CN108192892B - 一种羟基纳米磁珠法提取rna的试剂盒及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种羟基纳米磁珠提取RNA提取试剂盒，以及快速简介的提取产菌核真菌RNA的方法。所述试剂盒包含溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ、洗涤液、洗脱液和羟基纳米磁珠悬浮液。本申请创新性的使用溶液Ⅱ对产菌核真菌的多糖物质进行剔除，使得在RNA提取过程中避免胞外多糖的干扰。试验过程中还创新性的对试剂盒所使用的羟基纳米磁珠进行了预处理，以RNA作为分子靶标，减少羟基纳米磁珠对DNA和蛋白质的吸附能力，该操作具有较高特异性的突出特点。该试剂盒适用于产菌核真菌的RNA提取，检测简单便捷，降低了胞外多糖对RNA提取的干扰。

Description

一种羟基纳米磁珠法提取RNA的试剂盒及提取方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种羟基纳米磁珠法产菌核真菌RNA提取试剂盒，以及特异性强快速提取产菌核真菌RNA的方法。
背景技术
菌核是由菌丝紧密连接交织而成的休眠体，其功能主要是抵御不良环境。常见的产菌核真菌有菌核属和丝核菌属真菌，该类真菌含有大量的胞外多糖。而真菌胞外多糖具有高吸附高粘稠特点，是困扰产菌核真菌分离提取高纯度RNA的难点之一。随着分子生物学的快速发展，RNA相关的转录组学分析、cDNA文库的构建、Northern印迹等技术备受人们的关注，需要RNA。RNA的提取是现代分子生物学的一项基本技术，同时也是研究核酸的重要手段，而有一定纯度和完整性的RNA是影响许多分子生物学研究成功与否的关键。目前，异硫氰酸胍-酚法提取RNA是较常见的方法，其主要原理为GIT与β-巯基乙醇共同作用一直RNase的活性；GIT与十二烷基胺酸钠作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。但是针对多糖含量较高的产菌核真菌的RNA提取无法达到理想的效果。
苯酚法提取RNA的主要原理是细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基硫酸钠磺酸钠(SDS)的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧烈震荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。因DNA和RNA同在水相层中，常因为实验操作使RNA的提取混有DNA片段及其他杂质，RNA提取物达不到下一步分子生物学试验的标准。
柱式法真菌RNA提取试剂盒的发展大大提高了RNA提取的便利性。其主要原理为利用包埋有纯化填料的纯化柱对RNA分子的吸附作用，在提取过程中将RNA有效吸附在过滤膜中，再经离心、洗涤、洗脱等步骤后实现对RNA的提取工作，操作速度加快，RNA浓度增加。当前，柱式法回收RNA应用广泛，但也有其自身缺陷，对于多糖物质含量较高的真菌在过滤网时常常会引起滤网的堵塞，使大量RNA片段无法吸附在过滤网上，最终导致RNA提取浓度低或者失败。
Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。虽然使用Trizol可以很好的保存RNA的完整性，但是提取过程较多的样品多糖还是严重影响了RNA分离，使得到RNA提取物浓度太低，下游试验常常失败。
