CN114906876A - 一种基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法 - Google Patents

一种基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法，包括如下步骤：以Fe3O4@SiO2为原料，将其超声分散于无水DMSO中，搅拌后往其中加入1,6‑己二基二异氰酸酯，得到异氰酸基修饰的Fe3O4@SiO2；然后，将异氰酸基修饰的Fe3O4@SiO2分散于聚乙烯醇的DMSO溶液中，反应后得到聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠。本发明不仅可以得到单分散性好、高饱和磁强度的磁珠，还能够避免团聚、氧化等因素对磁珠性能的影响；本发明方法制得的聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠有优异的DNA提取性能，能够在较短的磁响应时间内，实现对DNA的分离富集；本发明制得的聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠DNA提取灵敏度高，能够在较低的浓度下，实现DNA实时荧光PCR扩增，Ct值为18。

Description

一种基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法
技术领域
本发明涉及一种基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)是一种携带生物细胞中合成蛋白质所必需的遗传信息的核酸，是生物体发育和正常运转所必需的。DNA分析由于其固有的特异性和技术能力，使得检测灵敏、快速对临床诊断、基因组学和食品安全有着至关重要的作用。在复杂的生物样品中，DNA的含量相对较低(相对于其他成分)，因此样品中含有的蛋白质、多糖、磷脂和代谢物会严重干扰DNA检测。
传统DNA检测方法如苯酚/氯仿抽提法，异丙醇沉淀法，甲酰胺裂解法等主要借助沉淀，离心和过滤步骤，耗时耗力且提取效率低下。近年来，新的DNA提取方法如液-液萃取法、液-液微萃取法、固相萃取法、磁固相微萃取法等得到了越来越多的研究。在以上提及这些方法中，磁固相微萃取因其低成本、少用有机溶液、过程简单、省时省力等优点，被广泛用于DNA的富集检测。同时，磁固相微萃取中使用的磁性纳米颗粒(MNPs)可以利用外部磁场快速收集，从而避免了因离心步骤产生的剪切力导致核酸降解损失。
在实际应用中，通常需要对磁性纳米颗粒(MNPs)进行合适的表面修饰，一方面是为防止裸露的磁性纳米颗粒氧化和团聚，另一方面可以实现对核酸的高通量、自动化提取。常用于表面修饰的材料包括氨基硅烷化试剂、二巯基丁二酸、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇等。聚乙烯醇因其生物相容、无毒、低成本等优点，被广泛用于磁性纳米颗粒的修饰。基于聚乙烯醇修饰的Fe3O4，材料表面富含大量的羟基官能团，材料分散性得到了很大的提高。如在WO 01/70831中，W.Jeffery等报道了PVA修饰的磁性纳米颗粒的合成及其生物材料分离方面的潜在性能。他们以体积分数2～7％的戊二醛为交联剂，质量分数为2.5～5％、分子量大于50000g/mol的聚乙烯醇为聚合物层，10-200nm的Fe3O4为磁核，采用反向微乳液法合成了聚乙烯醇包覆的磁性纳米颗粒，但该方法制得的磁性纳米粒子尺寸大小为0.5～5μm，分布范围宽，尺寸大小不均一。再如在WO 2014/015966中，Jungen Oster等人探究了搅拌速度、聚合物浓度和交联剂浓度等因素对PVA修饰的磁性纳米颗粒尺寸的影响，并将其用于实时定量荧光PCR检测。结果表明，高搅拌速度、低浓度聚合物和交联剂可以使微粒尺寸减小，磁性核心占比增加，甚至可以达到90％以上，但带来的是微粒悬浮分散性能变差。以上方法制得的磁性纳米粒子虽然可以实现对游离DNA的分离富集，但都存在修饰过程繁琐，材料尺寸不一，尺寸分布范围较宽，磁性核心占比较少等问题，导致批次之间分离性能差异较大，分离时间有所延长。
发明内容
发明目的：本发明目的旨在提供一种磁珠尺寸均一、且不同批次间磁珠尺寸差异小、磁性核心占比大、磁响应速度快的四氧化三铁磁珠的制备方法。
技术方案：本发明所述的基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法，在有机溶剂中，以1,6-己二基二异氰酸酯作为交联剂将Fe3O4@SiO2与聚乙烯醇进行桥联得到聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠。
上述制备方法具体包括如下步骤：
(1)将Fe3O4@SiO2超声分散于无水DMSO中，搅拌下再往其中加入1,6-己二基二异氰酸酯，得到异氰酸基修饰的Fe3O4@SiO2；
(2)将步骤(1)得到的异氰酸基修饰的Fe3O4@SiO2分散于聚乙烯醇的DMSO溶液中，反应后得到聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠。
其中，步骤(1)中，Fe3O4@SiO2中Fe3O4的尺寸为15～400nm，二氧化硅壳层厚度为5～10nm。
其中，步骤(1)中，对于每g Fe3O4@SiO2，1,6-己二基二异氰酸酯的加入量为不大于1mL。
其中，步骤(2)中，聚乙烯醇的DMSO溶液中，聚乙烯醇的质量分数为1～1.5％，聚乙烯醇的醇解度为92～94mol％。
其中，步骤(2)中，异氰酸基修饰的Fe3O4@SiO2与聚乙烯醇DMSO溶液的质量体积比为10：1。
其中，步骤(1)中，Fe3O4@SiO2采用如下方法制备而成：
(1.1)按质量比1:1.5～3将FeCl3·6H2O和NaAc加入到有机溶剂中，充分溶解后，将混合物料置于高温下反应，得到Fe3O4纳米粒子；所述Fe3O4纳米粒子的粒径范围为15-400nm；通过控制原料FeCl3·6H2O和NaAc的加入比例，控制铁离子的水解速度快慢，最后通过加热得到超顺磁性Fe3O4颗粒；
