JP6255034B2 - シリカ粒子の調製 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、ＳｉＯ_２をコア粒子上に堆積させることによって多孔質シリカ粒子を調製する方法に関しており、特に、磁性シリカ粒子を調製する方法、および核酸を単離するための上記磁性シリカ粒子の使用を記載する。

発明の背景
様々な分子の精製、分離および検出を容易にするために、様々な組成および特性の固体シリカ材料が利用可能である。磁性粒子は、該粒子が中に入っている容器に外部磁場を印加することによって収集または回収できるので、特に磁性シリカ粒子が使用される。非結合分子および上清液体は、粒子から分離または破棄され得、粒子に結合した分子は、例えば溶出によって回収することができる。したがって、磁性粒子は、核酸などの対象の分子を液相または他の分子の混合物から精製または分離するための、相対的に速やかで容易で簡単な手段を提供する。核酸およびタンパク質などの生体分子の精製または単離における、シリカ粒子の使用に基づく方法の適用が、ますます見出されている。

したがって、シリカ粒子、特に磁性シリカ粒子を生成するための低価格で簡単な生成方法が必要である。

シリカ粒子を調製するためのいくつかの方法が、従来技術において報告されている。

ＤＥ１０ ２００６ ０５４ １７３は、磁性コア粒子、シリカ塩、ｐＨ調節剤、有機細孔形成剤およびスプレー乾燥の使用に基づく磁性シリカ粒子の生成方法を記載している。生成されたシリカ粒子は、良好な核酸結合特性を呈する。しかし、スプレー乾燥に基づく方法は、上記文書に記載されている通り、必要な装置およびスプレー乾燥機の作動中に発生する費用に起因して、非常に高い費用がかかる。さらに、例えばスプレー乾燥機のノズルが詰まり得ることおよび他の問題が原因となり、スプレー乾燥機の維持費用もしばしば高くなる。したがって、スプレー乾燥に頼らずにシリカ粒子を生成できる、費用効率の高い方法が望ましい。

ＷＯ１９９６／０４１８１１は、実質的に細孔を含まない、または直径が１０ｎｍ未満の細孔を有する、外側のガラス表面を有する磁性粒子の調製を記載している。粒子は、酸性環境においてオルトケイ酸テトラエチルを加水分解することによって、ゲル−ゾルプロセスによって調製される。ゲルが形成されたら、それを乾燥させ、熱プロセスを用いて密度を高めて、ガラスを形成する。

ＷＯ１９９８／０３１４６１は、水性酸性環境に曝露された場合の磁性材料の滲出に対して高い耐性を有する、シリカを含む（ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ）酸化物でコーティングされた磁性粒子を記載している。シリカを含む酸化物をコア粒子上に堆積させることによって粒子を調製することが開示されており、ここでシリカを含む供給源（好ましくはケイ酸ナトリウム）および酸（好ましくは鉱酸）が、コア粒子を含有する懸濁液に添加される。ＵＳ６，０２７，９４５は、核酸を単離するための類似の粒子の使用を記載している。

ＥＰ０ ７５７ １０６は、超常磁性の金属酸化物を含む磁性シリカ粒子を記載している。粒子は、Ｆｅ_３Ｏ_４粒子をテトラエトキシシラン／アルコール溶液に添加することによって調製される。堆積は、弱酸であっても強酸であってもよいテトラエトキシシランの加水分解性触媒を添加することによって開始される。

ＷＯ２００１／０７１７３２は、シリケートを磁性コア粒子上に堆積させることによって、多孔質磁性シリカ粒子を調製することを開示しており、ここでシリカの供給源は、テトラアルコキシシランであり得る。主な粒子は、凝集体を形成することができ、それによって約５〜２５μｍのサイズを有しかつ有益な多孔質構造を有する、より大きい粒子を提供する。記載されている粒子は、核酸に対して良好な結合能を有する。

したがって一般に、シリカは、２種類の方法を使用して工業的に大規模に調製される。一つの方法は、塩基または酸の添加によって水性組成物からテトラアルコキシシランを加水分解することに基づく。他方の方法は、強アルカリ性のシリケート組成物を酸性化することに基づく。これらの方法が、コア粒子の存在下で実施される場合、上記コア粒子は、堆積したシリカのための核形成部位として働く。例えば酸化鉄粒子などの磁性コア粒子を使用する場合、磁性コア粒子がコーティングされ、したがって堆積したシリカによって封入されている、磁性シリカ粒子が提供される。より大きい粒子は、通常、コーティングされたコア粒子を凝集させ、形成された凝集体に潜在的にさらなるコーティングを施すことによって形成される。

シリケート溶液を酸性化する場合、ｐＨ値は、通常、少なくともｐＨ１２から１１未満に低減される。それによって、シリケートはプロトン化され、それによってＳｉＯ_２×ｎＨ_２Ｏとして沈殿するケイ酸が提供される。上記プロセスは、他の方法ではケイ酸が自然発生的に沈殿するので、非常にゆっくりと大きい希釈度で実施し、それによって画定された均一な粒子の生成を促進することが必須である。さらに、上記方法によって磁性シリカ粒子を調製する場合、非常に大きい粒径を有する凝集体が調製される危険性、またはシリカが自然発生的に加水分解され沈殿するが、磁性コア粒子上には堆積せず、それによって非磁性シリカ粒子になることによって生じる非磁性粒子、いわゆる「微粒子」が提供されるという危険性がある。したがって、それぞれに生成されたシリカ粒子の質は、しばしば許容可能ではないか、または欠損粒子の除去が必要になる。

したがって、シリカ粒子を調製するためのこれらの従来技術の方法には、高価な化合物（特に、テトラアルコキシシラン）を使用すること、または相対的に均一なサイズの粒子を作製するために堆積プロセスを適切に制御できないことなどのいくつかの不利益がある。シリカ粒子を生成するためのスプレー乾燥に基づく従来技術の方法には、必要な装置および作動費用が高価になるというさらなる不利益がある。

ＵＳ３，６７８，１４４、ＵＳ４，１１２，０３２およびＵＳ４，２２１，５７８は、シリケート組成物からシリカ体を生成することを記載している。記載の方法では、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルムアミドまたはグリオキサールなどの有機ゲル化剤が、高ｐＨ値を有するシリケート溶液に添加される。上記有機ゲル化剤は、ｐＨ調節剤として作用する。上記ゲル化剤は、シリケート溶液に均一に溶け、溶液中で非常にゆっくり均一に反応し、それによってｐＨ値が継続的に低下する。反応組成物のｐＨ値の上記低減によって、シリカが重合し、したがって沈殿する。また、Ｃｏｌｌ． Ｉｎｔｅｒｆ． Ｓｃｉ． １９７６年、３巻、６３〜６９頁の「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｓｉｌｉｃａ ｂｏｄｉｅｓ ｇｅｌｌｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｌｉｃａ ｓｏｌ−ａｌｋａｌｉ ｓｉｌｉｃａｔｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ」において、Ｓｈｏｕｐは、反応組成物のｐＨ値をゆっくり低減し、それによってシリカを制御された方式で沈殿させるためのｐＨ調節剤の使用を含む、それぞれの方法を記載している。ここでは、コロイドシリカおよびアルカリシリケートの混合物が、反応組成物において使用される。シリカは、シリケートの酸性加水分解、ケイ酸の生成、水の排除、およびその後のコロイドシリカ粒子（これらは、沈殿したシリカに対して、核形成部位をコア粒子として提供する）の表面上へのシリカの堆積によって沈殿する。コロイドシリカが、反応組成物中に安定な分散相として残り、分子状シリケートの重合のための核形成部位または成長部位として働くことが記載されている。この方法では、シリケートの酸性加水分解は、ｐＨ調節剤を添加することによって達成される。一実施形態によれば、ｐＨ調節剤としてホルムアミドが添加され、次にホルムアミドは、ギ酸アンモニウムに加水分解される。コロイドコア粒子の表面上へのシリカの堆積によって、凝集体が形成され、ここで、シリカコーティングされている主なコア粒子は、一緒になって成長し、それによってシリカ体を形成する。得られる細孔は、堆積したシリカに起因して接着する粒子間の空洞によって画定される。形成されたシリカ体の形状は、上記のすべての方法において、シリケート溶液をゲル化するための容器によって決定される。それぞれの文書に記載されている通り、狭い細孔径分布を有する制御された細孔本体の形成には、核形成を伴うことが記載されている。上記文書では、ｐＨ調節剤の使用に基づく上記シリカの生成プロセスが、生成プロセスを実施するための容器の形状を有する緻密なシリカ体の生成のためだけのものであると記載されている。別個のシリカ粒子の生成については、上記文書には記載されていない。さらに本発明者らは、それぞれの教示に従って別個の粒子を生成することが不可能であることを見出した。

本発明の目的は、前述の不利益を克服するシリカ粒子、特に磁性シリカ粒子を調製する方法を提供することである。特に、本発明の目的は、生体分子、特に核酸に対して高い結合能を有するシリカ粒子、特に磁性シリカ粒子を生成することができる、費用効率の高い方法を提供することである。

独国特許出願公開第１０２００６０５４１７３号明細書 国際公開第１９９６／０４１８１１号 国際公開第１９９８／０３１４６１号 米国特許第６，０２７，９４５号明細書 欧州特許出願公開第０７５７１０６号明細書 国際公開第２００１／０７１７３２号 米国特許第３，６７８，１４４号明細書 米国特許第４，１１２，０３２号明細書 米国特許第４，２２１，５７８号明細書

Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７６年，３巻，６３〜６９頁

発明の要旨
本発明者らは、反応組成物への塩基の添加を含む、特定の反応条件と組み合わせてケイ酸塩およびｐＨ調節剤を使用することに基づく方法によって、制御されたＳｉＯ_２堆積プロセスがもたらされ、それによって優れた吸着特徴を有する別個のシリカ粒子が得られることを見出した。上記方法は、磁性シリカ粒子を生成するのに適している。

したがって、第１の態様によれば、ＳｉＯ_２含有表面を有する粒子を生成する方法であって、
ａ）ｉ）コア粒子、
ｉｉ）ケイ酸塩、
ｉｉｉ）塩基、および
ｉｖ）ｐＨ調節剤
を含む水性反応組成物を提供するステップであって、反応組成物のｐＨ値がケイ酸塩のゲル化ｐＨ値より大きいステップと、
ｂ）上記反応組成物を撹拌するステップであって、上記ｐＨ調節剤が、上記反応組成物のｐＨ値を低減し、上記反応組成物のｐＨ値の上記低減に起因して、ＳｉＯ_２がコア粒子上に堆積し、それによって３０μｍまたはそれ未満の直径を有する粒子が形成されるステップと、
ｃ）粒子を得るステップと
を含む方法が提供される。

実施例に示されている通り、上記方法によって、別個のシリカ粒子を生成することができ、磁性シリカ粒子を生成することもできる。生成プロセスは、非常に費用効率が高く、大規模化することができ、従来技術の方法とは対照的に、取扱い上の誤りの影響を受けにくい。さらに、スプレー乾燥機などの高価な装置は必要ない。従来技術の方法と比較して、生成費用の５０％超を節約することができる。したがって、本発明は、従来技術に対して重要な貢献を行う。

第２の態様によれば、本開示は、凝集したＳｉＯ_２コーティングされたコア粒子によって形成される、３０μｍまたはそれ未満のサイズを有する多孔質シリカ粒子であって、コア粒子が、ＳｉＯ_２コーティングによって本質的に封入され、シリカ粒子が、含まれているＳｉＯ_２およびコア粒子に関して、１５〜７５％（重量）のコア粒子および２５％〜８５％（重量）のＳｉＯ_２である組成を有し、シリカ粒子が、粒子１ｍｇ当たり少なくとも１２．５μｇの核酸分子と結合することができる、多孔質シリカ粒子を提供する。

それぞれの高い核酸結合能を有するシリカ粒子は、核酸を単離するために有利に使用することができる。それぞれのシリカ粒子は、第１の態様による方法によって調製することができる。

第３の態様によれば、本発明は、様々な試料から生体分子を単離するための、特に核酸を単離するための、第２の態様によるシリカ粒子または第１の態様による方法に従って生成されたシリカ粒子の使用に関する。実施例に示されている通り、本発明による方法によって生成されたシリカ粒子は、高い核酸結合能を有する。好ましくは、磁性シリカ粒子が使用される。

特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
ＳｉＯ _２ 含有表面を有する粒子を生成する方法であって、
ａ）ｉ）コア粒子、
ｉｉ）添加塩基、
ｉｉｉ）ケイ酸塩、および
ｉｖ）ｐＨ調節剤
を含む水性反応組成物を提供するステップであって、前記反応組成物のｐＨ値がゲル化ｐＨ値より大きいステップと、
ｂ）前記反応組成物を撹拌するステップであって、前記ｐＨ調節剤が、前記反応組成物のアルカリ環境において反応し、それによって前記反応組成物のｐＨ値を経時的に低減する有機化合物であり、前記反応組成物のｐＨ値の前記低減に起因して、ＳｉＯ _２ が前記コア粒子上に堆積し、それによって３０μｍまたはそれ未満の直径を有する粒子が形成されるステップと、
ｃ）前記粒子を得るステップと
を含む方法。
（項目２）
前記反応組成物が、１ｍｏｌ／ｌ未満の濃度の前記ケイ酸塩を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
以下の特色、
ｉ）前記反応組成物の初期ｐＨ値が、ｐＨ１２．５もしくはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１３もしくはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１３．５もしくはそれより大きいｐＨ値、およびｐＨ１４もしくはそれより大きいｐＨ値から選択されること、ならびに／または
ｉｉ）前記反応組成物の初期ｐＨ値が、１１〜１５、１２〜１４もしくは１３〜１４にあること、
ｉｉｉ）前記ｐＨ調節剤の活性によって調整された、低減されたｐＨ値が、ｐＨ１２もしくはそれ未満のｐＨ値、ｐＨ１１．５もしくはそれ未満のｐＨ値、およびｐＨ１１．２もしくはそれ未満のｐＨ値から選択されること、ならびに／または
ｉｖ）前記一つまたは複数のｐＨ調節剤の活性によって調整された、低減されたｐＨ値が、９〜１２、９．５〜１１．７５、９．７５〜１１．５および１０〜１１．２から選択される範囲内にあること
の一つまたは複数を有する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記反応組成物が、１ｍｏｌ／ｌ未満の濃度の前記ケイ酸塩を含み、前記初期ｐＨ値が、１２．５またはそれより大きいｐＨ値であり、前記粒子の形成が完了した後、前記多孔質粒子が前記反応組成物から収集される、項目１から３の一項または複数項に記載の方法。
（項目５）
アルカリ水酸化物、好ましくはＫＯＨが、塩基として使用される、項目１から４の一項または複数項に記載の方法。
（項目６）
以下の特徴、
ｉ）前記得られる粒子が、凝集したＳｉＯ _２ コーティングされたコア粒子によって形成されること、ならびに／または
ｉｉ）１００ｎｍ〜２５μｍ、２５０ｎｍ〜１５μｍ、５００ｎｍ〜１０μｍ、７５０ｎｍ〜７．５μｍ、１μｍ〜５μｍおよび１．５μｍ〜３μｍから選択される中位径を有する粒子が形成されること
の一つまたは複数を有する、項目１から５の一項または複数項に記載の方法。
（項目７）
前記コア粒子が、以下の特徴、
ｉ）前記コア粒子が、磁性特性を有すること、
ｉｉ）前記コア粒子が、超常磁性、常磁性、強磁性もしくはフェリ磁性特性を有すること、
ｉｉｉ）前記コア粒子が、酸化鉄、好ましくは磁鉄鉱および／もしくは磁赤鉄鉱を含むこと、
ｉｖ）前記コア粒子が、８〜１５０ｎｍ、１０〜１００ｎｍおよび１０ｎｍ〜６０ｎｍから選択される範囲内にある直径を有すること、ならびに／または
ｖ）前記コア粒子が、中空であること
の一つまたは複数を有する、項目１から６の一項または複数項に記載の方法。
（項目８）
以下の特徴、
ｉ）前記ｐＨ調節剤が、前記反応組成物の初期ｐＨ値において加水分解され、前記ｐＨ調節剤の加水分解が、前記反応組成物のｐＨ値を、前記シリケートのゲル化ｐＨ未満に継続的に低減すること、
ｉｉ）前記反応組成物中に含まれる前記ｐＨ調節剤が、前記ｐＨ調節剤の加水分解および／もしくは活性化によって、前記初期ｐＨ値を少なくとも１ｐＨ単位、少なくとも１．５ｐＨ単位、少なくとも２ｐＨ単位もしくは少なくとも２．５ｐＨ単位だけ低減させること、
ｉｉ）前記ｐＨ調節剤が、エステル、アミド、アルデヒドもしくはポリオキシメチレン基を含む有機化合物であること、
ｉｉｉ）前記ｐＨ調節剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルムアミド、グリオキサール、ギ酸メチル、酢酸メチル、ギ酸エチル、酢酸エチル、アンモニアおよびそれらの混合物からなる群から選択されること、
ｉｖ）前記ｐＨ調節剤が、ホルムアミドであること、ならびに／または
ｖ）前記ｐＨ調節剤が、０．１〜２ｍｏｌ／ｌ、０．２５〜１．５ｍｏｌ／ｌおよび０．５〜１ｍｏｌ／ｌから選択される濃度で前記反応組成物中に含まれること
の一つまたは複数を有する、項目１から７の一項または複数項に記載の方法。
（項目９）
前記反応組成物のｐＨ値が、それぞれに前記ｐＨ調節剤の活性に起因して、それによってただ単に低減されるだけである、項目１から８の一項または複数項に記載の方法。
（項目１０）
以下の特徴、
ｉ）ケイ酸アルカリ、好ましくはケイ酸カリウムもしくはケイ酸ナトリウムが、ケイ酸塩として使用されること、
ｉｉ）式Ｋ _２ Ｏ・ｎＳｉＯ _２ のケイ酸カリウムが、ケイ酸塩として使用され、ここでｎが１．０〜５．０、好ましくは２．０〜３．０であること、ならびに／または
ｉｉｉ）前記反応組成物が、０．０１〜０．７５ｍｏｌ／ｌ、０．０２〜０．５ｍｏｌ／ｌ、０．０５〜０．２５ｍｏｌ／ｌ、０．０７５〜０．２ｍｏｌ／ｌおよび０．８５〜０．１５ｍｏｌ／ｌから選択される範囲内にある濃度の、前記ケイ酸塩に由来するＳｉＯ _２ を含むこと
の一つまたは複数を有する、先の項目の一項または複数項に記載の方法。
（項目１１）
前記反応組成物が、
−水性媒体中にコア粒子を提供し、撹拌して、懸濁液を形成するステップと、
−ある量の前記塩基を添加して、前記ｐＨ値を、シリカのゲル化ｐＨより大きいｐＨ値に調整するステップであって、好ましくは、前記初期ｐＨ値が、１２．５もしくはそれより大きいｐＨ値、好ましくは１３もしくはそれより大きいｐＨ値であるステップと、
−前記シリカ塩を添加するステップと、
−前記コア粒子、前記塩基および前記ケイ酸塩を添加した後に、前記ｐＨ調節剤を添加するステップと
によって調製される、項目１から１０の一項または複数項に記載の方法。
（項目１２）
ａ）ｉ）酸化鉄を含有するコア粒子、
ｉｉ）塩基としてのアルカリ水酸化物、
ｉｉｉ）０．０１〜０．７５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌの濃度のケイ酸塩としてのケイ酸カリウム、および
ｉｖ）ｐＨ調節剤としてのホルムアミド
を含む水性反応組成物を提供するステップであって、前記反応組成物のｐＨ値が１２．５もしくはそれより大きいｐＨ値、好ましくは１３もしくはそれより大きいｐＨ値であるステップと、
ｂ）前記反応組成物を撹拌するステップであって、前記ｐＨ調節剤が、前記反応組成物のｐＨ値において加水分解され、それによって前記反応組成物のｐＨ値を継続的に９．５〜１１．５、好ましくは１０〜１１．２の範囲のｐＨ値まで低減し、前記反応組成物のｐＨ値の前記低減に起因して、ＳｉＯ _２ が前記コア粒子上に堆積し、前記ＳｉＯ _２ コーティングされたコア粒子が凝集して、５００ｎｍ〜１５μｍの範囲内にある直径を有する別個の多孔質粒子を提供するステップと、
ｃ）前記多孔質粒子を得るステップと
を含む、項目１から１１の一項または複数項に記載の方法。
（項目１３）
ａａ）
−一つもしくは複数の鉄塩、好ましくは塩化鉄（ＩＩＩ）および塩化鉄（ＩＩ）を、アルカリ水酸化物水溶液に添加して、コア粒子としての磁鉄鉱または磁赤鉄鉱を沈殿させることによって、酸化鉄コア粒子を調製するステップ、ならびに
−水酸化カリウム、ケイ酸カリウムおよびホルムアミドを、前記コア粒子を含有する溶液に添加し、それによって前記ステップａ）の反応組成物を形成するステップ、
または
ｂｂ）
−酸化鉄コア粒子を、水溶液、好ましくは水に懸濁させるステップ、ならびに
−水酸化カリウム、ケイ酸カリウムおよびホルムアミドを、前記コア粒子を含有する懸濁液に添加し、それによって前記ステップａ）の反応組成物を形成するステップ
を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記コア粒子が、磁鉄鉱粒子であり、前記ケイ酸塩が、ケイ酸カリウムであり、前記ｐＨ調節剤が、ホルムアミドであり、前記反応組成物の初期ｐＨ値が、水酸化カリウムを使用することによって１３〜１４のｐＨ値に調整され、前記反応組成物が、室温で少なくとも１時間、好ましくは少なくとも５時間、より好ましくは少なくとも１０時間撹拌され、好ましくはかき混ぜられる、項目１から１３の一項または複数項に記載の方法。
（項目１５）
前記酸化鉄コア粒子が、好ましくはシトレートなどのカルボン酸のアニオンによって安定化され、任意選択で、ステップｂ）での後のシリカ堆積を容易にするために、前記コア粒子が、ステップａ）の前にアルカリシリカと接触させられる、項目７から１４の一項または複数項に記載の方法。
（項目１６）
前記得られた粒子が、多孔質構造を有し、２０μｍまたはそれ未満の直径に基づいて決定されるサイズを有し、凝集したＳｉＯ _２ コーティングされた磁性コア粒子によって形成される、項目１から１５の一項または複数項に記載の方法。
（項目１７）
以下の特徴、
ｉ）ステップｂ）において、前記反応組成物が、少なくとも１時間、少なくとも５時間、
少なくとも１０時間もしくは少なくとも１２時間、継続的に撹拌されること、
ｉｉ）前記反応組成物が、１２〜２０時間撹拌されること、
ｉｉｉ）前記コア粒子上に堆積する前記コーティングが、ＳｉＯ _２ からなること、
ｉｖ）前記コア粒子上に堆積する前記コーティングが、ＳｉＯ _２ および一つもしくは複数の追加の酸化物化合物を含み、好ましくは前記コア粒子上に堆積する前記ＳｉＯ _２ 含有コーティングが、Ｂ _２ Ｏ _３ 、Ａｌ _２ Ｏ _３ 、ＴｉＯ _２ 、ＺｒＯ _２ 、Ｎａ _２ Ｏ、Ｋ _２ Ｏ、ＣａＯおよびＭｇＯから選択される一つもしくは複数の酸化物化合物を含むこと、ならびに／または
ｖ）前記方法が、前記得られたシリカ粒子の表面を官能化するステップを含むこと
の一つまたは複数を有する、項目１から１６の一項または複数項に記載の方法。
（項目１８）
前記粒子の形成が完了した後、任意選択で熟成ステップの後、前記粒子が、沈降、濾過、デカンテーション、遠心分離によって、または磁性シリカ粒子が生成された場合には、磁場の印加によって前記反応組成物から収集される、項目１から１７の一項または複数項に記載の方法。
（項目１９）
凝集したＳｉＯ _２ コーティングされたコア粒子によって形成される、３０μｍまたはそれ未満のサイズを有する多孔質シリカ粒子であって、前記コア粒子が、ＳｉＯ _２ コーティングによって本質的に封入され、前記シリカ粒子が、前記含まれているＳｉＯ _２ およびコア粒子に関して、１５〜７５％（重量）のコア粒子および２５％〜８５％（重量）のＳｉＯ _２ である組成を有し、前記シリカ粒子が、粒子１ｍｇ当たり少なくとも１２．５μｇの核酸分子と結合することができる、多孔質シリカ粒子。
（項目２０）
粒子１ｍｇ当たり少なくとも１５μｇの核酸分子または粒子１ｍｇ当たり少なくとも１７．５μｇの核酸分子と結合することができる、項目１９に記載のシリカ粒子。
（項目２１）
粒子１ｍｇ当たり少なくとも２０μｇの核酸分子と結合することができる、項目１９に記載のシリカ粒子。
（項目２２）
マクロ孔を含む、項目１９から２１の一項または複数項に記載のシリカ粒子。
（項目２３）
前記粒子の表面が、ミクロ孔をさらに含む、項目２２に記載のシリカ粒子。
（項目２４）
２５μｍもしくはそれ未満、２０μｍもしくはそれ未満、１５μｍもしくはそれ未満、１０μｍもしくはそれ未満、５μｍもしくはそれ未満、または３μｍもしくはそれ未満のサイズを有する、項目１９から２３の一項または複数項に記載のシリカ粒子。
（項目２５）
前記含まれているＳｉＯ _２ およびコア粒子に関して、２０〜５０％（重量）のコア粒子および約５０〜８０％（重量）のＳｉＯ _２ 、好ましくは２５〜５０％（重量）のコア粒子および約５０〜７５％（重量）のＳｉＯ _２ である組成を有する、項目１９から２４の一項または複数項に記載のシリカ粒子。
（項目２６）
以下の特徴、
ｉ）前記コア粒子が、磁性特性を有すること、
ｉｉ）前記コア粒子が、超常磁性、常磁性、強磁性もしくはフェリ磁性特性を有すること、
ｉｉｉ）前記コア粒子が、酸化鉄、好ましくは磁鉄鉱および／もしくは磁赤鉄鉱を含むこと、
ｉｖ）前記コア粒子が、８〜１５０ｎｍ、１０〜１００ｎｍおよび１０ｎｍ〜６０ｎｍから選択される範囲内にある直径を有すること、ならびに／または
ｖ）前記コア粒子が、中空であること
の一つまたは複数を有する、項目１９から２５の一項または複数項に記載のシリカ粒子。
（項目２７）
前記粒子の核酸結合能が、実施例６に記載のとおり決定される、項目１９から２６の一項または複数項に記載のシリカ粒子。
（項目２８）
項目１から１８の一項または複数項に記載の方法によって得ることができる、項目１９から２７の一項または複数項に記載のシリカ粒子。
（項目２９）
生体分子を単離するため、好ましくは核酸を単離するための、先の項目１から１８の一項もしくは複数項に従って調製されたシリカでコーティングされた粒子または項目１９から２８の一項もしくは複数項に記載のシリカ粒子の使用。
本願の他の目的、特色、利点および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかになる。しかし、以下の説明、添付の特許請求の範囲および具体例は、本願の好ましい実施形態を示している一方で、単に例として示されていることを理解されたい。開示の本発明の精神および範囲に含まれる様々な変更および修飾は、以下を読むことによって当業者に容易に明らかになる。

カオトロピック結合緩衝液を使用して磁性シリカ粒子で精製したプラスミドＤＮＡ（２〜２０μｇのｐＵＣ２１）のゲル電気泳動分析（詳細については実施例６参照）。

カオトロピック結合緩衝液を使用して磁性シリカ粒子で精製したプラスミドＤＮＡ（２〜２０μｇのｐＵＣ２１）の測光定量化（ｙ軸：ｎｇ／μｌ単位でのＤＮＡ濃度；詳細については実施例６参照）。

アニオン交換体で修飾した磁性シリカ粒子で精製したプラスミドＤＮＡ（２〜２０μｇのｐＵＣ２１）のゲル電気泳動分析（詳細については実施例７参照）。

非修飾磁性シリカ粒子（ＵＮＭ）対カルボキシル化シリカ粒子（ＭＣ；詳細については実施例８参照）で精製したプラスミドＤＮＡ（２〜２０μｇのｐＵＣ２１）のゲル電気泳動分析。

発明の詳細な説明
第１の態様によれば、ＳｉＯ_２含有表面を有する粒子を生成する方法であって、
ａ）ｉ）コア粒子、
ｉｉ）ケイ酸塩、
ｉｉｉ）塩基、および
ｉｖ）ｐＨ調節剤
を含む水性反応組成物を提供するステップであって、上記反応組成物のｐＨ値が上記ケイ酸塩のゲル化ｐＨ値より大きいステップと、
ｂ）上記反応組成物を撹拌するステップであって、上記ｐＨ調節剤が、上記反応組成物のｐＨ値を経時的に低減し、上記反応組成物のｐＨ値の上記低減に起因して、ＳｉＯ_２がコア粒子上に堆積し、それによって３０μｍまたはそれ未満の直径を有する粒子が形成されるステップと、
ｃ）粒子を得るステップと
を含む方法が提供される。

特に、ＳｉＯ_２含有表面を有する粒子を生成する方法であって、
ａ）ｉ）コア粒子、
ｉｉ）添加塩基、
ｉｉｉ）ケイ酸塩、および
ｉｖ）ｐＨ調節剤
を含む水性反応組成物を提供するステップであって、上記反応組成物のｐＨ値がゲル化ｐＨ値より大きいステップと、
ｂ）上記反応組成物を撹拌するステップであって、上記ｐＨ調節剤が、上記反応組成物のアルカリ環境において反応し、それによって上記反応組成物のｐＨ値を経時的に低減する有機化合物であり、上記反応組成物のｐＨ値の上記低減に起因して、ＳｉＯ_２がコア粒子上に堆積し、それによって３０μｍまたはそれ未満の直径を有する粒子が形成されるステップと、
ｃ）粒子を得るステップと
を含む方法が提供される。