近年来，因纳米磁性氧化铁的特殊性，羟基纳米磁珠法在真菌RNA提取应用中越来越受到关注。其原理为羟基纳米磁珠表面修饰有特殊化学基团或者依靠巨大的表面能，可在不同条件下对RNA分子形成特异性吸附和解吸附作用，吸附在羟基纳米磁珠内的RNA分子在外加磁场作用下可与羟基纳米磁珠分离，简单便捷的完成DNA的提取工作。虽然羟基纳米磁珠法大部分真菌RNA提取的操作简便，其不足之处也是无法排除多糖物质对RNA吸附的影响。
另外，对于生物体的RNA提取，虽然具有很多经典的方法，但是，这些传统的方法不能日益满足一些测试的需要，有些测试需要纯度很高的RNA，而不希望含有任何其它杂质，例如蛋白、肽链、DNA、多糖或者其它非RNA的物质，因为这些物质会对测试产生干扰。有时候，尽管样本中具有RNA，但是仍然不能检测到目的RNA，这可能是含有的杂质对测试系统干扰造成的，虽然这些杂质含量很少，但是仍然会对检测结果造成干扰，有的时候，甚至让检测失败。这就需要对传统的方法进行改进，期望获得高纯度的RNA而不含有杂质。
发明内容
本发明目的在于提供一种羟基纳米磁珠法产菌核真菌RNA提取试剂盒。该试剂盒可以有效除去样本溶液中的杂质而特异吸附RNA，使获得的RNA的纯度达到99.5％以上。特别的，对羟基纳米磁珠采用特殊试剂进行处理，可以让羟基纳米磁珠只特异吸附RNA，而不会吸附其它杂质，例如蛋白碎片、多肽、DNA或者其它杂质。这里所说的特异是可以吸附99.9％的RNA，而不会或者几乎很少吸附其它非RNA的物质，例如DNA，蛋白或者多肽，或者多糖。尤其可以减少RNA提取中RNA的降解率，大大提高了试验的成功率。
这种处理羟基纳米磁珠的试剂包括Trizol溶液和双甘膦溶液，然后再用处理过的羟基纳米磁珠来吸附样本中的RNA，意外的发现RNA的纯度可以显著提高。双甘膦是属于常用的一种农药，他的处理，可能对羟基纳米磁珠的表面能增加，增强吸附能力，Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA,含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol的主要成分是苯酚。Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此相对传统的常规提取RNA的纯度，具有显著的提高。
在一些方式中，本发明提供一种羟基纳米磁珠法产菌核真菌RNA提取试剂盒，其特征在于包括：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ、洗涤液、洗脱液和羟基纳米磁珠悬浮液；
所述羟基纳米磁珠悬浮液：羟基纳米磁珠材质为纳米磁性氧化铁，直径为500钠米；
所述溶液Ⅰ由Trizol(主要是苯酚，都可以商业购买，例如InvitrogenTMTRIzolTM的产品)、Tris-HCl、NaCl和EDTA组成，pH值为8.0；
所述溶液Ⅱ为SDS溶液(氢氧化钠溶液稀释)和LiCl；
所述溶液Ⅲ为氯仿和异戊醇；
所述溶液Ⅳ包含异丙醇和醋酸钾溶液；
所述洗涤液为乙醇溶液；
所述洗脱液为去离子水；
其中，所述的羟基纳米磁珠悬浮液经过如下处理步骤处理：羟基纳米磁珠在Trizol溶液进行浸泡5-10小时后用PBS缓冲液(pH＝7.0)冲洗5-8次，将取出的羟基纳米磁珠再浸入双甘膦溶液5-6小时，PBS缓冲液冲洗5-8次后备用。
作为优选的方案，所述的Trizol溶液的浓度为5mol/L，双甘膦溶液的浓度为8mol/L。
另一方面，一种羟基纳米磁珠法产菌核真菌DNA提取的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一：在无菌条件下将培养好的真菌的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于300mg，加入100μL溶液Ⅰ，用液氮进行冷冻研磨，后再加100μL溶液Ⅰ，震荡混匀；