(1.2)将步骤(1.1)得到的Fe3O4纳米粒子超声分散于盐酸溶液中，超声处理后用水洗涤至中性；将Fe3O4纳米粒子与盐酸反应，使铁氧键暴露出来利于与二氧化硅的结合；
(1.3)将步骤(1.2)处理过的Fe3O4超声分散于乙醇和水的混合溶剂中，加入氨水调节溶液为碱性，然后加入正硅酸四乙酯，反应后得到Fe3O4@SiO2；Fe3O4@SiO2为以四氧化三铁为核，在四氧化三铁表面包裹有二氧化硅层；通过控制Fe3O4与正硅酸四乙酯的加入比，控制Fe3O4外SiO2层的包裹厚度，当SiO2层的包裹厚度厚会影响终产物磁珠的磁性强度。
本发明方法的合成路线为：
Figure BDA0003616600390000031
本发明制得的聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠应用于核酸富集分离的原理为：在一定浓度NaCl和PEG溶液的协同作用下，游离的DNA分子被沉淀下来，借助Na+的盐桥作用，实现Fe3O4磁珠对DNA的结合，达到分离富集检测的目的。
本发明制得的聚乙烯醇修饰的Fe3O4在细菌质粒DNA提取方面的应用，具体为：
S1、裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清液；向离心管中加入200μL溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎，然后加入400μL细菌裂解液I和20μL蛋白酶K，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清；取出离心管，然后加入300μL细菌裂解液II，充分混匀，12000rpm下离心5～10min，留上清液，得到细菌裂解液；
S2、结合：取15μL Fe3O4磁珠浓度为10mg/mL的悬浮液，悬浮液是将磁珠分散在水里，与结合缓冲液按合适体积比混匀，然后加入S1所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min；磁分离20s后，弃上清液，向离心管中加入质量分数为70％乙醇溶液洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留；所用结合缓冲液为质量分数20％PEG 8000和浓度2mol/L NaCI的混合溶液，结合缓冲液和悬浮液的体积比为50：1；
S3、洗脱：加入TE缓冲溶液洗脱吸附在Fe3O4磁珠表面的DNA，65℃水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清液至新的离心管，获得细菌组DNA。
有益效果：(1)本发明方法制得的聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠尺寸均一，不同批次间尺寸差异小且重现性良好；(2)本发明方法制得的Fe3O4磁珠磁性核心占比高，四氧化三铁外的二氧化硅和聚乙烯醇共同形成的壳层厚度为10nm以下，而Fe3O4核尺寸大，为400nm左右，磁性核心占比高，磁性强，磁珠的饱和磁强度为77.21emu/g，磁响应时间为20s，具有磁响应速度快、分离时间短的优点，在磁分离过程中，能够实现30s以内的快速分离；(3)本发明方法制得的Fe3O4磁珠表面富含羟基基团，材料在样品中分散稳定性良好，在一定浓度PEG和NaCl溶液协助下，与游离的DNA分子实现结合，从而实现其能够应用于微量核酸的分离富集；(4)本发明制得的聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠DNA提取灵敏度高，能够在较低的浓度下，实现DNA实时荧光PCR扩增，Ct值为18。
附图说明
图1为实施例1制得的Fe3O4磁珠提取细菌质粒DNA的流程以及原理图；
图2为实施例1制得的Fe3O4磁珠的磁滞回线图；
图3为不同Fe3O4磁珠用量对细菌质粒DNA提取效率的影响；
图4为不同浓度NaCl对Fe3O4磁珠细菌质粒DNA提取效率的影响；
图5为不同浓度PEG 8000对Fe3O4磁珠细菌质粒DNA提取效率的影响；
图6为洗脱温度对Fe3O4磁珠细菌质粒DNA提取效率的影响；
图7为在优化条件下，Fe3O4磁珠与Fe3O4@SiO2提取细菌质粒DNA的磁响应速度对比图；
图8为在优化条件下，Fe3O4磁珠与Fe3O4@SiO2提取细菌质粒DNA的实时PCR扩增结果图。
图9为在优化条件下，Fe3O4磁珠与Fe3O4@SiO2提取细菌质粒DNA的荧光PCR扩增结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
本发明基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法，包括如下步骤：
(1)将200mgFe3O4@SiO2超声分散于40mL无水DMSO中，搅拌(搅拌速度100r/min)后往其中加入200μL1,6-己二基二异氰酸酯，得到异氰酸基修饰的Fe3O4@SiO2；
(2)将步骤(1)中200mg异氰酸基修饰的Fe3O4@SiO2分散于20mL质量浓度为1％的聚乙烯醇DMSO溶液中，反应后得到聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠。超声混匀后测定固含量，即每毫升溶液中，聚乙烯醇包覆的四氧化三铁磁珠的质量为4.2mg/mL。
从图2可以看出，制得的聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠呈现超顺磁性，无任何磁滞现象，饱和磁强度为77.21emu/g。
实施例2
聚乙烯醇修饰Fe3O4磁珠加入量的不同对细菌质粒DNA提取效率的影响：
