CN109055359B - 一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法 - Google Patents

一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核酸提取试剂盒，包括核酸结合溶液和磁性吸附剂，核酸结合溶液包括聚乙二醇和氯化钠，磁性吸附剂是表面包覆有聚多巴胺涂层的磁性Fe3O4纳米粒子。本发明提供的磁性吸附剂具有超顺磁性的纳米粒子，纳米粒子表面包覆的聚多巴胺涂层富有氨基、羟基基团，在核酸结合溶液提供的盐溶液环境下，能够实现对核酸的高效吸附，提高了现有磁性纳米粒子吸附核酸的效率和质量，能够实现核酸的高效快速提取，在应用于人全血提取时，无需进行血液处理，适于临床疾病基因诊疗。本发明提供的核酸提取方法，应用上述的核酸提取试剂盒，提高了核酸提取的质量和效率，适于临床诊断和基础科学研究的应用推广。

Description

一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法
技术领域
本发明属于核酸分离、纯化或制备技术领域，具体涉及一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法。
背景技术
核酸分子的提取技术是分子生物学研究的关键技术，是核酸扩增、DNA片段连接、载体构建、高通量测序等一系列分子生物学分析的前提技术。此外，利用核酸扩增技术可进行植物病原生物检测、食品检测和疾病诊断。因此，核酸的提取具有十分重要的意义。一般来说，核酸提取是需要多步骤的工作，首先需要对细胞、组织材料等生物样本材料进行破碎处理，失活核酸酶，释放核酸，进而除去蛋白、多糖、脂类等其他组织或者细胞成分，从而获得高质量核酸。
目前，根据核酸提取方法的不同，可以将核酸提取技术分为液相提取与固相提取两类。液相提取是指通过物理或化学方法破碎细胞或组织，而后利用核酸与其他细胞或组织成分化学性质的不同，加入不同的溶剂，通过离心、溶解和沉淀，进而达到提取核酸的目的。液相提取主要有氯化铯梯度离心法提取法、碱裂解法和异硫氰酸胍.苯酚一氯仿提取法等。固相提取法主要是利用固相吸附剂(比如二氧化硅、磁性颗粒、硅藻土、玻璃纤维、阴离子交换载体等)与核酸间的静电、亲和、离子交换或氢键等相互作用，从而达到分离核酸的目的。相比于传统的提取方法，固相提取技术具有快速高效的优点，而且能够克服液相提取中有机相与水相的不完全分离的缺点。其中，以磁性纳米粒子(MNP)作为固相吸附剂的磁固相萃取技术(MSPE)，由于磁性纳米粒子(MNP)能够通过外部磁场去除，被越来越多地应用于从细菌或细胞裂解液中提取基因组DNA。
由于磁性纳米粒子容易聚集使其磁性改变，现有技术中通常在磁性纳米粒子的表面包覆一层壳层，例如，二氧化硅(SiO2)由于具有良好的亲水性、无毒且能够保护磁性纳米粒子，被广泛应用于包覆磁性纳米粒子。目前，大多采用
Figure BDA0001783588610000021
法合成二氧化硅包裹的磁性纳米粒子，即利用硅烷化试剂(如四乙氧基硅烷)在碱催化下水解，合成核壳结构的磁性颗粒，并且该颗粒可再次利用硅烷化试剂进行修饰，通过表面修饰基团实现对核酸分子的富集提取。上述包覆SiO2磁性纳米粒子虽然能够实现对核酸分子的提取，但普遍存在吸附效率低的问题，无法实现对核酸的高效率提取。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中应用磁固相萃取技术提取核酸分子的效率低的缺陷。
为此，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种核酸提取试剂盒，包括
核酸结合溶液，所述核酸结合溶液包括聚乙二醇和氯化钠；
磁性吸附剂，所述磁性吸附剂是表面包覆有聚多巴胺涂层的磁性Fe3O4纳米粒子。
可选地，上述的核酸提取试剂盒，所述聚乙二醇的浓度为20-30％(w/v)，所述氯化钠的浓度为3-5mol/L，所述核酸结合溶液的pH为2-3。
进一步可选地，上述的核酸提取试剂盒，所述聚乙二醇的浓度为20％(w/v)，所述氯化钠的浓度为4mol/L，所述核酸结合溶液的pH为2。
可选地，上述的核酸提取试剂盒，所述磁性吸附剂的饱和磁化强度为40.7emu/g，所述磁性吸附剂的粒径为110-130nm，所述聚多巴胺涂层的厚度为20nm。
可选地，上述的核酸提取试剂盒，所述磁性吸附剂的制备方法包括以下步骤：
(1)以FeCl3·6H2O为原料，水热法合成磁性Fe3O4纳米粒子；
(2)将多巴胺盐酸盐、Tris-HCl缓冲液和水混合形成多巴胺溶液，向所述多巴胺溶液中加入所述磁性Fe3O4纳米粒子，室温下搅拌10h，得到黑色沉淀；
(3)所述黑色沉淀经洗涤、干燥处理，得到表面包覆有聚多巴胺涂层的磁性Fe3O4纳米粒子。
进一步可选地，上述的核酸提取试剂盒，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM，pH为8.5；所述Tris-HCl缓冲液：所述多巴胺盐酸盐：所述磁性Fe3O4纳米粒子(g:g:g)为3:5:5。
可选地，上述的核酸提取试剂盒，所述步骤(1)包括：
将FeCl3·6H2O溶解于乙二醇，超声处理，得到澄清溶液；
向所述澄清溶液中加入醋酸钠和聚乙二醇10000，剧烈搅拌，得到深黄色溶液；
将所述深黄色溶液在200℃温度下加热48小时，然后经洗涤、干燥处理，得到磁性Fe3O4纳米粒子。
进一步可选地，上述的核酸提取试剂盒，所述FeCl3·6H2O：所述乙二醇：所述醋酸钠：所述聚乙二醇10000(g:L:g:g)＝1.35:0.04:3.6:1。
本发明提供了一种核酸提取方法，包括以下步骤：
裂解出生物样品中的核酸，向裂解后的样品溶液中加入核酸结合溶液和磁性吸附剂；所述磁性吸附剂是表面包覆有聚多巴胺涂层的磁性Fe3O4纳米粒子，所述核酸结合溶液包括聚乙二醇和氯化钠；
磁性吸附剂结合核酸，形成磁性吸附剂与核酸的复合物，在外部磁场作用下，分离出所述复合物；
将所述复合物洗涤、干燥后，向所述复合物加入核酸洗脱溶液，在外部磁场作用下，分离所述磁性Fe3O4纳米粒子与所述核酸，得到所述核酸。
可选地，上述的核酸提取方法，所述核酸结合溶液包括20％(w/v)的聚乙二醇，4mol/L的氯化钠，所述核酸结合溶液的pH为2。
可选地，上述的核酸提取方法，所述生物样品为人全血样品，所述裂解出生物样品中的核酸包括：
向人全血样品中加入含有EDTA二钾的抗血凝剂，然后加入去离子水破坏红细胞膜，反复混合，离心后弃去上清，得到沉淀物；
向所述沉淀物中加入含有蛋白酶K的溶液，溶解所述沉淀物，然后在65℃温度下静置，收集上清液，所述上清液中含有核酸。
本发明的技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的核酸提取试剂盒，包括核酸结合溶液和磁性吸附剂，所述核酸结合溶液包括聚乙二醇和氯化钠；所述磁性吸附剂是表面包覆有聚多巴胺涂层的磁性Fe3O4纳米粒子。
由于氧化铁纳米粒子容易聚集导致其磁性改变，限制了其作为磁性纳米材料的吸附萃取能力，本发明提供的磁性Fe3O4纳米粒子，表面包覆有聚多巴胺涂层。多巴胺涂层不仅具有一定胶体学和化学稳定作用，防止磁性Fe3O4纳米粒子发生团聚，保持磁性粒子的超顺磁性，使磁性纳米粒子的剩磁和矫顽力趋近于零，具有较强的磁响应性。
另一方面，由于多巴胺表面富有氨基和羟基基团，能够通过静电作用或者与核酸分子形成氢键，实现对核酸分子的吸附。利用聚乙二醇和氯化钠，能够为磁性吸附剂与核酸的结合创超良好的盐溶液环境，使DNA等核酸分子形成超聚状态，促进多巴胺表面基团与核酸之间形成氢键，并且能够通过调控等电点促进多巴胺表面基团与核酸之间的静电作用。与现有的表面包覆SiO2涂层、二羟基琥珀酸、甲基咪唑溴化物等涂层的磁性Fe3O4纳米粒子或者Fe3O4与碳纳米管的复合材料形成的磁性粒子相比，本发明提供的核酸提取试剂盒具有更高的DNA吸附效率(吸附效率最高达90％以上)。磁性吸附剂在核酸结合溶液中具有良好的分散性，能够实现对溶液中核酸分子的高效率吸附，得到核酸-纳米粒子的复合物，然后在外界磁场的作用，利用磁性Fe3O4纳米粒子的超顺磁性和环境稳定性，能够将核酸-纳米粒子的复合物从混合溶液中提取出来，分离核酸与磁性吸附剂即得到纯化的目标核酸分子。本发明提供的磁性吸附剂在应用于核酸提取时，能够实现了对核酸的快速、高效提取，并且在减少了核酸提取过程中化学试剂的使用，减少对核酸的物理和化学伤害，提高了分离的核酸分子的质量，核酸分子适于进行的PCR扩增等进一步的生物学研究分析。
2、本发明提供的核酸提取试剂盒，对核酸结合溶液进行进一步优化，当聚乙二醇的浓度为20-30％(w/v)，氯化钠的浓度为3-5mol/L，核酸结合溶液的pH为2-3时，磁性吸附剂对核酸的吸附效率超过80％，特别是在聚乙二醇的浓度为20％(w/v)，氯化钠的浓度为4mol/L。在一定浓度的PEG和NaCl条件下，磁性纳米粒子在空间位置的碰撞和排斥增加，磁性纳米粒子处于悬浮状态，不易沉降；同时，DNA的分子构象改变，DNA缩聚，增加了DNA分子与磁性纳米粒子之间的氢键，增加聚集效率。核酸结合溶液的pH为2时，由于磷酸基团的去质子化，DNA带负电荷。因此，负电荷的DNA可以通过静电相互作用被带正电的PDA@Fe3O4所吸附；通过设置核酸结合溶液中各成分的浓度以及溶液的pH值，能够进一步提高磁性吸附剂对核酸的吸附效率，实现吸附效率超过90％的有效核酸提取。
3、本发明提供的磁性吸附剂(磁性纳米粒子)的饱和磁化强度为40.7emu/g，所述磁性吸附剂(磁性纳米粒子)的粒径为110-130nm，所述聚多巴胺涂层的厚度为20nm。磁性纳米粒子的粒径分布均匀，其饱和磁化强度易于被外界磁场操作，兼具大的比表面积和超顺磁性，在粒径、饱和磁化强度、聚多巴胺涂层厚度在上述范围内的磁性纳米粒子，其表面电荷、空间位阻等能够达到胶体学稳定特性的要求，充分发挥磁性纳米粒子的协同作用，使其对核酸分子具有高吸附性。
4、本发明提供的磁性纳米粒子的制备方法，利用水热法合成磁性Fe3O4纳米粒子，制得的磁性Fe3O4纳米粒子粒径均一、磁学特性好，磁性Fe3O4纳米粒子与多巴胺盐酸盐在Tris-HCl缓冲液的存在下，室温下搅拌制得表面包覆有聚多巴胺涂层的磁性Fe3O4纳米粒子，制备方法简单，且条件易于实现。在磁性纳米粒子的制备过程中，不需要使用偶联剂，并且不需要对纳米粒子进行表面修饰，即得到能够用于核酸吸附的磁性纳米粒子，有效简化了作为核酸吸附试剂的磁性纳米粒子的制备过程，降低了制备成本。
5、本发明提供的磁性纳米粒子的制备方法，通过控制Tris-HCl缓冲液的浓度、pH，以及Tris-HCl缓冲液、多巴胺盐酸盐和磁性Fe3O4纳米粒子的使用质量比，能够使聚多巴胺牢固粘附在磁性Fe3O4纳米粒子的表面，形成一层厚度为20nm的聚多巴胺涂层，以提高磁性纳米粒子的核酸吸附效果。
6、本发明提供的水热法合成磁性Fe3O4纳米粒子的制备方法，以FeCl3·6H2O为原料，以乙二醇为高沸点还原剂，利用醋酸钠和聚乙二醇10000避免磁性Fe3O4纳米粒子在制备过程中发生团聚，通过调控反应条件，以及物质的添加量，得到粒径均一的超顺磁性粒子，并且适于下一步的聚多巴胺涂层的包覆。
7、本发明提供的核酸提取方法，利用上述的核酸提取试剂盒，能够实现对DNA等核酸分子的高效率提取，对于片段长度小于200bp的小片段DNA分子，同样具有90％以上的高吸附效率。同时，利用磁性吸附剂在水溶液中的高分散性、高稳定性以及超顺磁性，能够实现核酸的快速分离、提取，简化了核酸提取步骤。
8、本发明提供的核酸提取试剂盒以及核酸提取方法，在应用于全血提取时，无需对全血样品进行预处理，简化了全血样本的提取步骤，提高了核酸的提取速度，适于实现临床快速的基因诊断鉴定。同时，本发明提供的核酸提取试剂盒以及核酸提取方法对核酸的提取能力高、吸附率高，能够减少有机溶剂对核酸的损伤，适于提取低含量的循环游离DNA，或者提取组织、唾液、细菌、病毒的目标核酸，为疾病的临床诊断和个体化治疗提供了有效的核酸提取工具和方法。
附图说明
图1a是本发明实施例1的磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)(0.2μm标尺)的透射电子显微镜表征图；
图1b是本发明实施例1的磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)(0.2μm标尺)的透射电子显微镜表征图；
图1c是本发明提供的磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)(0.2μm标尺)的透射电子显微镜表征图；
图2是本发明提供的磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)的X射线衍射谱图；
图3是本发明提供的磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)与Fe3O4的磁化曲线图；
图4是本发明提供的磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)的红外吸收光谱图；
图5是本发明提供的磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)与Fe3O4的zeta电位随pH的变化结果图；
图6a是本发明提供的核酸结合溶液中的PEG浓度对PDA@Fe3O4吸附基因组DNA效率的影响检测结果图；
图6b是本发明提供的核酸结合溶液中的NaCl浓度对PDA@Fe3O4吸附基因组DNA效率的影响检测结果图；
图6c是本发明提供的核酸结合溶液的pH值对PDA@Fe3O4吸附基因组DNA效率的影响检测结果图；
图7是本发明实验例2检测核酸提取试剂盒对片段DNA的吸附率的结果图；
图8是本发明实验例3检测核酸提取试剂盒对DNA的提取能力的结果图；
图9是本发明实施例3中提取人全血基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
图10是以本发明实施例3中提取的人全血基因组DNA为模板的PCR产物的电泳检测结果图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述实施例中涉及到的材料和试剂如下：
从天津大茂化学试剂厂(中国天津)购买六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)，无水乙酸钠(NaAc)，乙醇，二甘醇(DEG)，乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)。Tris(羟甲基)，聚乙二醇10000，聚乙二醇6000，氢氧化钠(NaOH)和氯化钠(NaCl)购自广州化学试剂厂(中国广州)。盐酸多巴胺由阿法埃莎公司(中国上海)购买。盐酸(HCl)和醋酸(CH3COOH)均来自天津扶余化工公司(中国天津)。实验中使用的水均从ELGA水纯化系统(ELGA，伦敦，英国)获得。用于分离的人类EDTA抗凝全血由兰州大学第二医院(中国兰州)收集所得。
GeneRuler 50bp～500bp DNA ladder购自生工公司(中国上海)，由10个片段组成，从50至500bp，总浓度为0.5mg/ml。Ace Taq DNA聚合酶(5U/μl)，25mM MgCl 2，10×PCR缓冲液(100mM Tris-HCl[pH8.3]，500mM KCl)和脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合物(包括dATP，dGTP，dCTP和dTTP，其中每种dNTP的浓度为2.5mM)购自南京诺唯赞生物科技有限公司(南京，中国)。用于PCR反应的引物由南京生物工程技术有限公司(中国南京)合成。TIANampDNA试剂盒、缓冲液FG、缓冲液CL购自天根生物技术公司(中国北京)。
实施例1
本实施例提供一种磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)的制备方法，包括以下步骤：
(1)以FeCl3·6H2O为原料，水热法合成磁性Fe3O4纳米粒子
FeCl3·6H2O(1.35g)溶于乙二醇(40mL)，借助于超声波处理形成澄清溶液。然后，将醋酸钠(3.6g)和聚乙二醇10000(1.0g)加入到溶液中，剧烈搅拌混合物直至获得均匀的深黄色溶液。将该溶液放入聚四氟乙烯高压反应器中，在200℃条件下加热48小时。产物用乙醇和水洗涤数次，并在60℃的氮气气氛下干燥10小时，得到羧基改性的磁性Fe3O4纳米粒子，备用；
(2)将多巴胺盐酸盐(200mg)与0.12g Tris-HCl缓冲液(10mM，pH8.5)和100ml水混合制成多巴胺溶液。然后将羧基改性的磁性Fe3O4纳米粒子(200mg)加入到溶液中并在室温下搅拌10小时，得到黑色沉淀；
(3)将黑色沉淀用水洗涤几次，并在60℃的氮气气氛下干燥，得到磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)。
测试方法及结果
对本实施例制备的磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)进行表征，结果如下：
(1)透射电子显微镜(TEM)表征
使用FEI F30透射电子显微镜(FEI，Hillsboro，USA)对磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)的粒径和形貌进行观测，结果如图1a-图1c所示：PDA@Fe3O4粒子是单分散的，外形趋近于球形，通过Nano Measurer软件对TEM图中的颗粒粒径进行统计，得到PDA@Fe3O4粒子的尺寸分布相对集中，介于110-130nm的范围内，平均粒径为120nm。PDA被均匀地涂覆在Fe3O4颗粒的表面上，PDA的厚度约为20nm。
(2)X射线衍射谱图(XRD)表征
使用Rigaku X射线衍射仪D/max-2400(Rigaku，Tokyo，Japan)对磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)的晶型信息进行分析，结果如图2所示：X射线衍射得到特征峰衍射角2θ出现在17.8°，30.2°，35.4°，42.9°，53.4°，57.0°和62.7°；分别对应的晶面指数为(110)，(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(533)。这些峰表示制备的磁性颗粒为Fe3O4，且为单相立方结构(JCPDS 88-0315)。XRD结果表明，无定形涂覆的PDA层没有影响Fe3O4的结晶相。
(3)磁化曲线表征
使用振动样品磁强计(PPMS-9，Quantum Design，San Diego，USA)上在300K下测量磁性Fe3O4纳米粒子和表面包覆有聚多巴胺涂层的磁性Fe3O4纳米粒子(PDA@Fe3O4)的磁化曲线，通过VSM分析室温下Fe3O4和PDA@Fe3O4的磁学性质。结果如图3中的磁化曲线所示：Fe3O4和PDA@Fe3O4的饱和磁化强度值分别为71.5和40.7emu/g(图3)。曲线表明，PDA@Fe3O4没有磁滞现象，并显示出可忽略不计的剩磁和矫顽力，这表明概述的纳米材料具有超顺磁性。同时，与Fe3O4相比，PDA@Fe3O4饱和磁化强度值的下降证明了PDA在Fe3O4颗粒上改性。
(4)红外吸收光谱(FTIR)表征
使用FTIR(PerkinElmer Spectrum GX，USA)分析磁性Fe3O4纳米粒子(PDA@Fe3O4)的表面官能团信息。结果如图4所示：在该图中，位于约579cm-1处的吸收峰是存在于Fe3O4纳米颗粒中的Fe-O键的特征。在1619和3418cm-1出现的峰对应于表面吸附的水和羟基。在3418cm-1，2922cm-1，1466cm-1和876cm-1处显示的峰分别代表在苯环上的OH拉伸，CH拉伸，C＝C拉伸和CH拉伸，这分别对应于PDA@Fe3O4中苯酚的-OH和-C＝C-官能团。结果表明，PDA通过其表面的物理和化学吸附成功地固定了Fe3O4的表面。
(5)ζ电位(Zeta电位)表征
吸附材料的表面电荷对于材料的吸附能力有重要影响，使用Zetasizer Nano ZS(Malvern，Worcestershire，UK)测量ζ电位，结果如图5所示：随着溶液pH值增加，两种材料的ζ电位都降低。Fe3O4的等电点(PI)约为5.0。用PDA进一步涂覆后，pI增加到5.5。PDA@Fe3O4的表面电荷在pH值低于pI时为正值，在pH值高于pI时为负值。Fe3O4和PDA@Fe3O4颗粒的zeta电位在结合液(pH 2.0)中达到最大值。Fe3O4的zeta电位为12.1mV，而PDA@Fe3O4的zeta电位为28.6mV。PDA@Fe3O4的正zeta电位是由于PDA@Fe3O4表面存在PDA而产生，Fe3O4和PDA@Fe3O4粒子之间的ζ电位差异再次表明PDA在磁性Fe3O4纳米粒子上被修饰。
实施例2
本实施例提供一种核酸提取试剂盒，包括核酸结合溶液和磁性吸附剂：
核酸结合溶液包括20％(w/v)的聚乙二醇，4mol/L的氯化钠，核酸结合溶液的pH为2；
磁性吸附剂为实施例1中制备的磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)。
实施例3
本实施例提供一种核酸提取方法，使用实施例2提供的核酸提取试剂盒，提取方法包括以下步骤：
(1)裂解出人全血样品中的DNA
①将300μl EDTA-K2(EDTA二钾)抗凝血液用微量移液枪加入1.5ml离心管中。之后，将300μl无菌去离子水加入管中以破坏红细胞膜。反复混合数次后，将混合液以12000rpm/min离心3分钟，弃去上清液，得到沉淀物；
②在沉淀物中加入缓冲液CL(300μl)，混合物同样混合数次。将混合物以12000rpm/min离心1分钟，弃去上清液；
③制备蛋白酶K-缓冲液FG混合液(1：100)(g/V)并加入到沉淀中。立即将溶液稍微倒转几次，直至沉淀物完全溶解。然后，在瞬时离心后，将离心管放入65℃金属浴中静置10分钟，收集上清液，所述上清液中含有核酸。将上清液(细胞裂解物)转移到新的1.5mLEppendorf管中并在使用前储存在4℃。
(2)磁性吸附剂(PDA@Fe3O4)结合核酸，形成磁性吸附剂(PDA@Fe3O4)与核酸的复合物，在外部磁场作用下，分离出所述复合物；
将细胞裂解物(150μl)加入至含有300μL核酸结合溶液(20％(w/v)PEG，4M氯化钠，pH 2.0)的1.5mL Eppendorf管中，随后加入40ng PDA@Fe3O4。将混合物在室温下放置10分钟，形成磁性吸附剂(PDA@Fe3O4)与核酸的复合物。然后，在磁力分离架上分离PDA@Fe3O4与核酸的复合物，弃去上清液。
(3)PDA@Fe3O4与核酸的复合物用70％(v/v)乙醇溶液洗涤两次并在室温下干燥。通过加入50μL洗脱溶液(Fujifilm，日本，pH 8.0)从DNA与PDA@Fe3O4的复合物洗脱吸附的DNA并在室温下温育10分钟。之后，使用外部磁体进行磁分离。然后将洗脱液中提取的DNA用作后续PCR扩增的模板。通过测量在260nm处测量的吸光度值来量化吸收的DNA的容量，并且使用在260nm及280nm处的吸光度的比值来评估DNA的纯度。
实验例1
本实验例分析核酸提取试剂盒中核酸结合溶液的在不同溶液pH、不同聚乙二醇浓度和不同氯化钠浓度的条件下对磁性吸附剂(PDA@Fe3O4)吸附DNA的效率的影响。
DNA捕获和洗脱使用下述的分析方法：
为了研究随后从人全血中分离DNA的最佳提取条件，选择基因组DNA作为目标提取物来测量PDA@Fe3O4提取核酸的提取率。将基因组DNA溶于无菌去离子水中以制备DNA标准溶液(50ng/μl)。DNA溶液(20μL，DNA量为1μg)，100μL结合缓冲液(等体积的PEG溶液{0％～40％}和NaCl溶液{0～6mol/l})和30μg PDA@Fe3O4混合到1.5ml EP管中，混合物总体积为0.1mL。然后将混合物在室温下缓慢搅拌10分钟。之后，使用外部磁体进行磁分离。然后小心地取出上清液并收集，使用Nanodrop 2000分光光度计(Thermal scientific，USA)在260nm处进行UV测定。捕获的DNA量是根据磁分离之前相对于上清液中DNA的残留量来计算的。提取率(％)通过下式计算：
Figure BDA0001783588610000151
C0(ng/μl)和C(ng/μl)分别代表溶液中DNA的初始浓度和上清液浓度。V0(μl)和V(μl)表示原始制备的DNA溶液和上清液的体积。用70％(v/v)乙醇洗涤DNA与PDA@Fe3O4混合物两次并在室温下干燥。然后通过添加50μl洗脱缓冲液(Fujifilm，日本，pH＝8.0)并在室温下孵育10分钟，从结合物中洗脱吸附的DNA分子。小心取上清液在260nm测定其吸光度值从而计算得出磁珠吸附的DNA量。
实验结果：
首先，基于原始基因组DNA的质量为1μg，PDA@Fe3O4为30μg，NaCl浓度为4M，结合溶液的pH值为2.0，总体积为120μl的条件下，探讨PEG浓度对PDA@Fe3O4对基因组DNA的捕获效率的影响。结果如图6a所示，PEG在20％(w/v)时达到最高提取效率，基因组DNA的捕获率可达90.2％。因此，选择20％的PEG优化条件进行后续的实验。特定分子量和浓度PEG的作用主要是与盐离子相互作用，改变不同长度DNA的分子构象，增加体系的粘稠程度，使磁珠处于悬浮状态，不易沉降，增加磁珠在空间位置的碰撞和排斥，从而增强核酸与磁珠的聚集效率与效果。
其次，研究了不同NaCl浓度(0M-6M)对DNA分离的影响。如图6b所示，随着浓度从1M增加到4M，解吸的DNA量增加。在pH8.0时，提取率达到峰值，为90.3％，因此NaCl的最佳浓度大约为4M。
最后，溶液的pH值也是一个重要的影响因素。它可以调控在被吸附物表面之间的静电作用力，同时也对吸附材料自身由于电荷分布引起的静电作用具有一定影响。本研究了探讨了结合缓冲液(等体积20％PEG，4M NaCl)在pH从2.0到8.0范围内对基因组DNA富集效率的影响。如图6c所示，捕获的DNA最大提取率在pH 2.0条件下，对应于90％的DNA提取率。该结果与静电力是PDA@Fe3O4吸附DNA的主要驱动力的推测相吻合。PDA@Fe3O4在不同pH溶液中的ζ电位(图5)显示PDA@Fe3O4的等电点为5.5。因此，在2.0-5.0的pH范围内，一定量的DNA可以被带正电的PDA@Fe3O4吸附。当pH高于5.5时，PDA@Fe3O4和DNA都带负电，导致在6.0-10.0的pH范围内几乎没有DNA吸附在PDA@Fe3O4上。DNA中的磷酸二酯是一种pKa小于1的强酸。高于pH 1.0时，由于磷酸基团的去质子化，DNA带负电荷。因此，负电荷的DNA可以通过静电相互作用被带正电的PDA@Fe3O4所吸附。
实验例2
本实验例检测实施例2提供的核酸提取试剂盒对小片段DNA的吸附率。
实验方法：
1、以人基因组DNA为模板，PCR扩增APOC3、APOA5、SLC2A9和ABCG2四个基因的SNP位点处的片段。PCR反应体系由以下几部分组成：DNA模板(0.5μL)，2×PCR缓冲液，1.5mMMgCl2，0.4mM dNTP，0.1mM正反向引物，0.25U/ml Taq DNA聚合酶及DEPC水。总反应体积为10μL。对照溶液(空白)含有除DNA模板以外的所有PCR试剂。表1和表2列出了用于PCR的引物和不同SNP的扩增条件。
表1PCR引物
Figure BDA0001783588610000171
表2PCR扩增条件
Figure BDA0001783588610000172
2、利用实施例3提供的核酸提取方法，提取PCR反应溶液中的DNA片段，其中，向大小不同的PCR产物溶液(154bp、202bp、159bp和96bp；40ng/μl)中加入等体积的核酸结合溶液(20％PEG和4M NaCl；pH2.0；120mL)和0.04mg的磁性吸附剂(PDA@Fe3O4)。回收的DNA用4％琼脂糖凝胶，100V，15分钟的条件下进行电泳分析，以未进行核酸提取的PCR反应溶液作为对照。
实验结果：
图7显示核酸提取试剂盒对小片段DNA的吸附检测结果。由图7可知，磁性吸附剂(PDA@Fe3O4)可以吸附从100bp到200bp不等的小片段DNA，且吸附率可达90％左右，因此，本发明提供的核酸提取试剂盒可以应用于扩增产物DNA的回收及游离DNA(100bp～200bp)的富集与提取。
实验例3
本实验例检测实施例2提供的核酸提取试剂盒对DNA的提取能力：在核酸结合溶液(20％PEG和4M NaCl，pH2.0)中加入不同量的原始基因组DNA(2-10μg)，和PDA@Fe3O4(0.06mg)。混合均匀后孵育10分钟，然后使用外部磁体进行磁分离，测定其上清液在260nm处的吸光度并计算吸附的DNA的量。
检测结果如图8所示，PDA@Fe3O4所吸附的DNA数量在2μg-8μg范围内是线性的，超过这个范围，分离量达到平台。PDA@Fe3O4对DNA的提取能力为116.7mg·g-1。
实验例4
本实验例检测实施例3中提取的人全血基因组DNA的应用性，将实施例3中提取的人全血基因组DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测(100V，12min)。
结果如图9所示。电泳后，在自动凝胶成像仪(中国上海)下电泳带显示单一亮带。选用APROC3基因的rs121918382位点(表1)进行扩增，用于验证产物模板用于PCR扩增的可能性。图10显示了标准GeneRuler 50bp-500bp DNA ladder，PCR产物和空白样品的电泳图谱。在产物DNA的电泳图谱中(图10)，PCR产物的电泳结果呈现出背景清晰，位置恰当的单一明亮条带，表明本发明实施例3提取的基因组DNA可直接作为模板应用于下游PCR。
对比例1
本对比例比较本发明实施例1制备的磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)与商品化磁珠和DNA纯化试剂盒的DNA提取效果。应用磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)提取DNA的方法参照实施例3提供的核酸提取方法。
比对结果如表3所示，磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)作为磁性吸附剂在磁固相萃取(MSPE)中表现出优越的吸附能力，提取的DNA浓度高。此外，应用本发明提供的磁性纳米粒子(PDA@Fe3O4)提取DNA，整个吸附和洗脱过程均在室温(25℃)下进行，无需高温孵育。此外，应用PDA@Fe3O4的核酸方法不使用任何有毒溶剂和频繁离心，它还避免了商业试剂盒中相对大量的步骤增加样品损失的风险。分别在260和280nm处检测洗脱的DNA的吸光度，由表3可知，以PDA@Fe3O4提取的DNA的A260/A280比率为1.82，表明提取的DNA纯度足以用作PCR扩增的模板。
表3PDA@Fe3O4与商品化磁珠和DNA纯化试剂盒的提取比较
Figure BDA0001783588610000191
对比例2
本对比例比较了本发明实施例1制备的PDA@Fe3O4与现有的磁性纳米材料的DNA提取能力以及DNA吸附效率的区别，其中，对DNA提取能力的检测以本法明实验例3中提供的方法进行，对DNA吸附效率的检测以本发明实验例1中提供的方法进行。磁性纳米材料具体如下所示：
DMSA-MNP，Fe3O4磁性纳米颗粒(MNP)表面修饰二巯基琥珀酸，MNP粒径约8.4nm，最大zeta电位51.4±7.2mV；
Fe3O4@SiO2，Fe3O4磁性纳米颗粒表面包被SiO2，Fe3O4平均粒径14.1nm，SiO2厚度1.2nm，饱和磁化强度41.56emu·g-1；
IL@Fe3O4，Fe3O4磁性纳米颗粒表面修饰1-己基-3-甲基咪唑溴化物，平均粒径13nm；
PEI@Fe3O4，Fe3O4磁性纳米颗粒表面包被聚乙烯亚胺，PEI@Fe3O4平均粒径100nm，最大zeta电位45mV；
DES-Fe3O4/MWCNTs，由Fe3O4与碳纳米管(MWCNTs)的复合材料形成磁性纳米颗粒，表面包被聚(乙二醇)基低共熔溶剂，MWCNTs的平均直径为10-15nm，Fe3O4的平均粒径10-20nm，最大zeta电位约12mV；
MIm-MPs，Fe3O4磁性纳米颗粒表面修饰N-甲基咪唑，MIm-MPs平均粒径60nm，
