CN117999619A - 用于样本分离的磁性纳米粒子 - Google Patents
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Abstract
公开了具有更大的保持分散的能力的二氧化硅包被的磁性纳米粒子,以及制备和使用二氧化硅包被的磁性纳米粒子的方法,所述方法包括将新制备的粒子的水性分散体在室温下孵育达某一时间段,从而产生二氧化硅包被的磁性纳米粒子的簇,所得簇具有对于从人类临床样本中进行病毒RNA提取来说最佳的大小。所述磁性纳米粒子包括芯和包衣,其中所述芯包含Fe3O4或其他磁性材料,并且所述包衣的厚度是约1.5nm至约2nm。所述磁性纳米粒子可用于通过将核酸与其他组分分离并通过归一化核酸浓度来制备分析用核酸。
Description
相关申请的交叉引用
本国际申请要求2021年9月30日向作为受理局的美国专利商标局提交的国际申请号PCT/US2021/052974的优先权,该国际申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及一种二氧化硅包被的磁性纳米粒子(NP)、包含此类磁性纳米粒子的组合物、以及使用此类磁性纳米粒子和组合物从生物样本中分离分析物的方法。
背景技术
具有多种表面修饰的磁性粒子用于从生物样本中分离分子以进行进一步分析和处理。待分析的分子通过以下方式与样本中的其他组分分离:诱导所需分子与磁性粒子的结合,施加外部磁场以从样本的其余部分捕获分子所结合的粒子,洗涤粒子以去除污染物,并且最终使用水或低离子强度的缓冲液回收所需分子。
用于分离生物分子的磁性粒子往往在其芯处具有磁性氧化铁。磁性氧化铁粒子通常以磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γ-Fe2O3)或赤铁矿(Fe2O3)形式存在。例如,磁性粒子可包被有二氧化硅,并呈现从数十纳米到数百纳米到数微米的宽粒度分布。许多用于创建经二氧化硅包被的磁性粒子的合成方法会导致材料具有不良限定(不均匀)的二氧化硅表面和/或产生大聚集体,所述大聚集体从悬浮液中沉降出来,从而使得材料难以加工。因此,需要在方案之前和期间进行粒子混合,以确保最大的生物分子结合和高纯度材料的回收。
更具体地,二氧化硅包被的磁性粒子可用于从生物样本中分离核酸。Vogelstein[Vogelstein,B.和Gillespie,D.,Proc.Nalt.Acad.Sci.USA,76(2)615-619,1979]展示了使用二氧化硅从样本中捕获核酸的第一示例。他发现,在离液盐存在下,核酸会与二氧化硅玻璃牢固地结合。可以在核酸保持与二氧化硅结合的同时,用含水有机溶剂洗涤结合的核酸以去除污染物。当暴露于低离子强度的缓冲液时,核酸随后从二氧化硅中释放。开发一种可再现的合成方法来创建非常小的或最佳地小的二氧化硅包被的“纳米粒子”将允许使核酸被捕获在二氧化硅表面上,洗去污染物,然后在低离子强度的缓冲液中洗脱,而不会出现附聚和随后沉降的伴随问题。
上述纳米粒子(NP)可用于多种核酸纯化方案。例如,可以依靠从Covid-19疾病的病原体SARS-CoV-2病毒富集RNA来开发诊断方法。所得RNA可通过定量逆转录聚合酶链式反应(QRT-PCR)来检测。如果提供高度纯化的基于NP的核酸,则可以使用各种分析工具来分别检测多种其他病毒和细菌感染性致病因子,例如Flu-A、Flu-B和军团菌属(Legionella)(导致军团菌病)。
此外,可精简下一代测序(NGS)方案,从而通过使用NP将每个NGS文库调整到相同的特定靶浓度(称为“归一化”)来产生更高的样本通量。多个可变浓度的NGS文库的归一化允许在加载到测序仪器上之前合并所述NGS文库。这种过程允许在一个测序轮次中对多个NGS文库进行测序,从而最大化数据收集并最小化测序仪器成本。
存在几种归一化可变浓度的NGS文库的现有方法。这些现有方法包括通过分光光度法、荧光测定法、定量PCR、或电泳进行核酸定量,之后计算所需浓度,然后将所有样本稀释至归一化浓度。其他用于核酸归一化的方法包括由Corning Life Sciences和其他公司出售的试剂盒。Corning的“AxyPrep Mag PCR Normalizer”方案指出10μL的珠粒混合物具有200ng的输入文库DNA结合能力。该方案建议“为了最小化每个数据点内的变异性,输入DNA必须是所需DNA量的至少3-4倍高。例如,如果您所需的洗脱DNA浓度是2ng/μL,则您的样本输入量必须是至少8ng/μL”。在测序项目中获得这些量的文库NA(例如,从50μL的文库回收体积或200nM浓度获得400ng的DNA)非常困难。如果用于NGS文库合成的DNA的质量不良,例如典型地从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本中回收的DNA,则尤其如此。
Agilent Technologies,Inc.(Santa Clara,CA)目前提供了用于创建下一代测序文库的试剂盒,例如“SureSelectXT Target Enrichment System”。SureSelectXT方法创建了非归一化DNA总量的范围为10nM至约50nM的文库。这些DNA量被认为太低以至于无法使得能够使用AxyPrep Mag PCR Normalizer试剂盒。
基于核酸的诊断和测序在研究和医学诊断中的使用正在增长,但分析前的核酸制备是核酸分析技术(例如实时PCR、核酸测序和杂交测试)的重大成本组成部分。样本制备会延迟测试结果并限制由训练有素的人员在实验室进行这些测定的能力。目前的样本制备过程费力、耗时并且需要实验室能力。
仍然需要能够简化并从多种样本类型可靠地生产纯化的核酸以用于诊断和研究应用的磁性纳米粒子和组合物。
发明内容
作为本技术的一个方面,提供了一种磁性粒子的稳定水性分散体。个别磁性纳米粒子中的每个磁性纳米粒子均由磁芯和围绕所述芯的均匀保形包衣组成。均匀保形包衣的厚度为约1.5nm至约2nm。个别均匀保形包衣的磁性纳米粒子的平均总直径为约10nm至约20nm。在一些示例中,所形成的磁性纳米粒子小簇在分散体中的平均簇大小是约50nm至约190nm。在一些示例中,分散体中簇的平均簇大小是约10nm至约1000nm,例如约300nm。
作为本技术的另一方面,提供了制备二氧化硅包被的磁性纳米粒子的方法。将Fe3O4纳米粒子在醇混合物中提供,并且在对混合物进行超声处理的同时添加硅酸盐溶液。磁性纳米粒子上的二氧化硅包衣的厚度可以通过改变所添加的硅酸盐的量来调整。
在使用共沉淀制备Fe3O4粒子的一些示例中,本方法在Fe3O4共沉淀反应期间排除氧以最小化/消除不希望的Fe2O3的形成。在一些示例中,包衣厚度经选择以(1)保护Fe3O4芯免于被进一步氧化成Fe2O3,(2)完全覆盖磁芯,以及(3)改变所得芯-壳粒子的表面化学性质以包含高密度的硅烷醇基团(Si-OH),从而使得最终粒子更易与核酸结合。已经发现,包衣厚度和表面积是关于本发明的磁性粒子用于从生物样本中纯化核酸的用途和效率的重要参数。
