CN111804280A - 一种制备磁性纳米氨基复合物的方法、以及核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备磁性纳米氨基复合物的方法、以及核酸提取方法，包括如下步骤：步骤1、硅藻土纯化备用；清洗后将硅藻土放入烧瓶中，并加入去离子水；搅拌后静置，将上层清液分样离心，收集沉淀物用乙醇代替去离子水重复上述步骤，以进一步去除离子和蛋白杂质；最后，纯化的硅藻土在干燥箱中进行干燥，然后储存在试剂瓶中供使用；步骤2、硅藻土磁化处理；磁性硅藻土DE@Fe3O4在干燥箱中干燥；步骤3、磁性硅藻土负载APTES，首先将APTES滴入乙醇溶液中，并用磁力搅拌器搅拌；接着，在上述溶液中加入磁性硅藻土，利用磁铁收集DE@Fe3O4@APTES；接着，分别用乙醇和去离子水洗涤；最后，DE@Fe3O4@APTES在干燥箱中干燥，储存在试剂瓶中供使用。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，具体而言，涉及一种制备磁性纳米氨基复合物的方法、以及核酸提取方法。
背景技术
核酸扩增检测(Nucleic acid amplification tests，NAATs)具有无与伦比的敏感性和特异性，被认为是一种强有力的明星方法，可诊断感染性和疾病相关的致病菌。提取高质量的核酸对于后续聚合酶链式反应(PCR)或等温扩增检测等过程至关重要。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的肺炎疫情暴发以来，普通实时荧光定量PCR核酸检测试剂的迅速上市和临床应用在患者临床诊断和疑似患者排查中发挥了重要作用，但是受核酸提取操作繁琐、耗时长、需要集中送样等限制，不能满足疑似患者、无症状感染者等排查诊断的需求。这就对于研发适用于现场应用的新型核酸提取方法提出了新需求。
核酸检测包括样品制备、模板扩增和信号检测三个关键过程。大多数的研究和成果都致力于改进扩增和检测过程。尽管核酸提取不仅对临床疾病诊断，而且对生命科学研究都至关重要，但相比之下，很少有人致力于解决样品制备(核酸提取)过程中出现的瓶颈。传统的核酸提取纯化方法包括液-液提取纯化法、固相提取纯化法。目前的方法存在诸多限制，如需要使用可能抑制PCR酶活性的离液试剂或其他危险化学品；繁琐的样品处理步骤和严格的清洗步骤；需要离心机、真空器、涡流器等实验室设备，劳动强度大、耗时长；复杂的制备步骤包括膜/硅基基质/微或纳米尺度的衬底的安装和制造等。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出一种制备磁性纳米氨基复合物的方法，包括如下步骤：
步骤1、硅藻土纯化备用；首先清洗硅藻土，去除大颗粒、碎片、油脂和离子；然后，将硅藻土放入烧瓶中，并加入去离子水；接着，搅拌后静置，将上层清液分样离心，收集沉淀物用乙醇代替去离子水重复上述步骤，以进一步去除离子和蛋白杂质；最后，纯化的硅藻土在干燥箱中进行干燥，然后储存在试剂瓶中供使用；
步骤2、硅藻土磁化处理；首先将纯化的硅藻土与去离子水混合，接着倒入双颈烧瓶中油浴；加入铁溶液、氢氧化铵调节pH值；混合溶液在机械搅拌；接下来，将DE@Fe3O4倒入烧杯中，利用磁铁进行收集；然后，DE@Fe3O4分别用乙醇和去离子水洗涤；最后，磁性硅藻土DE@Fe3O4在干燥箱中干燥，储存在试剂瓶中供使用；
步骤3、磁性硅藻土负载APTES，首先将APTES滴入乙醇溶液中，并用磁力搅拌器搅拌；接着，在上述溶液中加入磁性硅藻土，用磁力搅拌器搅拌；然后，利用磁铁收集DE@Fe3O4@APTES；接着，DE@Fe3O4@APTES分别用乙醇和去离子水洗涤；最后，DE@Fe3O4@APTES在干燥箱中干燥，储存在试剂瓶中供使用。
进一步的，所述步骤1具体包括：在赋磁之前，将硅藻土DE经过清洗，去除大颗粒、碎片、油脂和离子；然后，将化硅藻土放入烧瓶中，并加入一定质量的去离子水；接着，在500rpm转速条件下搅拌5分钟，然后静置1分钟；接着，将上层清液倒入一个新的烧瓶；然后，使用50mL离心管进行分样离心；随后，收集沉淀物并放入又一个新的烧瓶中；接着，用99％乙醇代替去离子水重复上述步骤，以进一步去除离子和蛋白杂质；最后，纯化的硅藻土在干燥箱中进行干燥，然后储存在试剂瓶中供使用。
进一步的，所述步骤2具体包括：在涂覆APTES之前，首先将1g纯化的硅藻土与150mL去离子水混合，接着倒入300mL双颈烧瓶中，双颈烧瓶被置于80℃油浴中；接着，向双颈烧瓶中加入5mL的铁溶液，其中包含0.6mol L-1FeSO4·7H2O和1.1mol L-1FeCl3·6H2O；然后加入氢氧化铵调节pH值为11；混合溶液在100℃条件下机械搅拌30分钟；接下来，将DE@Fe3O4倒入烧杯中，利用磁铁进行收集；然后，DE@Fe3O4分别用乙醇和去离子水洗涤；最后，磁性硅藻土DE@Fe3O4在干燥箱中干燥，储存在试剂瓶中供使用。
