗,以此制得羧基磁珠。
请参考图1可以看出,核酸提取羧基磁珠的粒径小于50nm,分布较均匀,部分区域存在少量团聚现象,该团聚现象是因为拍摄SEM照片前的干燥过程造成的。
上述制备的核酸提取羧基磁珠,其应用于病毒中的核酸提取,包括以下步骤:
核酸提取阶段:准备3个核酸提取试剂盒,在第一个核酸提取试剂盒中加入400μL裂解液、200μL病毒样本;在第二个核酸提取试剂盒中加入500μL漂洗液、10μL磁珠,并放入磁棒套;在第三个核酸提取试剂盒中加入60μL洗脱液。以上步骤完成后,将3个核酸提取试剂盒放入全自动核酸提取纯化仪,提取高质量核酸。
扩增阶段:将缓冲液、酶、水、探针按照10:1:2:2的比例配置成混合溶液1,加入PCR板,然后将S1-核酸提取阶段提取的核酸加入PCR板,其中混合溶液1与核酸的添加比例为3:1。完成上述步骤后,将PCR板放入PCR基因扩增仪,完成测试。
参考图2可以看出,在病毒稀释1万倍和10万倍时,羧基磁珠的提取核酸的Ct值均比竞品磁珠提前约0.9个Ct值。PCR扩增曲线结果描述:阴性,阴性对照无Ct值,无特征性扩增曲线;阳性,Ct值≤31.0,且出现特定的扩增曲线。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤一;完成Fe3O4磁性微球的制备,其具体步骤如下:
子步骤一:将六水合氯化铁、七水合硫酸亚铁以及分散剂均匀分散在去离子水中,以300rmp/min的转速进行搅拌分散;
子步骤二:当其温度升至70摄氏度时,加入氨水,并再次升温至80摄氏度,持续1h后结束反应;
子步骤三:将制备的混合物用去离子水多次清洗后制得Fe3O4磁性微球;
步骤二:完成Fe3O4磁性微球的包覆及改性,其具体步骤如下:
子步骤一:将无水乙醇、硅包覆物、Fe3O4磁性微球混合搅拌30min,随后加入氨水,并将温度升高至60摄氏度;
子步骤二:上述操作持续1h,随后加入硅烷偶联剂,持续反应6h;
子步骤三:将制备完成的混合物用去离子水多次清洗,以此制得包覆、改性后的Fe3O4磁性微球;
步骤三:完成羧基磁珠的制备,其具体步骤如下:
子步骤一:将一定量的氢氧化钠溶解在去离子水中,随后加入羧基单位反应10min,制得混合溶液1;
子步骤二:将去离子水、分散剂、包覆、改性Fe3O4磁性微球加入三口烧瓶,以200rmp/min转速搅拌分散,制得混合溶液2;
子步骤三:将混合溶液1加入混合溶液2,当温度达到75摄氏度时加入引发剂,并再次升温至85摄氏度,恒温8h反应完成;
子步骤四:随后将混合物用去离子水多次清洗,以此制得羧基磁珠。
2.根据权利要求1所述的一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤一中,所述六水合氯化铁与七水合硫酸亚铁质量比为3:1-2,所述六水合氯化铁与七水合硫酸亚铁的总质量与去离子水的质量比为1:2-4,所述氨水质量为溶液总体积的0.5-2倍。
3.根据权利要求1所述的一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤一中,所述分散剂可为PVP、REG、CMC中的一种或多种,所述分散剂质量是六水合氯化铁与七水合硫酸亚铁总质量的10%-40%。
4.根据权利要求1所述的一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤二中,所述硅包覆物为硅酸钠、正硅酸四乙酯,所述无水乙醇、硅包覆物、Fe3O4磁性微球的质量比为20-40:1-4:1。
5.根据权利要求1所述的一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤二中,所述氨水的用量为溶液总体积的1-10%,所述硅烷偶联剂的用量为磁核质量的5-30%。
6.根据权利要求1所述的一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤三中,所述氢氧化钠的质量是羧基单体的0.5-1倍。
7.根据权利要求1所述的一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤三中,所述羧基单体为丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯中的一种或多种,所述羧基单体的质量为Fe3O4磁性微球的1-5倍。
8.根据权利要求1所述的一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤三中,所述分散剂选用柠檬酸钠,所述去离子水、柠檬酸钠、包覆、改性后Fe3O4磁性微球的质量比20-50:0.2-1:1。
9.根据权利要求1所述的一种核酸提取羧基磁珠的制备方法,其特征在于:步骤三中,所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾,所述引发剂用量是羧基单体的0.1%-2%。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310091673.1A CN116078358A (zh) | 2023-02-09 | 2023-02-09 | 一种核酸提取羧基磁珠的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310091673.1A CN116078358A (zh) | 2023-02-09 | 2023-02-09 | 一种核酸提取羧基磁珠的制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116078358A true CN116078358A (zh) | 2023-05-09 |
Family
ID=86208126
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310091673.1A Pending CN116078358A (zh) | 2023-02-09 | 2023-02-09 | 一种核酸提取羧基磁珠的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116078358A (zh) |
-
2023
- 2023-02-09 CN CN202310091673.1A patent/CN116078358A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103903827B (zh) | 一种磁性二氧化硅复合微球的制备方法及其应用 | |
CN111375360B (zh) | 一种粒径均一的磁性微球的制备方法 | |
CN113004546B (zh) | 一种硅羟基磁珠及其制备方法和应用 | |
CN103952397A (zh) | 一种使用磁珠从血清或血浆样品中分离游离核酸的方法 | |
CN109569544A (zh) | 一种氨基和羧基功能化磁性微球复合吸附剂的制备方法 | |
CN111393574B (zh) | 一种表面带有功能基团的磁性微球及其制备方法和用途 | |
CN105148846A (zh) | 一种dtpa改性材料及其制备的快速全解离型dgt结合相制备方法 | |
CN109569548A (zh) | 一种用于海水提铀的磁性纳米功能材料及其制备方法 | |
US20220396827A1 (en) | Solid phase extraction material and its use for nucleic acid enrichment and detection | |
CN105037664A (zh) | 一种采用溶胀共聚法制备的超顺磁性高级功能聚合物单分散微球 | |
CN114177893B (zh) | 磁性微球、制备方法及应用 | |
CN116078358A (zh) | 一种核酸提取羧基磁珠的制备方法 | |
CN111560369A (zh) | 一种用于纯化游离dna的微米级生物磁珠的制备方法 | |
CN103980525B (zh) | 具有磁场和温度双重响应性的聚(n-异丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸)多孔微球的制备方法 | |
CN114906876B (zh) | 一种基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法 | |
CN109456438A (zh) | 一种磁性印迹材料及其制备方法 | |
CN114773515A (zh) | 一种亚微米级羧基功能化聚苯乙烯微球的制备方法 | |
CN112604645A (zh) | 一种纳米磁粒及其制备方法和应用 | |
CN113307902B (zh) | 一种层层组装多功能纳米磁珠的制备 | |
CN112246196B (zh) | 一种功能化磁性微球的制备方法、磁性微球及应用 | |
CN110739143A (zh) | 基于蒸馏沉淀法制备磁性壳核微球的方法 | |
CN110655478A (zh) | Muba单体和磁性纳米复合微球及制备方法与在富集磷酸化肽段中的应用 | |
CN114908080B (zh) | 一种用于核酸提取的功能化磁性粒子、制备方法及其应用 | |
CN115197380B (zh) | 一种核酸片段分选用磁珠的制备方法及应用 | |
CN113788906B (zh) | 一种基于静电自吸引的P(St-X)@Ag导电材料的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |