CN111871381A - 一种磁性共价有机框架吸附剂及其对质粒dna分离纯化方法 - Google Patents

一种磁性共价有机框架吸附剂及其对质粒dna分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种磁性共价有机框架吸附剂及其对质粒DNA分离纯化方法，以Fe3O4为磁性核心，1,3,5‑三（4‑氨基苯基）苯和对苯二甲醛为构建单元，通过溶剂热法制备而成。吸附剂Fe3O4@COF对DNA具有优异和高效的吸附、脱附能力，是一种理想的DNA磁性吸附剂。由于生物样品的复杂性，将DNA从复杂生物样品中的分离纯化较为关键，同时DNA的分离纯化是PCR扩增实验的基础。但一般的提取方法具有过程复杂、耗费时间、所用的有机溶剂具有毒性等缺点，因此，本发明使用磁性吸附剂作为分离纯化DNA的核心材料，能快速高效的从实际样品大肠杆菌中提取质粒DNA，并且提取的DNA可以进行PCR扩增。

Description

一种磁性共价有机框架吸附剂及其对质粒DNA分离纯化方法
技术领域
本发明涉及一种通过静电作用吸附DNA的磁性吸附剂Fe3O4@COF及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
脱氧核糖核酸（DNA）是生物的遗传信息携带者，是合成RNA和蛋白质的基础，是基因表达、生物正常运作不可或缺的生物大分子。DNA在基因工程、蛋白质工程、法医鉴定等分析检测领域有着重要的作用。无论是研究DNA的功能与结构或是进行生物分析检测，为了进行DNA样品的后续实验，如聚合酶链式反应（PCR）、凝胶电泳等实验，关键步骤在于对DNA的提纯与分离，以保证DNA的纯度和浓度。同时，在DNA的分离提纯过程中，必须保证DNA的一级结构完整不变，同时去除杂质避免污染。
已有文献表明DNA的分离提纯方法有很多，但是常见的方法具有过程耗时，成本昂贵，操作复杂的确定，以及在分离过程中使用有毒的有机溶剂，这些都会影响DNA的纯度，不利于后续实验。因此，使用磁性吸附剂从复杂生物样品中分离纯化DNA，在提取过程中可以通过外部磁场的作用，使DNA从生物样品中快速分离，达到高效分离纯化DNA的目的，该方法快捷高效，操作简单，磁性材料已成为生物分子分离富集的热门材料。磁性共价有机框架材料（Fe3O4@COF）由于其较高的比表面积，有序的孔径结构，具有较大的吸附容量的同时具备快速分离的能力，是DNA的理想吸附剂材料。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：本发明提供一种磁性共价有机框架DNA吸附剂及其在大肠杆菌质粒DNA分离纯化的应用，即磁性吸附剂Fe3O4@COF通过静电作用在不同pH条件下吸附、脱附DNA。该磁性吸附剂能够高效快捷吸附、脱附DNA。因此将Fe3O4@COF应用于大肠杆菌质粒DNA的分离纯化。
本发明是通过以下技术方案实现的：
磁性吸附剂Fe3O4@COF的制备方法：以0.1-3.0 g的Fe3O4为核心，在30-60 mL的溶剂二甲基亚砜DMSO中加入0.3-2 mmol的单体1,3,5-三（4-氨基苯基）苯（TAPB）和0.45-3 mmol对苯二甲醛（TPA），加入Fe3O4 混合均匀，再加入1-4 mL的HAc，充分混匀，在温度为25-120℃下反应0.5-12 h。反应结束后所得的产物Fe3O4@COF通过磁场快速分离，再使用无水甲醇、二氯甲烷和四氢呋喃清洗，真空干燥后得到磁性吸附剂Fe3O4@COF。
磁性吸附剂Fe3O4@COF吸附、脱附DNA：将0.5-2 mg的Fe3O4@COF加入1-5 mL浓度为100-200 mg/L、pH 2-10的小牛胸腺DNA溶液中，在室温下，以120-180 rpm的速率振荡1-60min，完成吸附过程后通过外部磁场分离吸附剂与溶液，取上清液用紫外分光光度计检测DNA浓度，计算吸附效果。再向吸附DNA的Fe3O4@COF中加入1-2 mL、pH 6-12的缓冲液，对吸附的DNA进行洗脱，在室温下，以120-180 rpm的速率振荡1-60 min，完成DNA的脱附过程，当吸附剂用量为2 mg时，在pH为2时对100 mg/L的DNA溶液的吸附效率高达96%，在pH为10时对100 mg/L的DNA溶液的脱附效率高达85%。
磁性吸附剂Fe3O4@COF在大肠杆菌质粒DNA分离纯化的应用，具体步骤如下：
（1）取1-5 mL含PUC57质粒DNA的5×108 cfu/mL大肠杆菌菌液，加入离心管中，以10000-15000 rpm离心1-5分钟，收集沉淀。加入200-300 μL25 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-氯化氢和10 mmol/L乙二胺四乙酸二钠混合溶液对菌体进行重悬；再加入200-300 μL0.2mol/L氢氧化钠和1wt.%十二烷基硫酸钠混合溶液裂解菌体；然后加入300-400 μL 3 mol/L醋酸钾溶液沉淀杂质，离心后收集上清液。
（2）将200-300 μL 0.01 mol/L、pH 2BR缓冲液加入步骤（1）的上清液中，再加入1-5 mg磁性吸附剂Fe3O4@COF，室温下振荡1-60 min，对质粒DNA进行吸附。
（3）将步骤（2）的吸附产物用外部磁场分离，用70%乙醇和灭菌水分别清洗两次。
（4）向步骤（3）的产物加入200-300 μL 0.04 mol/L、pH 10BR缓冲液，在室温下振荡1-60 min，对吸附在Fe3O4@COF上的质粒DNA进行脱附，加入2 μL RNaseA消除RNA影响，得到从大肠杆菌中分离纯化的质粒DNA。
进一步的，对Fe3O4@COF分离纯化的大肠杆菌质粒DNA的验证：检测Fe3O4@COF分离纯化的质粒DNA的纯度和浓度，并对其进行PCR扩增实验，通过凝胶电泳实验证明该分离纯化方法的可行性。
本发明的显著优点在于：本发明制备的磁性吸附剂Fe3O4@COF具有较高的比表面积和饱和磁强度，能够在5 min内高效吸附、脱附DNA。说明Fe3O4@COF在提取DNA的实际应用中有良好的应用潜力。在Fe3O4@COF分离纯化大肠杆菌质粒DNA的实际应用中，该过程耗时较短、操作简易、无毒无害，且Fe3O4@COF提取的质粒DNA的OD260/OD280为1.91，浓度为14.5ng/μL，具有较好的纯度和浓度，可应用于下游PCR扩增实验。使得吸附剂Fe3O4@COF在DNA分离纯化领域有广泛的应用前景。
附图说明
图1是磁性吸附剂Fe3O4@COF的红外光谱图；
图2是磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的吸附图；
图3是磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的脱附图；
图4是Fe3O4@COF分离纯化的大肠杆菌质粒DNA经PCR扩增后的凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例1：
磁性吸附剂Fe3O4@COF的制备：将0.3 mmol TAPB、0.45 mmol TPA与50 mL DMSO加入烧杯，超声10 min至完全溶解，再加入0.105 g的Fe3O4纳米颗粒，超声10 min使其分散均匀，加入2 mL HAc后充分混匀，将烧杯内混合物转移至高压反应釜，在120℃下反应24 h。所得产物分别使用无水甲醇、二氯甲烷、四氢呋喃各清洗三次，最后在真空干燥箱中60℃干燥8 h，得到Fe3O4@COF。对制备的Fe3O4@COF进行红外光谱的检测，Fe3O4@COF的红外光谱图如图1所示。
从图1可以看出，在Fe3O4@COF的红外光谱图中，在1696 cm-1处存在C=N的特征峰，在1507 cm-1处存在芳香环C=C的拉伸振动峰，并且在586 cm-1处有Fe-O的伸缩振动峰，证明Fe3O4@COF材料的成功合成。
实施例2：
磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的吸附：以1 mL、浓度为100 mg/L、pH值为2的小牛胸腺DNA溶液作为实施例2的溶液，加入2 mg的磁性吸附剂Fe3O4@COF，在室温下，以160 rpm的速率振荡20 min，完成吸附过程后通过外部磁场分离吸附剂与溶液，取上清液用紫外分光光度计检测DNA浓度，Fe3O4@COF对DNA的吸附效果如图2所示。
实施例3：
磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的吸附：以1 mL、浓度为100 mg/L、pH值为3的小牛胸腺DNA溶液作为实施例3的溶液，加入2 mg的磁性吸附剂Fe3O4@COF，在室温下，以160 rpm的速率振荡20 min，完成吸附过程后通过外部磁场分离吸附剂与溶液，取上清液用紫外分光光度计检测DNA浓度，Fe3O4@COF对DNA的吸附效果如图2所示。
实施例4：
磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的吸附：以1 mL、浓度为100 mg/L、pH值为4的小牛胸腺DNA溶液作为实施例4的溶液，加入2 mg的磁性吸附剂Fe3O4@COF，在室温下，以160 rpm的速率振荡20 min，完成吸附过程后通过外部磁场分离吸附剂与溶液，取上清液用紫外分光光度计检测DNA浓度，Fe3O4@COF对DNA的吸附效果如图2所示。
实施例5：
磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的吸附：以1 mL、浓度为100 mg/L、pH值为5的小牛胸腺DNA溶液作为实施例5的溶液，加入2 mg的磁性吸附剂Fe3O4@COF，在室温下，以160 rpm的速率振荡20 min，完成吸附过程后通过外部磁场分离吸附剂与溶液，取上清液用紫外分光光度计检测DNA浓度，Fe3O4@COF对DNA的吸附效果如图2所示。
实施例6：
磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的吸附：以1 mL、浓度为100 mg/L、pH值为6的小牛胸腺DNA溶液作为实施例6的溶液，加入2 mg的磁性吸附剂Fe3O4@COF，在室温下，以160 rpm的速率振荡20 min，完成吸附过程后通过外部磁场分离吸附剂与溶液，取上清液用紫外分光光度计检测DNA浓度，Fe3O4@COF对DNA的吸附效果如图2所示。
实施例7：
磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的吸附：以1 mL、浓度为100 mg/L、pH值为10的小牛胸腺DNA溶液作为实施例7的溶液，加入2 mg的磁性吸附剂Fe3O4@COF，在室温下，以160 rpm的速率振荡20 min，完成吸附过程后通过外部磁场分离吸附剂与溶液，取上清液用紫外分光光度计检测DNA浓度，Fe3O4@COF对DNA的吸附效果如图2所示。
从图2可以看出，磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的吸附效果。在pH值从2-10之间，随着pH值的增大，Fe3O4@COF对DNA的吸附效率逐渐降低，这是因为Fe3O4@COF对DNA的吸附主要是通过静电作用进行的，随着pH值的增大，静电作用被削弱，导致吸附效率下降。在pH值为2时，Fe3O4@COF对DNA的吸附效率高达96%。
实施例8：
磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的脱附：以BR缓冲液(1 mL, pH 6、0.01 mol/L)作为实施例8的脱附溶剂，将其加入吸附DNA的Fe3O4@COF(2 mg)中，在室温下，以160 rpm的速率振荡20 min，完成脱附过程后通过外部磁场分离，取上清液用紫外分光光度计检测DNA浓度，Fe3O4@COF对DNA的脱附效果如图3所示。
实施例9：
磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的脱附：以BR缓冲液(1 mL, pH 9、0.01 mol/L)作为实施例9的脱附溶剂，将其加入吸附DNA的Fe3O4@COF(2 mg)中，在室温下，以160 rpm的速率振荡20 min，完成脱附过程后通过外部磁场分离，取上清液用紫外分光光度计检测DNA浓度，Fe3O4@COF对DNA的脱附效果如图3所示。
实施例10：
磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的脱附：以BR缓冲液(1 mL, pH 10、0.01 mol/L)作为实施例10的脱附溶剂，将其加入吸附DNA的Fe3O4@COF(2 mg)中，在室温下，以160 rpm的速率振荡20 min，完成脱附过程后通过外部磁场分离，取上清液用紫外分光光度计检测DNA浓度，Fe3O4@COF对DNA的脱附效果如图3所示。
实施例11：
磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的脱附：以BR缓冲液(1 mL, pH 11、0.01 mol/L)作为实施例11的脱附溶剂，将其加入吸附DNA的Fe3O4@COF(2 mg)中，在室温下，以160 rpm的速率振荡20 min，完成脱附过程后通过外部磁场分离，取上清液用紫外分光光度计检测DNA浓度，Fe3O4@COF对DNA的脱附效果如图3所示。
实施例12：
磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的脱附：以BR缓冲液(1 mL, pH 12、0.01 mol/L)作为实施例12的脱附溶剂，将其加入吸附DNA的Fe3O4@COF (2 mg)中，在室温下，以160 rpm的速率振荡20 min，完成脱附过程后通过外部磁场分离，取上清液用紫外分光光度计检测DNA浓度，Fe3O4@COF对DNA的脱附效果如图3所示。
从图3可以看出，磁性吸附剂Fe3O4@COF对DNA的脱附效果。在pH值从6-12之间，随着pH值的增大，Fe3O4@COF对DNA的脱附效率逐渐升高，这是因为Fe3O4@COF对DNA的吸附主要是通过静电作用进行的，随着pH值的增大，静电作用被削弱，DNA逐渐从吸附剂上脱离，脱附效率升高。在pH值为10时，Fe3O4@COF对DNA的吸附效率高达85%。
