CN109468311A - 一种提取质粒dna的菌体裂解液、试剂盒及提取质粒dna的方法 - Google Patents

一种提取质粒dna的菌体裂解液、试剂盒及提取质粒dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提取质粒DNA的菌体裂解液、试剂盒及提取质粒DNA的方法，属于生物技术领域。本发明提取质粒DNA的菌体裂解液由裂解缓冲液、溶菌酶、RNase A组成，裂解缓冲液的组成为：每100mL裂解缓冲液中含有1.5～10g蔗糖、0.7～2.2g乙二胺四乙酸二钠、0.3～0.9g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、2.7～5.4g NH4Cl、0.1～2.0mL 0.5％的Triton X‑100、0.2～0.6g CaCl2、0.5～8g盐酸胍、0.5～3g异硫氰酸胍，其余量为水。本发明提取质粒DNA的试剂盒，包括上述菌体裂解液、漂洗液和洗脱液。该试剂盒成本低、提取质粒纯度高、适用性好。

Description

一种提取质粒DNA的菌体裂解液、试剂盒及提取质粒DNA的 方法
技术领域
本发明涉及一种提取质粒DNA的菌体裂解液、试剂盒及提取质粒DNA的方法，属于生物技术领域。
背景技术
质粒DNA是现在分子生物学实验中常用的基因运载工具，在基因工程领域应用广泛。质粒DNA的分离提取是分子生物学实验中的一种常规技术，其提取效率、纯度和质量直接影响着后期分子生物学试验，如酶切、连接、大肠埃希菌的转化、转染哺乳动物细胞、PCR扩增和测序等过程的成败。
从原核生物中提取质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。较常用的菌体裂解方法有三种：煮沸法、去污剂(如TritonX-100和十二烷基磺酸钠)裂解法和碱裂解法。煮沸法操作简单、时间短，但是条件过于剧烈，易造成质粒断裂，回收率较低。去污剂裂解法比较温和，一般用于分离高拷贝质粒。目前质粒DNA最广泛的提取方法是采用强碱裂解法，需要用到三种溶液，溶液1的主要作用是将菌体沉淀悬浮起来；溶液2的主要作用是细胞裂解，溶液2包括两种成分：氢氧化钠和十二烷基磺酸钠(SDS)，氢氧化钠破坏细胞膜的结构，同时使染色体DNA氢键断裂，但是质粒DNA是超螺旋共价闭合的环状互补链相互盘绕，不会完全分离，SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀；溶液3的主要作用是中和第二步加入的强碱以及清除掉蛋白质等细胞内的杂质，主要包括醋酸钾和醋酸。溶液2中平均一个SDS分子就会结合两个氨基酸形成多肽复合体，同时变性的蛋白质与基因组DNA缠绕。当加入醋酸钾后，钾离子置换SDS中的钠离子生产十二烷基磺酸钾，十二烷基磺酸钾不易溶于水，从而将变性的蛋白质和绝大部分基因组DNA沉淀。其中醋酸的加入可以中和氢氧化钠，缓冲液恢复至中性，质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而染色体DNA较难复性形成缠绕的网状结构，与蛋白质-SDS复合物等通过离心沉淀。碱裂解法操作简单、质粒提取纯度高、质粒获得量较多且污染较少，但是该方法花费的时间较长。
德国Eppendorf公司发明了一步法提取质粒的方法，该方法简化了繁琐的提取步骤，但是只适用于高拷贝质粒的提取，不适合于大肠杆菌质粒的提取，而大肠杆菌是目前最常用的生产菌株，因此该方法具有一定的局限性。现有技术中也存在一步提取质粒DNA方法的报道，申请公布号为CN107254466A的中国发明专利申请公开了一种一步法提取质粒DNA的试剂盒和方法，该提取质粒DNA的试剂盒包括裂解试剂、漂洗液和洗脱缓冲液，其裂解试剂包括溶菌酶、RNaseA和裂解缓冲液，裂解缓冲液的组成为：每100mL中包括月桂酰基丙基甜菜碱5～10g、氯化钙1～2.5g、二甲基亚砜1～5g、甘油1～2.5g、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐1～2.5g、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐1～2.5g、三(羟甲基)氨基甲烷1～2.5g、盐酸胍1～3.5g、异硫氰酸胍1～2.5g、尿素5～10g、乙二胺四乙酸二钠1～2.5g，其余为水。该试剂盒及方法虽然适用于大肠杆菌，但是其裂解液配方复杂，成本高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种提取质粒DNA的菌体裂解液，该菌体裂解液中组分简单，裂解效果好，经济节约。