进一步的，所述步骤3具体包括：涂覆APTES时，首先，将4mL APTES滴入200mL 95％乙醇溶液中，并用磁力搅拌器搅拌5分钟；接着，在上述溶液中加入1g磁性硅藻土，用磁力搅拌器搅拌12小时，搅拌速度设定为600rpm；然后，利用磁铁收集DE@Fe3O4@APTES；接着，DE@Fe3O4@APTES分别用乙醇和去离子水洗涤。最后，DE@Fe3O4@APTES在干燥箱中干燥，储存在试剂瓶中供使用。
根据本发明的另一方面，还提出一种基于DE@Fe3O4@APTES的核酸提取试剂，其成分包括裂解液、结合液、清洗液和洗脱液，所述裂解液为：20μL蛋白酶K和200μL浓度为1摩尔的异硫氰酸胍，和浓度V/V为1％的Triton x-100的混合液，结合液为：浓度为50mg/mL的DE@Fe3O4@APTES 20μL，浓度为100mg/mL的庚二亚氨酸二甲酯80μL；清洗液为：1000μL 70％乙醇和1000μL去离子水；洗脱液包括：160μL NaHCO3，浓度为10mM，pH＝10.5。
根据本发明的另一方面，还提出一种基于DE@Fe3O4@APTES的核酸提取方法，包括以下步骤：
1)对样本进行裂解，释放核酸，得到裂解液；
2)步骤1)裂解处理后的裂解液，加入DE@Fe3O4@APTES和庚二亚氨酸二甲酯；得到混合样本；
3)对步骤2)得到的混合样本，庚二亚氨酸二甲酯用于介导DNA序列的两个粘性末端与位于DE@Fe3O4@APTES上的氨基团之间的可逆交联反应；DNA通过DNA@庚二亚氨酸二甲酯复合物与DE@Fe3O4@APTES的氨基基团之间的交联反应而被富集；
4)对步骤2)得到的混合样本，采用磁铁回收DE@Fe3O4@APTES，然后使用乙醇清洗蛋白质和离子，采用去离子水进一步清洗；得到清洗后的DE@Fe3O4@APTES；
对步骤4)处理后的DE@Fe3O4@APTES，加入NaHCO3洗脱液使DNA释放。
根据本发明的另一方面，还提出一种与DE@Fe3O4@APTES核酸提取试剂配合的微流控芯片，微流控芯片设有八个功能腔体，腔体体积足以容纳基于DE@Fe3O4@APTES的核酸提取试剂中所需的试剂，包括220μL裂解液、100μL结合液、1000μL 70％乙醇、1000μL去离子水和160μL洗脱液；微流控芯片还设有七条气路通道和七条试剂注入通道；在整个核酸提取过程中，不同试剂存储腔对应不同气路通道和试剂注入通道，避免交叉污染；具体的：
第一气路通道与废液腔相互连接，废液腔通过废液排出通道与核酸提取腔相互连接；第二气路通道与裂解液存储腔相互连接，裂解液存储腔通过裂解液注入通道与核酸提取腔相互连接；第三气路通道与结合液存储腔相互连接，结合液存储腔通过结合液注入通道与核酸提取腔相互连接；第四气路通道与第一清洗液存储腔相互连接，第一清洗液存储腔通过第一清洗液注入通道与核酸提取腔相互连接；第五气路通道与第二清洗液存储腔相互连接，第二清洗液存储腔通过第二清洗液注入通道与核酸提取腔相互连接；第六气路通道与洗脱液存储腔相互连接，洗脱液存储腔通过洗脱液注入通道与核酸提取腔相互连接；第七气路通道与混合腔相互连接，混合腔通过混合通道与核酸提取腔相互连接；
微流控芯片连接到流体驱动单元，流体驱动单元的气源接口与微流控芯片的之间的对接是方式为，第一气源接口与第一气路通道相互连接；第二气源接口与第二气路通道相互连接；第三气源接口与第三气路通道相互连接；第四气源接口与第四气路通道相互连接；第五气源接口与第五气路通道相互连接；第六气源接口与第六气路通道相互连接；第七气源接口与第七气路通道相互连接。
根据本发明的另一方面，还提出一种流体驱动单元，包括七个电磁阀和一个蠕动泵；七个电磁阀通过组合连接排布构成七个气源接口；不同气源接口与微流控芯片的相应气路通道相互衔接；蠕动泵提供微流控芯片内部核酸提取过程中试剂流动所需的动力；具体包括：
第一电磁阀、第二电磁阀、第四电磁阀连接形成第一气源接口和第二气源接口；第一气源接口和第二气源接口位于第四电磁阀上；
所述第一电磁阀、第二电磁阀、第五电磁阀连接，形成第三气源接口和第四气源接口，所述第三气源接口和第四气源接口位于第五电磁阀上；
所述第一电磁阀、第三电磁阀、第六电磁阀连接，形成第五气源接口和第六气源接口，所述第五气源接口和第六气源接口位于第六电磁阀上；
第一电磁阀、第三电磁阀连接形成第七气源接口；所述第七气源接口位于第三电磁阀上；第一电磁阀与蠕动泵相互连接。