步骤二：加入250μL溶液Ⅱ，充分混匀，4℃12000rpm离心5min，取上清至新管中；
步骤三：加入500μL溶液Ⅲ，轻轻上下翻动5-6次；4℃12000rpm离心5min，取上清至新管中；
步骤四：加入溶液Ⅲ，轻轻上下翻动，使菌液充分裂解成透明的溶液。4℃12000rpm离心5min，取上清至新管中；
步骤五：将离心管放在冰上，加入350μL溶液Ⅳ，轻轻上下翻动，直至有白色絮状物形成，静置2min；
步骤六：加入50μL羟基纳米磁珠悬浮液，轻轻上下翻动，在冰上静置2min；步骤七：将离心管放置于磁力架上，静置1min使溶液变透明，弃溶液；
其中，所述的羟基纳米磁珠悬浮液经过如下处理步骤处理：羟基纳米磁珠在Trizol溶液进行浸泡5-10小时后用PBS缓冲液(pH＝7.0)冲洗5-8次，将取出的羟基纳米磁珠再浸入双甘膦溶液5-6小时，PBS缓冲液冲洗5-8次后备用；所述溶液Ⅰ中Trizol浓度为10mmol/L，Tris-HCl浓度为15mmol/L，EDTA浓度为10mmol/L，NaCl浓度为10mmol/L；
所述溶液Ⅱ中SDS浓度为1-1.5％，NaOH溶液浓度为0.2mol/L，LiCl溶液浓度为8mol/L；
所述溶液Ⅲ中氯仿和异戊醇体积比为24:1；
所述溶液Ⅳ中醋酸钾溶液浓度为8mol/L。
优选的，所述的Trizol溶液的浓度为5mol/L，双甘膦溶液的浓度为8mol/L。
优选的，所述的Trizol溶液与双甘膦溶液的体积比为1:1。
优选的，其中，还包括对步骤七之后的对羟基纳米磁珠的洗涤和洗脱步骤：将含有已吸附RNA羟基纳米磁珠的离心管中加入500μL无水乙醇洗涤RNA，充分震荡后弃溶液，重复洗涤3次，将羟基纳米磁珠表面粘有的有机溶液尽量洗涤掉；打开离心管盖，室温静置3-5min，使羟基纳米磁珠表面的无水乙醇尽量挥发掉后加入50μL去离子水，静置2min后使用移液器将含有RNA的溶液至新管。
在一些优选的方式中，对样本中颗粒较大的物质进行过滤去除，或者对一些含量高的物质，例如多糖，较大的蛋白物质进行初步去除，然后再加入处理过的羟基纳米磁珠进行吸附，发现该羟基纳米磁珠仅仅吸附样本中的RNA，而不会吸附样本中的其它物质，例如蛋白碎片、多肽、DNA或者其它杂质。
沉淀多糖物质及吸附RNA，使产菌核真菌RNA浓度提高80％以上，可直接应用于可用于转录组分析、RT-PCR、实时荧光PCR等分子生物学实验。
本发明的目的之二在于提供了一种羟基纳米磁珠法对产菌核真菌RNA快速提取的方法。配合由Trizol溶液、双甘膦溶液和羟基纳米磁珠组成的羟基纳米磁珠悬浮液完成。该试剂盒可以提高羟基纳米磁珠对DNA分子的特异性吸附能力，使产菌核真菌RNA纯度提高90％以上。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种羟基纳米磁珠法产菌核真菌RNA提取试剂盒。包括溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ、洗涤液、洗脱液和羟基纳米磁珠悬浮液；
所述羟基纳米磁珠悬浮液：羟基纳米磁珠材质为纳米磁性氧化铁，直径为500钠米；
所述溶液Ⅰ由Trizol、Tris-HCl、NaCl和EDTA组成，pH值为8.0；
所述溶液Ⅱ为SDS溶液(氢氧化钠溶液稀释)和LiCl；
所述溶液Ⅲ为氯仿和异戊醇；
所述溶液Ⅳ包含异丙醇和醋酸钾溶液；
所述洗涤液为乙醇溶液；
所述洗脱液为去离子水；
所述羟基纳米磁珠悬浮液浓度为40-50mg/ml；
所述溶液Ⅰ中Trizol浓度为10mmol/L，Tris-HCl浓度为15mmol/L，EDTA浓度为10mmol/L，NaCl浓度为10mmol/L；
所述溶液Ⅱ中SDS浓度为1-1.5％，NaOH溶液浓度为0.2mol/L，LiCl溶液浓度为8mol/L；