本发明还提供一种提取质粒DNA的试剂盒，该试剂盒的组分简单，成本低。
本发明还提供一种利用上述提取质粒DNA的试剂盒提取质粒DNA的方法。该方法提取质粒DNA操作简便，提取效率高。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种提取质粒DNA的菌体裂解液，所述提取质粒DNA的菌体裂解液由裂解缓冲液、溶菌酶、RNase A组成，裂解缓冲液的组成为：每100mL裂解缓冲液中含有1.5～10g蔗糖、0.7～2.2g乙二胺四乙酸二钠、0.3～0.9g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、2.7～5.4g NH4Cl、0.1～2.0mL 0.5％的Triton X-100、0.2～0.6g CaCl2、0.5～8.0g盐酸胍、0.5～3.0g异硫氰酸胍，其余量为水，所述菌体裂解液的pH为5.0～8.0。
上述菌体裂解液中，溶菌酶可以破坏大肠杆菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，使得质粒DNA和蛋白质快速从大肠杆菌细胞中释放出来。RNase A降解掉溶液中的RNA，在很大程度减少了质粒提取物中的RNA污染。
上述裂解缓冲溶液的组成中，蔗糖的作用是增加溶液的粘度，保证菌体悬浮，延缓大肠杆菌沉降的时间；乙二胺四乙酸二钠是二价金属离子螯合剂，抑制DNase的活性，抑制对DNA的降解；三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐溶液被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，同时构成裂解所用缓冲液体系的一部分。CaCl2可以增加细菌细胞膜的通透性，使得质粒更容易从细菌释放出来；Triton X-100是一种非离子型表面活性剂，可以裂解膜蛋白，促使质粒DNA释放出来；盐酸胍是强变性剂可溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，从核酸上解离下来，此外，RNA酶可被盐酸胍等还原剂灭活，异硫氰酸胍能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
上述成分组成了本发明独特的菌体裂解液，提高了裂解效率，降低了蛋白质和RNA引起的污染，同时也提高了质粒DNA与离心吸附柱的结合效率。
在100mL提取质粒DNA的菌体裂解液中，溶菌酶的用量为250～350mg、RNase A的用量为15～25mg。溶菌酶的用量为250～350mg时既能保证细胞壁较厚的菌体细胞壁能有效裂解，也能保证细胞壁较薄的菌体细胞壁的有效裂解，节约资源，RNase A的用量为15～25mg时可以解决由于不同细菌的RNA丰度存在差异而导致的RNA清除不完全的问题。
一种提取质粒DNA的试剂盒，包括菌体裂解液、漂洗液和洗脱液，所述菌体裂解液为上述提取质粒DNA的菌体裂解液。该试剂盒的组分简单，成本低，提取质粒消耗时间短。
上述漂洗液包括漂洗液I和漂洗液II，所述漂洗液I的组成为：每100mL漂洗液I中含有19.1～76.4g盐酸胍、0.16～0.8g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、50～70mL的无水乙醇，其余量为水；所述漂洗液II的组成为：每100mL漂洗液II中含有0.05～0.15g NaCl、0.02～0.08g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.2～0.4g乙二胺四乙酸二钠、40～60mL的无水乙醇，其余量为水。上述漂洗液I和II的组成可以高效地溶解细胞中的蛋白质和RNA等物质，防止DNA的降解。
上述洗脱液的组成为：每100mL洗脱液中含有0.2g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.04g乙二胺四乙酸二钠，其余量为水。该洗脱液的组成可以使质粒DNA更好的从吸附柱上洗脱出来。
上述试剂盒还包括硅基质吸附柱。硅基质吸附柱上的硅基质膜可以与核酸特异性结合，将质粒DNA特异性的附着在吸附柱上，利用硅基质吸附柱安全性和核酸提取纯度更高、使用更简便。