根据本发明的另一方面，还提出一种自动化核酸提取方法，包括以下步骤：
步骤一、裂解样本：
1)取200μL样本注入微流控芯片核酸提取腔；
2)对于步骤1)，启动流体驱动单元的蠕动泵，将存在于微流控芯片裂解液存储腔的20μL蛋白酶K和200μL浓度为1摩尔的异硫氰酸胍，和浓度V/V为1％的Triton x-100注入核酸提取腔；
3)对于步骤2)得到的混合液，采用60℃加热10min，使样本裂解，释放核酸；
步骤二、结合核酸：
4)对于步骤3)得到的裂解混合液，启动蠕动泵，将存在于微流控芯片结合液存储腔的20μL DE@Fe3O4@APTES和80μL庚二亚氨酸二甲酯注入核酸提取腔；
5)对于步骤4)得到的液体进行混合操作，启动蠕动泵施加混合力于核酸提取腔和混合腔之间，使DE@Fe3O4@APTES充分吸附核酸；
步骤三、杂质清洗：
6)对于步骤5)得到的混合液，使用磁铁富集DE@Fe3O4@APTES，剩余裂解废液；
7)移出步骤6)得到的裂解废液；
8)对于步骤6)得到的DE@Fe3O4@APTES，启动蠕动泵，将存在于微流控芯片第一清洗液存储腔和第二清洗液存储腔中的1000μL 70％乙醇和1000μL去离子水依次注入核酸提取腔，充分清洗DE@Fe3O4@APTES；
步骤四、洗脱核酸：
9)对于步骤8)得到的DE@Fe3O4@APTES，启动蠕动泵，将存在于微流控芯片洗脱液存储腔的160μL NaHCO3注入核酸提取腔；
10)对于步骤9)得到洗脱液，设定温度60℃，混合时间5分钟，使核酸充分释放。
有益效果：
1、本发明所述制备方法的工艺流程简单，操作简便，适宜于工业化大批量生产。制得的磁性纳米氨基复合物，磁响应性能强，表面氨基含量丰富，分散性优异，与核酸结合能力强，可用于复杂体液样本中核酸的提取，核酸得率高。
2、本发明提供的新型核酸提取试剂(DE@Fe3O4@APTES试剂盒)，在应用于核酸提取时，能够避免使用离液试剂，可实现核酸的高效率提取，减少了核酸提取过程中化学试剂的使用，减少对核酸的物理和化学伤害，提高了分离的核酸分子的质量，核酸分子适于进行的PCR扩增等进一步的生物学研究分析。
3、本发明提供的微流控芯片可以预埋新型核酸提取试剂中的所有试剂，可以实现全封闭式核酸提取。结合流体驱动控制单元，可有效加快核酸提取速率并降低成本。在缺乏高技能技术人员和仪器的情况下，简化和标准化提取程序，具有高重现性。
4、第一，DE@Fe3O4@APTES比表面积大，直接与核酸相接触，能够能显著加快吸附核酸的效率，避免或减少核酸在洗涤过程中的损失，保证核酸高效提取。第二，将DE@Fe3O4@APTES与低成本庚二亚氨酸二甲酯(庚二亚氨酸二甲酯)、乙醇、去离子水和NaHCO3组成新型核酸提取试剂，避免使用离液试剂，可实现核酸的高效率提取。第三，所述微流控芯片设计方案可以预埋所有核酸提取试剂，结合流体驱动系统，核酸提取过程无需人为干扰，在提高提取效率的情况下，有效降低了劳动强度并节省提取时间成本。
附图说明
图1为纯化硅藻土(Diatomite earth，DE)的SEM图像。
图2为(3-aminopropyl)triethoxysilane(APTES)官能团化的DE(DE@APTES)的SEM图像。
图3为Fe3O4官能团化DE(DE@Fe3O4)的SEM图像。
图4为Fe3O4官能团化DE(DE@Fe3O4)的局部SEM图像。
图5为APTES官能团化DE@Fe3O4(DE@Fe3O4@APTES)的SEM图像。
图6为APTES官能团化DE@Fe3O4(DE@Fe3O4@APTES)的SEM图像。
图7为本发明所用到的DE@Fe3O4@APTES磁性纳米氨基复合物的红外(FTIR)表征。
图8为本发明所用到的DE@Fe3O4@APTES磁性纳米氨基复合物的磁力回线(VSM)表征。
图9为本发明所用到的流体驱动控制单元的设计方案，用于实现微流控芯片上试剂的驱动控制，完成核酸自动化提取。
图10为本发明所用到的微流控芯片设计方案及内部试剂存储和管道分布示意图。
图11为PCR产物凝胶电泳图像。
图12为DE@Fe3O4@APTES试剂盒和商品化手工磁珠法试剂盒提取大肠杆菌工程菌DNA(80,000CFU/mL)的Ct值对比结果。
图13为DE@Fe3O4@APTES试剂盒提取不同体积的大肠杆菌工程菌DNA(1mL，200μL，20μL)的Ct值对比结果。
图14为DE@Fe3O4@APTES试剂盒和商品化手工磁珠法试剂盒提取预先混合在不同体液样本(PBS，尿液和血清)中的大肠杆菌工程菌DNA(80,000CFU/mL)的Ct值对比结果。