所述溶液Ⅲ中氯仿和异戊醇体积比为24:1；
所述溶液Ⅳ中醋酸钾溶液浓度为8mol/L。
上述试剂盒快速提取产菌核真菌RNA方法，包括以下步骤：
步骤一：在无菌条件下将培养好的真菌的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于300mg，加入100μL溶液Ⅰ，用液氮进行冷冻研磨，后再加100μL溶液Ⅰ，震荡混匀；
步骤二：加入250μL溶液Ⅱ，充分混匀，4℃12000rpm离心5min，取上清至新管中；
步骤三：加入500μL溶液Ⅲ，轻轻上下翻动5-6次；4℃12000rpm离心5min，取上清至新管中；
步骤四：加入溶液Ⅲ，轻轻上下翻动，使菌液充分裂解成透明的溶液。4℃12000rpm离心5min，取上清至新管中；
步骤五：将离心管放在冰上，加入350μL溶液Ⅳ，轻轻上下翻动，直至有白色絮状物形成，静置2min；
步骤六：加入50μL羟基纳米磁珠悬浮液，轻轻上下翻动，在冰上静置2min；
步骤七：将离心管放置于磁力架上，静置1min使溶液变透明，弃溶液；
步骤八：加入500μL洗涤液洗涤RNA，充分震荡后弃溶液。
步骤九：打开离心管盖，室温静置3-5min后加入50μL洗脱液，静置2min后取溶液至新管，放置于-20℃备用。
一种用于提取RNA的试剂，其中所述的试剂包括羟基磁珠，所述的磁珠采用如下的方法制备；所述的羟基纳米磁珠悬浮液经过如下处理步骤处理：羟基纳米磁珠在Trizol溶液进行浸泡5-10小时后用PBS缓冲液(pH＝7.0)冲洗5-8次，将取出的羟基纳米磁珠再浸入双甘膦溶液5-6小时，PBS缓冲液冲洗5-8次后备用。
有益效果
本申请创新性的提出针对产菌核真菌的多糖物质进行有效的沉淀，使其RNA浓度提高，减弱了产菌核真菌胞外多糖对RNA浓度的影响，可以避免传统RNA提取中出现浓度低而导致下游试验失败的现象。
本发明的有益效果：
(1)RNA提取率较高，浓度可达到500ng/μL以上。该方法基于LiCl溶液可沉降多糖物质，在缓冲液的环境中对RNA去除真菌的胞外多糖，使RNA分子提取时减少多糖物质的干扰，RNA提取率高，提取的RNA浓度可达到500ng/μL以上。
(2)RNA纯度较高，DNA和蛋白质含量少。该方法基于Trizol溶液和双甘膦溶液抑制RNA酶活性和溶解蛋白质，在缓冲液的环境中羟基纳米磁珠对RNA的特异性吸附能力增强，使DNA和蛋白质无法吸附到羟基纳米磁珠上，RNA纯度升高，OD260/280值为1.80-1.90。
(3)RNA降解率降低。该方法基于Trizol溶液对羟基纳米磁珠的处理，使RNA降解率降低至10％，大大提高了RNA提取的成功率。
(3)操作便捷、省时、安全。该方法基于羟基纳米磁珠法再配合试剂盒溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ、洗涤液和洗脱液的使用可大幅度提高工作效率，操作方法简介高效，完成一次RNA提起仅需约30分钟。
具体实施方式
实施例1：羟基纳米磁珠法产菌核真菌RNA提取试剂盒
1.1.羟基纳米磁珠法产菌核真菌RNA提取试剂盒包括：
步骤一：在无菌条件下将培养好的立枯丝核菌的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于300mg，加入100μL溶液Ⅰ，用液氮进行冷冻研磨，后再加100μL溶液Ⅰ，震荡混匀；
步骤二：加入250μL溶液Ⅱ，充分混匀，4℃12000rpm离心1min，取上清至新管中；
步骤三：加入500μL溶液Ⅲ，轻轻上下翻动5-6次；4℃12000rpm离心1min，取上清至新管中；
步骤四：加入溶液Ⅲ，轻轻上下翻动，使菌液充分裂解成透明的溶液。4℃12000rpm离心1min，取上清至新管中；