利用上述提取质粒DNA的试剂盒提取质粒DNA的方法，包括以下步骤：
(1)菌体收集：从培养的菌液中收集菌体沉淀；
(2)菌体裂解：在菌体沉淀中加入预冷的菌体裂解液，混匀，悬浮菌体沉淀，得菌体裂解物；
(3)质粒DNA的纯化：将菌体裂解物室温静置30s～2min，离心，取上清转入硅基质吸附柱中，室温静置20s～2min；
(4)离心，弃废液，再向吸附柱中依次加入漂洗液Ⅰ、漂洗液Ⅱ进行漂洗，最后加入洗脱液，得到质粒DNA溶液。
该提取方法整个提取质粒DNA的时间仅需要5min左右，此外该方法适用性高，对于拷贝数较低或大于10kb的质粒均适用。
步骤(3)所述的离心为4000～7000r/min离心20～50s。通过4000～7000r/min、20～50s的离心可以使质粒DNA与其他杂质初步分离。
步骤(4)所述的离心为10000～13000r/min离心20～50s。此处10000～13000r/min离心20～50s可以使质粒DNA快速吸附于吸附柱上，离心用时短，操作方便，便于下一步的漂洗。
步骤(4)所述的漂洗液I的用量为200～700μL，漂洗液II的用量为200～700μL、洗脱液的用量为40～100μL。上述各试剂的使用量，既能保证质粒中的蛋白质、RNA等杂质的高效洗脱，得到高质量的质粒DNA，又可以节约试剂使用量，避免了资源浪费。
附图说明
图1为本发明试验例1中从大肠杆菌培养物中提取高拷贝质粒的电泳图；
图2为本发明试验例2中从大肠杆菌培养物中提取低拷贝质粒的电泳图；
图3为本发明利用本发明的提取质粒DNA的方法的实施例1、提取质粒DNA的方法的实施例2、提取质粒DNA的方法对比例2、3的方法提取高拷贝质粒的效果对比图；
图1中，1泳道对应的是DL10000DNA Marker，2～5泳道对应的是利用本发明的试剂盒及方法提取的质粒DNA的条带；
图2中，1泳道对应的是DL10000DNA Marker，2～5泳道对应的是利用本发明的试剂盒及方法提取的质粒DNA的条带；
图3中，1泳道对应的是DL10000DNA Marker，2和3泳道分别对应的是利用提取质粒DNA的方法的实施例1和2中的方法提取的质粒DNA的条带，4和5泳道对应的是利用提取质粒DNA的方法的对比例2中的方法提取的质粒DNA的条带，6和7泳道对应的是利用提取质粒DNA的方法的对比例3中的方法提取的质粒DNA的条带。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明。
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实验试剂的配制：
(1)裂解缓冲液的配制：称取1.5～10g蔗糖、0.7～2.2g乙二胺四乙酸二钠、0.3～0.9g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、2.7～5.4g NH4Cl、0.1～2.0mL 0.5％的TritonX-100、0.2～0.6g CaCl2、0.5～8.0g盐酸胍和0.5～3.0g异硫氰酸胍，加去离子水定容至100mL，搅拌均匀，即为裂解缓冲溶液。
(2)漂洗液I的配制：称取19.1～76.4g盐酸胍、0.16～0.8g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、50～70mL的无水乙醇，加去离子水定容至100mL，搅拌均匀，即为漂洗液I，漂洗液I在25℃下的pH为6.0～8.0。
(3)漂洗液II的配制：称取0.05～0.15g NaCl、0.02～0.08g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.2～0.4g乙二胺四乙酸二钠、40～60mL的无水乙醇，加去离子水定容至100mL，搅拌均匀，即为漂洗液II，漂洗液II在25℃下的pH为6.0～8.0。
(4)洗脱液的配制：称取0.2g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.04g乙二胺四乙酸二钠加去离子水定容至100mL，搅拌均匀，即为洗脱液，洗脱液25℃下的pH为6.0～8.0。
菌体裂解液的实施例1
本实施例提取质粒DNA的菌体裂解液，由裂解缓冲液、溶菌酶、RNase A组成，每100mL菌体裂解液中包括溶菌酶350mg、RNase A 25mg，每100mL裂解缓冲液中含10g蔗糖、2.2g乙二胺四乙酸二钠、0.9g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、5.4g NH4Cl、2.0mL 0.5％的Triton X-100、0.6g CaCl2、8.0g盐酸胍、3.0g异硫氰酸胍，其余量为水，菌体裂解液的pH为5.0。