方法、その個々のステップおよび好ましい実施形態を、以下に詳細に説明する。

ステップａ）では、後に詳細に説明されるいくつかの構成成分ｉ）〜ｉｖ）を含む水性組成物が提供される。

コア粒子
反応組成物は、構成成分ｉ）としてコア粒子を含む。コア粒子は、ステップｂ）で堆積するＳｉＯ_２の核形成部位として働く。好ましくは、コア粒子は、５ｎｍ〜２００ｎｍ、８ｎｍ〜１５０ｎｍまたは１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内にある中位径を有する。一実施形態によれば、中位径は、１０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲内にある。いくつかの材料は、コア粒子を提供するのに適しており、コア粒子の選択は、生成されるシリカ粒子の特性にも影響を及ぼす。一実施形態によれば、コア粒子は、二酸化ケイ素を含むか、または二酸化ケイ素からなる。例えば、コロイドシリカ粒子は、コア粒子として使用することができる。コア粒子はまた、ポリマー材料を含んでもよく、ポリマー材料からなってもよい。例えば層の状態で配置されている、異なる材料を含む複合コア粒子を使用することもできる。

一態様では、コア粒子は、酸化物、特に半金属酸化物もしくは金属酸化物を含むか、または酸化物、特に半金属酸化物もしくは金属酸化物からなる。

磁性特性を有するコア粒子を使用する場合、生成されたシリカ粒子も、磁場の存在下で磁性特性を呈する。磁性シリカ粒子は、取扱いに関して著しく良好な利点を有するので、磁性特性を有するコア粒子を使用することが好ましい。コア粒子は、磁場の存在下で少なくとも磁性である場合には磁性特性を有し、したがって磁場の助力により除去され得る。例えば、コア粒子は、超常磁性、常磁性、フェリ磁性または強磁性特性を有することができる。超常磁性または常磁性のコア粒子を使用することが好ましい。

一実施形態によれば、コア粒子は、金属酸化物を含むか、または金属酸化物からなる。好ましくは、金属酸化物は、磁性特性を有する。好ましくは、コア粒子は、酸化鉄を含むか、または酸化鉄からなる。酸化鉄粒子は、例えばＦｅ_２Ｏ_３（赤鉄鉱）、ｙ−Ｆｅ_２Ｏ_３（磁赤鉄鉱）、Ｆｅ_３Ｏ_４（磁鉄鉱）または前述の材料の組合せによって提供することができる。好ましくは、超常磁性特性を有する酸化鉄粒子が使用される。直径約３０ｎｍ未満の酸化鉄結晶は、超常磁性特性を呈することができる。一実施形態では、磁性コア粒子は、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｚｎ、Ｍｇ、Ｔｉ、Ｚｒなどの二価のカチオンを有する金属酸化物、ならびにそれらの組合せおよび／または酸化鉄との組合せを含む。

一実施形態によれば、中空コア粒子が使用される。中空コア粒子の使用は、得られたシリカ粒子が沈降する特徴に対して強い影響を及ぼす。中空コア粒子は、シリカをコア材料上に、例えば親水性表面を有するポリマーコア上に堆積させ、その後コア材料を例えばＴＨＦによって除去することによって調製することができる。それによって、本発明の方法においてコア粒子として使用できる中空シリカ粒子が提供される。さらに、磁性中空コア粒子を使用することもできる。例えば、磁性材料を、中空シリカコア粒子内に組み込むか、または中空シリカコア粒子上に堆積させ、それによって磁性中空シリカコア粒子を提供することができる。例えば、中空シリカコア粒子が多孔質である場合、例えばＷＯ９３／１０１６２に記載されている通り、中空シリカコア粒子に磁性顔料を含浸させ、それによって磁性中空コア粒子を提供することができる。その後、ＳｉＯ_２を上記磁性中空コア粒子上に堆積させるので、磁性材料がシリカコーティングで被包され、それによって磁性材料の浸出を防止する。緩慢な沈降プロファイルを有する磁性シリカ粒子の生成は、核酸などの生体分子を単離するためにその粒子を使用する場合に有利である。

磁性コア粒子は、その場で調製することができる。

一実施形態では、鉄、銅、ニッケルまたはそれらの合金からなる磁性コア粒子が使用される。一実施形態では、コア粒子は、複合粒子、例えば金属および金属酸化物の複合体、より好ましくは磁鉄鉱コーティングを有する鉄粒子である。

本発明の一実施形態では、コア粒子は、磁鉄鉱からなり、好ましくは超常磁性特性を有する。

一実施形態によれば、反応組成物におけるコア粒子の量は、２０％もしくはそれ未満、１５％もしくはそれ未満、１０％もしくはそれ未満、または７．５％もしくはそれ未満である。また、反応組成物におけるコア粒子の量は、凝集体形成の望ましいまたは許容される度合いに応じて決まる。

本発明の範囲には、例えば酸化鉄粒子、例えば磁鉄鉱などのコア粒子を、反応組成物に直接添加することが包含される。それぞれのコア粒子は、市販されている。コア粒子は、加工され得、例えば所望のサイズに粉砕され得る。

好ましくは、磁性コア粒子として安定化酸化鉄粒子が使用される。本発明の一実施形態では、酸化鉄コア粒子は、界面活性剤、リン脂質または有機酸もしくはその塩によって安定化される。一実施形態では、酸化鉄コア粒子は、カルボン酸、例えばクエン酸またはその塩によって安定化される。好ましい一実施形態では、シトレートによって安定化された磁鉄鉱コア粒子が使用される。それぞれの安定剤が存在することによって、酸化鉄コア粒子の分離が支持され、それによって反応組成物における酸化鉄粒子の望ましくない凝集が低減されると想定される。カルボン酸、特にジカルボン酸、トリカルボン酸またはポリカルボン酸の他のアニオンをそれぞれの安定剤として使用することもでき、それらの例として、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸およびカルボキシメチルデキストランが挙げられるが、それらに限定されない。

一実施形態によれば、コア粒子は、ステップａ）の前に生成される。例えば、酸化鉄を含むコア粒子は、鉄塩、好ましくは塩化鉄（ＩＩＩ）および塩化鉄（ＩＩ）を、アルカリ水酸化物水溶液、例えばＫＯＨ溶液に添加し、上記溶液から酸化鉄粒子を沈殿させることによって調製することができる。あるいは、鉄−アセチルアセトン錯体を加熱して、酸化鉄粒子を提供することができる。それぞれに得られた酸化鉄粒子は、前述の通り安定化することができる。好ましくは、酸化鉄粒子は、シトレートによって安定化される。一実施形態によれば、酸化鉄コア粒子の生成は、酸化を防止するために、窒素などの保護ガスの存在下で行われる。

一実施形態によれば、生成された酸化鉄粒子は、酸化鉄粒子上へのシリカコーティングの堆積によってそれらが沈殿した時点からずっと、水性媒体と接触したままである。一実施形態によれば、得られた酸化鉄コア粒子は、生成された酸化鉄粒子を事前に単離または精製せずに、反応組成物中でＳｉＯ_２により直接コーティングすることができる。

一実施形態によれば、本発明の方法は、
−好ましくは例えば前述の通り安定化されている酸化鉄コア粒子を、水溶液、好ましくは水に懸濁させるステップと、
−任意選択で、シリカ塩および／または安定剤、好ましくはカルボン酸、例えばシトレートを添加するステップと、
−水酸化カリウム、ケイ酸カリウムおよびホルムアミドを、上記コア粒子を含有する懸濁液に添加し、それによってステップａ）の反応組成物を形成するステップと
を含む。

次に、粒子の形成が完了するまで、反応を本明細書に記載の通り継続させる。磁性シリカ粒子のそれぞれの生成により、核酸などの生体分子に対して高い結合能を有する、均一なサイズの磁性粒子を提供する。前述の通り、予め形成された安定化酸化鉄コア粒子を使用することは、酸化鉄の調製中に形成された可能性がある塩がそれぞれに除去され得、したがって反応組成物におけるコア粒子の凝集を支持しないので、有利である。

一実施形態によれば、ＳｉＯ_２の薄層を、塩基およびｐＨ調節剤を添加する前にコア粒子上に堆積させる。シリカを予め堆積させることは、有益であり、その後のＳｉＯ_２コーティングの堆積を支持すると想定される。

一実施形態によれば、本発明の方法は、
−一つまたは複数の鉄塩、好ましくは塩化鉄（ＩＩＩ）および塩化鉄（ＩＩ）を、アルカリ水酸化物水溶液、好ましくはＫＯＨ溶液に添加して、コア粒子としての磁鉄鉱または磁赤鉄鉱を沈殿させることによって、酸化鉄コア粒子を調製するステップと、
−水酸化カリウム、ケイ酸カリウムおよびホルムアミドを、上記コア粒子を含有する溶液に添加し、それによってステップａ）の反応組成物を形成するステップと
を含む。

次に、粒子の形成が完了するまで、反応を本明細書に記載の通り継続させる。磁性シリカ粒子のそれぞれの生成は、非常に費用効率が高く、高い結合能を有する磁性粒子を提供する。

ケイ酸塩
反応組成物は、構成成分ｉｉ）としてケイ酸塩を含む。シリカ自体は本質的に水不溶性なので、シリカは、可溶性ケイ酸塩の形態で添加される。ケイ酸塩をシリカ供給源として使用することは、ケイ酸塩が低価格であり、したがって生成方法を低価格に抑えられるので有利である。従来技術の方法とは対照的に、本発明の方法においては、シリケートの濃度は低い。特に、ケイ酸塩の濃度は、ＳｉＯ_２が自然発生的に沈殿しないような濃度である。コア粒子上へのＳｉＯ_２の効率的でありかつ制御された堆積をもたらし、別個のシリカ粒子の形成を可能にする目的で、ケイ酸塩に由来するＳｉＯ_２は、反応組成物中に１ｍｏｌ／ｌ未満の濃度で含まれることが好ましい。したがって好ましくは、ケイ酸塩は、反応組成物中に１ｍｏｌ／ｌ未満の濃度で存在する。反応組成物中のＳｉＯ_２を低減、したがってケイ酸塩の濃度を低減する一方で、塩基の添加により好ましくは１２．５もしくは１２．５超の高ｐＨ値を維持することは、核酸などの生体分子に対して良好な結合特性を有する別個の小型粒子を形成するのに有益であることが見出された。一実施形態によれば、反応組成物は、０．０１〜０．９ｍｏｌ／ｌ、０．０２〜０．７ｍｏｌ／ｌ、０．０３〜０．６ｍｏｌ／ｌ、０．０４〜０．５ｍｏｌ／ｌ、０．０５〜０．４ｍｏｌ／ｌ、０．０６〜０．３ｍｏｌ／ｌ、０．０７〜０．２ｍｏｌ／ｌおよび０．０９〜０．１５ｍｏｌ／ｌから選択される範囲内にある濃度のケイ酸塩に由来するＳｉＯ_２を含む。一実施形態によれば、反応組成物中のケイ酸塩の濃度は、０．０１〜０．９ｍｏｌ／ｌ、０．０２〜０．７ｍｏｌ／ｌ、０．０３〜０．６ｍｏｌ／ｌ、０．０４〜０．５ｍｏｌ／ｌ、０．０５〜０．４ｍｏｌ／ｌ、０．０６〜０．３ｍｏｌ／ｌ、０．０７〜０．２ｍｏｌ／ｌおよび０．０９〜０．１５ｍｏｌ／ｌから選択される範囲内にある。

適切なケイ酸塩として、ケイ酸アンモニウム、アルカリ金属ケイ酸塩、置換アンモニウム塩のケイ酸塩、例えば水酸化テトラメチルアンモニウム、アルカリ土類金属ケイ酸塩、および土類金属ケイ酸塩が挙げられるが、それらに限定されない。原則として、任意のアルカリ可溶性ケイ酸塩を使用してもよい。一実施形態によれば、アルカリ金属ケイ酸塩が使用される。例として、ケイ酸ナトリウムもしくはケイ酸カリウムまたはそれらの混合物が挙げられる。好ましい一実施形態によれば、ケイ酸塩は、ケイ酸カリウムである。ケイ酸カリウムを使用することは、カリウムイオンが、堆積したシリカの特性、したがって形成されたシリカ粒子の特性に対して有利な影響を及ぼすので、有利である。一実施形態によれば、ケイ酸カリウム塩は、式Ｋ_２Ｏ・ｎＳｉＯ_２の塩であり、ここでｎは１．０〜５．０であり、好ましくは２．０〜３．０である。ケイ酸塩に適した濃度範囲は、先に記載されている。

一実施形態によれば、コア粒子上に堆積するコーティングは、ＳｉＯ_２からなる。しかし、コーティングは、他の化合物、特に他の酸化物化合物を含むことも可能である。一実施形態では、コア粒子上に堆積するＳｉＯ_２含有コーティングは、Ｂ_２Ｏ_３、Ａｌ_２Ｏ_３、ＴｉＯ_２、ＺｒＯ_２、Ｎａ_２Ｏ、Ｋ_２Ｏ、ＣａＯおよびＭｇＯから選択される一つまたは複数の酸化物化合物を含む。それぞれのコーティングは、適切な酸化物種を反応組成物に組み込むことによって生成することができる。それぞれの酸化物を、ｐＨ調節剤の活性によりシリケート溶液から沈殿するＳｉＯ_２コーティングに組み込むのに適した方法は、ＵＳ３，６７８，１４４に記載されており、その方法を本発明による方法に適合させることができる。

塩基および反応組成物の初期ｐＨ値
反応組成物は、構成成分ｉｉｉ）として塩基を含む。本発明者らは、シリケート濃度を低減するときに高ｐＨ値を維持するために、反応組成物中に塩基を含むことが重要であることを見出した。塩基を添加すると確実に、反応組成物のｐＨ値は、シリケートのゲル化ｐＨ値を十分に上回る。シリケートのゲル化点を少なくとも０．５ｐＨ単位、少なくとも０．７５ｐＨ単位、好ましくは少なくとも１ｐＨ単位、より好ましくは少なくとも１．５ｐＨ単位だけ上回る初期ｐＨ値を有することは、堆積結果にとって有益である。特にそれによって、反応組成物からのシリカの制御されていない沈殿、特にコア粒子と接触していないシリカの沈殿が防止される。反応組成物の初期ｐＨ値とシリケートのゲル化ｐＨ値がより大きく離れていると確実に、ｐＨ調節剤の活性化によってゲル化ｐＨ値に達するまでに時間がかかる。これによって、ゲル化ｐＨ値に達する前に、したがってシリカ堆積プロセスが始まる前に、反応組成物中に含まれるすべての構成成分、特に反応組成物のコア粒子を完全に再懸濁させ、混合することができる。それによって確実に、シリカは、再懸濁したコア粒子上にゆっくりと制御された方式で、沈殿かつ／または吸着する。このことは特に、前述の通り反応組成物中のＳｉＯ_２の量を、例えば１ｍｏｌ／ｌもしくはそれ未満、より好ましくは０．７５ｍｏｌ／ｌもしくはそれ未満に低減する場合に達成することができる。