步骤五：将离心管放在冰上，加入350μL溶液Ⅳ，轻轻上下翻动，直至有白色絮状物形成，静置2min；
步骤六：加入0.5μL未经过处理的羟基纳米磁珠悬浮液(羟基纳米磁珠材质为纳米磁性氧化铁，直径为500钠米)(购买自上海羧菲生物医药科技有限公司，专门用于提取RNA的羟基纳米磁珠,批号：FE10001,浓度为5毫克美毫升)，轻轻上下翻动后在冰上静置2min；
步骤七：将离心管放置于磁力架上，静置1min使溶液变透明，弃溶液；
步骤八：将含有已吸附RNA羟基纳米磁珠的离心管中加入500μL无水乙醇洗涤RNA，充分震荡后弃溶液，重复洗涤3次，将羟基纳米磁珠表面粘有的有机溶液尽量洗涤掉；打开离心管盖，室温静置3-5min，使羟基纳米磁珠表面的无水乙醇尽量挥发掉后加入50μL去离子水，静置2min后使用移液器将含有RNA的溶液至新管，放置于-20℃备用。
溶液Ⅰ中Trizol浓度为10mmol/L(购买自赛默飞世尔)，Tris-HCl浓度为15mmol/L，EDTA浓度为10mmol/L，NaCl浓度为10mmol/L；
溶液Ⅱ中SDS浓度为1-1.5％，NaOH溶液浓度为0.2mol/L，LiCl溶液浓度为8mol/L；
溶液Ⅲ中氯仿和异戊醇体积比为24:1；
溶液Ⅳ中醋酸钾溶液浓度为8mol/L。
1.2异硫氰酸胍-酚法：
步骤一：在无菌条件下将培养好的真菌的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于500mg，加入液氮充分研磨至粉末状；
步骤二：移入预冷的10ml离心管，加入4ml异硫氰酸胍溶液，轻轻摇动离心管使其混合均匀；
步骤三：顺序加入2mol/LNaAc 0.5mL、水饱和酚0.4mL，每加入一种试剂都轻轻混匀样品，冰浴15min；
步骤四：4℃15000rpm离心30min，移上清至新管，加入水饱和酚0.4mL，混匀后4℃15000rpm离心10min，移上清至新管；
步骤五：加入等量的异丙醇，放入-20℃冰箱过夜沉淀；
步骤六：用70％乙醇洗一次，4℃15000rpm离心5min。吸去乙醇，空气中吹干RNA沉淀，去离子水溶解。
1.3 RNA试剂盒(离心柱法)提取法：(北京百奥莱博科技有限公司)
步骤一：在无菌条件下将培养好的真菌的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于500mg，用液氮进行冷冻研磨至粉末状。
步骤二：加入100ul样品至新的离心管中，再加入600μL FR1试剂，充分颠倒或振荡混匀，6000rpm瞬时离心5s。
步骤三：将步骤二混合液转入吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管；
步骤四：向吸附柱中加入600μL FR2试剂，12000rpm离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管；
步骤五：空柱12000rpm离心2min，去除残留液体；
步骤六：将吸附柱放置于新的无RNA酶的1.5mL收集管中，在膜中央加入25-50μLFR3试剂，室温静置1min，12000rpm离心1min，收集RNA溶液，-20℃保存，长期保存于-80℃。
OD值检测：使用721紫外分光光度计对9份RNA产物样品进行了OD值检测(见表1)。检测结果显示使用本试剂盒对产菌核真菌提取的RNA产物浓度较高并且纯度良好。
表1：实施例1中从100mg产菌核真菌中提取的RNA产物的OD值及浓度检测结果
(A1-A3：异硫氰酸胍-酚法；A4-A6：离心柱法；A7-A9：本试剂盒)
Figure BDA0001585812110000091