在另一方面中,提供了用于将本文所述的纳米粒子的水性分散体维持达成簇期(“老化的”NP),从而导致形成稳定且具最佳大小的簇的方法。例如,在成簇期期间可将纳米粒子维持在室温或在20℃与30℃之间,所述成簇期可以是至少一个月,或者至少二个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月或八个月,由此个别磁性纳米粒子形成具有为选定值或范围的平均簇大小(例如,直径)的簇。例如,平均簇大小可以是至少约200nm、或者至少约220nm、或者至少约235nm、或者至少约250nm、或者至少约260nm,和/或平均簇大小可以是至多约400nm、或者至多约370nm、或者至多约350nm、或者至多约320nm、或者至多约300nm、或者至多约290nm。明确设想前述最小值和最大值中的任一者可组合以形成选定范围,例如约200nm至约400nm、或者约250nm至约350nm的范围。与“未老化”的NP相比,使用老化的NP实现了对人类临床样本中核酸检测的增强。在一些实施方式中,老化的NP形成了平均簇大小为约250nm、约255nm、约260nm、约265nm、约270nm、约275nm、约280nm、约285nm、约290nm、约295nm、约300nm、约305nm、约310nm、约315nm、或约320nm的簇;可设想的是,这些值中的任何值都可经组合以形成范围。进一步可设想并在此声明,前述近似值中的每个近似值也是具体值的公开。
在另一方面中,提供了用于制备分析用核酸的方法。所述方法包括以下步骤:将包含核酸的样本与结合介质和如本文所述的磁性纳米粒子组合物在器皿中组合;使所述核酸结合至磁性纳米粒子的包衣;通过使用磁场将纳米粒子与所述器皿内的液体分离;从所述器皿中去除液体并将与核酸结合的磁性纳米粒子保留在所述器皿内;使所述与核酸结合的磁性纳米粒子与洗涤溶液接触以去除污染物,与此同时所述磁性纳米粒子保持被磁体吸引或者分散,然后被磁场重新吸引,随后去除洗涤溶液;以及最终添加洗脱介质并收集从磁性纳米粒子释放的核酸。将核酸从器皿中取出,从而提供核酸制备物。
作为本发明的另一个方面,提供了用于从生物样本获得RNA并制备分析用RNA的方法。所述方法包括将包含RNA的生物样本置于器皿中,其中所述生物样本是细胞或病毒。使生物样本与硫氰酸胍(GTC)和蛋白酶K接触以形成样本混合物,将所述样本混合物在升高的温度下孵育达样本制备期。将净醇和磁性纳米粒子组合物(其实施方式在本文中描述)添加到器皿中的样本混合物中。所述方法还包括将样本混合物和磁性纳米粒子混合并孵育达第二孵育期,然后施加磁力以将所述磁性纳米粒子与器皿内的上清液分离。将上清液从器皿中取出,而不干扰分离的磁性纳米粒子,将所述分离的磁性纳米粒子用醇溶液洗涤一次或多次。将分离的磁性纳米粒子干燥,并将洗脱介质添加到器皿中并与磁性纳米粒子混合。在将RNA从磁性纳米粒子上洗脱以形成洗脱液的洗脱期之后,将洗脱液从器皿中取出。
本发明方法和组合物的这些和其他特征和优点将从以下详细描述结合所附权利要求书变得显而易见。
附图说明
图1A和图1B是根据本技术制备的二氧化硅包被的磁性纳米粒子的实施方式的图示。
图2A和图2B是示出个别的二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子和由水性分散体中的未老化的粒子形成的典型簇大小的电子显微照片。图2C示出了根据本技术的二氧化硅包被的磁性纳米粒子的激光衍射数据。图2D至图2I是实施例1中制备的二氧化硅包被的磁性纳米粒子的TEM图像。
图3示出了通过FT-IR光谱法获得的二氧化硅包被的磁性纳米粒子的全光谱。清楚地看到了约580cm-1处的Fe-O伸缩振动和约1100cm-1处的Si-O-Si伸缩振动。
图4是一系列IR光谱,强调了随着用于二氧化硅包被过程的TEOS体积的增加(0.5ml至2.5ml),Si-O与Fe-O峰比率增加。Si-O与Fe-O峰比率越高发信号通知Fe3O4纳米粒子芯上形成了的二氧化硅壳越厚。
图5是示出二氧化硅包衣的厚度随着TEOS量的增加而线性增加的图表。
图6是放大倍率为250,000倍的根据本技术的二氧化硅包被的磁性纳米粒子的扫描电子显微术(SEM)图像。粒子是用1.5ml TEOS和超声处理制成的。
图7是根据本技术的二氧化硅包被的磁性纳米粒子的透射电子显微术(TEM)图像。典型Fe3O4芯的范围是7nm至10nm。使用1.5ml TEOS时粒子上的平均二氧化硅包衣厚度是约1.6nm。芯内可见明显的Fe3O4晶格指示在合成期间缺乏氧化。
图8A至图8F示出了诊断定量逆转录聚合酶链式反应(QRT-PCR)结果。使用手动(图8A至图8C)和自动(图8D至图8F)方案和多批磁性二氧化硅纳米粒子,从样本中回收病毒RNA并通过诊断QRT-PCR进行分析。
图9示出了NGS相关的“归一化”结果。所呈现的数据是电泳和下一代测序数据度量,验证了如下所定义的归一化已完成。
图10提供了使用小磁体从稳定悬浮液中磁性分离二氧化硅包被的磁性纳米粒子的照片。
图11A至图11K示出了通过各种参数分析的NGS文库归一化结果。
图12A、图12B、图13A和图13B示出了纳米粒子簇由于老化而大小增加。
当结合附图阅读时,可从以下详细描述最好地理解本发明的教导。各特征不一定按比例绘制。
具体实施方式
本公开所描述的二氧化硅包被的磁性纳米粒子(本文中也缩写为“NP”)对于从样本中分离核酸令人惊讶地有效。二氧化硅包衣提供了亲水性底物,从而大大减少了重要应用(例如核酸纯化)中的非特异性结合。
在一些实施方式中,作为定量逆转录聚合酶链式反应(QRT-PCR)检测测定的一部分,本技术用于富集从细胞或病毒样本获得的RNA。举例来说,本技术可用于在通过QRT-PCR检测RNA之前从SARS-CoV-2或其他病毒病原体中富集所述RNA。在一些实施方式中,本技术用于富集人类RNA以及人类和细菌DNA。例如,本技术可用于富集和检测来自呼吸道病原体(例如军团菌属(军团病的病原体))的DNA。在一些实施方式中,本技术用于在下一代测序(NGS)之前对DNA文库进行归一化。在一些实施方式中,本技术用于在分析样本之前对DNA或RNA样本进行归一化。
参考图1A,本技术提供了磁性纳米粒子100,所述磁性纳米粒子包含芯10和芯10上的基本上包封芯10的均匀保形包衣20。在一个示例中,包衣20完全包封芯10。芯10可以由金属、合金或金属氧化物制成,并且包衣可以由二氧化硅制成。在一个示例中,芯10可以是Fe3O4并且包衣包含二氧化硅。在一个示例中,二氧化硅包衣是基本上无孔的。芯直径与包衣厚度的比率以及包衣表面的特性可以使得多个磁性纳米粒子100以允许样本溶液中的分析物最佳地结合在磁性纳米粒子100的包衣的表面上的方式聚集。然后,可以通过向具有磁性纳米粒子100的样本溶液施加磁场,将在其经包被的表面上结合有分析物的磁性纳米粒子100从样本溶液中快速去除。
图1A示出了本发明磁性纳米粒子100的制备的实施方式。在一个示例中,磁性纳米粒子100可包括约9nm至约40nm,例如约20nm至约30nm的大小。芯10可包括约5nm至约20nm,例如约7nm至约15nm或更小、例如约10nm至约15nm或更小,例如约8.8nm或更小、约8nm或更小、或约7.9nm的直径。包衣20基本上包封芯10。在一些示例中,包衣20可包括约0.5nm至约7.5nm、约1nm至约2nm、例如约1.5nm至约2nm的厚度。图1B示出了粒子大小为约15nm且包衣厚度为约2.5nm的磁性纳米粒子100。
二氧化硅包衣20的芯直径与厚度的比率与二氧化硅包衣20的特性的组合允许磁性纳米粒子100聚集并产生簇,如图2A和图2B中所示。在一个示例中,簇可以是约10nm至约1000nm,例如约20nm至约500nm、约100nm至约500nm、约200nm至约500nm、约250nm至约450nm、约275nm至约325nm(例如,约300nm)、约30nm至约400nm、约40nm至约300nm。图2C示出了用来自Malvern Panalytical的Mastersizer3000所测量的激光衍射数据,显示了典型的NP水性分散体中的粒度分布。分散体中存在个别粒子直至直径为约1微米的簇,其中平均簇直径大小是128-174nm。这个示例的纳米粒子是“未老化的”。