反応組成物の初期ｐＨ値は、次のセクションで説明する通り、例えばｐＨ調節剤のアルカリ加水分解によって、使用されるｐＨ調節剤を活性化するのに十分に高い。したがって、初期ｐＨ値も、使用されるｐＨ調節剤に応じて決まる。例えば、ｐＨ調節剤としてホルムアミドなどの化合物を使用する場合には、１２．５もしくは１２．５超、好ましくは１３もしくは１３超の高い初期ｐＨ値が好ましく、尿素などの他のｐＨ調節剤を使用する場合には、より低いｐＨ値を使用することができる。

反応組成物のｐＨ値を初期ｐＨ値に調整するために、塩基が含められ、それぞれ、反応組成物に添加される。初期ｐＨ値を所望の高ｐＨ値に調整することができる任意の強塩基を使用することができる。例えば、アンモニアを使用することができる。好ましくは、アルカリ水酸化物などの無機塩基、例えばＮａＯＨまたはＫＯＨが使用される。ＫＯＨは、非常に均質な反応組成物を提供し、堆積結果に有益な影響を及ぼすことが見出されたので、ＫＯＨを塩基として使用することが好ましい。さらに、塩基および／またはシリカ塩に由来するカリウムカチオンは、細孔径に関して有益である。特に、カリウムの使用は、カリウムの電荷密度がより低くかつカリウムの水和球が大きく、そしてそれにより懸濁液が安定化され、不安定化プロセスが緩徐されるので、有益である。

一実施形態によれば、反応組成物の初期ｐＨ値は、ｐＨ１１またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１１．５またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１１．７５またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１２またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１２．２５またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１２．５またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１２．７５またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１３またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１３．２５またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１３．５またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１３．７５またはそれより大きいｐＨ値、およびｐＨ１４またはそれより大きいｐＨ値から選択される。したがって、反応組成物のｐＨ値は、例えば１１．５〜１５、１２〜１４、１２．５〜１４もしくは１３〜１４の範囲内であり得るか、またはこれらの範囲内の任意の値を有し得る。先に論じた通り、反応組成物の初期ｐＨ値は、塩基、好ましくはＫＯＨを添加することによってこれらの高ｐＨ値に調整することができ、好ましくは、ｐＨ１２．５またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１２．７５またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１３またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１３．２５またはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１３．５またはそれより大きいｐＨ値、およびｐＨ１４またはそれより大きいｐＨ値から選択される。

ｐＨ調節剤
反応組成物は、構成成分ｉｖ）としてｐＨ調節剤を含む。反応組成物中に含まれているｐＨ調節剤は、化学反応によって反応組成物のｐＨ値をゆっくり低減させる。請求項１のステップｂ）に定義されている通り、反応組成物を撹拌し（ａｇｉｔａｔｅ）、例えばかき混ぜて（ｓｔｉｒ）、ｐＨ調節剤は、反応組成物のｐＨ値をゆっくり均一に低減する。ｐＨ調節剤によって誘発される反応組成物のｐＨ値のゆっくりとした均一な上記低減に起因して、ＳｉＯ_２は、制御された方式でコア粒子上に堆積し、それによって別個の小型粒子が形成される。

「ｐＨ調節剤」という用語は、本明細書で使用される場合、特に、反応組成物のアルカリ環境で反応し、それによって反応組成物のｐＨ値を経時的に低減する有機化合物を指す。反応組成物の初期ｐＨ値は、ｐＨ調節剤が活性化され、したがって反応組成物のｐＨを低減するほど高い値である。例えば、ｐＨ調節剤は、反応組成物の高い初期ｐＨ値で加水分解されると、酸性化合物をもたらすことができる。得られた酸性化合物の酸性度によって、反応組成物のｐＨ値は、ＳｉＯ_２が沈殿し、したがって反応組成物中に含まれるコア粒子上に堆積する、ゲル化ｐＨ値まで低減される。２種以上のｐＨ調節剤を使用することもできる。１種または複数種のｐＨ調節剤を使用すると、ｐＨ値はゆっくりと均一に低下し、それによってシリケートの不利益な自然発生的加水分解が防止され、したがってＳｉＯ_２の沈殿が防止される。反応組成物は、シリカの堆積中に継続的に撹拌されるので、コア粒子は懸濁状態を維持し、それによってＳｉＯ_２はコア粒子上に均一に堆積する。本明細書に記載の反応組成物は、実施例によって実証される通り、良好な結合の特徴を有する別個のシリカ粒子の確実な調製を可能にする、制御された反応条件を提供する。ｐＨ調節剤を、本明細書に記載の反応条件と組み合わせて使用すると、工業規模でシリカ粒子を生成するために従来技術で一般に使用されている高価であまり便利ではない有機シリカ誘導体の代わりに、相対的に高価でない無機ケイ酸塩を使用することができる。ｐＨ調節剤の使用に基づく本発明の方法には、反応組成物の酸性化プロセスが非常にゆっくりであり、かつ制御されており、それによって確実に、粒子生成の再現性が添加される試薬の変動に強く依存しないという利点がある。したがって、反応組成物のｐＨ値を滴定によって低減するのではなく、それぞれｐＨ調節剤の活性だけに起因して、それだけによって低減することが好ましい。ｐＨ調節剤を使用すると、堆積速度が低減し、それによってコア粒子上のＳｉＯ_２の堆積が改善され、良好な結合の特徴を有する小型の別個の粒子が提供される。

反応組成物のｐＨ値を低減するｐＨ調節剤から上記酸性化合物を生成するための反応機構として、例えば、カルボン酸を得るための有機化合物の加水分解、またはカルボン酸へのアルデヒドの酸化が挙げられる。アルデヒドの場合、分子内で実施することもできる不均衡反応（カニッツァーロ反応）（例えば、グリオキサールなどのジアルデヒドに関して）は、カルボン酸の形成に関与することができる。一実施形態によれば、ｐＨ調節剤として有機ゲル化剤が使用される。一実施形態によれば、ｐＨ調節剤は、エステル、アミド、アルデヒドまたはポリオキシメチレン基を含む有機化合物である。ポリオキシメチレン基を含有する化合物は、好ましくは、アルデヒドの縮重合生成物を代表する。適切なｐＨ調節剤は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルムアミド、グリオキサール、ギ酸メチル、酢酸メチル、ギ酸エチル、酢酸エチル、アルキルハロゲン化物、酸アミド、例えばアセトアミド、酸エステル、グルタルジアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）および尿素からなる群から選択され得る。本発明の目的で使用することができる適切なｐＨ調節剤は、ＵＡ４，２２１，５７８およびＵＳ３，６７８，１４４にも開示されている。ｐＨ調節剤の加水分解によって、反応中に反応組成物のｐＨ値が低減する。好ましい一実施形態では、高い反応性およびその化合物の取扱いの高い利便性に起因して、ホルムアミドがｐＨ調節剤として使用される。ホルムアミドは、高ｐＨ値、好ましくはｐＨ１３またはそれより大きいｐＨ値で加水分解され、それによってアンモニウムおよびホルメート（ｆｏｒｍｉａｔｅ）を提供し、反応組成物のｐＨ値を経時的にゆっくり低減する。

ｐＨ調節剤は、広い濃度範囲で使用することができる。その量は、使用されるｐＨ調節剤のタイプに応じて、したがって反応性に応じても決まる。適切な濃度範囲として、０．０１〜４ｍｏｌ／ｌ、０．１〜３ｍｏｌ／ｌ、０．２〜２．５ｍｏｌ／ｌ、０．３〜２ｍｏｌ／ｌ、０．４〜１．５ｍｏｌ／ｌおよび０．５〜１ｍｏｌ／ｌが挙げられるが、それらに限定されない。ホルムアミドは、ある特定の他のｐＨ調節剤よりも反応性が高く、したがってより低い濃度で使用することができる。好ましい一実施形態では、ｐＨ調節剤としてホルムアミドが使用され、それによって反応組成物におけるホルムアミドの濃度は、０．０１〜２ｍｏｌ／ｌ、０．１〜１．５ｍｏｌ／ｌ、０．２ｍｏｌ／ｌ〜１．２５ｍｏｌ／ｌ、０．３ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｍｏｌ／ｌ、０．４〜０．８ｍｏｌ／ｌおよび０．５〜０．７ｍｏｌ／ｌの範囲であり、好ましくは、初期ｐＨ値は、少なくとも１２．５、より好ましくは少なくとも１３である。

一実施形態によれば、ｐＨ調節剤とケイ酸塩の比は、５：１〜２０：１、７．５：１〜１５：１または１０：１〜１３：１の範囲内にある。一実施形態によれば、ｐＨ調節剤とケイ酸塩の比、好ましくはホルムアミドとケイ酸カリウムの比は、およそ１１：１である。

反応組成物のｐＨ値は、ｐＨ調節剤によって、例えばそのアルカリ加水分解に起因して低減させられる。一実施形態によれば、反応組成物の初期ｐＨ値は、少なくとも１ｐＨ単位、好ましくは少なくとも１．５ｐＨ単位、より好ましくは少なくとも２ｐＨ単位、より好ましくは少なくとも２．５ｐＨ単位、最も好ましくは少なくとも３ｐＨ単位だけ低減させられる。それにより、コア粒子上へのＳｉＯ_２の堆積は、制御された方式で生じる。反応組成物をＳｉＯ_２の堆積中に継続的に撹拌する、例えばかき混ぜる（ｓｔｉｒ）と、ｐＨ値の制御された低減によって、非常に均質な堆積結果がもたらされ、自然発生的な制御の効かないシリカの堆積が回避される。したがって、従来技術の方法とは対照的に、シリカの沈殿は、数秒または数分以内には生じないが、長時間に亘って、好ましくは少なくとも１時間、少なくとも５時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間または少なくとも１２時間に亘って生じる。

反応組成物の初期ｐＨ値を、ｐＨ調節剤の酸性化活性によって、１２．０もしくはそれ未満、１１．５もしくはそれ未満、１１．４もしくはそれ未満、１１．３もしくはそれ未満、１１．２もしくはそれ未満、１１．０もしくはそれ未満、１０．８もしくはそれ未満、１０．７もしくはそれ未満、１０．６もしくはそれ未満、１０．５もしくはそれ未満、１０．４もしくはそれ未満、１０．３もしくはそれ未満または１０．２もしくはそれ未満のｐＨ値に低減させてもよい。シリケートの加水分解が生じ、シリカがコア粒子上に堆積する低ｐＨ値に適した範囲として、９〜１２、９．５〜１１．７５、１０〜１１．５、より好ましくは１０．５〜１１．２が挙げられる。

プロセスパラメータ
確実にＳｉＯ_２をコア粒子上に均一に堆積させ、所望のサイズの別個のシリカ粒子を形成するためには、ＳｉＯ_２の堆積中、したがって粒子の形成中に、反応組成物を継続的に撹拌することが重要である。撹拌は、例えば、かき混ぜ（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）、超音波処理、振とう、気泡ストリームまたは当業者に公知の任意の他の技術によって達成することができる。

ＳｉＯ_２含有コーティングを堆積させるために、コア粒子またはコア粒子スラリーを、好ましくは脱イオン水などの水に基づいて調製される反応組成物に分散させることができる。反応組成物中のコア粒子の濃度は、様々であり得るが、好ましくは５０ｇ／ｌ未満である。

コア粒子、塩基、シリケートおよびｐＨ調節剤は、様々な添加順で添加して、反応組成物を提供することができる。好ましくは、水性媒体中にコア粒子を提供し、撹拌して、好ましくはかき混ぜて（ｓｔｉｒ）、懸濁液を形成する。次に、反応組成物のｐＨ値を、シリカのゲル化ｐＨより大きいｐＨ値に調整するための量の塩基、好ましくはＫＯＨを添加する。好ましくは、初期ｐＨ値は、１２．５もしくはそれより大きいｐＨ値、好ましくは１３もしくはそれより大きいｐＨ値である。また、適切な初期ｐＨの値および範囲は、既に先に記載されている。その後、シリカ塩、好ましくはアルカリ金属ケイ酸塩を添加する。次に、ｐＨ調節剤を添加する。この添加順が好ましい。好ましくは、反応組成物を継続的に撹拌しながら、構成成分を添加する。ｐＨ調節剤を添加すると、ｐＨ調節剤は、反応組成物の強いアルカリ条件下で、例えば加水分解によって反応し、それによってｐＨ値をゆっくり低減する。したがって、コア粒子、塩基およびケイ酸塩を添加した後に、ｐＨ調節剤を添加することが好ましい。一実施形態によれば、ｐＨ調節剤は、反応組成物に添加される最後の化合物である。

シリカがコア粒子上に堆積または沈殿すると、ＳｉＯ_２コーティングされたコア粒子、例えばＳｉＯ_２コーティングされた磁性コア粒子は、凝集し始めて、より大きい多孔質シリカ粒子を形成する。したがって、ＳｉＯ_２が堆積したコア粒子は、より大きい凝集体を形成することができ、好ましくは形成し、そしてその上にさらなるＳｉＯ_２が堆積または吸着し得る。したがって、凝集体自体は、凝集体の表面上に追加のＳｉＯ_２コーティングを有することができる。それぞれの凝集体によって形成されるシリカ粒子は、いくつかのコア粒子を含む。本発明による方法は、凝集プロセスを制御することができ、その結果、実施例に示されている通り、良好な結合特性を呈する、ある程度均一なサイズの別個の粒子が提供される。本発明の方法に従って製造されるシリカ粒子は、コア粒子上へのシリカの堆積およびこうして調製された複合粒子のその後の凝集によって作り出されるので、大きい表面積を呈する。これの結果として、有利なことには、マクロ孔が間隙として形成される。

前述の通り、本発明の好ましい一実施形態では、反応組成物の初期ｐＨ値は、１２．５より大きく、ｐＨ調節剤の酸性化活性に起因して、１１．２未満のｐＨ値まで低減される。より好ましくは、初期反応組成物のｐＨ値は、１３〜１４であり、ｐＨ調節剤の酸性化活性に起因して、１０．５〜１１．２の範囲内にあるｐＨ値まで低減される。反応組成物の初期の高い塩基性のｐＨ値は、好ましくはＫＯＨなどのアルカリ水酸化物である無機塩基を使用することによって、好ましくは調整される。

反応組成物は、氷点および沸点の間の任意の温度で撹拌することができる。シリカの堆積は、温度が上昇するにつれてより急速になる。本発明の一実施形態では、反応組成物を、５〜５０℃、好ましくは１０〜３０℃の温度で撹拌し、好ましくはかき混ぜ（ｓｔｉｒ）、より好ましくは室温でかき混ぜる。撹拌は、一実施形態によれば、５０℃未満、好ましくは３０℃未満の温度で、より好ましくは室温で実施する。