菌体裂解液的实施例2
本实施例提取质粒DNA的菌体裂解液，由裂解缓冲液、溶菌酶、RNase A组成，每100mL菌体裂解液中包括溶菌酶250mg、RNase A 15mg，每100mL裂解缓冲液中含1.5g蔗糖、0.7g乙二胺四乙酸二钠、0.3g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、2.7gNH4Cl、0.1mL 0.5％的Triton X-100、0.2g CaCl2、0.5g盐酸胍、0.5g异硫氰酸胍，其余量为水，菌体裂解液的pH为8.0。
菌体裂解液的实施例3
本实施例提取质粒DNA的菌体裂解液，由裂解缓冲液、溶菌酶、RNase A组成，每100mL菌体裂解液中包括溶菌酶300mg、RNase A 20mg，每100mL裂解缓冲液中含5g蔗糖、1g乙二胺四乙酸二钠、0.4g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、4.2gNH4Cl、1.5mL 0.5％的TritonX-100、0.31CaCl2、2.3g盐酸胍、1.4g异硫氰酸胍，其余量为水，菌体裂解液的pH为6.6。
提取质粒DNA的试剂盒的实施例1
本实施例提取质粒DNA的试剂盒，包括菌体裂解液、漂洗液I、漂洗液II和洗脱液，本实施例的菌体裂解液为提取质粒DNA的菌体裂解液的实施例1中的菌体裂解液。其中，漂洗液I的组成为：每100mL漂洗液I中含76.4g盐酸胍、0.8g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、70mL无水乙醇，其余量为水，所述漂洗液I在25℃下的pH为7.0；漂洗液II的组成为：每100mL漂洗液II中含0.15g NaCl、0.08g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.4g乙二胺四乙酸二钠、60mL的无水乙醇，其余量为水，所述漂洗液II在25℃下的pH为8.0；洗脱液的组成为：每100mL洗脱液中含0.16g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.04g乙二胺四乙酸二钠，其余量为水，所述洗脱液在25℃下的pH为8.0。
提取质粒DNA的试剂盒的实施例2
本实施例提取质粒DNA的试剂盒，包括菌体裂解液、漂洗液I、漂洗液II和洗脱液，本实施例的菌体裂解液为提取质粒DNA的菌体裂解液的实施例2中的菌体裂解液。其中，每100mL漂洗液I中含19.1g盐酸胍、0.16g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、50mL无水乙醇，其余量为水，所述漂洗液I在25℃下的pH为6.0；漂洗液II的组成为：每100mL漂洗液II中含0.05gNaCl、0.02g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.2g乙二胺四乙酸二钠、40mL的无水乙醇，其余量为水，所述漂洗液II在25℃下的pH为6.0；洗脱液的组成为：每100mL洗脱液中含0.16g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.04g乙二胺四乙酸二钠，其余量为水，所述洗脱液在25℃下的pH为8.0。
提取质粒DNA的方法的实施例1
本实施例提取质粒DNA的方法，采用上述提取质粒DNA的试剂盒的实施例1中的试剂盒进行，包括以下步骤：
(1)质粒的扩增和菌体收集：取1.5mL在LB培养基上过夜培养的大肠杆菌菌液加入离心管中，13000r/min离心30s，弃上清，收集菌体沉淀。
(2)菌体裂解：向菌体沉淀物中加入400μL预冷的菌体裂解液，在移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀，得菌体裂解物。