附图标记说明：1、第一电磁阀；2、第二电磁阀；3、第三电磁阀；4、第四电磁阀；5、第五电磁阀；6、第六电磁阀；7、第一气源接口；8、第二气源接口；9、第三气源接口；10、第四气源接口；11、第五气源接口；12、第六气源接口；13、第七气源接口；24、蠕动泵；
71、第一气路通道；81、第二气路通道；91、第三气路通道；101、第四气路通道；111、第五气路通道；121、第六气路通道；131、第七气路通道；14、裂解液存储腔；15、结合液存储腔；16、第一清洗液存储腔；17、第二清洗液存储腔；18、洗脱液存储腔19、废液腔；20、核酸提取腔；21、混合腔；22、DE@Fe3O4@APTES；23、磁铁；141、裂解液注入通道；151、结合液注入通道；161、第一清洗液注入通道；171、第二清洗液注入通道；181、洗脱液注入通道；191、废液排出通道；211、混合通道。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅为本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1磁性纳米氨基复合物制备
根据本发明的一个实施例1，提供了一种用于核酸提取的磁性纳米氨基复合物(DE@Fe3O4@APTES)的制备方法，该方法能制备出一种用于核酸提取的磁性材料。其制备包括以下步骤：
步骤1、硅藻土纯化备用
在赋磁之前，一定质量的商业化硅藻土DE(Diatomite earth，DE，CAS号91053-39-3)经过清洗，去除大颗粒、碎片、油脂和离子。然后，将商业化硅藻土放入烧瓶中，并加入一定质量的去离子水。接着，在500rpm转速条件下搅拌5分钟，然后静置1分钟。接着，将上层清液倒入一个新的烧瓶。然后，使用50mL离心管进行分样离心。随后，收集沉淀物并放入一个新的烧瓶中。接着，用99％乙醇代替去离子水重复上述步骤，以进一步去除离子和蛋白等杂质。最后，纯化的硅藻土在干燥箱中进行干燥，然后储存在试剂瓶中供使用。
步骤2、硅藻土磁化处理
在涂覆APTES之前，首先将1g纯化的硅藻土与150mL去离子水混合，接着倒入300mL双颈烧瓶中，双颈烧瓶被置于80℃油浴中。接着，向双颈烧瓶中加入5mL的铁溶液，其中包含0.6mol L-1FeSO4·7H2O和1.1mol L-1FeCl3·6H2O。然后加入氢氧化铵调节pH值为11。混合溶液在100℃条件下机械搅拌30分钟。接下来，将DE@Fe3O4倒入烧杯中，利用磁铁进行收集。然后，DE@Fe3O4分别用乙醇和去离子水洗涤。最后，磁性硅藻土DE@Fe3O4在干燥箱中干燥，储存在试剂瓶中供使用。
步骤3、磁性硅藻土负载APTES
涂覆APTES时，首先，将4mL APTES滴入200mL 95％乙醇溶液中，并用磁力搅拌器搅拌5分钟。接着，在上述溶液中加入1g磁性硅藻土，用磁力搅拌器搅拌12小时，搅拌速度设定为600rpm。然后，利用磁铁收集DE@Fe3O4@APTES。接着，DE@Fe3O4@APTES分别用乙醇和去离子水洗涤。最后，DE@Fe3O4@APTES在干燥箱中干燥，储存在试剂瓶中供使用。
本发明所用到的DE@Fe3O4@APTES的扫描电镜图像(SEM)如图1所示。图1表明DE表面光滑，有许多多孔结构。经APTES处理后，DE的表面发生了显著的变化，多孔结构被填充(图2)。本发明还发现，在加入Fe3O4之后，DE的多孔结构并没有改变(图3和图4)。然而，DE的表面变得粗糙，因为Fe3O4附着在DE表面(图3)。如图4所示，DE@Fe3O4@APTES的大量孔隙被APTES所覆盖。如图5和图6所示，DE@APTES和DE@Fe3O4@APTES的表面有一些细小颗粒，应该是Fe3O4。
本发明所用到的DE@Fe3O4@APTES的红外表征(FTIR)如图7所示。1097cm-1处的吸收峰归因于DE上Si-O-Si的不对称拉伸振动，而479、620和794cm-1处的吸收峰归因于DE@Fe3O4表面的Si-O。经过APTES修饰后的DE@Fe3O4，在1638cm-1处出现新的吸收峰。1638cm-1处的峰值是由于N-H拉伸、面内弯曲和面外弯曲振动引起的。这些特征表面APTES成功地对DE@Fe3O4实施了高效氨基功能化。
本发明所用到的DE@Fe3O4@APTES的磁力回线(VSM)表征如图8所示。DE@Fe3O4@APTES的磁滞回线呈S形，未观察到剩磁或矫顽力。室温下，最大饱和磁化强度为17.96emug-1。该结果低于纯Fe3O4(33.12emu g-1)，但与单独的DE@Fe3O4(20.9emu g-1)的磁力相当。
实施例2核酸提取试剂