(1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μL溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μL细菌裂解液I和20μL蛋白酶K，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液II，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
(2)结合：设置磁珠用量梯度，分别取5μL、10μL、15μL、20μL、25μL和30μL浓度为10mg/mL的聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠与结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中结合缓冲液中NaCl浓度为2mol/L，PEG 8000质量分数为20％。然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min；磁分离，弃上清，向离心管中加入70％乙醇洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留。
(3)洗脱：加入pH＝8的TE缓冲溶液洗脱吸附在材料表面的DNA，65℃水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清至新的离心管，获得细菌组DNA。
(4)检测：借助Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定DNA浓度；具体如下，首先将得到的细菌组DNA摇动混匀，取1μL滴加到检测台上，读出DNA浓度。然后依据公式q＝C×V/m，计算得到提取DNA的效率。其中，q为提取DNA的效率(mg/g)，m为加入的聚乙烯醇修饰的磁珠质量(μg)，C为得到的DNA浓度，V为得到的细菌DNA的体积。
从图3的结果可以看出，随着聚乙烯醇修饰Fe3O4磁珠加入量的增加，提取DNA量效率先是不断增加，然后逐渐降低，推测原因可能为菌液中DNA总量有限，磁珠吸附已经达到饱和。(加入量增加提取量降低的原因是随着磁珠加入量增加，分母增大，分子不变，提取效率降低)，临界点加入聚乙烯醇修饰Fe3O4磁珠的体积为15μL。可以得出，当聚乙烯醇修饰Fe3O4磁珠的加入量为15μL，吸附效率最高。
实施例3
结合缓冲液中NaCl浓度的不同对细菌质粒DNA提取效率的影响：
(1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μL溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μL细菌裂解液I和20μL蛋白酶K，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液II，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
(2)结合：取15μL、10mg/mL聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠与一系列结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中，结合缓冲液中NaCl浓度分别为0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L、3.0mol/L和3.5mol/L。然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min。磁分离，弃上清，向离心管中加入70％乙醇洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留。
(3)洗脱：加入pH＝8的TE缓冲溶液洗脱吸附在材料表面的DNA，65℃水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清至新的离心管，获得细菌组DNA。
(4)检测：借助Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定DNA浓度。具体如下，首先将得到的细菌组DNA摇动混匀，取1μL滴加到检测台上，读出DNA浓度。然后依据公式q＝C×V/m，计算得到提取DNA的效率。其中，q为提取DNA的效率(mg/g)，m为加入的聚乙烯醇修饰的磁珠质量(μg)，C为得到的DNA浓度，V为得到的细菌DNA的体积。
从图4可以看出，随着NaCl浓度的增加，提取DNA的效率是不断增加，然后逐渐降低。可以得出，当NaCl浓度为2.5mol/L时，吸附效率最高。原因是当NaCl浓度不断升高，溶液中离子强度增大，聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠出现聚沉现象，影响其吸附效率。
实施例4
结合缓冲液中PEG 8000浓度的不同对细菌质粒DNA提取效率的影响：
(1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μL溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μL细菌裂解液I和20μL蛋白酶K，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液II，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