本发明NP在手动和自动化工作流程中表现出高磁化率。这在自动化平台中尤其理想,在自动化平台中磁性粒子捕获的时机和效率很重要,从而需要在捕获、洗涤和洗脱步骤处快速且定量的粒子收集。
在一些实施方式中,纳米粒子的芯大部分或全部由Fe3O4晶格构成。在一些实施方式中,纳米粒子的芯大部分或完全由表现出顺磁性的磁铁矿(Fe3O4)的单纳米级晶体或Fe3O4的单畴磁性纳米粒子构成。
在一些示例中,NP的布鲁诺尔-埃默特-泰勒(Brunauer-Emmett-Teller,BET)表面积是至少105m2/g,例如至少约110m2/g至约180m2/g或至少约110m2/g至约130m2/g。NP的BET表面积可通过氮气吸附技术测定。例如,可使用Micromeritics ASAP2020体积吸附分析仪在液氮温度(-196℃)下测量氮气吸附/解吸等温线,以测定中孔率。
本文所述的二氧化硅包被的磁性纳米粒子可以直接使用或经官能化以适应特定应用需要。官能团(例如羧酸根、环氧基和甲苯磺酸根)可被包含在或添加到二氧化硅包衣中,并且此类官能团可以是用于共价官能化的便利方法。作为进一步的示例,二氧化硅包衣还可以通过将一种或多种类型的有机基团掺入二氧化硅基质中来改性。有机基团可以共价官能化二氧化硅包衣的表面和/或孔隙。作为另一示例,聚合物还可通过简单的包衣或共价附接来官能化二氧化硅表面。
本文所述的二氧化硅磁性纳米粒子的包衣可包括延伸至磁性纳米粒子的表面的孔隙。包衣可以用其孔隙内部和外部的官能团进行改性。在一些示例中,包衣进一步包含被配置为结合分析物(例如核酸)的反应性化学部分。
本技术提供了组合物,所述组合物可包含多个本文所述的磁性纳米粒子。所述多个磁性纳米粒子的平均粒度为约15nm或更小、或约12nm或更小、或约11nm或更小。所述组合物是磁性纳米粒子在液体介质(例如水)中的稳定悬浮液。在一些示例中,磁性纳米粒子以3g/L至30g/L、或10g/L至20g/L、或约13g/L的浓度存在于稳定悬浮液中。
在一些示例中,纳米粒子在25℃的温度下保持悬浮至少6个月,或者至少9个月。在一些示例中,纳米粒子在被使用、运送给用户或释放用于一般用途或指定用途之前被保持达聚集期。聚集期经选择为使纳米粒子形成具有所需大小或特性的簇。示例性聚集期包括至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约六个月、至少约八个月或更长;或者,示例性聚集期包括至多约十八个月、至多约十二个月、至多约十个月、至多约八个月、至多约六个月、至多约五个月或更短;可设想的是,前述最小值和最大值中的任一者都可组合以形成范围,只要最小值短于最大值即可。在一些示例中,一般用途是从样本中分离分析物,例如RNA。在一些示例中,指定用途是对从样本获得的核酸的量进行归一化。
本技术还包括磁性纳米粒子的经包装的稳定悬浮液。本文所述的磁性粒子或组合物可以在密封包装中提供,其中所述密封包装的内部体积是纳米粒子在水中的悬浮液。
本技术提供了一种制备二氧化硅包被的磁性纳米粒子的方法。本发明的用于生产二氧化硅包被的磁性纳米粒子的方法包括通过在室温下在惰性气氛下添加碱(例如氨或NaOH)来由Fe3+/Fe2+盐的水溶液合成磁性铁氧化物。Fe3O4粒子可以使用共沉淀来制备。磁性纳米粒子的大小、形状和组成取决于所用盐的类型(例如氯化物、硫酸盐、硝酸盐)、Fe3+/Fe2 +比率、反应温度和pH值。一旦合成条件固定,所合成的磁铁矿纳米粒子的最终特性就变得完全可再现。这种技术在形成Fe3O4纳米粒子方面的优点包括粒子快速形成、使用廉价溶剂、用于分离产物的磁性分离、受控的粒子大小和形态、可再现的磁性性质,以及在更大工业规模上执行纳米粒子合成的能力。在一些示例中,用于共沉淀的Fe+浓度小于0.1M,或者小于0.05M,或者小于0.02M,例如0.01M。
所述方法包括在经去离子、经脱氧的水中以约2/1的Fe3+/Fe2+摩尔比制备Fe3+离子和Fe2+离子的水溶液。在一些示例中,水溶液中Fe3+的浓度是约2mM至约50mM,并且水溶液中Fe2+的浓度是约1mM至约25mM。所述水溶液可通过将FeCl3和FeCl2溶解在经去离子、经脱氧的水中来制备,但也可使用其他铁盐。在所述水与铁盐合并之前,所述水可以通过任何合适的技术脱氧,例如通过用惰性气体喷射、超声处理和/或搅拌达足够的脱氧期。脱氧期通常是至少两个小时,但也可采用更长或更短的时间。
对Fe3+离子和Fe2+离子的水溶液进行超声处理,并且任选地可将所述水溶液的温度调整至约35℃,例如通过将水溶液从室温加热。可以在惰性气氛下将碱添加到加热的水溶液中。在一些示例中,合适的碱包括氨、氢氧化钠等。所述碱以足以从水溶液中形成Fe3O4芯的量添加。例如,所述碱可以2倍或更大(例如,4倍或8倍)摩尔过量添加。作为添加足够量的碱的结果,形成了包含Fe3O4纳米粒子和碱性水的混合物。在一些示例中,可以将碱滴加到所述水溶液中,任选地与此同时搅拌和/或超声处理所述水溶液。
将混合物维持在惰性气氛下不搅拌达沉降期,在所述沉降期期间Fe3O4纳米粒子从碱性水中沉降出。在一些示例中,沉降期是过夜,或约12小时;在其他示例中,沉降期是至少4小时、6小时、8小时、12小时或18小时,和/或不大于60小时、48小时、36小时、24小时或20小时;前述值可经组合以形成沉降期范围。在沉降期之后,将大部分碱性水经由抽吸从混合物中去除。这提供了Fe3O4纳米粒子在碱性水中的浓缩混合物。
将脱氧醇添加到所述浓缩混合物中以形成水性醇混合物。将所述水性醇混合物搅拌并超声处理以悬浮Fe3O4纳米粒子。在一些示例中,在进一步加工之前将附加碱添加到所述水性醇混合物中。
在超声处理并维持惰性气氛的同时,将硅酸盐溶液添加到含水醇混合物中。所述二氧化硅包衣的厚度可以通过所用反应物的量来控制。可以例如在30min至90min的时段内将硅酸盐溶液缓慢滴加到水性醇混合物中,与此同时搅拌并超声处理所述混合物。硅酸盐溶液包含原硅酸四乙酯(TEOS)和醇。在一些示例中,硅酸盐溶液是无水的。
将这种混合物在惰性气氛下搅拌达包被期,在所述包被期期间在Fe3O4纳米粒子上形成了二氧化硅包衣。在一些示例中,包衣期是过夜,或约12小时;在其他实施方式中,包衣期是至少4小时、6小时、8小时、12小时或18小时,和/或不大于60小时、48小时、36小时、24小时或20小时;前述值可经组合以形成包被期范围。
通过任何合适的分离技术将二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子与醇水性混合物分离。通过磁性捕获从水性醇混合物中分离Fe3O4纳米粒子。二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子可用甲醇或其他醇或溶剂洗涤。所分离的二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子可进行干燥,例如通过真空干燥进行干燥。通过干燥形成二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子的粉末。在一些示例中,在不研磨或机械分离包含二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子的情况下形成了所述纳米粒子的粉末。
所得干燥的纳米粒子可分散到脱氧水中以形成组合物。在一些示例中,所述组合物是稳定悬浮液。所得粒子的悬浮液可老化达长达6个月,以允许纳米粒子的平均簇大小从平均125nm增大至260nm。