实施例13：
磁性吸附剂Fe3O4@COF对大肠杆菌质粒DNA的分离纯化应用，包括以下步骤：
（1）取2 mL含PUC57质粒DNA的大肠杆菌菌液(5×108 cfu/mL)，加入离心管中，以12000rpm离心1分钟，收集沉淀。加入250 μL三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(25 mmol/L)和乙二胺四乙酸二钠(10 mmol/L)混合溶液对菌体进行重悬；再加入250 μL氢氧化钠(0.2 mol/L)和十二烷基硫酸钠(1wt.%)混合溶液裂解菌体；然后加入300 μL醋酸钾(3 mol/L)沉淀杂质，离心后收集上清液。
（2）将250 μL BR缓冲液(0.01 mol/L, pH 2)加入步骤（1）的上清液中，再加入2mg磁性吸附剂Fe3O4@COF，室温下振荡20 min，对质粒DNA进行吸附。
（3）将步骤（2）的吸附产物用外部磁场分离，用70%乙醇和灭菌水分别清洗两次。
（4）向步骤（3）的产物加入200 μL BR缓冲液(0.04 mol/L, pH 10)，在室温下振荡20 min，对吸附在Fe3O4@COF上的质粒DNA进行脱附，加入2 μL RNaseA消除RNA影响，得到从大肠杆菌中分离纯化的质粒DNA。
（5）对步骤（4）Fe3O4@COF分离纯化的质粒DNA进行PCR扩增实验，通过凝胶电泳实验证明该分离纯化方法的可行性。凝胶电泳图如图4所示。
从图4可以看出，泳道M为DNA Marker，泳道1为试剂盒提取的大肠杆菌质粒DNA进行PCR扩增的产物，泳道2是Fe3O4@COF提取的大肠杆菌质粒DNA进行PCR扩增的产物，泳道3为空白样品的PCR扩增产物。通过三个泳道和Marker的对比发现，由磁性吸附剂Fe3O4@COF分离纯化的大肠杆菌质粒DNA可用于后续的PCR扩增实验，证明Fe3O4@COF可以从复杂生物样品中分离纯化DNA，是一种理想的DNA吸附剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种通过静电作用吸附DNA的磁性吸附剂Fe3O4@COF的制备方法，其特征在于：以0.1-3.0 g的Fe3O4为核心，在30-60 mL的溶剂二甲基亚砜中加入0.3-2 mmol的单体1,3,5-三（4-氨基苯基）苯和0.45-3 mmol对苯二甲醛，加入Fe3O4 混合均匀，再加入1-4 mL的HAc，充分混匀，在温度为25-120℃下反应0.5-12 h；反应结束后所得的产物Fe3O4@COF通过磁场快速分离，再使用无水甲醇、二氯甲烷和四氢呋喃清洗，真空干燥后得到磁性吸附剂Fe3O4@COF。
2.如权利要求1所述的方法制备获得的磁性吸附剂Fe3O4@COF。
3.如权利要求2所述的磁性吸附剂Fe3O4@COF在DNA分离纯化中的应用。
4.如权利要求2所述的磁性吸附剂Fe3O4@COF在大肠杆菌质粒DNA分离纯化中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将含有PUC57质粒的大肠杆菌菌种重悬，再将菌体裂解，使核酸从细胞中释放出来，然后将蛋白质等杂质沉淀，最后使用磁性吸附剂Fe3O4@COF将质粒DNA提取出来，得到分离纯化的质粒DNA。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：Fe3O4@COF分离纯化大肠杆菌质粒DNA的具体方法为：
（1）取1-5 mL含PUC57质粒DNA的大肠杆菌菌液，加入离心管中，以10000-15000 rpm离心1-5分钟，收集沉淀；加入200-300 μL的25 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-氯化氢和10 mmol/L乙二胺四乙酸二钠的混合溶液对菌体进行重悬；再加入200-300 μL的0.2 mol/L氢氧化钠和1wt.%十二烷基硫酸钠混合溶液裂解菌体；然后加入300-400 μL的3 mol/L醋酸钾溶液沉淀杂质，离心后收集上清液；
（2）将200-300 μL 0.01 mol/L、 pH 2BR缓冲液加入步骤（1）的上清液中，再加入1-5mg磁性吸附剂Fe3O4@COF，室温下振荡1-60 min，对质粒DNA进行吸附；
（3）将步骤（2）的吸附产物用外部磁场分离，用70%乙醇和灭菌水分别清洗两次；
（4）向步骤（3）的产物加入200-300 μL 0.04 mol/L、pH 10 BR缓冲液，在室温下振荡1-60 min，对吸附在Fe3O4@COF上的质粒DNA进行脱附，加入2 μL RNaseA消除RNA影响，得到从大肠杆菌中分离纯化的质粒DNA。
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