すべての構成成分ｉ）〜ｉｖ）を含み、任意選択でさらなる化合物を含む反応組成物は、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも７時間、少なくとも１０時間、より好ましくは少なくとも１２時間撹拌する間にインキュベートされ得る。一実施形態によれば、反応組成物は、５〜２０時間、好ましくは１０〜２０時間、１２〜２０時間、より好ましくは１５〜１８時間撹拌しながら、好ましくは室温でインキュベートされる。このような長いインキュベーション時間にわたってＳｉＯ_２をゆっくり堆積させることは、本明細書に記載の粒子特徴に有利に影響を及ぼし、均一な特徴を有する粒子の、費用効率が高くかつ安定な生成をもたらす。

本発明の好ましい一実施形態では、コア粒子は、磁性粒子、好ましくは酸化鉄粒子であり、堆積のために使用されるシリケート供給源は、好ましくは式Ｋ_２Ｏ・ｎＳｉＯ_２（ｎは２．０〜３．０である）のケイ酸カリウムであり、ｐＨ調節剤は、ホルムアミドであり、反応組成物の初期ｐＨ値は、ＫＯＨを使用することによって１３もしくはそれより大きいｐＨ値に調整し、反応組成物を室温で１０〜２０時間撹拌する。

粒子のサイズは、反応時間、反応温度および反応物の濃度などのある特定の反応パラメータの変化によって制御され得る。例えば塩濃度を増大することによって、例えば反応組成物のイオン強度を増大させることによって、より大きい粒子が得られる。さらに、より多くのＳｉＯ_２を堆積させる場合により長い反応時間を使用することによって、より大きい粒子およびより大きい細孔を得ることもできる。また、コア粒子に対するシリケートの比を増大させると、より多くのＳｉＯ_２がコア粒子上に堆積するにつれて、より大きい細孔が形成される。この結果としてより大きい粒子がもたらされ、このことが、より大きいシリカ粒子を形成する凝集小型粒子間の間隙を増大させる。シリカコーティングされたコア粒子の凝集度合い、したがって凝集体によって形成されるシリカ粒子のサイズは、組成物の反応物の濃度、ステアリング速度および反応組成物の粘度に影響を受け、したがってそれらによって調整され得る。

粒子の形成が完了した後、および任意選択で熟成ステップの後、最終的な粒子を、沈降、濾過、デカンテーション 遠心分離によって、または磁性シリカ粒子が生成された場合には、磁場の印加によって収集することができる。反応組成物の液体上清のすべてまたは主部分は、破棄することができる。粒子は、粒子懸濁液の形態で収集することができる。好ましくは、粒子は、数回洗浄される。洗浄溶液は、水、塩および／または有機溶媒を含有することができる。例えば、粒子は、水および／またはアルコール、例えば無水アルコール、例えばエタノールで洗浄することができる。それぞれに後処理した粒子は、好ましくは、懸濁液の形態で保存される。粒子は、例えば水、緩衝液またはアルコール中で保存することができる。

一実施形態によれば、熟成および／または乾燥ステップは実施されない。本発明に従って生成されたシリカ粒子は、好ましくは少なくとも１回洗浄した後に直接使用することができる。本発明の方法は、有利なことには、シリカ粒子を生成するためにスプレー乾燥機などの高価な装置を使用しない。

粒子表面の修飾
一実施形態によれば、得られたシリカ粒子、好ましくは磁性シリカ粒子であるシリカ粒子の表面は、それ以上修飾されない。しかし、本発明の範囲には、得られたシリカ粒子をさらに処理し、例えば粒子の表面を修飾することも包含される。非限定的な例を、以下に記載する。

一実施形態によれば、粒子は、シリカ表面をガラス表面に変換するために熱処置され、例えば焼結される。

一実施形態によれば、任意選択で前述の通りガラス表面であるシリカ粒子の表面は、修飾され、特に官能化される。例えば、本発明の範囲には、対象の標的を特異的または非特異的に結合できる適切な化学的官能基および／またはリガンドで、シリカ表面を官能化することが包含される。標的として、生体分子および細胞などの他の生物学的材料が挙げられるが、それらに限定されない。特異的な官能基および／またはリガンドとして、例えば特異的な細胞などの対象の生物学的材料を特異的に結合できる、タンパク質またはペプチドなどの化合物、核酸プローブまたは生物学的化合物を用いる官能化が挙げられるが、それらに限定されない。シリカ表面のためのそれぞれの官能化戦略は、従来技術において周知であり、したがって本明細書中では詳細な説明は必要ない。また、非限定的な例を以下に記載する。

一実施形態によれば、得られたシリカ粒子の表面は、粒子表面上に官能基を生じさせるために、化学的に修飾される。シリカ表面を官能化または修飾するのに適した方法は、当業者に周知であり、したがって本明細書中ではさらなる説明は必要ない。

一実施形態によれば、粒子の表面は、イオン交換部分、例えばアニオン交換部分もしくはカチオン交換部分で、または両方のタイプのイオン交換部分で修飾される。一実施形態によれば、表面は、アニオン交換部分で修飾される。アニオン交換部分は、例えばアミン基などのアニオン交換が可能な一つまたは複数の基を含む。適切な条件下、特に適切なｐＨ条件下では、アニオン交換部分は、アニオンと結合することができる。しかし、アニオン交換部分が、アニオンと会合する必要はない。アニオン交換部分は、固相の表面に結合している化合物または組成物の一部を形成し得る。好ましくは、表面は、一つまたは複数のアニオン交換基を含む一つまたは複数のアニオン交換部分で官能化される。「部分」という用語は、サイズに関していかなる制限も含まない。一つの部分が、一つより多くのアニオン交換基を含む場合、その一つの部分内に、同じまたは異なるアニオン交換基が存在していてもよい。適切なアニオン交換部分の例として、モノアミン、ジアミン、ポリアミン、および窒素含有芳香族基または脂肪族複素環式基、ならびに環状アミン、芳香族アミンおよび複素環式アミンが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、アニオン交換部分は、少なくとも一つの第一級、第二級および／または第三級アミノ基を含む。好ましい実施形態では、アニオン交換部分は、次式
Ｒ_３Ｎ、Ｒ_２ＮＨ、ＲＮＨ_２および／またはＸ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｙ
の第一級、第二級または第三級アミンを含むか、またはそれらからなり、
式中、
Ｘは、Ｒ_２Ｎ、ＲＮＨまたはＮＨ_２であり、
Ｙは、Ｒ_２Ｎ、ＲＮＨまたはＮＨ_２であり、
Ｒは、互いに独立に、好ましくはＯ、Ｎ、ＳおよびＰから選択される一つまたは複数のヘテロ原子を含むことができる、直鎖、分枝鎖または環式アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール置換基であり、
ｎは、０〜２０、好ましくは０〜１８の範囲の整数である。

したがって、アニオン交換部分は、アニオン交換基を含み、任意選択で、互いに同じであっても異なっていてもよい１個超のアニオン交換基を有することができる。アニオン交換基は、好ましくは、高ｐＨ値で中性または無電荷であり、低ｐＨ値ではプロトン化され、それによって正電荷を有する化学基である。アニオン交換基が正電荷を有するｐＨ値は、アニオン交換基のｐＫａ値に応じて決まる。アニオン交換基のｐＫａ値は、約７．５〜１４、８〜約１４、好ましくは約８．５〜約１３．５、８．７５〜１３、より好ましくは９〜１２．５、９．２５〜１２、９．５〜１１．５または約９．５〜約１１の範囲内にあってもよい。アニオン交換部分は、正イオン化可能であり、したがって低いｐＨ値から中程度のｐＨ値では既に正に帯電しているので、少なくとも８、好ましくは少なくとも８．５、より好ましくは少なくとも９、最も好ましくは少なくとも９．５のｐＫａ値が有利である。アニオン交換部分は、適切なｐＨ値において正イオン化可能であり、それによって、負に帯電している分子を引きつけ、結合し、特に核酸を引きつけ、結合することができる。

アミノ基は、環式置換基、および窒素原子と一緒になって複素環式環または芳香族複素環を形成する置換基を含めた、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび／または芳香族置換基を有することができる。置換基は、好ましくは１〜２０個の炭素原子、より好ましくは１〜１２個、１〜８個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１個もしくは２個の炭素原子を含む。置換基は、直鎖であっても分枝鎖であってもよく、ヘテロ原子、例えば酸素、窒素、硫黄、ケイ素およびハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）原子を含むことができ、同様に置換されていてもよい。好ましくは、置換基は、四つ以下、より好ましくは三つ以下、二つ以下または一つ以下のヘテロ原子を含む。一実施形態では、アニオン交換部分は、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、２〜８個または２〜６個のアミノ基を有する。

アニオン交換部分の具体例として、アミノメチル（ＡＭ）、アミノエチル（ＡＥ）、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルトリメトキシシラン（ＤＥＡＰＳ）、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、ペンタエチレンヘキサアミン、トリメチルアミノ（ＴＭＡ）、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）、直鎖または分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、カルボキシル化またはヒドロキシアルキル化ポリエチレンイミン、ジェファーミン、スペルミン、スペルミジン、３−（プロピルアミノ）プロピルアミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、Ｎ−モルホリノエチル、ポリリシン、およびテトラアザシクロアルカンが挙げられるが、それらに限定されない。好ましいアニオン交換部分として、ジアルキルアミノ基、特にジエチルアミノ基、または直鎖もしくは分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられる。直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、第一級、第二級および第三級アミノ基を含有する分岐ＰＥＩとは対照的に、第二級アミンを含有する。

一実施形態では、アニオン交換部分は、式
Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｎ、
Ｒ_１Ｒ_２Ｎ（ＣＨ２）_ｎＮＲ_３Ｒ_４、
Ｒ_１Ｒ_２Ｎ（ＣＨ２）_ｎＮＲ_３（ＣＨ２）_ｍＮＲ_４Ｒ_５、
Ｒ_１Ｒ_２Ｎ（ＣＨ２）_ｎＮＲ_３（ＣＨ２）_ｍＮＲ_４（ＣＨ２）_ｏＮＲ_５Ｒ_６
Ｒ_１Ｒ_２Ｎ（ＣＨ２）_ｎＮＲ_３（ＣＨ２）ｍＮＲ_４（ＣＨ２）_ｏＮＲ_５（ＣＨ２）_ｐＮＲ_６Ｒ_７
Ｒ_１Ｒ_２Ｎ（ＣＨ２）_ｎＮＲ_３（ＣＨ２）ｍＮＲ_４（ＣＨ２）_ｏＮＲ_５（ＣＨ２）_ｐＮＲ_６（ＣＨ２）_ｑＮＲ_７Ｒ_８
Ｒ_１Ｒ_２Ｎ（ＣＨ２）_ｎＮＲ_３（ＣＨ２）_ｍＮＲ_４（ＣＨ２）_ｏＮＲ_５（ＣＨ２）_ｐＮＲ_６（ＣＨ２）_ｑＮＲ_７（ＣＨ２）_ｒＮＲ_８Ｒ_９
Ｒ_１Ｒ_２Ｎ（ＣＨ２）_ｎＮＲ_３（ＣＨ２）_ｍＮＲ_４（ＣＨ２）_ｏＮＲ_５（ＣＨ２）_ｐＮＲ_６（ＣＨ２）_ｑＮＲ_７（ＣＨ２）_ｒＮＲ_８（ＣＨ２）_ｓＮＲ_９Ｒ_１０
［式中、
ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは、互いに独立に、２〜８であり得、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９およびＲ_１０は、同じであっても異なっていてもよく、Ｈ、アルキル（分枝鎖または非分枝鎖であり、飽和または不飽和であり、好ましくは１〜１０個のＣ原子を含む）およびアリールの群から選択される］
の第一級、第二級および第三級モノアミンおよびポリアミンからなる群から選択される実体を含む。

一実施形態では、アニオン交換部分は、Ｎ−プロピル−１，３−プロパンジアミンまたはペンタエチレンヘキサミンを含む。ある特定の実施形態では、アニオン交換部分は、スペルミンおよびスペルミジンから選択される。

本発明によれば、表面は、一より多くのタイプのアニオン交換部分を含むことができ、したがってそれらで官能化され得る。したがって、二つもしくは二つより多くの異なるアニオン交換部分が、表面上に存在することもできる。したがって、本発明の範囲には、表面が異なるアニオン交換部分の混合物を含むことが包含される。しかし、本発明の範囲には、主にまたは排他的に一つのタイプのアニオン交換部分を使用することも包含される。

アニオン交換部分などの官能基で表面を官能化するために、いくつかの方法が実行可能である。アニオン交換部分などの官能基は、共有結合もしくは非共有結合のいずれかにより、静電気的に表面に直接結合することができ、かつ／または表面コーティングを形成するか、もしくは固相の表面に提供されるポリマーもしくは他の組成物の一部を形成することができる。官能基は、固相上に沈殿させることもできる。一実施形態によれば、アニオン交換部分は、固相上にコーティングの形態で提供される。

一実施形態によれば、共有結合によるカップリング戦略が使用される。一実施形態によれば、固相は、その表面に、アニオン交換部分の共有結合性結合に適した官能基を含む。粒子表面は、カップリングに使用できるＳｉ−ＯＨ基を含む。アニオン交換部分のカップリングに使用される官能基は、固相に直接的に、または（直鎖または分枝鎖）スペーサもしくはリンカー基、例えば炭化水素、例えば−（ＣＨ_２）_ｎ−基、炭水化物、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを介して結合することができる。

一実施形態によれば、アニオン交換部分などの官能基は、シランを使用して上記表面にカップリングされる。シリカ表面をシランで修飾するための例は、Ｅ． Ｐｌｕｅｄｄｅｍａｎ（Ｓｉｌａｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年、８２〜８３頁）に見ることができる。一実施形態では、シリカ材料のシリカヒドロキシル基は、アルコキシシランと反応する。これが、粒子の表面を被覆する網目の生成を可能にする。なぜなら、アルコキシシランは、お互いと反応することができ、表面上のシラノール基とも反応できるからである。本発明の一実施形態では、粒子は、ただ一つのシランで修飾され、別の実施形態では、二つもしくは二つより多くのシランの混合物が使用される。本発明の好ましい一実施形態では、二つもしくは二つより多くのタイプのシランが使用され、ここで、少なくとも一つのタイプのシランは、例えば第一級、第二級、第三級または第四級アミンなどの核酸結合基を含み、少なくとも一つの他のタイプのシランは、無電荷である。結果として、粒子の「アミノ」表面は、無電荷の基で希釈され、それによって粒子の核酸結合特徴が修飾される。一実施形態によれば、シリカ粒子は、３−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル−トリアルコキシシランおよび３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシランで官能化される。

一実施形態によれば、アニオン交換部分は、第三級アミノ基、例えばジアルキルアミノ基、好ましくはジエチルアミノ基、例えばジエチルアミノプロピル基である。アニオン交換部分は、シラン基によって、すなわちシラン処理によって導入することができる。シリカ表面は、ジアルキルアミノシラン化合物、例えばジエチルアミノプロピルトリメトキシシランで誘導体化され得る。

