CN112604645A - 一种纳米磁粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米磁粒及其制备方法和应用。本发明方法制备的纳米磁粒具有粒径集中、多孔结构、磁响应时间短等优点；可用于生物样品痕量病毒核酸的富集，针对血液、唾液、内脏等生物样品可实现痕量病毒核酸的检测；降低了样品前处理的成本，增加了样品核酸检测的灵敏度和准确度，使其在核酸快速检测、病毒核酸的诊断上有更大的应用前景。

Description

一种纳米磁粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物检测方法及材料技术领域，具体涉及一种纳米磁粒及其制备方法和应用。
背景技术
采用功能化磁粒进行痕量核酸的富集可有效提高聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)核酸检测方法的灵敏度。但是，目前用于核酸富集的磁粒具有一定的局限性，主要表现为粒径分布宽、表面孔隙少、磁响应时间长、分散性差等。专利CN1203916C公开了一种铁磁性多孔硅胶微球及其制备方法，所述的微球是二氧化硅/三氧化二铁的无定形纳米微粒，表面虽含有羟基，但是容易受到酸碱等反应条件的干扰并使磁性材料受到腐蚀，影响其性能的发挥。该问题也出现在其它类似的文献资料中，并且在实际应用中极大地限制了磁性材料的工作条件。
发明内容
本发明的为了解决现有技术中的上述不足，提供一种用于富集核酸的纳米磁粒及其制备方法和应用。本发明方法制备的纳米磁粒，可用于生物样品痕量病毒核酸的富集，针对血液、唾液、内脏等生物样品可实现痕量病毒核酸的检测。
本发明的第一个目的是提供一种纳米磁粒的制备方法。
所述的纳米磁粒的制备方法，包括以下步骤：
a.以Fe2+和Fe3+为前驱体，用化学共沉淀法制备纳米Fe3O4，磁分离，分离出的黑色磁性物质为纳米Fe3O4，纳米Fe3O4经洗涤后分散在去离子水中，制备得到纳米Fe3O4分散液；
b.取纳米Fe3O4分散液，均质化，在40℃～100℃、搅拌条件下逐滴加入硅酸盐溶液，用盐酸溶液调节pH至4.5～7.0，陈化3～6h，使二氧化硅包裹到纳米Fe3O4表面，磁分离，获得的磁粒用甲醇和去离子水洗涤至无杂质且pH为中性，然后分散在去离子水中得到Fe3O4@SiO2分散液；
c.向Fe3O4@SiO2分散液中搅拌条件下逐滴加入HCl溶液活化，磁分离，获得的磁粒用去离子水洗至上清液呈无色澄清且pH为中性，制备得到Fe3O4@Si-OH纳米磁粒分散液。
优选，所述的制备方法，步骤a为：
取FeCl2和FeCl3溶于HCl溶液制得Fe2+和Fe3+前驱体；无氧条件下搅拌NaOH溶液并加热至40～100℃，加入Fe2+和Fe3+前驱体，反应20～90min；用强力磁铁进行磁分离，分离出的黑色磁性物质为纳米Fe3O4，纳米Fe3O4用去离子水洗涤至无杂质、pH为中性，然后分散在去离子水中，制备得到纳米Fe3O4分散液。
优选，所述的制备方法，步骤b为：
取纳米Fe3O4分散液，均质化，加热至40～100℃，在搅拌条件下逐滴加入Na2SiO3·5H2O溶液，用盐酸溶液调节pH至中性，陈化3h，使二氧化硅包裹到纳米Fe3O4表面，用强力磁铁进行磁分离，获得的磁粒用甲醇和去离子水洗涤至无杂质且pH为中性，然后分散在去离子水中得到Fe3O4@SiO2分散液。
优选，所述的Fe3O4分散液的固含量与Na2SiO3·5H2O溶液的固含量的质量比为1:6～1:2。
本发明还提供按照所述的纳米磁粒的制备方法制备得到的纳米磁粒。
本发明还提供所述的纳米磁粒在核酸提取和富集中的应用。
所述的应用，在样品核酸提取过程中加入所述的纳米磁粒富集核酸。
本发明中核酸富集的原理：
生物样品经裂解获得粗核酸，被纳米磁粒吸附的核酸与结合液结合，经洗涤除去杂质，被纳米磁粒吸附的核酸与洗脱液反应后被洗脱下来并溶解在洗脱液中，移走内含核酸的洗脱液，将其放置在多通道实时荧光PCR检测仪(以下简称PCR仪)按PCR步骤进行检测。