根据本发明的实施例2，提供了一种由DE@Fe3O4@APTES、低成本庚二亚氨酸二甲酯、乙醇、去离子水和NaHCO3组成的核酸提取试剂(DE@Fe3O4@APTES试剂盒)，避免使用离液试剂，可实现核酸的高效率提取。
DE@Fe3O4@APTES试剂成分主要由裂解液、结合液、清洗液和洗脱液共同组成。裂解液包括：20μL蛋白酶K和200μL异硫氰酸胍(1M)和Triton x-100(1％)的混合液。结合液包括：20μL DE@Fe3O4@APTES(50mg/mL)，80μL庚二亚氨酸二甲酯(100mg/mL)。清洗液包括：1000μL 70％乙醇和1000μL去离子水。洗脱液包括：160μL NaHCO3(10mM，pH＝10.5)。
实施例3微流控芯片
根据本发明实施例3，提供了一种微流控芯片，该芯片能预埋上述实施例2所述DE@Fe3O4@APTES的所有试剂，配合流体驱动单元可完成核酸自动化提取，有效加快核酸提取的速率。同时，降低提取成本，经济实用。
微流控芯片设有多个功能腔体，包括裂解液存储腔14、结合液存储腔15、第一清洗液存储腔16、第二清洗液存储腔17、洗脱液存储腔18、废液腔19、核酸提取腔20、混合腔21。微流控芯片的腔体体积足以容纳DE@Fe3O4@APTES试剂盒中所需的试剂。
微流控芯片设有多条独立的试剂注入通道，包括裂解液注入通道141、结合液注入通道151、第一清洗液注入通道161、第二清洗液注入通道171、洗脱液注入通道181、废液排出通道191、混合通道211。在整个核酸提取过程中，不同试剂存储腔对应不同得流体通道，交叉污染被消除。
微流控芯片不同试剂腔设计有对应的气路通道，包括第一气路通道71、第二气路通道81、第三气路通道91、第四气路通道101、第五气路通道111、第六气路通道121、第七气路通道131。不同气路通道可与流体驱动单元的气源接口相互连接。流体驱动单元主要包括第一电磁阀1、第二电磁阀2、第三电磁阀3、第四电磁阀4、第五电磁阀5、第六电磁阀6、蠕动泵24。不同电磁阀通过特定的排布构成第一气源接口7、第二气源接口8、第三气源接口9、第四气源接口10、第五气源接口11、第六气源接口12、第七气源接口13。不同气源接口可以与微流控芯片不同试剂腔对应的动力源接口相互衔接。蠕动泵24可提供微流控芯片内部核酸提取过程中试剂流动所需的动力。
实施例4基于微流控芯片的核酸自动化提取方法
根据本发明实施例4，提供了一种基于微流控芯片，结合DE@Fe3O4@APTES试剂盒的核酸自动化提取方法。该提取方法提取核酸的浓度、纯度和完整性较好，避免了人为干扰误差，同时显著缩短了核酸提取时间。
核酸提取的原理如下：低成本庚二亚氨酸二甲酯是一种非离液试剂，可以介导DNA序列的两个粘性末端与位于DE@Fe3O4@APTES表面的氨基团之间可逆交联反应。DE@Fe3O4@APTES与DNA之间形成的共价结合可以在高pH(pH>10)条件下逆转，使DNA释放到洗脱缓冲液中。DE@Fe3O4@APTES作为磁性基质，可以方便地在微流控芯片中的实现分离和循环。将DE@Fe3O4@APTES试剂盒和微流控芯片相互结合，优势在于可以直接从临床样本中富集DNA，避免使用离液试剂，避免人为操作误差。此外，本发明提出的微流控芯片设计方案允许处理10μL到1mL内不同体积的样本，且可以在无人值守的情况下提取出高纯度的DNA。
实施例5核酸自动化提取实施例
根据本发明实施例5，首先提供了一种微流控芯片(图10)，可以结合DE@Fe3O4@APTES试剂盒实现核酸自动化提取。此外，提供了一个流体驱动单元，可以与微流控芯片精确对接(图9)。微流控芯片与流体驱动单元各个部件之间的对接关系：对于流体驱动单元，第一电磁阀1、第二电磁阀2、第四电磁阀4连接形成第一气源接口7和第二气源接口8。第一电磁阀1、第二电磁阀2、第五电磁阀5连接形成第三气源接口9和第四气源接口10。第一电磁阀1、第三电磁阀3、第六电磁阀6连接形成第五气源接口11和第六气源接口12。第一电磁阀1、第三电磁阀3组成第七气源接口13。第一电磁阀与蠕动泵24相互连接。
对于微流控芯片，第一气路通道与废液腔19相互连接，废液腔19通过废液排出通道191与核酸提取腔20相互连接。第二气路通道与裂解液存储腔14相互连接，裂解液存储腔14通过裂解液注入通道141与核酸提取腔20相互连接。第三气路通道与结合液存储腔15相互连接，结合液存储腔15通过结合液注入通道151与核酸提取腔20相互连接。第四气路通道与第一清洗液存储腔16相互连接，第一清洗液存储腔16通过第一清洗液注入通道161与核酸提取腔20相互连接。第五气路通道与第二清洗液存储腔17相互连接，第二清洗液存储腔17通过第二清洗液注入通道171与核酸提取腔20相互连接。第六气路通道与洗脱液存储腔18相互连接，洗脱液存储腔18通过洗脱液注入通道181与核酸提取腔20相互连接。第七气路通道与混合腔21相互连接，混合腔21通过混合通道211与核酸提取腔20相互连接。