(3)质粒DNA的纯化：将菌体裂解物室温放置2min，7000r/min离心20s，将上清转移到已转入收集管的吸附柱中，室温静置2min，13000r/min离心20s，弃废液；加入700μL漂洗液Ⅰ，继续13000r/min离心30s，弃废液；加入700μL漂洗液Ⅱ，13000r/min离心20s，弃废液；将吸附柱放入收集管中，于13000r/min离心20s，去除残余漂洗液I和II；将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜中间部位加入50μL洗脱液(提前65℃预热)，室温放置2min，13000r/min离心30s，得到质粒DNA溶液。
提取质粒DNA的方法的实施例2
本实施例提取质粒DNA的方法，采用上述提取质粒DNA的试剂盒的实施例2中的试剂盒进行，包括以下步骤：
(1)质粒的扩增和菌体收集：取2mL在LB培养基上过夜培养的大肠杆菌菌液加入离心管中，13000r/min离心30s，弃上清，收集菌体沉淀。
(2)菌体裂解：向菌体沉淀物中加入400μL预冷的菌体裂解液，在移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀，得菌体裂解物。
(3)质粒DNA的纯化：将菌体裂解物室温放置30s，4000r/min离心50s，将上清转移到已转入收集管的吸附柱中，室温静置20s，10000r/min离心50s，弃废液；加入200μL漂洗液Ⅰ，继续10000r/min离心30s，弃废液；加入200μL漂洗液Ⅱ，10000r/min离心1min，弃废液；将吸附柱放入收集管中，于10000r/min离心1min，去除残余漂洗液I和II；将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜中间部位加入70μL洗脱液(提前65℃预热)，室温放置2min，10000r/min离心1min，得到质粒DNA溶液。
提取质粒DNA的试剂盒的对比例1
本对比例提取质粒DNA的试剂盒，包括菌体裂解液、漂洗液I、漂洗液II和洗脱液。本对比例的菌体裂解液为菌体裂解液的实施例1中的菌体裂解液；漂洗液I的组成为：每100mL漂洗液I中含47.75g盐酸胍、0.3125g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、38mL的无水乙醇，漂洗液I在25℃下的pH为6.6；漂洗液II的组成为：每100mL漂洗液II中含0.117g NaCl、0.3125g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、80mL的无水乙醇，漂洗液II在25℃下的pH为7.5；洗脱液的组成为：每100mL洗脱液中含0.12g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.29g乙二胺四乙酸二钠，其余量为水，所述洗脱液在25℃下的pH为7.5。
提取质粒DNA的试剂盒的对比例2
本对比例的试剂盒为申请公布号为CN107254466A的中国发明专利申请公开的试剂盒，包括裂解试剂、漂洗液和洗脱缓冲液。其裂解试剂包括溶菌酶、RNase A和裂解缓冲液，裂解缓冲液：溶菌酶：RNase A(10mg/mL)按100mL：300mg:2mL的比例混合。裂解缓冲液的组成是：每100mL裂解缓冲液中包括10g月桂酰基丙基甜菜碱、l.lg CaCl2、2.5g二甲基亚砜、lg甘油、1.25g 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、1.36g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、1.65g三(羟甲基)氨基甲烷、2.39g盐酸胍、1.18g异硫氰酸胍、6g尿素、1.86g乙二胺四乙酸二钠，其余为水；漂洗液的组成为：终浓度为20mM Tris和200mM NaCl的水溶液(pH8.5)；洗脱缓冲液组成：10mM Tris(pH 8)。
提取质粒DNA的试剂盒的对比例3
本对比例提取质粒DNA的试剂盒为康为世纪高纯度质粒小提试剂盒(编号：CW0500)，该试剂盒包括Buffer P1、Buffer P2、Buffer N3、Buffer PB、Buffer PW、BufferEB和RNase A(10mg/ml)。
提取质粒DNA的方法的对比例1
本对比例提取质粒DNA的方法和提取质粒DNA的方法的实施例1的区别仅在于，将提取质粒DNA的试剂盒的实施例1中的试剂盒替换为提取质粒DNA的试剂盒的对比例1中的试剂盒。
提取质粒DNA的方法的对比例2
本对比例利用申请公布号为CN107254466A的中国发明专利申请公开的提取质粒DNA的试剂盒及其方法进行提取质粒DNA，具体操作按申请文件中公开的内容进行，包括如下步骤：