由表1中采用未经处理的羟基纳米磁珠对产菌核真菌的RNA提取结果可以看出，采用本发明的试剂盒提取的RNA浓度最高，均能达到100ng/μL以上，而异硫氰酸胍-酚法和离心柱法提取的RNA浓度明显较低，该结果表明本发明的试剂盒可以有效的去除产菌核真菌的多糖物质，避免其对RNA提取的干扰。但是三种方法提取的RNA样本液所测得的OD值均偏低，有蛋白、DNA等杂质干扰的情况，样本液中RNA纯度并没有有效改善。因此，本发明也对吸附RNA的羟基纳米磁珠进行了一定的处理，因为高纯度的RNA，一般OD读数在1.8-2.0之间，小于1.8的大多含有DNA，高于2.0的，大多含有蛋白。虽然，本发明的试剂盒提取的RNA浓度明显大于异硫氰酸胍-酚法和离心柱法提取的RNA浓度，但是数值仍然偏小，说明在提取的过程中RNA还是存在着很严重的降解。从以上实验结果可以看出，采用直接购买的羟基纳米磁珠进行RNA提取，虽然可以提高浓度，但是含有杂质，特别是RNA比较多，RNA纯度不符合要求，而且RNA降解现象很严重，有时候，不能用于特定用途的RNA检测或者其它高要求的需要。
实施例2：利用处理的羟基纳米磁珠对样本的RNA提取
按照实施例子1所描述的提取过程，其区别是：在采用羟基纳米磁珠进行RNA提取前，对购买的羟基纳米磁珠进行处理，采用处理后的羟基纳米磁珠对RNA进行提取，其它方法和试剂的实用与实施例子1中的羟基纳米磁珠提取方法一样步骤相同。
对羟基纳米磁珠进行处理，处理的方法如下：
羟基纳米磁珠购买自上海羧菲生物医药科技有限公司(与实施例子1是同一个批号)，专门用于提取RNA的羟基纳米磁珠，对该羟基纳米磁珠进行处理，用Trizol溶液(5mol/L,购买自赛默飞世尔)(Trizol溶液提取细菌总RNA的方法。其实验原理Trizol主要物质是异硫氰酸胍,它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时,保护RNA的完整性,可以从市面购买不同的型号和规格))和双甘膦溶液(8mol/L)进行浸泡。
处理的方法如下：取5毫克羟基纳米磁珠(实施例子1中购买的商业化磁珠)(磁珠悬浮液离心去掉液体后剩下的磁珠)在10毫升Trizol溶液进行浸泡5-10小时后用PBS缓冲液(pH＝7.0)冲洗5-8次，将取出的羟基纳米磁珠再浸入10毫升的双甘膦溶液5-6小时，PBS缓冲液冲洗5-8次后备用。用处理的羟基纳米磁珠来吸附RNA，最后用去离子水洗脱羟基纳米磁珠，获得目标RNA。
当然，羟基纳米磁珠的数量多少或者重量与需要的用Trizol溶液和双甘膦溶液的浓度有关系，这个可以根据本发明的精神做任意调整，例如5毫克本发明的羟基纳米磁珠可以用10毫升Trizol溶液和10毫升的双甘膦溶液进行处理，这个根据羟基纳米磁珠的直径大小可以做有限实验的调整。处理过的5毫克羟基纳米磁珠可以吸附大约200-250ng/μL的RNA，一般放入的羟基纳米磁珠都是过量的，当溶液中的RNA浓度很低的时候，可以放入过量的羟基纳米磁珠，过量的羟基纳米磁珠可以吸附RAN，这样起到富集的作用，从而获得高浓度的RNA，同时这种富集是具有特异选择性的，只是富集RNA，而不会富集RAN或者蛋白，从而获得高纯度的RNA。
未经过处理的羟基纳米磁珠作为对照(和实施例子1中羟基纳米磁珠提取方法一样)。
检测结果显示使用本试剂盒中发明的羟基纳米磁珠对产菌核真菌提取的RNA产物浓度较高并且纯度良好，可使提取的RNA含量提升80％以上。
表2：实施例2中处理和未处理的羟基纳米磁珠提取RNA产物中的OD值检测结果
Figure BDA0001585812110000111
表3：实施例2中处理和未处理的羟基纳米磁珠提取RNA产物中的浓度检测结果(ng/μL)
Figure BDA0001585812110000112