Fe3O4@PANI，Fe3O4磁性纳米颗粒表面包被聚苯胺，Fe3O4磁性纳米颗粒的平均粒径约为300nm，PANI(聚苯胺)的厚度约为30nm，饱和磁化强度62.2emu·g-1；
表4
Figure BDA0001783588610000201
Figure BDA0001783588610000211
检测结果如表4所示，与DMSA-MNP、Fe3O4@SiO2、IL@Fe3O4、PEI@Fe3O4、MIm-MPs、Fe3O4@PANI相比，本发明实施例1制备的PDA@Fe3O4具有明显提高的DNA的提取能力和DNA的吸附率；与DES-Fe3O4/MWCNTs相比，虽然PDA@Fe3O4的DNA提取能力弱于DES-Fe3O4/MWCNTs，但PDA@Fe3O4对DNA吸附效率更高。基于此，PDA@Fe3O4可被认为是理想的核酸吸附材料。
综上所述，本发明提供的磁性纳米粒子PDA@Fe3O4被验证为成功被PDA功能化，应用PDA@Fe3O4能够通过简单有效的方法分离人类基因组DNA。透射电镜观察表明，PDA@Fe3O4是单分散的，高度结晶的，具有较窄的尺寸分布，而VSM结果表明了它的超顺磁性，这是生物应用的理想特性。实验结果表明，核酸的吸附过程与PEG和NaCl溶液的浓度，结合溶液的pH值以及PDA@Fe3O4的量有关。研究发现，修饰后的PDA@Fe3O4不仅可以提取基因组DNA，而且还可以高效率地提取片段较小的DNA。与商品化磁珠和纯化柱核酸提取方法相比，PDA@Fe3O4对血液标本中的核酸成分具有更强的吸附能力(P<0.05)。此外，PDA@Fe3O4可直接应用于人类基因组DNA的提取和纯化而无需预处理，因此能够更加方便，快速和高效地为疾病基因方面的诊疗服务。最重要的是，PDA@Fe3O4复合纳米粒子的应用在生物分子样品高效分离领域中存在巨大潜力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种核酸提取试剂盒，其特征在于，包括
核酸结合溶液，所述核酸结合溶液由浓度为20％的聚乙二醇和浓度为4mol/L的氯化钠组成，且所述核酸结合溶液的pH为2；
磁性吸附剂，所述磁性吸附剂是表面包覆有聚多巴胺涂层的磁性Fe3O4纳米粒子；
所述磁性吸附剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将FeCl3·6H2O溶解于乙二醇，超声处理，得到澄清溶液；向所述澄清溶液中加入醋酸钠和聚乙二醇10000，剧烈搅拌，得到深黄色溶液；将所述深黄色溶液在200℃温度下加热48小时，然后经洗涤、干燥处理，得到磁性Fe3O4纳米粒子；
(2)将多巴胺盐酸盐、Tris-HCl缓冲液和水混合形成多巴胺溶液，向所述多巴胺溶液中加入所述磁性Fe3O4纳米粒子，室温下搅拌10h，得到黑色沉淀；
(3)所述黑色沉淀经洗涤、干燥处理，得到表面包覆有聚多巴胺涂层的磁性Fe3O4纳米粒子；
所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM，pH为8.5；所述Tris-HCl缓冲液：所述多巴胺盐酸盐：所述磁性Fe3O4纳米粒子(g:g:g)为3:5:5；
所述FeCl3·6H2O：所述乙二醇：所述醋酸钠：所述聚乙二醇10000(g:L:g:g)＝1.35:0.04:3.6:1。
2.根据权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述磁性吸附剂的饱和磁化强度为40.7emu/g，所述磁性吸附剂的粒径为110-130nm，所述聚多巴胺涂层的厚度为20nm。
3.一种核酸提取方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1或2所述的核酸提取试剂盒，包括以下步骤：
裂解出生物样品中的核酸，向裂解后的样品溶液中加入权利要求1或2所述的核酸提取试剂盒中的核酸结合溶液和磁性吸附剂；
磁性吸附剂结合核酸，形成磁性吸附剂与核酸的复合物，在外部磁场作用下，分离出所述复合物；
将所述复合物洗涤、干燥后，向所述复合物加入核酸洗脱溶液，在外部磁场作用下，分离所述磁性Fe3O4纳米粒子与所述核酸，得到所述核酸。
4.根据权利要求3所述的核酸提取方法，其特征在于，所述生物样品为人全血样品，所述裂解出生物样品中的核酸包括：
向人全血样品中加入含有EDTA二钾的抗血凝剂，然后加入去离子水破坏红细胞膜，反复混合，离心后弃去上清，得到沉淀物；
向所述沉淀物中加入含有蛋白酶K的溶液，溶解所述沉淀物，然后在65℃温度下静置，收集上清液，所述上清液中含有核酸。
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