本技术还包括用于通过从样本中分离核酸来制备分析用核酸的方法。在一些示例中,所述方法包括将包含核酸的样本与结合介质和如本文所述的磁性纳米粒子组合物在器皿中组合的步骤。所述核酸与磁性纳米粒子的包衣结合。在结合期后,将与核酸结合的磁性纳米粒子与器皿内的结合介质分离。使与核酸结合的磁性纳米粒子与洗涤溶液接触以去除不希望的污染物,然后与洗脱介质接触,从而将结合的核酸与磁性纳米粒子分离。所述磁性纳米粒子被磁体吸引,并且将所得的含有所需核酸的澄清溶液从器皿中取出,从而提供核酸制备物。
本文所述的磁性纳米粒子和组合物具有许多用途,例如用于从生物样本中分离分析物,例如小分子、蛋白质和/或核酸。磁性纳米粒子和组合物可用作化学或生物物质的载体,包括例如贵金属粒子、有机或无机小分子、DNA、肽或多肽(例如抗体和其他蛋白质)以及全细胞。此类载体的应用可能包括磁共振成像(MRI)、光学成像、靶向药物递送和细胞递送。
本技术提供了一种用于制备分析用核酸的方法。所述方法包括将包含核酸的样本与结合介质和如本文所述的磁性纳米粒子组合物在器皿中组合的步骤。所述核酸与磁性纳米粒子的包衣结合。在结合期后,将与核酸结合的磁性纳米粒子与器皿内的结合介质分离。在一些示例中,然后用包含水性醇或各种可与水混溶的有机溶剂(例如乙腈、丙酮和环丁砜)的洗涤介质洗涤与核酸结合的磁性纳米粒子。然后将大部分液体(结合介质和/或洗涤介质)从器皿中去除,与此同时注意将与核酸结合的磁性纳米粒子保留在所述器皿内。使与核酸结合的磁性纳米粒子与洗脱介质接触,从而将所结合的核酸与磁性纳米粒子分离。将核酸从所述器皿中取出,从而提供核酸制备物。
所述磁性纳米粒子的包衣可包含被配置为选择性地结合核酸或另一种分析物的结合部分。
从样本中分离核酸是对分离其他分析物,例如小分子,例如药剂、蛋白质或多肽、脂质或其他分析物的说明。
本方法可用于归一化从样本获得的核酸的量。在此类方法中,所述样本包括输入量的核酸,并且所述磁性纳米粒子组合物具有对输出量的核酸的结合能力。所述输出量小于所述输入量。
所述磁性纳米粒子组合物的归一化因子可在0.8与1.2之间,其中所述归一化因子是指在暴露于高浓度核酸之后从磁性二氧化硅纳米粒子回收的核酸的浓度值除以在暴露于低浓度核酸之后从磁性二氧化硅纳米粒子回收的核酸的浓度值。对于为NGS制备的组合物来说,理想地,归一化因子将是约1.0。
核酸制备物包含长度在预定长度范围内的核酸。在一些示例中,最小核苷酸长度是50个核苷酸(nt)、或70nt、或75nt、或80nt、或100nt、或150nt、或200nt、或500nt、或2,000nt、或5,000nt、或10,000nt、或50,000nt、或100,000nt;最大核苷酸可以是200万nt、或100万nt、或500,000nt、或200,000nt、或75,000nt、或25,000nt、或12,500nt、或6,000nt、或3,000nt、或1,500nt、或750nt,或400nt、或250nt;前述最小值和最大值中的任一者都可经组合以形成所需的核苷酸长度范围,只要最小值小于最大值即可。
本方法可用于包含低量核酸,例如小于1,000ng、或小于500ng、或小于200ng、或小于100g、或小于50ng的核酸的输入样本。
本技术提供了一种从生物样本获得RNA以及制备分析用RNA的方法。在所述方法中,将包含RNA的生物样本置于器皿中。所述生物样本可以是细胞或病毒。
所述方法包括使生物样本与硫氰酸胍(GTC)和蛋白酶K接触以形成样本混合物,将所述样本混合物在升高的温度(例如约60℃)下孵育达样本制备期(例如10分钟或更短,或约5分钟)。GTC和蛋白酶K可以单独添加或预混并一起添加。在样本制备期之后,将净醇添加到器皿中的样本混合物中,并且还将本文所述的磁性纳米粒子组合物中的一种磁性纳米粒子组合物添加到器皿中的样本混合物中。将样本混合物和磁性纳米粒子混合并孵育达第二孵育期(例如10分钟或更短,或约5分钟)。
在第二孵育期后,施加磁力以将磁性纳米粒子与器皿内的上清液分离。将上清液从器皿中取出,而不干扰分离的磁性纳米粒子,然后将所述分离的磁性纳米粒子用醇溶液洗涤一次或多次。合适的醇溶液可包含80%v/v或更高的低级醇,例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或它们的混合物。可与水混溶的多种非醇有机溶剂也可用于洗涤目的并且是本领域技术人员已知的。这些非醇有机溶剂中的若干非醇有机溶剂包括但不限于乙腈、丙酮和环丁砜。将分离的磁性纳米粒子干燥,并将洗脱介质添加到器皿中。将磁性纳米粒子与洗脱介质混合达洗脱期(例如,小于10分钟),在此之后将RNA从磁性纳米粒子洗脱以形成洗脱液。从器皿中取出含有RNA的洗脱液,然后可以对所述RNA进行分析,例如用于诊断和研究目的的定量逆转录聚合酶链式反应(QRT-PCR),或者可以对所述RNA进行修饰以用作核苷酸测序(例如桑格测序和NGS测序)的底物。或者,可以将取出的洗脱液置于密封并在降低的温度下存储的第二器皿中,例如以供运输或稍后进行分析。
在一些示例中,前述方法的一个、几个或所有步骤由自动化仪器执行。
术语
应当理解的是,本文中使用的术语仅是为了描述特定实施方式的目的,而不是旨在进行限制。所定义的术语是作为对本教导的技术领域中通常理解和接受的所定义术语的技术和科学含义的补充。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用以描述任何长度,例如大于约10个碱基、大于约100个碱基、大于约500个碱基、大于1000个碱基、大于10,000个或更多个碱基的由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成聚合物,或者合成产生的化合物,所述化合物可以以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交,例如可以参与沃森-克里克碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)。
术语“互补的”、“补体”或“互补核酸序列”是指通过沃森-克里克碱基配对规则与另一核酸链中的碱基序列相关的核酸链。一般而言,当一个序列可以以反平行的方式与另一序列杂交时,所述两个序列是互补的,其中各序列的3'末端与另一序列的5'末端杂交,并且然后将一个序列的每个A、T/U、G和C分别与另一序列的T/U、A、C和G进行比对。
术语“双链体”是指完全或部分互补的至少两个序列在其全部或大部分核苷酸之间进行沃森-克里克型碱基配对,从而形成稳定的复合物。术语“退火”和“杂交”可互换使用以意指形成稳定双链体。
在核苷酸序列的上下文中,术语“杂交(hybridization/hybridizing)”在本文中可互换使用。两个核苷酸序列彼此杂交的能力基于所述两个核苷酸序列的互补程度,所述互补程度继而基于匹配的互补核苷酸对的分数。给定序列中与另一序列互补的核苷酸越多,则杂交条件就可越严格,并且两个序列的杂交将越特异。提高严格性可以通过升高温度、增加共溶剂的比例、降低盐浓度等来实现。
如说明书和所附权利要求书中所使用的,并且除了它们的普通含义之外,术语“基本上”或“实质上”是指在本领域普通技术人员可接受的限度或程度内。例如,“基本上取消”意指本领域技术人员认为取消是可以接受的。
如说明书和所附权利要求书中所使用的,除了其普通含义之外,术语“大约”和“约”意指在本领域普通技术人员可接受的极限或量内。术语“约”通常指指定数字的正负15%。例如,“约10”可以指示8.5至11.5的范围。例如,“大约相同”意味着本领域普通技术人员认为所比较的项目是相同的。
在本公开中,数字范围包括定义该范围的数字。应当认识到,出于说明目的,化学结构和化学式可以被延长或放大。
除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域中的技术人员通常理解的相同含义。