本発明の別の実施形態では、官能基は、上記官能基を有するリガンドの非共有結合性結合によって導入される。好ましい一実施形態では、これらのリガンドは、モノアミンまたはポリアミン、より好ましくはスペルミンまたはスペルミジンである。

粒子表面を修飾するために使用できる適切な官能化戦略および官能基は、参照されるＷＯ２０１０／０７２８３４、ＷＯ２０１０／０７２８２１、ＤＥ１０ ２００８ ０６３ ００１Ａ１およびＤＥ１０ ２００８ ０６３ ００３にも記載されている。

本発明の一態様では、粒子は、例えばカルボキシル基などのカチオン交換基を有するために修飾することができる。好ましい一実施形態では、この目的で、アミノ官能化シリカ粒子が使用される。好ましくは、上記アミノ基は、それぞれのカルボキシアルキルアミドに対する酸無水物と反応することができる。あるいは、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリル酸、ポリメタクリル酸またはポリマレイン酸は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）のようなカルボジイミドまたはカルボニルジイミダゾールなどの活性化物質を添加することによって、アミノ基と反応することができる。他の官能化戦略も実行可能である。

粒子
本発明の生成方法を用いて得られるシリカ粒子は、３０μｍもしくはそれ未満、２５μｍもしくはそれ未満、２０μｍもしくはそれ未満、１５μｍもしくはそれ未満、１０μｍもしくはそれ未満、５μｍもしくはそれ未満、または３μｍもしくはそれ未満のサイズを有する。粒径に影響を及ぼす方法の適切なパラメータおよび変動は、先に記載されている。粒径は、粒子の直径に基づいて決定される。通常、５μｍもしくはそれ未満、好ましくは３μｍもしくはそれ未満のメジアン径を有する小さい粒子ほど、より高い核酸結合能を有する。一実施形態によれば、得られた粒子は、１００ｎｍ〜２５μｍ、２５０ｎｍ〜１５μｍ、５００ｎｍ〜１０μｍ、７５０ｎｍ〜７．５μｍ、１μｍ〜５μｍおよび１．５μｍ〜２．５μｍから選択されるサイズを有する。本発明の一実施形態では、粒子は、５０ｎｍ〜２５μｍ、好ましくは１００ｎｍ〜１０μｍ、より好ましくは１００ｎｍ〜５μｍ、最も好ましくは２５０ｎｍ〜３μｍのサイズを有する。本発明の方法によって、相対的に狭い粒径分布を有する粒子を得ることが可能となる。一実施形態によれば、粒径分布は、生成された粒子の約７０％、好ましくは８０％または９０％が、メジアン粒径について１０μｍの範囲内、メジアン粒径について７．５μｍの範囲内、より好ましくはメジアン粒径について５μｍの範囲内、またはメジアン粒径について２．５μｍの範囲内にあるような分布である。

前述の通り、本発明による方法によって得られる粒子は、好ましくは、凝集したＳｉＯ_２コーティングされたコア粒子によって形成される。それによって、多孔質シリカ粒子が提供される。これらの多孔質シリカ粒子は、間隙中の、凝集したＳｉＯ_２コーティングされたコア粒子間に形成されるマクロ孔を有することができる。さらに好ましくは、表面は、ミクロ孔も含む。本発明の多孔質粒子は、総表面積が大きく、これは、窒素Ｂｒｕｎａｕｒ Ｅｍｍｅｔ Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）方法によって測定することができる。多孔質材料の細孔径のＩＵＰＡＣ定義および特徴付けに関する情報は、例えばＰｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ．、６６巻、８号、１７３９〜１７５８頁、１９９４年に記載されている。

本発明による方法によって、コア粒子がＳｉＯ_２コーティングによって本質的に完全に取り囲まれ、したがって被包されている粒子がもたらされる。これによって、コア粒子の、取り囲む媒体への曝露が防止される。酸化鉄コアを有する粒子の場合、これによって、有利なことには粒子からの実質的な量の酸化鉄の放出が防止される。

本発明の一実施形態では、本発明の方法によって調製された磁性シリカ粒子は、含まれているＳｉＯ_２および酸化鉄に関して、約１５〜７５％（重量）の酸化鉄および約２５％〜８５％（重量）のＳｉＯ_２、好ましくは２０〜５０％（重量）の酸化鉄および約５０〜８０％（重量）のＳｉＯ_２、より好ましくは２５〜５０％（重量）の酸化鉄および約５０〜７５％（重量）のＳｉＯ_２である組成を有する。一実施形態によれば、酸化鉄としてＦｅ_３Ｏ_４が使用される。反応組成物における酸化鉄コア粒子およびシリケートの濃度は、得られる磁性シリカ粒子におけるそれぞれの組成を達成するように調整される。酸化鉄／ＳｉＯ_２について説明した比は、その比によって、得られる粒子の十分に強力な磁性特性と、磁性粒子の（望ましくない）凝集の防止との間で平衡が達成されるので、有利である。説明した比は、一般に、コア粒子／ＳｉＯ_２の比にも適用される。コア粒子に関する詳細は、先に記載されており、ここでも、適用される前述の開示が参照される。

先に論じた通り、粒子は、他の化合物、例えば他の金属の酸化物を含むこともできる。一実施形態によれば、ＳｉＯ_２コーティングは、少なくとも８０重量％（乾燥ベース）のＳｉＯ_２、好ましくは少なくとも９０重量％のＳｉＯ_２、より好ましくは９５重量％〜１００重量％のＳｉＯ_２を含む。例えば、ＳｉＯ_２コーティングは、コーティングの形成に関連するアルカリ金属イオンを含有することができるが、コーティングは、好ましくは、アルカリ金属酸化物として測定される約１．５重量％未満、より好ましくは約１重量％未満、より好ましくは約０．５重量％未満、最も好ましくは０．２重量％未満のアルカリ金属を含有する。

好ましい一実施形態では、本発明の方法によって調製された磁性シリカ粒子は、粒子１ｍｇ当たり少なくとも１μｇの核酸、粒子１ｍｇ当たり少なくとも２μｇの核酸分子、粒子１ｍｇ当たり少なくとも５μｇの核酸分子、粒子１ｍｇ当たり少なくとも７．５μｇの核酸分子、粒子１ｍｇ当たり少なくとも１０μｇの核酸分子、粒子１ｍｇ当たり少なくとも１２．５μｇの核酸分子、粒子１ｍｇ当たり少なくとも１５μｇの核酸分子、粒子１ｍｇ当たり少なくとも１７．５μｇの核酸分子、より好ましくは粒子１ｍｇ当たり少なくとも２０μｇの核酸分子と結合する。実施例に示されている通り、本発明の教示に従って生成されたシリカ粒子によって、従来技術のシリカ粒子の結合能よりもさらに高い結合能が達成される。一実施形態によれば、核酸結合能は、実施例６に記載の方法を使用して決定される。この方法は、非磁性粒子を試験するために使用することもできる。非磁性シリカ粒子をアッセイする場合、シリカ粒子は、沈降または遠心分離を手段として分離することができる。

一実施形態によれば、本発明のシリカ粒子を使用して単離される核酸の収率は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％である。

したがって、第２の態様によれば、本開示は、凝集したＳｉＯ_２コーティングされたコア粒子によって形成される、３０μｍまたはそれ未満のサイズを有する多孔質シリカ粒子を提供し、ここでコア粒子は、ＳｉＯ_２コーティングによって本質的に被包されており、シリカ粒子は、含まれているＳｉＯ_２およびコア粒子に関して、１５〜７５％（重量）のコア粒子および２５％〜８５％（重量）のＳｉＯ_２である組成を有し、シリカ粒子は、粒子１ｍｇ当たり少なくとも１２．５μｇの核酸分子を結合することができる。粒子のサイズ（直径に基づいて決定される）、コア粒子、核酸結合能およびその結合能を決定する方法に関する詳細、ならびに含まれているＳｉＯ_２およびコア粒子に関するシリカ粒子の組成は、先に記載されており、ここでも、適用される前述の開示が参照される。非限定的な実施形態を、再び以下に簡潔に記載する。

一実施形態によれば、シリカ粒子は、粒子１ｍｇ当たり少なくとも１２．５μｇの核酸分子、粒子１ｍｇ当たり少なくとも１５μｇの核酸分子、または粒子１ｍｇ当たり少なくとも１７．５μｇの核酸分子と結合することができる。実施例によって示される通り、本発明のシリカ粒子は、粒子１ｍｇ当たり少なくとも２０μｇもの核酸分子と結合することができる。この並外れて高い核酸結合能は、従来技術によるシリカ粒子を上回る重要な利点である。前述の通り、一実施形態によれば、粒子の核酸結合能は実施例６に記載の通り決定される。

多孔質シリカ粒子は、マクロ孔を含むことができる。一実施形態によれば、粒子の表面は、ミクロ孔をさらに含む。ミクロ孔およびマクロ孔は、ＩＵＰＡＣによって記載されている通り決定され得る（上記参照）。一実施形態によれば、粒子は、２５μｍもしくはそれ未満、２０μｍもしくはそれ未満、１５μｍもしくはそれ未満、１０μｍもしくはそれ未満、５μｍもしくはそれ未満、または３μｍもしくはそれ未満のサイズを有する。適切なサイズの範囲も、先に記載されている。シリカ粒子は、５０ｎｍ〜２５μｍ、１００ｎｍ〜１０μｍ、１００ｎｍ〜５μｍまたは２５０ｎｍ〜３μｍの範囲内にあるサイズを有することができる。

一実施形態によれば、多孔質シリカ粒子は、含まれているＳｉＯ_２およびコア粒子に関して、２０〜５０％（重量）のコア粒子および約５０〜８０％（重量）のＳｉＯ_２、好ましくは２５〜５０％（重量）のコア粒子および約５０〜７５％（重量）のＳｉＯ_２（上記も参照）である組成を有する。一実施形態によれば、シリカ粒子は、非修飾シリカ表面を有する。

一実施形態によれば、含有されているコア粒子は、磁性特性を有する。例えば、コア粒子は、超常磁性、常磁性、強磁性またはフェリ磁性特性を有することができる。適切な材料は、先に詳細に説明されている。一実施形態によれば、粒子は、コア粒子として、酸化鉄、好ましくは磁鉄鉱および／または磁赤鉄鉱を含む。一実施形態によれば、好ましくは磁性であるコア粒子は、８〜１５０ｎｍ、１０〜１００ｎｍおよび１０ｎｍ〜６０ｎｍから選択される範囲内にある直径を有する。

前述の通り、第２の態様によるシリカ粒子は、第１の態様による方法によって得ることができる。第１の態様による上記方法に関する詳細は、先に記載されており、先の開示が参照される。粒子は、それらの高い核酸結合能に起因して、好ましくは核酸を単離するために使用される。

粒子の使用
第３の態様によれば、本開示は、様々な試料から生体分子を単離するため、特に核酸を単離するための、第１の態様による方法に従って生成されたシリカ粒子の使用、または第２の態様によるシリカ粒子の使用に関する。

本発明による方法を用いて生成された粒子、ならびに第２の態様による粒子は、基本的に、あらゆる分野、特に、生体分子、細胞または細胞小器官などの生物学的材料の単離、分析的、法医学的、診断的または医学的適用を含むが、それらに限定されない生命科学のあらゆる分野において使用できる。

本発明による方法によって得られたシリカ粒子は、核酸などの生体分子と結合する高い能力を有し、それによって本発明の粒子は、様々な試料および混合物から核酸分子などの生体分子を単離または分離するのに特に有用となる。単離される生体分子は、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、脂質、およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。特に、本発明に従って生成された粒子は、核酸を単離するのに適している。

続いて、試料から核酸を単離するための本発明の方法によって生成された粒子の使用について、さらに詳細に説明する。これに関して「試料」という用語は、広範な意味で使用され、核酸を含有する様々な供給源を含むことを企図する。試料は、生物学的試料であってもよいが、この用語には、他の試料、例えば核酸を含む人工試料、例えば核酸を含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ反応混合物、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列決定反応、制限エンドヌクレアーゼまたは他のヌクレアーゼ消化反応、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ混合物、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および／または翻訳アッセイ混合物、ならびに増幅反応も含まれる。好ましくは、試料は生物学的試料である。例示的な生物学的試料としては、組織（例えば、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、脂肪、膵臓が挙げられるが、これらに限定されない）、細胞、細胞培養物、一般に体液；全血；血清；血漿；赤血球；白血球；軟膜、腫瘍細胞、胎児細胞、宿主および移植細胞；スワブ（例えば、頬側スワブ、喉スワブ、膣内スワブ、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、喉スワブ、直腸スワブ、病変スワブ、膿瘍（ａｂｃｅｓｓ）スワブ、および鼻咽頭スワブ等が挙げられるが、これらに限定されない）；尿；喀痰；唾液；精液；リンパ液；液；羊水；脳脊髄液；腹水；胸水；嚢胞からの流体；滑液；硝子体液；眼房水；滑液包流体（ｂｕｒｓａ ｆｌｕｉｄ）；洗眼液；眼吸引液（ｅｙｅ ａｓｐｉｒａｔｅ）；肺洗浄；肺吸引液；骨髄吸引液、懸濁状態の細胞、ならびにライセート、抽出物、または試料上もしくは試料中に存在し得る任意の細胞および微生物およびウイルスから得られた材料等が挙げられるが、これらに限定されない。臨床的または法医学的な設定から得られた核酸含有材料も、生物学的試料という用語の企図される意味に含まれる。さらに当業者は、上記の例示的試料のいずれから得られたライセート、抽出物、または材料もしくはそれらの部分も、試料という用語の範囲内に包含されることを理解する。好ましくは、試料は、ヒト、動物、植物、細菌または真菌に由来する生物学的試料である。試料は、原核生物起源のものであっても真核生物起源のものであってもよい。特に「試料」という用語は、細胞も含む核酸含有試料を指す。好ましくは、試料は、細胞、組織、例えば血液などの体液、血液製剤、例えば軟膜、血漿および血清、尿、液、喀痰、糞便、ＣＳＦおよび精子、上皮スワブ、生検、骨髄試料、ならびに多様な組織試料からなる群から選択される。生物学的試料は、貯蔵され得、例えば貯蔵媒体に含有され得る。例えば、核酸が単離される試料は、保存剤中で保存されていたものであってよく、例えば、パラフィン包埋組織試料、ならびに液体ベースの細胞診断媒体、例えばＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）またはＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（登録商標）に保存されている細胞性および組織試料または細胞試料を含むが、これらに限定されない。例えばタンパク質などの他の生体分子も、対象のそれぞれの生体分子を含む、先に列挙した試料から単離することができる。