(2)结合：取15μL、10mg/mL聚乙烯醇修饰的高磁性Fe3O4与一系列结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中，结合缓冲液中PEG 8000质量分数分别为5％、10％、15％、20％、25％和30％，然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min。磁分离，弃上清，向离心管中加入70％乙醇洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留。
(3)洗脱：加入pH＝8的TE缓冲溶液洗脱吸附在材料表面的DNA，65℃水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清至新的离心管，获得细菌组DNA。
(4)检测：借助Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定DNA浓度。具体如下，首先将得到的细菌组DNA摇动混匀，取1μL滴加到检测台上，读出DNA浓度。然后依据公式q＝C×V/m，计算得到提取DNA的效率。其中，q为提取DNA的效率(mg/g)，m为加入的聚乙烯醇修饰的磁珠质量(μg)，C为得到的DNA浓度，V为得到的细菌DNA的体积。
从图5可以看出，随着PEG 8000质量分数的增加，提取DNA的效率先是不断增加，然后略微降低，但分离时间显著增加。原因是PEG 8000质量分数过高时，混合液黏性增强，磁性粒子扩散受阻，混合和磁分离时间延长，给实际操作带来了一定困难。由此可以得出，当PEG 8000质量分数为15％，分离时间短且吸附效率最高。
实施例5
洗脱温度的不同对细菌质粒DNA提取效率的影响：
(1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μL溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μL细菌裂解液I和20μL蛋白酶K，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液II，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
(2)结合：取15μL、10mg/mL聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠与一系列结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中，结合缓冲液中NaCl的浓度为2.5mol/L，PEG 8000质量分数分别为15％，然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min。磁分离，弃上清，向离心管中加入70％乙醇洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留。
(3)洗脱：分别加入pH＝8的TE缓冲溶液洗脱吸附在材料表面的DNA，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃条件下水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清至新的离心管，获得细菌组DNA。
(4)检测：借助Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定DNA浓度。具体如下，首先将得到的细菌组DNA摇动混匀，取1μL滴加到检测台上，读出DNA浓度。然后依据公式q＝C×V/m，计算得到提取DNA的效率。其中，q为提取DNA的效率(mg/g)，m为加入的聚乙烯醇修饰的磁珠质量(μg)，C为得到的DNA浓度，V为得到的细菌DNA的体积。
从图6可以看出，随着洗脱温度的增加，提取得到的DNA量先是不断增加，然后略微降低。原因是温度升高减弱了DNA和材料间的相互作用，提取的细菌DNA更容易脱附下来，脱附效率显著提高。但温度过高给实际操作带来了一定麻烦，相应操作繁琐(如冷却到室温时间长，影响后续相关PCR实验的开展)、升温时间长(水浴升温时间长)。由此可以得出，当洗脱温度为70℃，脱附效率最高。
实施例6
为了凸显本发明制备的聚乙烯醇修饰的Fe3O4提取质粒DNA的磁响应速度快，将聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠与Fe3O4@SiO2提取细菌质粒DNA的磁响应速度进行了对比：
1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μL溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μL细菌裂解液I和20μL蛋白酶K，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液II，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
(2)结合：分别取15μL、10mg/mL聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠、Fe3O4@SiO2与结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中，结合缓冲液中NaCl的浓度为2.5mol/L，PEG 8000质量分数分别为15％，然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min。磁分离，弃上清，评估磁分离速度快慢。
磁响应速度结果如图7所示，可以清楚的看到，相较于Fe3O4@SiO2(图8左)，在外部磁场作用下，聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠可以在20s内快速响应，而Fe3O4@SiO2响应时间稍稍延长。因此，可以得出结论，本发明制得的聚乙烯醇修饰的Fe3O4具有快的磁响应速度，将其应用于微量核酸的分离，大大节省时间。
实施例7