在描述各种实施方式之前,应当理解的是,本公开的教导不限于所描述的特定实施方式,并且因此当然可以变化。还应理解,本文使用的术语仅用于描述特定实施方案,并不旨在限制,因为本教导的范围仅受所附权利要求的限制。
如本文所公开的,提供了多个值范围。应当理解的是,除非上下文另外明确指出,否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值至下限单位的十分之一。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料也可用于本技术的实践或测试,但是现在描述一些例示性方法和材料。
本文提及的所有专利和出版物均明确以引用方式并入。
如说明书和所附权利要求书中所使用的,除非上下文另外明确指出,否则术语“一”、“一个(种)”和“所述”包括单数和复数指示物。因此,例如,“一部分”包括一个部分和多个部分。
实施例
实施例1
在此实施例中,使用先前和以下所述的方法来制备二氧化硅包被的磁性纳米粒子(NP)。如下执行合成1g规模的Fe3O4纳米粒子的示例性工序:使用硬N2吹扫、机械搅拌和超声处理2小时,将400ml去离子(DI)水彻底脱氧。一旦脱氧,就在氮气下添加2.508g的FeCl3(9.24mM)和0.919g的FeCl2(4.62mM)并另外吹扫/超声处理。在超声处理过程中,将水温升高至35℃。然后,将10ml的28%氨溶液(0.18M,其大约是将铁完全转换为磁铁矿所需的4摩尔过量)快速添加到快速搅拌和超声处理中的溶液中。溶液立即变成黑色,并具有纳米粒子沉淀。停止超声处理并将混合物在氮气下再搅拌4小时。然后,将粒子在没有搅拌的情况下在氮气下静置直至第二天。纳米粒子沉降到烧瓶底部,产生澄清的上部水层和由磁性Fe3O4纳米粒子组成的黑色底层。
在第二天,通过经由抽吸去除澄清的氨/水上层来分离沉降的Fe3O4纳米粒子。将剩余的溶剂(100ml)留在原处。然后将300ml的脱氧乙醇添加到黑色浆液中。将粒子搅拌并超声处理1小时以重悬所述纳米粒子。在超声处理的同时,将1.5ml的TEOS与80ml的无水乙醇混合,并在氮气吹扫下置于加料漏斗中并装配至烧瓶。吹扫所述烧瓶,然后将所述烧瓶在流动的N2下密封。然后向黑色纳米粒子悬浮液中添加5ml的附加氨溶液(28%)。将混合物再次超声处理并在氮气流下机械搅拌10分钟。然后在约60min的时段内将TEOS溶液滴加到搅拌和超声处理中的纳米粒子中。在添加TEOS溶液后,在N2下继续缓慢搅拌过夜。
在第二天,使用磁体将纳米粒子分离到烧瓶底部。将澄清的乙醇/水混合物从由磁体保持在原处的纳米粒子中倾析出。将二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子用新鲜甲醇洗涤两次并磁力分离。然后将纳米粒子在氮气流下干燥成粉末,然后分散到100ml的脱氧水中。将纳米粒子在惰性气氛下密封之前用氮气广泛喷洗并进行超声处理,从而产生1.3重量%的纳米粒子水溶液。
将二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子的样本分离为干燥粒子,以便执行各种分析。使用扫描电子显微术(SEM)对粒子进行成像,以估算个别粒子的聚集程度和总体大小。图2A至图2B是根据本技术的二氧化硅包被的磁性纳米粒子的扫描电子显微术(SEM)图像。图2C示出了根据本技术的二氧化硅包被的磁性纳米粒子的激光衍射数据。
使用当前技术(其包括在合成期间进行超声处理)有助于分散纳米粒子芯,从而允许发生均匀二氧化硅包被并防止过早粒子聚集。SEM估计显示最终二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子的直径在10nm与15nm之间。这表明芯/包衣结构由直径为约7-10nm的内部Fe3O4纳米粒子结合厚度为约1.5nm的外部均匀二氧化硅壳构成。这些大小已使用高分辨率TEM确认。
实施例1-1、实施例1-2和实施例1-3使用上述技术用不同量的TEOS溶液制备。通过IR和TEM分析二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子,发现它们具有高度理想的大小特性和SiO:FeO比率。图2D和图2E是实施例1-1的TEM图像,图2F和图2G是实施例1-2的TEM图像,并且图2H和图2I是实施例1-3的TEM图像。下表提供了这些实施例中的每个实施例的平均壳厚度和平均芯粒度。
在上表中,用于反应的TEOS的量以体积计并以当量计提供。通过IR分析测定所得二氧化硅包被的纳米粒子中SiO与FeO的比率。基于TEM分析确定壳厚度和芯粒度。
使用布鲁诺尔-埃默特-泰勒(BET)理论对干燥的二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子的分析表明材料表面积超过105m2/g,例如113-127m2/g,这与粒子的估计直径很好地匹配。在使用二氧化硅壳进行官能化之前和之后,还使用FT-IR光谱学执行纳米粒子分析。未包被的Fe3O4纳米粒子的FT-IR分析显示在580cm-1和630cm-1处有两个重叠带,这与Fe3O4磁相的晶格中的金属-氧Fe-O伸缩振动相关联。在用二氧化硅包被纳米粒子之后,这些带通过在3400cm-1、1094cm-1和467cm-1处的附加模式接合,这些附加模式由SiO2壳的二氧化硅O-H拉伸和Si-O拉伸产生(参见图3)。新模式的出现证实了纳米粒子被二氧化硅薄壳包封。
以与实施例1-1相同的方式制备另外两批次的二氧化硅包被的纳米粒子,并评定包衣厚度。如下表所示,该工序产生的二氧化硅包被的纳米粒子具有极其一致的包衣厚度,批次间几乎没有变异性。
实施例编号 | SiO2包衣厚度(nm) |
1-1 | 1.5 |
1-1A | 1.54 |
1-1B | 1.56 |
实施例2
在这个实施例中,按照实施例1中阐述的工序制备二氧化硅包被的纳米粒子,区别在于在该工序中使用了不同量的硅酸盐。下表总结了本实施例中制备的磁性纳米粒子的五个不同实施例。
实施例编号 | Fe(III)Cl3 | Fe(II)Cl2 | TEOS | Fe3O4@Fe3O4 | IR比率 |
2-1 | 2.50g | 0.93g | 0.5ml | 1.25g | 1.09 |
2-2 | 2.50g | 0.92g | 1.0ml | 1.33g | 1.94 |
2-3 | 2.50g | 0.94g | 1.5ml | 1.41g | 2.84 |
2-4 | 2.51g | 0.95g | 2.0ml | 1.63g | 3.45 |
2-5 | 2.50g | 0.96g | 2.5ml | 1.62g | 4.23 |
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通过FT-IR对二氧化硅包被的磁性纳米粒子进行分析,并且图4示出了光谱。各种实施例的粒子具有不同厚度的二氧化硅包衣。IR分析表明,二氧化硅包衣的厚度随着TEOS量的增加而线性增加。
图5是示出二氧化硅包衣的厚度随着TEOS量的增加而线性增加的图表。
图6是放大倍率为250,000倍的根据本技术的二氧化硅包被的磁性纳米粒子的扫描电子显微术(SEM)图像。粒子是用1.5ml TEOS和超声处理制成的。
图7是根据本技术的二氧化硅包被的磁性纳米粒子的透射电子显微术(TEM)图像。个别二氧化硅包被的磁性纳米粒子是可见的。粒子的聚集也是可见的。典型Fe3O4芯的范围是7nm至10nm。使用1.5ml TEOS时粒子上的平均二氧化硅包衣厚度是约1.6nm。Fe3O4晶格在芯内可见,并且这表明纳米粒子在合成或运输期间没有被氧化。