流体驱动单元与微流控芯片之间的对接是方式为，第一气源接口7与第一气路通道71相互连接。第二气源接口8与第二气路通道81相互连接。第三气源接口与9第三气路通道91相互连接。第四气源接口10与第四气路通道101相互连接。第五气源接口11与第五气路通道111相互连接。第六气源接口12与第六气路通道121相互连接。第七气源接口13与第七气路通道131相互连接。
微流控芯片结合流体驱动单元完成病原体核酸自动化提取的步骤如下：
步骤1、样品裂解。首先，人工将样本注入核酸提取腔20。然后，将微流控芯片与流体驱动控制单元相互结合，开始自动化提取核酸。首先控制第一电磁阀1、第二电磁阀2、第四电磁阀4使第二气源接口8开启，并与微流控芯片第二气路通道81对接。来自蠕动泵24的压力通过第二气源接口8、第二气路通道81、裂解液存储腔14、裂解液注入通道141，将裂解液存储腔14中的裂解液推入核酸提取腔20。接着在60℃条件下，充分混合10分钟。对于混合操作，首先，控制第一电磁阀1、第三电磁阀3使第七气源接口13开启，并与微流控芯片第七气路通道131对接。然后，蠕动泵24往复运动，来自蠕动泵24的推拉力通过第七气源接口13、第七气路通道131、混合腔21、混合通道211到达核酸提取腔20，进而执行混合操作，使样本充分裂解。
步骤2、核酸绑定。首先控制第一电磁阀1、第二电磁阀2、第五电磁阀5使第三气源接口9开启，并与微流控芯片第三气路通道9对接。来自蠕动泵24的压力通过第三气源接口9、第三气路通道91、结合液存储腔15、结合液注入通道151，将结合液存储腔15中的结合液推入核酸提取腔20。接着在室温条件下，充分混合2分钟，使DE@Fe3O4@APTES22充分吸附DNA。对于混合操作，首先，控制第一电磁阀1、第三电磁阀3使第七气源13接口开启，并与微流控芯片第七气路通道131对接。然后，蠕动泵24往复运动，来自蠕动泵24的推拉力通过第七气源接口13、第七气路通道131、混合腔21、混合通道211到达核酸提取腔20，进而执行混合操作，使核酸充分吸附。
步骤3、杂质清洗。DE@Fe3O4@APTES22捕获DNA后，将一块磁铁23移至核酸提取腔20的底部富集DE@Fe3O4@APTES22。然后执行废液排出操作。为了清除废物，首先控制第一电磁阀1、第二电磁阀2、第四电磁阀4使第一气源接口7开启，并与微流控芯片第一气路通道71对接。然后，来自蠕动泵24的负压力通过第一气源接口7、第一气路通道71到达废液腔19，进而通过废液排出通道191将废液移至废液腔19。然后，与核酸绑定步骤相同，将第一清洗液存储腔16和第二清洗液存储腔17中的清洗液1和清洗液2，分别通过第一清洗液注入通道161和第二清洗液注入通道171依次注入核酸提取腔20，将残留的离子和蛋白碎片洗净，而核酸依然被固定在DE@Fe3O4@APTES22的表面。
步骤4、核酸洗脱。像核酸绑定步骤一样，将洗脱液存储腔18中的洗脱液通过洗脱液注入通道181注入核酸提取腔20。接着在60℃条件下，充分混合5分钟。对于混合操作，首先，控制第一电磁阀1、第三电磁阀3使第七气源接口7开启，并与微流控芯片第七气路通道71对接。然后，蠕动泵24往复运动，来自蠕动泵24的推拉力通过第七气源接口7、第七气路通道71、混合腔21、混合通道211到达核酸提取腔20，进而执行混合操作，使核酸充分洗脱。
实施例6扩增检测实施例
使用TAKARA TB Green II kit(RR820)完成PCR扩增检测。
扩增反应体系包括：DNA模版(2μL)，TB Green Premix Ex Taq II(10μL)，正向引物(1μL，10μM)，反向引物(1μL，10μM)和6μL去离子水，总反应体系20μL。
扩增条件：初始变性(95℃，30s)，45个扩增循环(95℃5s；60℃30s)。
引物设计：F1：GAGCCAGTGAAGAAGTACTCATCAGG；R1：CATACTTACATTTTTCTGCAAAGCG
对比例1
采用商品化手工磁珠法核酸提取试剂盒(QIAGEN kit)提取相同浓度的大肠杆菌工程菌样本(含有流感嗜血杆菌特异性核酸序列)。核酸的产量和纯度用NanoDrop 2000分光光度计测量。吸光度的比值(A260/A280)被用来评估纯度。凝胶电泳图像被用来评估核酸提取完整性。核酸质量采用罗氏LC96荧光定量PCR仪进行扩增并记录循环阈值(Cyclethreshold，Ct)。
结果分析：
核酸提取浓度和纯度分析：