为了凸显本发明制备的聚乙烯醇修饰的Fe3O4提取质粒DNA的效率高，将聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠与Fe3O4@SiO2提取细菌质粒DNA的效果进行了对比：
(1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μL溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μL细菌裂解液I和20μL蛋白酶K，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液II，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
(2)结合：分别取15μL、10mg/mL聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠、Fe3O4@SiO2与结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中，结合缓冲液中NaCl的浓度为2.5mol/L，PEG 8000质量分数分别为15％，然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min。磁分离，弃上清，向离心管中加入70％乙醇洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留。
(3)洗脱：分别加入pH＝8的TE缓冲溶液洗脱吸附在材料表面的DNA，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃条件下水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清至新的离心管，获得细菌组DNA。
(4)PCR扩增：选用的合适的Mix体系进行扩增，具体条件如下：首先依次在PCR扩增管中加入5μL 2×mix buffer，2μL ddH2O，上游引物和下游引物各1μL，模板为提取的细菌DNA2μL，总体积为10μL。然后将其放入PCR扩增仪进行扩增，循环扩增条件如下：95℃预变性2min，94℃变形30s，61℃退火30s，72℃预延伸30s，72℃延伸10min，循环次数为35次。
PCR扩增结果如图8所示，聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠和Fe3O4@SiO2提取的乙肝病毒质粒DNA均得到了良好的扩增。相较于Fe3O4@SiO2，聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠对应的条带更亮，说明聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠提取出的初始DNA模板量比Fe3O4@SiO2多，由此可以得出结论，本发明制得的聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠具有良好的DNA提取效果，可以将其应用于微量核酸的检测。
实施例8
为了凸显本发明制备的聚乙烯醇修饰的Fe3O4提取质粒DNA的灵敏度更高，将聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠与Fe3O4@SiO2提取细菌质粒DNA的荧光PCR扩增结果进行了对比：
(1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μL溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μL细菌裂解液I和20μL蛋白酶K，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液II，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
(2)结合：分别取15μL、10mg/mL聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠、Fe3O4@SiO2与结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中，结合缓冲液中NaCl的浓度为2.5mol/L，PEG 8000质量分数分别为15％，然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min。磁分离，弃上清，向离心管中加入70％乙醇洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留。
(3)洗脱：分别加入pH＝8的TE缓冲溶液洗脱吸附在材料表面的DNA，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃条件下水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清至新的离心管，获得细菌组DNA。
(4)荧光PCR扩增：选用的合适的Mix体系进行扩增，具体条件如下：首先依次在PCR扩增板中加入10μL 2×mix buffer，6μL ddH2O，上游引物和下游引物各0.5μL，探针0.5μL，模板为提取的细菌DNA2.5μL，总体积为20μL。然后将其放入PCR扩增仪进行扩增，循环扩增条件如下：95℃预变性2min，94℃变形15s，61℃退火30s，72℃预延伸30s，72℃延伸10min，循环次数为40次。
荧光PCR扩增结果如图9所示，可以明显看到，聚乙烯醇修饰的Fe3O4磁珠和Fe3O4@SiO2提取的乙肝病毒质粒DNA均得到了良好的扩增，当荧光PCR扩增信号到达设定阈值时，相应的Ct值分别为18和22，即达到相同的荧光强度时，聚乙烯醇修饰的Fe3O4循环圈数更少，灵敏度更高。