实施例3
在这个实施例中,按照实施例1中所阐述的工序制备若干批次的二氧化硅包被的磁性纳米粒子,从而产生实施例3-1至实施例3-14。这些实施例中的几个实施例的表面积通过布鲁诺尔-埃默特-泰勒(BET)表面积测定,并且发现表面积在约113m2/g与约127m2/g之间。
实施例编号 | 表面积(m2/g) |
3-1 | 113 |
3-2 | 116 |
3-3 | 127 |
3-4 | 120 |
3-5 | 122 |
3-6 | 122 |
3-7 | 125 |
3-8 | 116 |
3-9 | |
3-10 | 120 |
3-11 | 113 |
实施例4
在这个实施例中,使用本公开的磁性纳米粒子以手动方案和自动方案两者从样本中回收RNA。在这些方法中,将75μL等分试样的含有RNA的生物样本移液到0.2ml联管(striptube)中。将75μL的含有裂解缓冲液的硫氰酸胍(GTC)和2μL的蛋白酶K(20mg/ml)添加到每个管中。将管加盖,通过涡旋混合并自旋。将管在60℃下孵育5分钟。在孵育后,将75μL的100% EtOH与2μL的基于8.82nm的芯粒度和1.56nm的包衣厚度而粒度为10.38nm的磁性纳米粒子一起添加到每个管中。将管加盖,混合,短暂自旋,并在室温下孵育5分钟。在这个第二孵育期期间,来自样本的RNA与所述二氧化硅包被的磁性纳米粒子结合。
在第二孵育期后,将管置于磁体上5分钟。然后,将所有上清液从管中取出,而不干扰纳米粒子沉淀。将200μL的洗涤介质(80% EtOH)添加到管中的沉淀中。去除洗涤介质而不干扰纳米粒子沉淀,并重复洗涤和去除步骤。将纳米粒子沉淀在室温下孵育3分钟以干燥纳米粒子。
然后将预热至65℃的75μL洗脱介质添加到管中,并吹打几次以混合纳米粒子,与此同时避免产生气泡。使试管静置2分钟,通过磁铁捕获纳米粒子,并将含有RNA的洗脱液回收并转移至新管中。将新鲜管加盖并置于冰上。
实施例5
在这个实施例中,使用本公开的磁性纳米粒子以手动方案从样本中回收RNA。图8A提供了用于使用手动工作流程进行病毒RNA提取的六个纳米粒子(NP)批次的比较。
通过以下方式制备设计的样本:将经SARS-CoV-2装甲的合成RNA掺加到收集到VTM中的鼻拭子(NS)中以达到105个拷贝/微升、104个拷贝/微升、103个拷贝/微升、102个拷贝/微升、10个拷贝/微升、1个拷贝/微升和0.5个拷贝/微升的SARS-CoV-2N1和N2靶标的最终浓度。按照NAP手动方案,使用75ul的每种稀释液一式两份地执行RNA提取。很快,将75ul的每个样本与75ul的裂解缓冲液和2ul的蛋白酶K混合,在室温下孵育5min并在60℃下孵育5min,然后添加含有2ul的纳米粒子珠粒的75ul 100%乙醇。这个实验中使用了以下6个纳米粒子批次:实施例3-3、实施例3-5、实施例3-6、实施例3-7、实施例3-8和实施例3-9。将样本混合并在室温下孵育5min,以使核酸与磁性珠粒结合,然后将管转移到磁体支架上,并将珠粒收集在管的底部处(在这个步骤处,RNA保持与磁性珠粒结合)。在抽吸掉上清液后,将珠粒用80%乙醇洗涤两次,在室温下干燥3min,并将RNA用30ul的低TE缓冲液(10mM Tris、0.1mM EDTA,pH 8.0)洗脱。
将5ul的每种提取的RNA样本用于使用特异于SARS-CoV-2N1和N2靶标以及人类RNA酶P基因的引物和探针的多重QRT-PCR反应中。在Agilent AriaMx实时PCR系统上运行测定。N1靶标、N2靶标和RP靶标的扩增曲线在图8A、图8B和图8C中呈现并且对应的Cq在表A、表B和表C中呈现。在六个纳米粒子批次之间没有观察到显著差异,并且展现了对105-0.5个拷贝/ul的SARS-CoV2 N1和N2 RNA靶标以及人类RP的QRT-PCR检测。
表A
表B
表C
实施例6
在以下实施例中,使用本公开的磁性纳米粒子以自动化方案从样本中回收RNA。图8D、图8E和图8F示出了用于使用自动化工作流程进行病毒RNA提取的六个纳米粒子批次的比较。
通过以下方式制备设计的样本:将经SARS-CoV-2装甲的合成RNA掺加到收集到病毒转移介质(VTM)中的鼻拭子(NS)中以达到105个拷贝/微升、104个拷贝/微升、103个拷贝/微升、102个拷贝/微升、10个拷贝/微升、1个拷贝/微升和0.5个拷贝/微升的SARS-CoV-2N1和N2靶标的最终浓度。使用75ul的每种稀释液执行RNA提取。很快,将75ul的每个样本与75ul的裂解缓冲液和2ul的蛋白酶K混合,在室温下孵育5min,然后转移到Bravo仪器中进行自动化处理。这个实验中使用了以下纳米粒子批次:实施例3-2、实施例3-3(来自两个不同的小瓶,指定为3-3a和3-3b)、实施例3-4、实施例3-5、和实施例1-1B。将RNA用30ul的低TE缓冲液(10mM Tris、0.1mM EDTA,pH 8.0)洗脱。
将5ul的每种提取的RNA样本用于使用特异于SARS-CoV-2N1和N2靶标以及人类RNA酶P基因的引物和探针的多重QRT-PCR反应中。在Agilent AriaMx实时PCR系统上运行测定。N1靶标、N2靶标和RP靶标的扩增曲线在图8D、图8E和图8F中呈现并且对应的Cq在表D、表E和表F中呈现。在六个纳米粒子批次之间没有观察到显著差异,并且展现了对105-0.5个拷贝/ul的SARS-CoV2 N1和N2 RNA靶标以及人类RP的QRT-PCR检测。
表D
表E
表F
实施例7
在这个实验中,评估了NP老化对平均簇大小的效应。图12A和图12B示出了当本公开的纳米粒子组合物老化长达218天时簇大小的增加。表H显示了在指定时间点测量的值。
表H
模态(μm) | 时间(天) |
0.128 | 0 |
0.16 | 11 |
0.147 | 14 |
0.174 | 21 |
0.184 | 29 |
0.252 | 120 |
0.262 | 150 |
0.261 | 164 |
0.269 | 180 |
0.27 | 218 |
图13A和图13B示出了另一实验,所述实验证明当本公开的另一种纳米粒子组合物老化长达109天时簇大小增加。表I显示了在指定时间点处测量的值。
表I
模态(μm) | 时间(天) |
0.121 | 0 |
0.25 | 92 |
0.257 | 109 |
这些实验表明纳米粒子模态大小在簇时段内增加并在约300nm,更具体地在约260nm处趋于稳定。包含这种大小的簇的纳米粒子组合物用于例示性RNA分离/QRT-PCR测定以及NGS归一化。
实施例8
在这个实施例中,通过比较使用2周龄和14周龄的NP分离的RNA的QRT-PCR分析,来评估NP老化对核酸提取效率的效应。从14份鼻咽(NP)临床样本中提取核酸,已知所述核酸中的8份核酸呈人偏肺病毒(hMPV)阳性并且6份核酸呈人副流感3病毒(hPIV3)阳性。通过在20μl PCR反应中,使用Brilliant IIIQRT-PCR试剂、ABI TaqMan微生物测定(用于检测hMPV或hPIV3的引物和探针)和2μl的每种RNA样本,在AriaMx实时PCR系统上进行QRT-PCR来评估提取的病毒RNA的量。使用AriaMx v1.5软件对结果进行分析(每个样本的ΔCq值计算为[ΔCq=2周的Cq-14周的Cq]),并且数据如下表所示。
如表G所示,使用14周龄NP提取的14个样本中有10个样本(71%)导致>0.5的Cq改善((ΔCq 1=3倍的RNA产率差异)。
表G
这个实验证明,如通过QRT-PCR所测量的,十四周龄的NP组合物(“老化的”NP组合物)导致来自临床样本的病毒RNA产量的显著提高。
实施例9