(1)质粒的扩增：取1.5mL过夜培养的大肠杆菌菌液，12000r/min离心lmin，弃上清，得菌体沉淀物。
(2)菌体裂解：向菌体沉淀物中加入500μL预冷的裂解试剂，涡旋振荡30s至菌体沉淀物完全溶解，得菌体裂解物。
(3)质粒DNA的纯化：将步骤(2)中的菌体裂解物室温放置2分钟后转入硅基质膜吸附柱中，12000r/min离心吸附30s，弃废液；再向硅基质膜吸附柱中加入300μL漂洗液，12000r/min脱盐离心30s，弃废液；最后再向硅基质膜吸附柱中加入50μL洗脱缓冲液，12000r/min洗脱离心30s，得到质粒DNA溶液。
提取质粒DNA的方法的对比例3
本对比例利用提取质粒DNA的试剂盒的对比例3中的试剂盒(编号：CW0500)进行提取质粒DNA，具体操作按试剂盒的说明书进行，包括以下步骤：
(1)取1.5mL过夜培养的菌液加入离心管中，13000r/min离心30s收集菌体沉淀，尽量吸弃上清。
(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL Buffer P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀。
(3)向离心管中加入250μL Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4～6次，充分混匀使菌体裂解，此时溶液应变得清亮粘稠。
(4)向离心管中加入350μL Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀8～10次，充分混匀，此时应出现白色絮状沉淀，13000r/min离心5min。
(5)将步骤(4)中所得的上清液转移到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns DM)中，13000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(6)向吸附柱中加入150μL Buffer PB，13000r/min离心30s。
(7)向吸附柱中加入400μL Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，13000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液。
(8)将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位加入50μL Buffer EB，室温放置2min，13000r/min离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。
试验例1
本试验例利用提取质粒DNA的方法的实施例1提供的方法从大肠杆菌培养物中提取高拷贝质粒，将提取的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，1泳道对应的是DL10000 DNA Marker，2～5泳道对应的是利用本发明的试剂盒及方法提取的质粒DNA的条带。将提取的质粒DNA用酶标仪检测纯度，其OD260/280在1.7～1.9之间。从电泳图和酶标仪检测结果可见，本发明的试剂盒和方法从大肠杆菌培养物中提取高拷贝质粒DNA含量高、无杂质、超螺旋质粒含量在90％以上，并且整个操作过程只需5min，提高了实验效率。
试验例2
本试验例利用提取质粒DNA的方法的实施例2提供的方法从大肠杆菌培养物中提取低拷贝质粒，将提取的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，1泳道对应的是DL10000 DNA Marker，2～5泳道对应的是利用本发明的试剂盒及方法提取的质粒DNA的条带。将提取的质粒DNA用酶标仪检测纯度，其OD260/280在1.7～1.9之间。从电泳图和酶标仪检测结果可见，本发明的试剂盒和方法从大肠杆菌培养物中提取高拷贝质粒DNA含量高、无杂质、超螺旋质粒含量在90％以上，并且整个操作过程只需5min，提高了实验效率。
试验例3