Claims (6)

1.一种基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法，其特征在于，所述制备方法为在有机溶剂中，以1,6-己二基二异氰酸酯作为交联剂将Fe3O4@SiO2与聚乙烯醇进行桥联得到聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠。
2.根据权利要求1所述的基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)将Fe3O4@SiO2超声分散于无水DMSO中，搅拌下再往其中加入1,6-己二基二异氰酸酯，得到异氰酸基修饰的Fe3O4@SiO2；
(2)将步骤(1)得到的异氰酸基修饰的Fe3O4@SiO2分散于聚乙烯醇的DMSO溶液中，反应后得到聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠。
3.根据权利要求2所述的基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，Fe3O4@SiO2中Fe3O4的尺寸为15～400nm，二氧化硅壳层厚度为5～10nm。
4.根据权利要求2所述的基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，对于每g Fe3O4@SiO2，1,6-己二基二异氰酸酯的加入量为不大于1mL。
5.根据权利要求2所述的基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，聚乙烯醇的DMSO溶液中，聚乙烯醇的质量分数为1～1.5％。
6.根据权利要求2所述的基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，异氰酸基修饰的Fe3O4@SiO2与聚乙烯醇DMSO溶液的质量体积比为10：1。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115430410A (zh) * 2022-08-22 2022-12-06 四川大学华西医院 一种由苯胺化修饰的磁珠复合物及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102294208A (zh) * 2010-06-23 2011-12-28 北京金麦格生物技术有限公司 一种聚乙烯醇和二氧化硅复合包被多孔磁珠的制备方法及应用
CN107490681A (zh) * 2017-09-29 2017-12-19 安徽安龙基因科技有限公司 一种EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法
US20200124592A1 (en) * 2017-06-30 2020-04-23 Apostle, Inc. Magnetic nanoparticle

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102294208A (zh) * 2010-06-23 2011-12-28 北京金麦格生物技术有限公司 一种聚乙烯醇和二氧化硅复合包被多孔磁珠的制备方法及应用
US20200124592A1 (en) * 2017-06-30 2020-04-23 Apostle, Inc. Magnetic nanoparticle
CN107490681A (zh) * 2017-09-29 2017-12-19 安徽安龙基因科技有限公司 一种EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALI REZA SARDARIAN等: "Green, cost‐effective and efficient procedure for Heck and Sonogashira coupling reactions using palladium nanoparticles supported on functionalized Fe3O4@SiO2 by polyvinyl alcohol as a highly active, durable and reusable catalyst", 《APPL ORGANOMETAL CHEM.》, pages 4856 *
YAOHUI XU等: "Colorimetric Fluorescent Nanosensor Based on Hexamethylene Diisocyanate for Fluorescent Responses and Adsorption of Heavy Metal Ions", 《J. NANOSCI. NANOTECHNOL.》, pages 2853 - 2860 *
YONGJUN TANG等: "Preparation of Functional Magnetic Nanoparticles Mediated with PEG-4000 and Application in Pseudomonas Aeruginosa Rapid Detection", 《J. BIOMED. NANOTECHNOL.》, pages 312 - 317 *
郭雅飞等: "磁性纳米复合颗粒(Fe3O4/PVA)/SiO2的制备与修饰", 《应用化学》, pages 1022 - 1026 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115430410A (zh) * 2022-08-22 2022-12-06 四川大学华西医院 一种由苯胺化修饰的磁珠复合物及其制备方法与应用

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