由表2中处理和未处理的羟基纳米磁珠提取RNA产物中的OD值检测结果可以看出，本发明的羟基纳米磁珠提取的RNA产物中的OD值均在1.80-1.90之间，具有较高的纯度，而未处理的羟基纳米磁珠提取的RNA产物中的OD值明显低于1.80，其中混有杂质，纯度较低，经过方差分析，本发明的羟基纳米磁珠提取RNA的纯度显著(P<0.01)高于不用处理过的羟基纳米磁珠的纯度。
由表3种处理和未处理的羟基纳米磁珠提取RNA产物中的浓度检测结果可以看出，本发明的羟基纳米磁珠提取的RNA提取物浓度均可达到500ng/μL，而未处理的羟基纳米磁珠虽然浓度也可达到100ng/μL左右，但是数值仍远远低于本发明的羟基纳米磁珠提取的RNA浓度。说明本发明的羟基纳米磁珠在吸附RNA的同时可以很好抑制RNase，可有效降低RNA的降解率，因此，采用本发明的羟基纳米磁珠可以显著的提高RNA的纯度和浓度。
实施例3：利用处理的羟基纳米磁珠对RNA吸附能力测定
使用超声波细胞破碎仪对待测细菌(金黄色葡萄球菌)进行细胞壁破碎，破碎具体方法如下：
刮取细菌并用蒸馏水配制成悬浮液(107个/mL),后将盛有悬浮液的烧杯放置于破碎仪内，将破碎仪的探头放入烧杯插入孢子悬浮液中，在冰浴环境下设置破碎时间为10min，细胞破碎后取出样品使用异硫氰酸胍-酚法获得RNA粗提物，后对该粗提物进行羟基纳米磁珠吸附RNA检测。
向破碎好的样品液体中加入本发明的一定重量的羟基纳米磁珠(可是2-5克)(实施例子2中的处理过的羟基纳米磁珠)，将烧杯放在磁力架上进行RNA的羟基纳米磁珠吸附，10min后取出羟基纳米磁珠，用洗涤液冲洗3遍，后加入50μL洗脱液洗脱羟基纳米磁珠上的RNA，静置2min后使用移液器将含有RNA的溶液至新管，获得RNA样本并测定其OD值及浓度，未经过处理的羟基纳米磁珠作为对照。
对羟基纳米磁珠洗脱的方法如下：
将含有已吸附RNA羟基纳米磁珠的离心管中加入500μL无水乙醇洗涤RNA，充分震荡后弃溶液，重复洗涤3次，将羟基纳米磁珠表面粘有的有机溶液尽量洗涤掉；打开离心管盖，室温静置3-5min，使羟基纳米磁珠表面的无水乙醇尽量挥发掉后加入50μL去离子水，静置2min后使用移液器将含有RNA的溶液至新管。
检测结果显示使用本发明的羟基纳米磁珠对细胞内的RNA吸附能力较高，其产物浓度较高并且纯度良好，RNA和蛋白干扰较少，可使提取的RNA浓度达到500ng/μL以上。
表4：实施例3中处理和未处理的羟基纳米磁珠提取RNA产物中OD值、浓度及降解率检测结果(A1-A3：本发明羟基纳米磁珠；A4-A6：未处理羟基纳米磁珠)
Figure BDA0001585812110000131
通过处理和未处理的羟基纳米磁珠提取RNA产物中的OD值检测结果可以看出，本发明的羟基纳米磁珠提取的RNA样本液中的OD值均在1.80-1.90之间，具有较高的纯度，可以很好的排除对RNA和蛋白等杂质的吸附，并且其浓度可以达到300ng/μL以上，而未处理的羟基纳米磁珠提取的样本液中RNA的纯度和浓度均较低。同时RNA的降解率降低50％。结果表明本发明的羟基纳米磁珠具有显著的吸附RNA的特性，并且可以有效的降低RNA降解率。
本文中用来描述方法的术语和表达方式并不是唯一不变的，并且我们没有任何意图使用这些术语和表达方式来排除描述本发明或者特征的任何相同意义的表达方式，我们认同在本发明声明的范围内的各种不同的表达方式。因此，我们认为尽管在本文中本发明已经用各种具体方案和任意的特征描述清楚地展示出来，但是改变本文中揭示的设计的表达方式还要求助于那些有经验的专业技术人士，并且这些改变要与本发明附带的声明一致。文章、专利、专利应用和所有其它文档的内容以及本文中提到的和引证的有用的电子化信息是结合在一起的，必须作为一个完整的内容来参考，发表其中任何一个部分都要特别指明这一点。申请者具有将任何和全部的这些文章、专利、专利应用或其它文档的信息和材料合并入该申请书作为本专利说明书揭示的一部分的权利。