一つまたは複数の「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、特に、典型的にサブユニット間のホスホジエステル結合によって、ある場合にはホスホロチオエートおよびメチルホスホネート等によって、共有結合により結合したリボヌクレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレオシドを含む高分子を指す。ＤＮＡとしては、あらゆるタイプのＤＮＡ、例えばｇＤＮＡ；環状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよび循環ＤＮＡが挙げられるが、それらに限定されない。ＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｈｎＲＮＡ；ｍＲＮＡ；細胞外ＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば限定されるものではないが、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）、ｌｉｎｃＲＮＡ（長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（低分子核内ＲＮＡ）およびｓｔＲＮＡ（小分子ＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ）、ｔｉＲＮＡ（転写開始ＲＮＡ）、ＰＡＳＲ（プロモーター関連（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ＲＮＡ）、ＣＵＴ（不安定な潜在性転写物（ｃｒｙｐｔｉｃ ｕｎｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ））が挙げられる。核酸として、二本鎖および／または一本鎖核酸を挙げることができ、これらの核酸は、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、または一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。核酸は、修飾ヌクレオチドを含むことができる。本明細書で使用される場合、修飾ヌクレオチドは、構造的に変化させられており、その結果、天然に生じるヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである。このような修飾ヌクレオチドとして、修飾糖部分、修飾ホスフェート部分および／または修飾核酸塩基を含有するヌクレオチドが挙げられる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、リボザイム、アプタマー、スピエゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）、および化学的に合成された核酸分子も挙げられる。

生体分子、例えば核酸または細胞などの他の標的を単離するために、本発明に従って生成された磁性粒子を使用することが特に好ましい。標的の特異的捕捉を可能にするために、シリカ粒子は、それぞれの特異的捕捉を可能にする適切な化学的官能基またはリガンド（上記参照）を用いて官能化され得る。磁性粒子の磁性特性により、当技術分野で利用可能な様々な磁気収集系のいずれかを使用して、外部磁場を印加することで粒子を試料または混合物から容易かつ急速に収集することができる。

シリカ粒子を使用して核酸などの生体分子を単離するのに適した方法は、当業者に周知であり、したがって本明細書中では詳細な説明は必要ない。核酸をシリカ粒子に結合させ、また特異的なタイプの核酸と選択的に結合するのに適した方法は、例えば、ＥＰ０ ３８９ ０６３、ＥＰ０ ８８０ ５３７およびＷＯ９５／２１８４９およびＷＯ０１／７１７３２に記載されている。一般に、本発明の粒子は、シリカ粒子を用いて実施することができる任意の核酸単離方法において使用することができる。また、非限定的な例を以下に記載する。

本発明の一態様によれば、
−試料に含有されている核酸を、本発明の第１の態様による方法に従って生成されたシリカ粒子に、適切な条件下で結合させるステップと、
−結合した核酸を有する粒子を、非結合構成成分から分離するステップと、
−任意選択で、結合した核酸を洗浄するステップと、
−任意選択で、結合した核酸を溶出するステップと
を含む、試料から核酸を単離する方法が提供される。

試料が、対象の核酸を使用可能な形態で含有していない場合、核酸を、最初に例えば試料を溶解させることによって放出させることができる。試料の溶解を達成するために、異なる方法を使用することができ、適切な溶解方法は、従来技術で周知である。「溶解」という用語は、本明細書で使用される場合、試料またはその一部もしくは画分の破壊、分解および／または消化を指す。それぞれの溶解ステップでは、特に核酸などの生体分子を細胞から放出させることができるか、または例えばタンパク質などの他の試料添加剤から遊離させることができる。本明細書では、特に核酸などの生体分子が細胞から放出されるかどうか、または核酸などの生体分子を、例えば試料に含まれるタンパク質もしくは他の物質から放出させるために溶解を実施するかどうかに関わらず、試料を破壊、分解かつ／または消化するそれぞれのステップは、一般に溶解ステップと呼ばれる。したがって試料は、細胞を含む場合があるか、または、例えば血漿を用いる場合などと同様に、細胞を全く含まないか、もしくはほんの少量しか細胞を含まない場合がある。好ましくは、溶解させるために、試料を一つまたは複数の溶解剤と接触させる。ＲＮＡなどの核酸は、溶解中にヌクレアーゼによる分解から保護され得る。選択される溶解条件は、処理される試料のタイプに応じても変わってもよい。一般に、溶解手順には、試料に対する機械的、化学的、物理的および／または酵素的な作用が含まれ得るが、それらに限定されない。例として、ビーズミルによるもしくはガラスビーズの存在下での試料の粉砕、試料のホモジナイズ、超音波の適用、加熱、一つもしくは複数の洗浄剤の添加、および／または例えばタンパク質を分解する酵素もしくは塩などのタンパク質を分解する化合物の添加が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、例えばベータ−メルカプトエタノールまたはＤＴＴなどの還元剤を溶解のために添加して、例えばヌクレアーゼの変性を促進することができる。シリカ粒子を使用して生物学的試料から核酸を単離するために、試料の溶解中に、少なくとも一つのカオトロピック剤、好ましくは少なくとも一つのカオトロピック塩を使用することが好ましい。適切なカオトロピック剤、特にカオトロピック塩は、周知であり、以下にも記載されている。さらに溶解中に、例えばキレート剤、ヌクレアーゼ阻害剤、特にＲＮａｓｅ阻害剤またはＤＮａｓｅ阻害剤（特に、ＲＮＡおよびＤＮＡの同時並行の単離が企図される場合）、および洗浄剤等の他の添加剤を添加することもできる。試料の溶解を支持し、放出された核酸、特に放出されたＲＮＡを保護するために使用することができるそれぞれの添加剤は、従来技術で周知であり、したがって本明細書で詳説する必要はない。

核酸は、粒子への核酸の結合を促進する塩の存在下で、本発明の方法によって生成されたシリカ粒子に結合することができる。これらの条件下で、核酸は、非修飾シリカ表面にも結合する。好ましくは、一つまたは複数のカオトロピック剤、特にカオトロピック塩が、結合中に存在する。それぞれのカオトロピック塩は、溶解のため、および／または結合混合物中の適した結合条件を確立するために添加され得る。カオトロピック剤として、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、過塩素酸アンモニウムまたは他の過塩素酸塩を含有するカオトロピック塩、塩酸グアニジウム、イソチオシアン酸グアニジウム、イソチオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジウム、チオシアン酸カリウムまたは他のグアニジウムを含有するカオトロピック塩、チオシアン酸塩を含有するカオトロピック塩および／またはイソチオシアン酸塩を含有するカオトロピック塩、ヨウ化カリウム、ヨウ化カリウムまたはヨウ化ナトリウムまたは他のヨウ化物を含有するカオトロピック塩、および尿素が挙げられるが、それらに限定されない。カオトロピック剤は、結合のために、好ましくは１〜８Ｍの範囲、より好ましくは１．５〜５Ｍの範囲、最も好ましくは２〜４Ｍの範囲の濃度で使用され得る。しかし、シリカ表面への核酸の結合を促進するために、他の塩、特に非カオトロピック塩を使用することもできる。核酸がカオトロピック剤の非存在下でシリカ表面に結合するそれぞれの方法は、従来技術では周知であり、したがって本明細書中ではさらなる説明は必要ない。

さらに、シリカ表面への核酸の結合を促進するために、アルコール、例えばＣ１〜Ｃ５脂肪族アルコール、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、またはそれらの組合せを使用することができる。ＲＮＡを単離する場合には、アルコールを使用することが特に好ましい。アルコールは、１〜８５％（ｖ／ｖ）、好ましくは１５％〜７５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは２０％〜７０％（ｖ／ｖ）の濃度で結合混合物に含まれ得る。さらに、結合混合物は、洗浄剤を含むことができる。塩および／またはアルコールの濃度は、核酸がシリカ粒子に選択的に結合するように調整することができる。さらに、カオトロピック塩および／またはアルコールの濃度を調整することによって、互いに異なる長さの核酸を分離することが可能である。

次に、結合した核酸は、非結合構成成分から分離される。分離は、濾過、沈降または遠心分離などの任意の手段によって達成することができる。次に、上清は破棄することができる。磁性シリカ粒子が使用される場合、磁場の助力により分離を達成することができる。磁性粒子を処理するのに適した方法は、当業者に周知であり、したがって本明細書では任意のさらなる説明は必要ない。

所望に応じて、一つまたは複数の洗浄ステップを実施することができる。適切な洗浄溶液は、従来技術で公知である。洗浄溶液は、アルコール、他の揮発性が高い有機溶媒、例えばアセトン、およびさらに一つまたは複数のカオトロピック剤を含有することができる。洗浄するために水を使用してもよい。

核酸分子をさらに利用することが適している場合、核酸分子を粒子から溶出することができる。溶出では、水、低塩濃度の水溶液、トリス緩衝液および他の適切な溶出溶液を使用することができる。しかし、いくつかの適用では、核酸を溶出する必要はない。例えば、結合した核酸を保持しているシリカ粒子は、分析的反応、例えばハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅反応に直接供することもできる。

本発明の別の態様では、アニオン交換体で修飾された粒子は、核酸の精製に使用され、それによって核酸は、第１のｐＨ値で結合し、任意選択で脱イオン水または低塩濃度緩衝液（ｌｏｗ ｓａｌｔ ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄され、第１のｐＨ値よりも高い第２のｐＨ値で溶出される。したがって、本発明の方法によって生成された、それぞれに官能化されたシリカ粒子は、電荷の転換に基づく単離手法を利用して核酸を単離するために使用され得る。一実施形態によれば、３−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル−トリアルコキシシランおよび３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシランの混合物でコーティングされた粒子は、ｐＨ値６でＤＮＡおよびＲＮＡと結合することができ、不純物は、脱イオン水で洗浄することによって除去することができ、結合した核酸は、ｐＨ値が８．０以上の溶出緩衝液を使用することによって溶出される。それぞれに修飾された粒子を使用する適切な核酸単離方法は、ＷＯ２０１０／０７２８３４、ＷＯ２０１０／０７２８２１、ＤＥ１０ ２００８ ０６３ ００１Ａ１およびＤＥ１０ ２００８ ０６３ ００３に記載されている。

本発明のさらなる一態様では、カルボキシレート官能化粒子は、例えばＵＳ５，７０５，６２８に開示されている通り、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘発性沈殿に使用され得る。この方法は、核酸がＰＥＧの存在下で沈殿し、親水性表面に結合するという原則に基づくものである。この目的では、実施例に示されている通り、シリカ表面を有する非修飾粒子を使用することもできる。

本明細書に記載のシリカ粒子は、様々な分子、特に核酸に対して比較的高い結合能を有し、したがって粒子は、混合物から分子を有用な収率で単離または分離するのに有用である。粒子は、分析手順ならびに調製規模の手順の両方で使用することができる。特定の多孔性、結合能、および結合特異性を有する粒子を、本発明に従って、様々な合成反応パラメータを選択的に変更することによって得ることができる。

本明細書に記載の数値範囲は、その範囲を規定する両端の数を含む。本明細書に記載の見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を制限するものではなく、これらは、本明細書を全体として参照することによって読み取ることができる。「溶液」という用語は、本明細書で使用される場合、特に液体組成物、好ましくは水性組成物を指す。溶液は、一相だけの均質な混合物であり得るが、本発明の範囲には、本発明に従って使用される溶液が、例えば沈殿物などの固体構成成分を含むことも包含される。一実施形態によれば、方法の場合にはある特定のステップを含むものとして、または組成物、溶液および／もしくは緩衝液の場合にはある特定の成分を含むものとして本明細書に記載されている主題は、それぞれのステップまたは成分からなる主題を指す。本明細書に記載の好ましい実施形態を選択し、組み合わせることが好ましく、好ましい実施形態のそれぞれの組合せから生じる特定の主題も、本開示に属する。

本発明は、本明細書に開示されている例示的な方法および材料によって制限されない。

（実施例１）
磁性シリカ粒子の１ステップ調製

工程用水１４リットルを、パドルミキサーを備えた２０リットルの二重壁反応器に入れ、窒素で十分にフラッシュし、５００ｒｐｍで撹拌しながらＫＯＨ２２８ｇと共に懸濁させる。５００ｒｐｍで継続的に撹拌することによって、２×６００ｍｌの体積の脱イオン水中に塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｒｔ．ｎｏ．４４９４４）２×１０９．５ｇおよび塩化鉄（ＩＩ）四水和物（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｒｔ．ｎｏ．４４９３９）２×４０．３２ｇを含む、アルゴンでフラッシュした混合物を添加し、窒素を供給しながら１５０ｒｐｍでさらに２時間撹拌する。その後、クエン酸ナトリウム一水和物（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｒｔ．ｎｏ．７１４０２）１５ｇおよびケイ酸カリウム溶液（ＫａＳｉｌ、Ｃｏｇｎｉｓ ＡＧ、今日ではＢＡＳＦ：Ａｒｔ．ｎｏ．１７００）１５ｍｌを添加し、２５０ｒｐｍで１５分間撹拌する。次に、水酸化カリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｒｔ．ｎｏ．６０３６８）１６１．２ｇ、ケイ酸カリウム溶液３００ｍｌおよびホルムアミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｒｔ．ｎｏ．４７６７０）４０５ｍｌを懸濁液に入れ、窒素の供給を停止した後、懸濁液を２５０ｒｐｍで終夜撹拌する。

１７時間後、反応物全体をさらに処理する。ｐＨ値を分析し、反応混合物を、容積容量２リットルの８つの遠心分離バケットを使用して処理する。懸濁液１５００ｍｌを、遠心分離バケットのそれぞれに充填する。充填したバケットを撹拌し、長時間磁化した後、上清をデカントする。ビーズ懸濁液を、脱イオン水で５回洗浄する。次に、遠心分離バケットを、超音波浴内で２分間、超音波処理する。脱イオン水による２回の追加の洗浄ステップの後、磁性粒子を、脱イオン水中で保存するために一つまたは複数のＮａｌｇｅｎｅボトル中に貯める。

反応中、ｐＨ値は１４から１０．７４に低下した。こうして調製された粒子は、２０μｍの平均サイズを有する。例えば、５〜１０μｍの範囲内にあるメジアン径を有するより小さい粒子は、シリケート濃度を低減し、かつ／またはステアリング速度を増大させることによって得ることができる。