DE@Fe3O4@APTES试剂盒提取800,000,000CFU/mL的大肠杆菌工程菌DNA的浓度为21.9ng/μL，纯度为2.02，商品化手工磁珠法试剂盒的Ct值为18.2ng/μL，纯度为1.84。
DE@Fe3O4@APTES试剂盒提取400,000,000CFU/mL的大肠杆菌工程菌DNA的浓度为16.5ng/μL，纯度为1.94，商品化手工磁珠法试剂盒的Ct值为14.7ng/μL，纯度为1.99。
核酸提取灵敏度分析：
DE@Fe3O4@APTES试剂盒提取80CFU/mL的大肠杆菌工程菌DNA的Ct值为31.5，商品化手工磁珠法试剂盒的Ct值为33.14。
DE@Fe3O4@APTES试剂盒提取8CFU/mL的大肠杆菌工程菌DNA的Ct值为32.28，商品化手工磁珠法试剂盒的Ct值为34.01。
DE@Fe3O4@APTES试剂盒提取2CFU/mL的大肠杆菌工程菌DNA的Ct值为32.73，商品化手工磁珠法试剂盒的Ct值为32.09。
核酸提取性能分析：
如图11所示，本发明提取的大肠杆菌工程菌DNA呈现明显目标条带，说明提取的DNA完整性良好。图中从左到右显示的图像中的数字依次是：1-marker；2-DE@Fe3O4@APTES试剂盒提取大肠杆菌工程菌DNA(800,000,000CFU/mL)；3-商品化手工磁珠法试剂盒提取大肠杆菌工程菌DNA(800,000,000CFU/mL)；4-DE@Fe3O4@APTES试剂盒提取大肠杆菌工程菌DNA(400,000,000CFU/mL)；5-商品化手工磁珠法试剂盒提取大肠杆菌工程菌DNA(400,000,000CFU/mL)。注：大肠杆菌工程菌包含有流感嗜血杆菌特异性核酸序列。
如图12所示，本发明提取的大肠杆菌工程菌DNA(80,000CFU/mL)扩增Ct值较商品化手工磁珠法试剂盒提前1.5个Ct值。这种差异可能是由于不同的核酸吸附原理造成的。因为化学共价结合比物理沉淀更强，所以经过多次洗涤后，DE@Fe3O4@APTES上残留的DNA更多。另一方面，经过乙醇和去离子水清洗后，微流控芯片的核酸提取腔内没有残留PCR抑制剂。
如图13所示，采用DE@Fe3O4@APTES试剂盒提取1mL的大肠杆菌工程菌DNA，其Ct值分别低于200μL样本和20μL样本2周期和5.3周期，表明DNA提取量随着样本量的增加而增加。
实际临床样品中往往含有大量杂质，会影响核酸提取效率。因此，有必要确定使用1×PBS稀释样品优化的DE@Fe3O4@APTES试剂盒是否能满足复杂生物样品中核酸提取的要求。如图14所示，无论是血清还是尿液，其Ct值与1×PBS相比没有显著性差异，这意味着本发明适用于提取实际样本中的病原体核酸。
综上，本发明提出了一种用于核酸提取的磁性纳米氨基复合物(DE@Fe3O4@APTES)的制备方法、DE@Fe3O4@APTES核酸提取试剂盒组成成分及微流控芯片上的核酸提取方法。
具体实施例仅用于说明本发明，并不局限于此。在由本发明权利要求所限定的发明实质和范围内对本发明进行细微的改变均落在本发明的保护范围内。
本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分步骤，并可以设计相关的软硬件程序指令来完成。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。
本领域普通技术人员依然可以对其进行技术方案进行修改，而这些修改并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种制备磁性纳米氨基复合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、硅藻土纯化备用；首先清洗硅藻土，去除大颗粒、碎片、油脂和离子；然后，将硅藻土放入烧瓶中，并加入去离子水；接着，搅拌后静置，将上层清液分样离心，收集沉淀物用乙醇代替去离子水重复上述步骤，以进一步去除离子和蛋白杂质；最后，纯化的硅藻土在干燥箱中进行干燥，然后储存在试剂瓶中供使用；
步骤2、硅藻土磁化处理；首先将纯化的硅藻土与去离子水混合，接着倒入双颈烧瓶中油浴；加入铁溶液、氢氧化铵调节pH值；混合溶液在机械搅拌；接下来，将DE@Fe3O4倒入烧杯中，利用磁铁进行收集；然后，DE@Fe3O4分别用乙醇和去离子水洗涤；最后，磁性硅藻土DE@Fe3O4在干燥箱中干燥，储存在试剂瓶中供使用；
步骤3、磁性硅藻土负载APTES，首先将APTES滴入乙醇溶液中，并用磁力搅拌器搅拌；接着，在上述溶液中加入磁性硅藻土，用磁力搅拌器搅拌；然后，利用磁铁收集DE@Fe3O4@APTES；接着，DE@Fe3O4@APTES分别用乙醇和去离子水洗涤；最后，DE@Fe3O4@APTES在干燥箱中干燥，储存在试剂瓶中供使用。