在以下实施例中,将具有不同浓度的用于NGS的DNA样本(称为“文库”)进行“归一化”,这意味着无论磁性二氧化硅纳米粒子暴露于的DNA浓度如何,归一化后所得的所有DNA浓度都具有大致相等的浓度。
以下步骤均在4℃下执行。
将10μL(0.1μg/mL;1μg)的磁性纳米粒子和60μL的DNA结合介质添加到管A1至管H1(纳米粒子批次CS-019A)和管A2至管H2(纳米粒子CS-019B)中,并通过吹打混合。
将20μL的10nM DNA文库添加到管A1至管D1和管A2至管D2中,并将20μL的100nMDNA文库添加到管E1至管H1和管E2至管H2中,通过吹打混合并立即捕获粒子。
将捕获的粒子用150μL的80% EtOH洗涤一次,去除上清液,干燥粒子,添加10μL的10mM Tris-0.1mM EDTA(pH 8.0),混合,立即捕获粒子,并对上清液执行电泳分析(HSD1000TapeStation)。
图9示出了TapeStation分析的结果。尽管用作归一化方法的输入的DNA文库中的核酸浓度不同,但CS-019A的归一化因子为1.1并且CS-019B的归一化因子为1.0。来自管A1至管D1和管E1至管H1(CS-019A)管的平均DNA浓度分别是9.4nM和10.4nM。10.4除以9.4得到的归一化因子基本上是1.1。来自管A2至管D2和管E2至管H2(CS-019B)的平均DNA浓度分别是9.8nM和9.7nM。9.8除以9.7得到的归一化因子基本上是1.0。
实施例10
在这个实施例中,对具有不同浓度的NGS的DNA样本(或文库)进行归一化。这个实施例进一步证明,可以通过以下方式来改进NGS方案:使用NP归一化可变浓度的核酸文库,从而产生更高的样本通量以及降低的测序仪器时间和成本。NGS仪器平台通常需要将特定浓度的核酸加载到测序仪器上。浓度太低或太高会导致序列数据输出和品质低下。存在几种归一化NGS的可变浓度核酸的现有方法。这些现有方法包括通过分光光度法、荧光测定法、定量PCR、或电泳进行核酸定量,之后计算所需浓度,然后将所有样本稀释至归一化浓度。以下NGS数据比较显示,与电泳(Agilent TapeStation设备)相比,NP归一化的品质相同或更高。
将实施例8中阐述的归一化工序与根据实施例1制备的二氧化硅包被的磁性纳米粒子(纳米粒子批号CS-019)一起使用。
结果示出于图11A至图11J中。在这些图中,BN是指经NP归一化的文库,并且TS是指经TapeStation归一化的文库。图11A示出了TapeStation分析的结果。
图11B示出了“bam计数”,其是映射到每个感兴趣特征(例如基因、外显子、转录物等)的序列读段的数量。与经TS归一化的文库相比,经NP归一化的文库的bam计数较低,但它们更均匀。
图11C示出了经归一化的文库的复杂性,其反映了由给定实验设计产生的偏差量。就文库复杂性而言,理想的是高保真地反映源材料的原始复杂性的高度复杂的文库。NP归一化和TS归一化产生相等的复杂性,如几乎相等的变异系数所示。经NP归一化的文库和经TS归一化的文库同等复杂。
图11D示出了经归一化的文库的均匀性,所述均匀性是其中读段深度大于平均区域靶覆盖深度的规定倍数的靶碱基位置的百分比。经NP归一化的文库比经TS归一化的文库更均匀。
图11E示出了经归一化的文库的覆盖率。靶区域内的特定碱基在序列数据中被表示的次数称为覆盖率或覆盖深度。‘x’之前的数字是覆盖率(基因组将测序的平均次数)。例如,当一个人进行了30次全基因组测序(WGS)时,“30x”意指整个基因组将被测序平均30次。在20X和30X覆盖率下,NP归一化和TS归一化提供相等的结果。
图11F示出“80倍(Fold 80)”碱基对罚分,这是确保80%的靶碱基达到平均覆盖率所需的附加测序的倍数。在靶率越低,或80倍越高,则捕获低效率和浪费的测序就越高。NP归一化导致平均“80倍”为3,而TS归一化导致平均“80倍”为3.25,这意味着与经TS归一化的文库相比,经NP归一化的文库所需的测序次数更少。80倍数值越低,则结果越好。
图11G示出了经归一化的文库中的重复。当多个测序读段映射到完全相同的位置(包括3'末端和5'末端的坐标)时,它们被视为重复读段。重复率是特定数据集中标记为重复读段的映射读段的分数。与重叠读段相比,重复读段不提供附加信息,并且会在生物信息学分析期间中从测序数据中去除,这一过程被称为去重复。NP归一化和TS归一化提供相等的重复值。
图11H示出AT/GC脱落。AT/GC脱落度量基于特定区域的AT或GC含量指示所述特定区域的覆盖不足程度。对于经NP归一化的文库和经TS归一化的文库,这些度量的值是相等的。
图11I示出了平均插入片段大小。插入片段大小是待测序且被“插入”在衔接子之间的DNA(或RNA)的长度。对于经NP归一化的文库,平均插入片段大小是220bp,并且对于经TS归一化的文库,平均插入片段大小是190bp,NP归一化文库的平均插入片段大小比TS归一化文库高30bp高30bp。
图11J示出了经归一化的文库的在靶值。在靶碱基百分比是映射到靶区域的碱基的数量,而在靶读段百分比包括与靶区域重叠(甚至单个碱基)的所有测序读段。落在靶区域内的碱基或读段越多,则总体在靶率越高—这表明强探针特异性、高品质探针和高效的基于杂交的靶富集。经NP归一化的文库和经TS归一化的文库仅相差0.03%。
鉴于本公开,应当注意的是,可以根据本教导来实现本发明方法、组合物和系统。另外,各种部件、材料、结构和参数仅通过说明和举例的方式被包括在内,而不具有任何限制意义。鉴于本公开,本发明教导可以在其他应用中实现,并且可以确定用于实现这些应用的部件、材料、结构和设备,与此同时保持在所附权利要求的范围内。
Claims (54)
1.一种包含在液体介质中的磁性纳米粒子的组合物,其中所述磁性纳米粒子中的每个磁性纳米粒子包含磁芯和在所述芯上的包衣,其中所述包衣的厚度为约1nm至约2nm;并且所述组合物中的所述磁性纳米粒子的布鲁诺尔-埃默特-泰勒(BET)表面积是约110m2/g至约130m2/g;并且所述组合物包含个别磁性纳米粒子的簇,其中所述簇的平均簇大小是约250nm至约350nm。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述包衣的厚度是约1.5nm至约2.0nm。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中所述磁性纳米粒子的BET表面积是约113m2/g至约127m2/g。
4.根据权利要求1所述的组合物,其中所述个别磁性纳米粒子的平均总直径是约15nm或更小。
5.根据权利要求1所述的组合物,其中所述个别磁性纳米粒子的平均总直径是约10nm至约15nm。
6.根据权利要求1所述的组合物,其中所述磁性纳米粒子的所述芯的平均直径是约10nm或更小。
7.根据权利要求1所述的组合物,其中所述芯是表现出顺磁性的Fe3O4单畴磁性纳米粒子。
8.根据权利要求1所述的组合物,其中所述芯是磁铁矿的单纳米级晶体。
9.根据权利要求1所述的组合物,其中所述芯基本上不含Fe2O3。
10.根据权利要求1所述的组合物,其中所述包衣包含二氧化硅。
11.根据权利要求1所述的组合物,其中所述包衣进一步包含结合分析物的结合部分。
12.根据权利要求11所述的组合物,其中所述分析物是核酸。
13.根据权利要求1所述的组合物,其中所述液体介质是水。
14.根据权利要求13所述的组合物,其中所述组合物是稳定的水性分散体。
15.根据权利要求13所述的组合物,其中所述组合物包含所述磁性纳米粒子分散在所述水中的簇。
16.根据权利要求15所述的组合物,其中所述簇的平均簇大小是约300nm。