本发明的纳米磁粒的制备方法，通过采用酸性溶液、水和醇类溶液交替洗涤磁粒去除其表面未反应完的铁离子、亚铁离子，有效避免磁性物质的暴露，提高磁粒的稳定性，扩大了磁珠法提取核酸时的pH范围；通过控制硅酸盐的加入量和加入速度，调节了磁粒表面硅基的厚度和孔隙度，提高了表面官能团(羟基)的载量，提升了该磁粒对核酸的富集作用。
本发明方法制备的磁粒具有粒径分布窄、表面孔隙多、磁响应时间短、富集效果好等优点，并且该方法具有操作简单、可复现的优势，适合用于批量生产核酸提取试剂盒中的磁粒原材料。本发明的纳米磁粒降低了样品前处理的成本，增加了样品核酸检测的灵敏度和准确度，使其在核酸快速检测、病毒核酸的诊断上有更大的应用前景。
附图说明
图1为化学共沉淀法制备纳米Fe3O4装置示意图，图中1、铁架台；2、水浴锅；3、搅拌器；4、多口烧瓶；5、恒流泵或恒压漏斗；8、四氟三通；9、橡胶珠胆；10、支架；
图2为合成磁粒Fe3O4@Si-OH的结构模型图；
图3为磁粒粉末的红外吸收光谱图；
图4为磁粒分散液的粒径分布图；
图5为合成磁粒粉末的SEM形貌照片。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
一种表面带有硅羟基的纳米磁粒，按如下步骤制备(制备磁粒过程示意图如图2所示)：
S1用图1所示的装置经化学共沉淀法制备超顺磁性纳米Fe3O4分散液：具体步骤如下：
取2g FeCl2·4H2O和5.2g FeCl3·6H2O溶于25ml 0.4mol L-1的HCl溶液配制成溶液A；往烧瓶中加入250ml 1.6mol L-1的NaOH溶液，通入氮气并快速搅拌，加热至80℃，将溶液A迅速倒入烧瓶中，反应30min后停止搅拌，用强力磁铁(铁铷硼永磁体)进行磁分离，分离出来的黑色磁性物质是纳米Fe3O4，弃去清液，用去离子水洗涤至无杂质、pH为中性，将收集到的磁粒分散在去离子水中，制备得到超顺磁性纳米Fe3O4分散液(分散液A)，室温(5℃～35℃)保存。分散液A的主要成分为超顺磁性的纳米Fe3O4磁粒。
S2由步骤S1获得的分散液A经超声30min后，移入烧瓶，通入氮气并快速搅拌，加热至80℃，在30min内采用逐滴滴加的方式加入40ml 0.02mol L-1的Na2SiO3·5H2O溶液，使用2mol L-1的HCl溶液缓慢调节pH至6.0，在搅拌并保持恒温的条件下持续3h，使二氧化硅包裹到纳米Fe3O4表面，用强力磁铁进行磁分离，用甲醇和去离子水洗涤至无杂质且pH为中性，获得分散液B，分散液B即为Fe3O4@SiO2分散液，室温(5～35℃)保存。
S3将步骤S2获得的分散液B配制成固含量为5mg/ml的分散液并将其移入烧瓶中继续搅拌，在室温的条件下，滴加20ml 1.0mol/L的HCl溶液，滴加持续时间为30min，使pH调节至6.0，陈化6h，采用强力永磁体(铁铷硼磁铁)磁分离后，弃去清液，用去离子水洗至上清液呈无色澄清且pH为中性，制备得到功能性Fe3O4@Si-OH磁粒分散液(分散液C)，该分散液的主要成分为Fe3O4@Si-OH磁粒，即为本实施例制备的表面带有硅羟基的纳米磁粒。
上述的步骤S1中化学共沉淀法的反应装置(图1)，其由铁架台(1)、水浴锅(2)、搅拌器(3)、多口烧瓶(4)、恒流泵或恒压漏斗(5)、四氟三通(8)、橡胶珠胆(9)、支架(10)等组成。所述铁架台(1)用于固定水浴锅(3)和支架(10)，支架(10)用于固定搅拌器(3)，多口烧瓶(4)用于放置反应液，多口烧瓶(4)上端的多个瓶口分别与搅拌器(3)、恒流泵(5)、四氟三通(8)、冷凝管(非必选)、温度计(非必选)相连接，四氟三通(8)除了与多口烧瓶(4)连接，还与橡胶珠胆(9)以及氮气瓶相连接。所述恒压滴液漏斗(5)可调节溶液的滴速，从而有效控制反应的进程，反应在无氧气条件下进行。