本试验例分别利用提取质粒DNA的方法的实施例1和2、提取质粒DNA的方法的对比例2和对比例3中提供的方法从大肠杆菌培养物中提取高拷贝质粒，将提取的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，1泳道对应的是DL10000 DNA Marker，2和3泳道分别对应的是利用提取质粒DNA的方法的实施例1和2中的方法提取的质粒DNA的条带，4和5泳道对应的是利用提取质粒DNA的方法的对比例2中的方法提取的质粒DNA的条带，6和7泳道对应的是利用提取质粒DNA的方法的对比例3中的方法提取的质粒DNA的条带。从电泳图结果可见，本发明的试剂盒和方法从大肠杆菌培养物中提取的高拷贝质粒DNA含量高、纯度高，提高了实验效率。
本发明适用于高拷贝和低拷贝质粒DNA的提取，所配制的试剂盒用最少的试剂配制而成，减少了质粒DNA提取的成本和时间，结合提供的提取方法，只需5min即可得到高纯度、高质量的质粒DNA，提高了实验效率。

Claims (10)

1.一种提取质粒DNA的菌体裂解液，其特征在于：所述提取质粒DNA的菌体裂解液由裂解缓冲液、溶菌酶、RNase A组成，裂解缓冲液的组成为：每100mL裂解缓冲液中含有1.5～10g蔗糖、0.7～2.2g乙二胺四乙酸二钠、0.3～0.9g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、2.7～5.4gNH4Cl、0.1～2.0mL 0.5％的Triton X-100、0.2～0.6g CaCl2、0.5～8.0g盐酸胍、0.5～3.0g异硫氰酸胍，其余量为水，所述菌体裂解液的pH为5.0～8.0。
2.根据权利要求1所述的提取质粒DNA的菌体裂解液，其特征在于：在100mL提取质粒DNA的菌体裂解液中，溶菌酶的用量为250～350mg、RNase A的用量为15～25mg。
3.一种提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于：包括菌体裂解液、漂洗液和洗脱液，所述菌体裂解液为权利要求1或2所述的提取质粒DNA的菌体裂解液。
4.根据权利要求3所述的提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于：所述漂洗液包括漂洗液I和漂洗液II，所述漂洗液I的组成为：每100mL漂洗液I中含有19.1～76.4g盐酸胍、0.16～0.8g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、50～70mL的无水乙醇，其余量为水；所述漂洗液II的组成为：每100mL漂洗液II中含有0.05～0.15g NaCl、0.02～0.08g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.2～0.4g乙二胺四乙酸二钠、40～60mL的无水乙醇，其余量为水。
5.根据权利要求3或4所述的提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于：所述洗脱液的组成为：每100mL洗脱液中含有0.2g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.04g乙二胺四乙酸二钠，其余量为水。
6.根据权利要求3所述的提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括硅基质吸附柱。
7.如权利要求3～6中任一项所述的提取质粒DNA的试剂盒提取质粒DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)菌体收集：从培养的菌液中收集菌体沉淀；
(2)菌体裂解：在菌体沉淀中加入预冷的菌体裂解液，混匀，悬浮菌体沉淀，得菌体裂解物；
(3)质粒DNA的纯化：将菌体裂解物室温静置30s～2min，离心，取上清转入硅基质吸附柱中，室温静置20s～2min；
(4)离心，弃废液，再向吸附柱中依次加入漂洗液Ⅰ、漂洗液Ⅱ进行漂洗，最后加入洗脱液，得到质粒DNA溶液。
8.根据权利要求7所述的提取质粒DNA的方法，其特征在于：步骤(3)所述的离心为4000～7000r/min离心20～50s。
9.根据权利要求7所述的提取质粒DNA的方法，其特征在于：步骤(4)所述的离心为10000～13000r/min离心20～50s。
10.根据权利要求7所述的提取质粒DNA的方法，其特征在于：步骤(4)所述的漂洗液I的用量为200～700μL，漂洗液II的用量为200～700μL、洗脱液的用量为40～100μL。
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