Claims (4)

1.一种羟基纳米磁珠法产菌核真菌RNA提取试剂盒，其特征在于包括：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ、洗涤液、洗脱液和羟基纳米磁珠悬浮液；
所述羟基纳米磁珠悬浮液：羟基纳米磁珠材质为纳米磁性氧化铁，直径为500纳米；
所述溶液Ⅰ由10mmol/L的Trizol、15mmol/L的Tris-HCl、10mmol/L的NaCl和10mmol/L的EDTA组成，pH值为8.0；
所述溶液Ⅱ为氢氧化钠溶液稀释的1-1.5％的SDS溶液、和8mol/L的LiCl，其中NaOH溶液的浓度为0.2mol/L ；
所述溶液Ⅲ为氯仿和异戊醇，氯仿和异戊醇体积比为24:1；
所述溶液Ⅳ为异丙醇和醋酸钾溶液，醋酸钾溶液浓度为8mol/L；
所述洗涤液为乙醇溶液；
所述洗脱液为去离子水；
其中，所述的羟基纳米磁珠悬浮液经过如下处理步骤处理：对羟基纳米磁珠悬浮液进行离心，去掉溶剂保留磁珠，然后把羟基纳米磁珠在5mol/L的Trizol溶液进行浸泡5-10小时后用pH7.0的PBS缓冲液冲洗5-8次，将取出的羟基纳米磁珠再浸入8mol/L的双甘膦溶液5-6小时，PBS缓冲液冲洗5-8次后备用。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述羟基纳米磁珠悬浮液浓度为40-50mg/ml。
3.一种利用如权利要求1所述的试剂盒进行羟基纳米磁珠法产菌核真菌RNA提取的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一：在无菌条件下将培养好的真菌的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于300mg，加入100μL溶液Ⅰ，用液氮进行冷冻研磨，后再加100μL溶液Ⅰ，震荡混匀；
步骤二：加入250μL溶液Ⅱ，充分混匀，4℃12000rpm离心5min，取上清至新管中；
步骤三：加入500μL溶液Ⅲ，轻轻上下翻动5-6次；4℃12000rpm离心5min，取上清至新管中；
步骤四：加入溶液Ⅲ，轻轻上下翻动，使菌液充分裂解成透明的溶液；4℃12000rpm离心5min，取上清至新管中；
步骤五：将离心管放在冰上，加入350μL溶液Ⅳ，轻轻上下翻动，直至有白色絮状物形成，静置2min；
步骤六：加入50μL羟基纳米磁珠悬浮液，轻轻上下翻动，在冰上静置2min；
步骤七：将离心管放置于磁力架上，静置1min使溶液变透明，弃溶液；
其中，所述的羟基纳米磁珠悬浮液经过如下处理步骤处理：羟基纳米磁珠在5mol/L的Trizol溶液进行浸泡5-10小时后用pH7.0的PBS缓冲液冲洗5-8次，将取出的羟基纳米磁珠再浸入8mol/L的双甘膦溶液5-6小时，PBS缓冲液冲洗5-8次后备用。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，还包括对步骤七之后的对羟基纳米磁珠的洗涤和洗脱步骤：将含有已吸附RNA羟基纳米磁珠的离心管中加入500μL无水乙醇洗涤RNA，充分震荡后弃溶液，重复洗涤3次，将羟基纳米磁珠表面粘有的有机溶液尽量洗涤掉；打开离心管盖，室温静置3-5min，使羟基纳米磁珠表面的无水乙醇尽量挥发掉后加入50μL去离子水，静置2min后使用移液器将含有RNA的溶液至新管。
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