上述制备得到的分散液C中的Fe3O4@Si-OH磁粒，经红外光谱法溴化钾压片技术测得其主要官能团为Si-OH，波数约为1100cm-1(图3)，经粒度分析仪分析稀释液中磁性颗粒，该磁性颗粒的平均粒径为450nm(图4)，经扫描电镜分析其球状固体粉末的直径可达13.2μm(图5)。
实施例2
S1样品预处理。
移取感染非洲猪瘟病毒且稀释倍数为100倍的血液稀释液样本100μl，于塑料离心管中，用匀浆器研磨，加入400μl生理盐水混匀、离心，弃去沉淀物，留取上清液备用。
S2溶液的配制与保存。
①裂解液：各组分质量百分数为盐酸胍36％、Tris盐酸盐0.4％、EDTA 0.2％、NaCl0.04％、曲拉通(Triton X-100)1％以及水62％，用盐酸调节pH至6.0，作为裂解液备用；于4℃冰箱中保存；
②结合液：无水乙醇；
③洗涤液：质量分数52％的盐酸胍溶液(pH5.5)和体积分数70％的乙醇水溶液；盐酸胍水溶液于4℃冰箱中保存；
④洗脱液：去离子水；
⑤取实施例1制备的Fe3O4@Si-OH磁粒，以水为溶剂，配制成浓度为8mg/ml的磁粒分散液，此磁粒分散液作为吸附剂备用。
S3核酸的提取与富集。
(1)取步骤S1中的上清液300μl于塑料离心管中；加入步骤S2中的裂解液900μl，反应10min；然后加入1020μl结合液，加入浓度为8mg/ml的磁粒分散液50μl，充分混匀，静置5min；
(2)用强力磁铁进行磁分离，弃去清液，保留磁粒；
(3)用洗涤液质量分数52％的盐酸胍溶液(pH5.5)、体积分数70％的乙醇水溶液分别洗涤磁珠，用量共3000μl，期间磁分离时弃去清液、保留磁珠；
(4)加入300μl洗脱液，充分混匀分散磁珠，将离心管置于65℃下孵育5min，磁分离后，取5μl清液为待测液。
S4核酸扩增反应与检测。
使用PCR仪进行核酸的扩增反应与检测，具体操作如下：将PCR混合反应液按20μl/管分装至PCR反应管中，加入待检液5μl，盖紧管盖，漩涡混合，瞬时离心，移至扩增检测区；期间，每批次需要增加阴性对照、阳性对照各1个(阳性对照最后添加，避免交叉污染)；选定设置好的扩增程序，开启检测，等待Ct值的数据报告。
S5清洁。
弃去实验中使用过的一次性试剂与耗材，将移液枪和PCR仪置于PCR快速检测实验箱中，开启使用程序，以便杀菌消毒，同时使环境中的核酸灭活。
实施例3
S1样品预处理。从感染非洲猪瘟病毒的猪只新鲜/冰鲜脾脏中切取2颗黄豆大小的样本，于塑料离心管中，用匀浆机研磨，加入400μl生理盐水混匀、离心、留取上清液备用。
S2溶液的配制与保存操作与实施例1步骤S2相同。
S3核酸提取与富集。
取步骤S1中的上清液100μl于塑料离心管中；步骤S3余下操作、步骤S4以及步骤S5与实施例2相同。
对比例1(针对实施例2核酸提取与富集结果的对比)
S1样品预处理操作与实施例2步骤S1相同。
S2采用试剂盒方法(非磁珠法)进行核酸提取与富集。
使用深圳真瑞生物科技有限公司的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，操作步骤按试剂盒的说明书进行。
移取60μl试剂盒中的样品提取液添加至塑料离心管中，加入3μl步骤S1的样品预处理液(对应实施例2的样品预处理液(上清液))，充分混匀，反应5min，离心、取上清液5μl待检。
S3核酸扩增反应与检测操作与实施例2步骤S4相同。
S4清洁操作与实施例2步骤S5相同。
对比例2(针对实施例3核酸提取与富集结果的对比)
S1样品预处理。
切取2颗黄豆大小的感染非洲猪瘟病毒猪只新鲜/冰鲜内脏样本，于塑料离心管中，用匀浆机研磨，加入400μl生理盐水混匀、离心，弃去沉淀物，留取上清液备用。
S2采用试剂盒方法(非磁珠法)核酸提取与富集。
使用深圳真瑞生物科技有限公司的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，操作步骤按试剂盒的说明书进行。