17.根据权利要求1所述的组合物,其中所述组合物是所述磁性纳米粒子的稳定悬浮液,并且所述磁性纳米粒子以约3g/L至约30g/L的浓度存在。
18.根据权利要求17所述的组合物,其中所述磁性纳米粒子在约25℃的温度下保持悬浮至少6个月。
19.一种在密封包装中的磁性纳米粒子的包装稳定悬浮液,其中:
所述磁性纳米粒子包括芯和在所述芯上的包衣,并且所述包衣的厚度是约1nm至约2nm;并且
所述密封包装的内部体积基本上不含氧气。
20.一种制备二氧化硅包被的磁性纳米粒子的方法,所述方法包括:
在经去离子、经脱氧的水中以约2/1的Fe3+/Fe2+摩尔比制备Fe3+离子和Fe2+离子的水溶液;
对所述水溶液进行超声处理;
从所述水溶液中沉淀Fe3O4,从而形成包含Fe3O4纳米粒子的混合物;
向所述混合物中添加脱氧醇和硅酸盐;
在所述Fe3O4纳米粒子上形成二氧化硅包衣;以及
从所述混合物中分离二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述水溶液中Fe3+的浓度是2mM至50mM,并且所述水溶液中Fe2+的浓度是1mM至25mM。
22.根据权利要求20所述的方法,其中所述水溶液通过将FeCl3和FeCl2溶解在经去离子、经脱氧的水中来制备。
23.根据权利要求20所述的方法,所述方法进一步包括在惰性气氛下向所述水溶液中添加碱。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述碱是氨,并且所述碱以2倍或更大摩尔过量添加。
25.根据权利要求23所述的方法,所述方法进一步包括:
将所述混合物维持在惰性气氛下不搅拌达沉降期,在所述沉降期期间所述Fe3O4纳米粒子从所述混合物中沉降出;以及
在所述沉降期之后,从所述混合物中去除大部分水,从而浓缩所述Fe3O4纳米粒子的混合物。
26.根据权利要求23所述的方法,所述方法进一步包括在所述惰性气氛下搅拌达包被期。
27.根据权利要求20所述的方法,其中所述沉降期和/或所述包被期是约8小时至约24小时。
28.根据权利要求20所述的方法,所述方法进一步包括在添加无水硅酸盐溶液之前向所述混合物中添加附加碱。
29.根据权利要求20所述的方法,其中在搅拌和超声处理所述混合物的同时将所述硅酸盐滴加到所述混合物中。
30.根据权利要求20所述的方法,其中通过磁性捕获从所述混合物中分离所述Fe3O4纳米粒子,并且所述方法进一步包括用甲醇洗涤所述二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子。
31.根据权利要求20所述的方法,所述方法进一步包括真空干燥所述分离的二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子,从而形成所述二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子的粉末。
32.根据权利要求31所述的方法,所述方法进一步包括将所述粉末分散到脱氧水中,用惰性气体喷洗并超声处理,然后在惰性气氛下密封在包装中。
33.根据权利要求20所述的方法,所述方法进一步包括将所述二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子维持达成簇期以形成平均簇大小为约250nm至约350nm的个别磁性纳米粒子的簇。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述二氧化硅包被的Fe3O4纳米粒子在所述成簇期期间维持在20℃至30℃的温度下。
35.根据权利要求33所述的方法,其中所述成簇期是至少一个月。
36.一种用于制备分析用核酸的方法,所述方法包括以下步骤:
将包含核酸的样本与结合介质和磁性纳米粒子组合物在器皿中组合,其中:
所述磁性粒子组合物包含多个磁性纳米粒子,所述磁性纳米粒子包括芯和在所述芯上的包衣,并且所述包衣的厚度是约1.5nm至约2nm,并且
所述核酸与所述磁性纳米粒子的所述包衣结合;
在结合期后,使用磁体将与核酸结合的磁性纳米粒子与所述器皿内的液体分离;
从所述器皿中去除所述液体并将所述与核酸结合的磁性纳米粒子保留在所述器皿内;洗涤所述纳米粒子以去除污染物,与此同时所述纳米粒子仍被所述器皿内的所述磁体吸引;去除所述洗涤介质;
使所述与核酸结合的磁性纳米粒子与洗脱介质接触,从而将所述结合的核酸与所述磁性纳米粒子分离;使用磁体将所述磁性纳米粒子与所述器皿内的含核酸的液体分离,以及
从所述器皿中去除所述核酸,从而提供核酸制备物。
37.根据权利要求36所述的方法,其中所述样本包含输入量的所述核酸,并且
所述磁性纳米粒子组合物具有针对输出量的核酸的结合能力,其中所述输出量小于所述输入量。
38.根据权利要求36所述的方法,所述方法进一步包括用包含至少80%v/v醇的洗涤介质洗涤所述与核酸结合的磁性纳米粒子。
39.根据权利要求36所述的方法,其中所述磁性纳米粒子的包衣包含被配置为结合所述核酸的结合部分。
40.根据权利要求36所述的方法,其中所述磁性纳米粒子组合物的归一化因子在0.8与1.2之间,其中所述归一化因子是来自第一样本的第一输出量与来自第二样本的第二输出量的比率,其中所述第一样本。
41.根据权利要求36所述的方法,其中所述输出量在所述磁性纳米粒子组合物的预定输出量的10%以内。
42.根据权利要求36所述的方法,其中所述核酸制备物包含长度在预定长度范围内的核酸。
43.根据权利要求36所述的方法,其中所述输入样本包含少于200ng的核酸。
44.根据权利要求36所述的方法,其中所述输入样本包含少于50ng的核酸。
45.根据权利要求36所述的方法,其中所述方法的步骤由自动化仪器执行。
46.一种从生物样本中获得核酸并制备分析用核酸的方法,所述方法包括:
将包含核酸的生物样本置于器皿中以形成样本混合物,其中所述生物样本是细胞或病毒;
将磁性纳米粒子组合物添加到所述器皿中的所述样本混合物中,其中所述磁性粒子组合物包含多个磁性纳米粒子,所述磁性纳米粒子包括芯和在所述芯上的包衣,并且所述包衣的厚度是约1.5nm至约2nm;
将所述样本混合物与所述磁性纳米粒子混合并孵育达孵育期;
从所述样本混合物中分离所述磁性纳米粒子;
将洗脱介质添加到所述器皿中,以及将所述磁性纳米粒子与所述洗脱介质混合;以及
在核酸从所述磁性纳米粒子上洗脱以形成洗脱液的洗脱期之后,从所述器皿中去除所述洗脱液。
47.根据权利要求46所述的方法,所述方法进一步包括使所述生物样本与硫氰酸胍(GTC)和蛋白酶K接触以形成所述样本混合物;
将所述样本混合物在升高的温度下孵育达样本制备期;以及
将净醇添加到所述器皿中的所述样本混合物中。
48.根据权利要求46所述的方法,其中通过以下方式从所述样本混合物中分离所述磁性纳米粒子:
施加磁力以将所述磁性纳米粒子与所述器皿内的上清液分离;
从所述器皿中去除所述上清液而不干扰所述分离的磁性纳米粒子;以及
用醇溶液洗涤所述分离的磁性纳米粒子一次或多次。
49.根据权利要求46所述的方法,其中所述洗脱时间是小于10分钟。
50.根据权利要求46所述的方法,所述方法进一步包括将去除的洗脱液置于第二器皿中;密封所述第二器皿;以及在降低的温度下存储所述第二器皿。
51.根据权利要求46所述的方法,其中所述样本制备期和/或所述孵育期是约10分钟或更短。
52.根据权利要求46所述的方法,其中所述醇溶液包含约80%v/v或更高的醇。
53.根据权利要求46所述的方法,其中所述核酸是RNA。
54.根据权利要求46所述的方法,其中所述核酸是DNA。
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