（実施例２）
磁性シリカ粒子の２ステップ調製

工程用水１リットルを、プロペラミキサーを備えた溶解機反応器（ＶＭＡ Ｇｅｔｚｍａｎｎ、Ｒｅｉｃｈｓｈｏｆ−Ｂｅｒｇｎｅｕｓｔａｄｔ、ドイツ）に入れ、シトレートで安定化した磁鉄鉱（例えば、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ａｒｔ．ｎｏ．４４６６５）５ｇ（Ｆｅ_３Ｏ_４重量に関して）を、２０００ｒｐｍで溶液にゆっくり懸濁させる。２０００ｒｐｍで継続的に撹拌しながら、クエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｒｔ．ｎｏ．２７４９０）１ｇおよびケイ酸カリウム溶液１ｍｌを添加し、懸濁液をさらに１５分間撹拌する。その後、水酸化カリウム１３．７５ｇ、ケイ酸カリウム溶液（ＫａＳｉｌ、Ｃｏｇｎｉｓ ＡＧ、今日ではＢＡＳＦ：Ａｒｔ．ｎｏ．１７００）２５ｇおよびホルムアミド３０ｇを懸濁液に入れ、次に２０００ｒｐｍで終夜撹拌する。１６時間および１７時間後に、懸濁液２５ｍｌを除去し、１８時間後に完全な反応混合物を処理する。この目的では、ｐＨ値を決定し、工程用水１リットルをビーズ懸濁液に添加し、２０００ｒｐｍでさらに１０分間撹拌する。さらなる処理を、容積容量２リットルの遠心分離バケットで実施する。遠心分離バケットに懸濁液１０００ｍｌを入れ、撹拌し、長時間磁化した後、上清をデカントする。磁性沈殿物をＮａｌｇｅｎｅボトルに貯め、脱イオン水で３回、工業グレードのエタノールで２回、脱イオン水でもう１回洗浄する。ビーズ懸濁液を、脱イオン水で保存する。

反応中、ｐＨ値は１４から１０．６４に低下した。こうして調製された粒子は、２．５μｍの平均サイズを有する（Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ、体積の観点から）。

（実施例３）
アニオン交換体表面による磁性シリカ粒子の修飾（均一なシラン化（ｓｉｌａｎｉｓａｔｉｏｎ））

修飾されるシリカ粒子を含むビーズ懸濁液５００ｍｇを取り出し、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ管にピペットで注入し、脱イオン水１０ｍｌで４回洗浄し、３分間磁化した後、上清を分離する。次に、脱イオン水５．７５ｍｌ、ＱＳＰ１緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウムを含有し、ｐＨ５．６）７５０μｌおよびジエチルアミノプロピル−トリメトキシシラン３０μｌを添加する。混合物を十分にボルテックスし、エッペンドルフ振とう器で１０００ｒｐｍにおいて、９５℃の温度で４時間インキュベートする。その後、ビーズを脱イオン水１０ｍｌで３回、無水エタノール１０ｍｌで２回、最後に脱イオン水１０ｍｌで３回洗浄する。洗浄ステップを、ビーズを簡単にボルテックスし、約５分間磁気分離した後に洗浄溶液を除去することによって実施する。その後、ビーズをＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ｐＨ６．１）２ｍｌに再懸濁させる。

（実施例４）
アニオン交換体表面による磁性シリカ粒子の修飾（混合シラン化）

修飾されるシリカ粒子を含むビーズ懸濁液５００ｍｇを取り出し、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ管にピペット注入し、脱イオン水１０ｍｌで４回洗浄し、３分間磁化した後、上清を分離する。その後、脱イオン水５．７５ｍｌ、１Ｍ酢酸ナトリウム７５０μｌ、ｐＨ５．５、ジエチルアミノプロピル−トリメトキシシラン７．１μｌおよび３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン１８．７５μｌを添加する。混合物を十分にボルテックスし、エッペンドルフ振とう器にて、１０００ｒｐｍで、９５℃の温度で４時間インキュベートする。その後、ビーズを脱イオン水１０ｍｌで３回、無水エタノール１０ｍｌで２回、最後に脱イオン水１０ｍｌで３回洗浄する。洗浄ステップを、ビーズを簡単にボルテックスし、約５分間磁気分離した後に洗浄溶液を除去することによって実施する。その後、ビーズをＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．１）２ｍｌに再懸濁させる。

（実施例５）
ポリカルボキシレート表面による磁性シリカ粒子の修飾

修飾されるシリカ粒子を含むビーズ懸濁液５００ｍｇを、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ管にピペットで注入し、脱イオン水１０ｍｌで４回洗浄し、磁気分離した後、上清を除去する。その後、脱イオン水５．７５ｍｌ、１Ｍ酢酸ナトリウム７５０μｌ、ｐＨ５．５、３−アミノプロピル−トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）５０μｌを添加する。混合物を十分にボルテックスし、エッペンドルフ振とう器にて、１０００ｒｐｍで、９５℃の温度で４時間インキュベートする。その後、磁気分離後に上清を除去し、ビーズを脱イオン水１０ｍｌで３回、無水エタノールで２回、最後に脱イオン水で３回洗浄する。洗浄ステップを、ビーズを短時間ボルテックスし、磁気分離した後に洗浄溶液を除去することによって実施する。ボルテックスすることによって、ビーズをポリアクリル酸緩衝液（１ｇ／１００ｍｌのポリアクリル酸を含有し、ｐＨ７．５）２０ｍｌ中に再懸濁させ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）２５０ｍｇを添加する。懸濁液をボルテックスし、超音波によって手短に脱揮発処理し（ｄｅｖｏｌａｔｉｌｉｓｅｄ）、室温で６０分間インキュベートする。最後に、懸濁液を１０ｍＭトリス、ｐＨ８．５で２回、脱イオン水で３回洗浄する。反応生成物をＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．１）で保存する。

（実施例６）
カオトロピック結合緩衝液を用いて核酸を精製するための磁性シリカ粒子の使用

実施例２に従って調製した磁性粒子１ｍｇを、５Ｍ塩酸グアニジウム、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、および３０％イソプロパノールを含有する緩衝液（ｐＨ５．０）１００μｌに添加する。次に、２〜２０μｇのプラスミドｐＵＣ２１を添加する。反応混合物を、エッペンドルフ振とう器にて、１０００ｒｐｍで、室温で１０分間振とうし、磁気分離した後、上清を除去する。その後、ビーズを、８０％エタノール、１０ｍＭトリスを含有する洗浄緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌで２回洗浄する。洗浄ステップを、ビーズを１０００ｒｐｍで１０分間振とうし、磁気分離した後に洗浄緩衝液を除去することによって実施する。最後の洗浄ステップの後、残留エタノールが磁気分離器中に残っているので、それを除去するために、反応管を１０分間上下逆にする。溶出を、溶出緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．５）１００μｌを添加し、懸濁液を１０００ｒｐｍで１０分間振とうすることによって実施する。磁気分離の後、溶出物を除去し、溶出物のＤＮＡ含量を、光分析およびゲル電気泳動分析によって決定する。

結果
図１に示したゲル電気泳動分析によって、分解の徴候なしにＤＮＡの量依存性単離が明らかになる。ゲル電気泳動分析および光分析（図２参照）では、本発明の教示に従って調製したシリカビーズ１ｍｇによって、ＤＮＡ少なくとも２０μｇを精製できることが実証される。

（実施例７）
核酸を精製するためのアニオン交換体で修飾した磁性シリカ粒子の使用

粒子ＮＢ−１２〜ＮＢ−１５を、同じ合成によって（実施例２参照）得たが、ただし１６時間（ＮＢ−１２）、１７時間（ＮＢ−１３）および１８時間（ＮＢ−１５）の反応時間が経過した後に得た。磁性粒子（実施例２に従って調製し、実施例４に従って修飾した）０．５ｍｇを、２５ｍＭのＭＥＳを含有するＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）１００μｌに添加する。その後、５μｇ、１０μｇまたは１５μｇのプラスミドｐＵＣ２１を添加する。混合物を、エッペンドルフ振とう器にて、１０００ｒｐｍで、室温で１０分間振とうし、磁気分離後に上清を除去する。次に、ビーズを脱イオン水１００μｌで２回洗浄する。洗浄ステップを、ビーズを１０００ｒｐｍで１０分間振とうし、磁気分離した後に洗浄溶液を除去することによって実施する。溶出を、溶出緩衝液（１００ｍＭトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５）１００μｌを添加し、懸濁液を１０００ｒｐｍで１０分間振とうすることによって実施する。磁気分離の後、溶出物を除去し、溶出物のＤＮＡ含量を、光分析およびゲル電気泳動分析によって決定する。

結果
ゲル電気泳動分析を図３に示す。ここで、ビーズにＤＮＡを結合させた後に得られた上清（ＳＮ）を分析した。図に示す通り、ＤＮＡのほとんどは、使用した結合条件下でビーズに効率的に結合した。さらに、溶出物（Ｅ）を分析した。この結果は、ビーズ０．５ｍｇが、プラスミドＤＮＡ５〜１５μｇの効率的精製を可能にしたことを実証する。

（実施例８）
ポリエチレングリコールを用いる核酸の精製に関してポリカルボキシレートで修飾した磁性シリカ粒子と比較した、非修飾磁性シリカ粒子の使用

磁性粒子（実施例１に従って調製した非修飾粒子（ＵＮＭ）または実施例５に従ってカルボキシル基で修飾した粒子（ＭＣ）のいずれか）１ｍｇを、２０％ＰＥＧ６００、１ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシンを含有する結合緩衝液（ｐＨ４．０）１００μｌに懸濁させる。その後、１０ｍＭトリスを含有する緩衝液（ｐＨ８．５）中、２μｇのプラスミドｐＵＣ２１を添加する。反応混合物を、エッペンドルフ振とう器にて、１０００ｒｐｍで、室温で１０分間振とうし、磁気分離後に上清を除去する。その後、ビーズを、８０％エタノール、１０ｍＭトリスを含有する洗浄緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌで２回洗浄する。洗浄ステップを、ビーズを１０００ｒｐｍで１０分間振とうし、磁気分離した後に洗浄溶液を除去することによって実施する。溶出を、溶出緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．５）１００μｌを添加し、懸濁液を１０００ｒｐｍで１０分間振とうすることによって実施する。磁気分離の後、溶出物を除去し、第２の溶出を、５０ｍＭトリス、５０ｍＭのＮａＣｌを含有する溶出緩衝液（ｐＨ８．５）１００μｌを使用することによって記載の通り実施する。溶出物のＤＮＡ含量を、光分析およびゲル電気泳動分析によって決定した。

結果
ゲル電気泳動分析（図４参照）および光分析（表１参照）は、非修飾シリカ粒子（ＵＮＭ）と同様に本発明のポリカルボキシレートで修飾したシリカ粒子（ＭＣ）の両方が、核酸の精製に使用され得ることを実証する。核酸を、ＰＥＧの存在下で粒子表面に結合させ、任意選択で洗浄し、水または低塩濃度緩衝液で溶出する。
表１：非修飾磁性シリカ粒子対カルボキシル化シリカ粒子で精製したプラスミドＤＮＡ（２〜２０μｇのｐＵＣ２１）の測光定量化

（実施例９）カオトロピック結合緩衝液を使用して核酸を精製するための異なる磁性シリカ粒子の使用

２種類の市販の磁性シリカ粒子（ＷＯ０１／７１７３２に従って調製したＭａｇ Ｇビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）；ＵＳ２００６／１８８８７６に従って調製したＭａｇ Ｂビーズ）の核酸単離性能を、本発明に従って調製した磁性シリカ粒子（実施例２参照）と比較した。プラスミドＤＮＡ２〜２０μｇを、インプットＤＮＡとして使用した。核酸単離を、実施例６に記載の通り実施した。結果を表２に示す。
表２：異なる非修飾磁性シリカ粒子で精製したプラスミドＤＮＡ（２〜２０μｇのｐＵＣ２１）の測光定量化

図に示す通り、本発明に従って調製された磁性シリカ粒子は、市販のＭａｇ Ｂビーズと比較して優れた単離特性を示した。さらに、本発明による磁性シリカ粒子は、核酸の単離に広く使用されている市販のＭａｇ Ｇビーズと比較して、同等またはさらに優れた性能を示した。Ｍａｇ Ｇビーズと比較した場合の、本発明に従って調製された磁性シリカ粒子の決定的な利点は、生成費用の低減である。生成費用は、本発明による方法を使用すると、１／３〜１／４に低減される。さらに、他の従来技術の方法とは対照的に、本開示の方法は、スプレー乾燥に基づかない。

Claims (4)

1. ＳｉＯ_２含有表面を有する粒子を生成する方法であって、
   ａ）ｉ）コア粒子、
   ｉｉ）添加塩基、
   ｉｉｉ）ケイ酸塩、および
   ｉｖ）ｐＨ調節剤
   を含む水性反応組成物を提供するステップであって、前記反応組成物の初期ｐＨ値がゲル化ｐＨ値より大きく、前記初期ｐＨ値が前記添加塩基によって調整されるステップと、
   ｂ）前記反応組成物を撹拌するステップであって、前記ｐＨ調節剤が、前記反応組成物のアルカリ環境において反応し、それによって前記反応組成物のｐＨ値を経時的に低減する有機化合物であり、前記反応組成物のｐＨ値の前記低減に起因して、ＳｉＯ_２が前記コア粒子上に堆積し、それによって３０μｍまたはそれ未満の直径を有する粒子が形成されるステップと、
   ｃ）前記粒子を得るステップと
   を含み、前記反応組成物が、１ｍｏｌ／ｌ未満の濃度の前記ケイ酸塩を含む方法。
2. 以下の特色、
   ｉ）前記反応組成物の初期ｐＨ値が、ｐＨ１２．５もしくはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１３もしくはそれより大きいｐＨ値、ｐＨ１３．５もしくはそれより大きいｐＨ値、およびｐＨ１４もしくはそれより大きいｐＨ値から選択されること、ならびに／または
   ｉｉ）前記反応組成物の初期ｐＨ値が、１１〜１５、１２〜１４もしくは１３〜１４にあること、
   ｉｉｉ）前記ｐＨ調節剤の活性によって調整された、低減されたｐＨ値が、ｐＨ１２もしくはそれ未満のｐＨ値、ｐＨ１１．５もしくはそれ未満のｐＨ値、およびｐＨ１１．２もしくはそれ未満のｐＨ値から選択されること、ならびに／または
   ｉｖ）前記一つまたは複数のｐＨ調節剤の活性によって調整された、低減されたｐＨ値が、９〜１２、９．５〜１１．７５、９．７５〜１１．５および１０〜１１．２から選択される範囲内にあること
   の一つまたは複数を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記反応組成物が、１ｍｏｌ／ｌ未満の濃度の前記ケイ酸塩を含み、前記初期ｐＨ値が、１２．５またはそれより大きいｐＨ値であり、前記粒子の形成が完了した後、多孔質粒子が前記反応組成物から収集される、請求項１または２に記載の方法。
4. 請求項１に記載の粒子を生成する方法であって、
   前記反応組成物の前記初期ｐＨ値がゲル化ｐＨ値より大きく、かつ、少なくとも１１．５であり、前記初期ｐＨ値が前記添加塩基によって調整され、
   前記反応組成物を撹拌するステップｂ）において、前記ｐＨ調節剤が、前記反応組成物のアルカリ環境において反応して酸性化合物を生成し、それによって前記反応組成物のｐＨ値を経時的に低減する有機化合物であり、前記反応組成物のｐＨ値の前記低減に起因して、ＳｉＯ _２ が前記コア粒子上に堆積し、それによって３０μｍまたはそれ未満の直径を有する粒子が形成され、前記粒子が、凝集したＳｉＯ _２ コーティングされたコア粒子によって形成され、そして
   ステップｃ）において、前記反応組成物から前記粒子を収集することによって、前記粒子を得る、方法。