移取60μl试剂盒中的样品提取液添加至塑料离心管中，加入3μl步骤S1的样品预处理液(对应实施例3的样品预处理液(上清液))，充分混匀，反应5min，离心、取上清液5μl待检。
S3核酸扩增反应与检测操作与实施例2步骤S4相同。
S4清洁操作与实施例2步骤S5相同。
上述的实施例2-3、对比例1-2的结果判断依据如表1所示，不同方法检测样本的Ct值和判断结果如表2所示。
表1结果判定依据表
Figure BDA0002828995710000061
表2感染非洲猪瘟病毒的猪只中血液和脾脏样本的Ct值
名称 实施例2 对比例1 实施例3 对比例2
Ct值 16.12 27.74 22.46 24.59
结果参考 阳性 阳性 阳性 阳性
在上述的实施例2-3及对比例1-2中，阳性对照的Ct值范围为16.12～24.59，阴性对照Ct值均大于38或无Ct值，经比对实验，证明了本发明制备的Fe3O4@Si-OH纳米磁粒与商品化的试剂盒(非磁珠法)相比具有较好的效果，而且适用于大样本量样品的核酸提取。
以上实施方式说明本发明制备的Fe3O4@Si-OH纳米磁粒，可用于猪只非洲猪瘟核酸的提取和检测，且能提高检测准确度和灵敏度。
应当理解，以上实施例仅仅是本发明的部分实施例，本发明还可以运用在其它类型核酸提取与富集的领域。

Claims (7)

1.一种纳米磁粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.以Fe2+和Fe3+为前驱体，用化学共沉淀法制备纳米Fe3O4，磁分离，分离出的黑色磁性物质为纳米Fe3O4，纳米Fe3O4经洗涤后分散在去离子水中，制备得到纳米Fe3O4分散液；
b.取纳米Fe3O4分散液，均质化，在40℃～100℃、搅拌条件下逐滴加入硅酸盐溶液，用盐酸溶液调节pH至4.5～7.0，陈化3～6h，使二氧化硅包裹到纳米Fe3O4表面，磁分离，获得的磁粒用甲醇和去离子水洗涤至无杂质且pH为中性，然后分散在去离子水中得到Fe3O4@SiO2分散液；
c.向Fe3O4@SiO2分散液中搅拌条件下逐滴加入HCl溶液活化，磁分离，获得的磁粒用去离子水洗至上清液呈无色澄清且pH为中性，制备得到Fe3O4@Si-OH纳米磁粒分散液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤a为：
取FeCl2和FeCl3溶于HCl溶液制得Fe2+和Fe3+前驱体；无氧条件下搅拌NaOH溶液并加热至40～100℃，加入Fe2+和Fe3+前驱体，反应20～90min；用强力磁铁进行磁分离，分离出的黑色磁性物质为纳米Fe3O4，纳米Fe3O4用去离子水洗涤至无杂质、pH为中性，然后分散在去离子水中，制备得到纳米Fe3O4分散液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤b为：
取纳米Fe3O4分散液，均质化，加热至40～100℃，在搅拌条件下逐滴加入Na2SiO3·5H2O溶液，用盐酸溶液调节pH至中性，陈化3h，使二氧化硅包裹到纳米Fe3O4表面，用强力磁铁进行磁分离，获得的磁粒用甲醇和去离子水洗涤至无杂质且pH为中性，然后分散在去离子水中得到Fe3O4@SiO2分散液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的Fe3O4分散液的固含量与Na2SiO3·5H2O溶液的固含量的质量比为1:6～1:2。
5.按照权利要求1所述的纳米磁粒的制备方法制备得到的纳米磁粒。
6.权利要求5所述的纳米磁粒在核酸提取和富集中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在样品核酸提取过程中加入所述的纳米磁粒富集核酸。
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