2.根据权利要求1所述的一种制备磁性纳米氨基复合物的方法，其特征在于，所述步骤1具体包括：
在赋磁之前，将硅藻土DE经过清洗，去除大颗粒、碎片、油脂和离子；然后，将化硅藻土放入烧瓶中，并加入一定质量的去离子水；接着，在500rpm转速条件下搅拌5分钟，然后静置1分钟；接着，将上层清液倒入一个新的烧瓶；然后，使用50mL离心管进行分样离心；随后，收集沉淀物并放入又一个新的烧瓶中；接着，用99％乙醇代替去离子水重复上述步骤，以进一步去除离子和蛋白杂质；最后，纯化的硅藻土在干燥箱中进行干燥，然后储存在试剂瓶中供使用。
3.根据权利要求1所述的一种制备磁性纳米氨基复合物的方法，其特征在于，所述步骤2具体包括：
在涂覆APTES之前，首先将1g纯化的硅藻土与150mL去离子水混合，接着倒入300mL双颈烧瓶中，双颈烧瓶被置于80℃油浴中；接着，向双颈烧瓶中加入5mL的铁溶液，其中包含0.6mol L-1FeSO4·7H2O和1.1mol L-1FeCl3·6H2O；然后加入氢氧化铵调节pH值为11；混合溶液在100℃条件下机械搅拌30分钟；接下来，将DE@Fe3O4倒入烧杯中，利用磁铁进行收集；然后，DE@Fe3O4分别用乙醇和去离子水洗涤；最后，磁性硅藻土DE@Fe3O4在干燥箱中干燥，储存在试剂瓶中供使用。
4.根据权利要求1所述的一种制备磁性纳米氨基复合物的方法，其特征在于，所述步骤3具体包括：涂覆APTES时，首先，将4mL APTES滴入200mL 95％乙醇溶液中，并用磁力搅拌器搅拌5分钟；接着，在上述溶液中加入1g磁性硅藻土，用磁力搅拌器搅拌12小时，搅拌速度设定为600rpm；然后，利用磁铁收集DE@Fe3O4@APTES；接着，DE@Fe3O4@APTES分别用乙醇和去离子水洗涤。最后，DE@Fe3O4@APTES在干燥箱中干燥，储存在试剂瓶中供使用。
5.一种基于DE@Fe3O4@APTES的核酸提取试剂，其特征在于，其成分包括裂解液、结合液、清洗液和洗脱液，所述裂解液为：20μL蛋白酶K和200μL浓度为1摩尔的异硫氰酸胍，和浓度V/V为1％的Triton x-100的混合液，结合液为：浓度为50mg/mL的DE@Fe3O4@APTES 20μL，浓度为100mg/mL的庚二亚氨酸二甲酯80μL；清洗液为：1000μL 70％乙醇和1000μL去离子水；洗脱液包括：160μL NaHCO3，浓度为10mM，pH＝10.5。
6.一种基于DE@Fe3O4@APTES的核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对样本进行裂解，释放核酸，得到裂解液；
2)步骤1)裂解处理后的裂解液，加入DE@Fe3O4@APTES和庚二亚氨酸二甲酯；得到混合样本；
3)对步骤2)得到的混合样本，庚二亚氨酸二甲酯用于介导DNA序列的两个粘性末端与位于DE@Fe3O4@APTES上的氨基团之间的可逆交联反应；DNA通过DNA@庚二亚氨酸二甲酯复合物与DE@Fe3O4@APTES的氨基基团之间的交联反应而被富集；
4)对步骤2)得到的混合样本，采用磁铁回收DE@Fe3O4@APTES，然后使用乙醇清洗蛋白质和离子，采用去离子水进一步清洗；得到清洗后的DE@Fe3O4@APTES；
对步骤4)处理后的DE@Fe3O4@APTES，加入NaHCO3洗脱液使DNA释放。
7.一种与DE@Fe3O4@APTES核酸提取试剂配合的微流控芯片，其特征在于：
微流控芯片设有八个功能腔体，各功能腔体体积足以容纳基于DE@Fe3O4@APTES的核酸提取试剂中所需的试剂，包括220μL裂解液、100μL结合液、1000μL 70％乙醇、1000μL去离子水和160μL洗脱液；微流控芯片还设有七条气路通道和七条试剂注入通道；在整个核酸提取过程中，不同试剂存储腔对应不同气路通道和试剂注入通道，避免交叉污染；具体的：
第一气路通道与废液腔相互连接，废液腔通过废液排出通道与核酸提取腔相互连接；
第二气路通道与裂解液存储腔相互连接，裂解液存储腔通过裂解液注入通道与核酸提取腔相互连接；第三气路通道与结合液存储腔相互连接，结合液存储腔通过结合液注入通道与核酸提取腔相互连接；第四气路通道与第一清洗液存储腔相互连接，第一清洗液存储腔通过第一清洗液注入通道与核酸提取腔相互连接；第五气路通道与第二清洗液存储腔相互连接，第二清洗液存储腔通过第二清洗液注入通道与核酸提取腔相互连接；第六气路通道与洗脱液存储腔相互连接，洗脱液存储腔通过洗脱液注入通道与核酸提取腔相互连接；第七气路通道与混合腔相互连接，混合腔通过混合通道与核酸提取腔相互连接；
微流控芯片连接到流体驱动单元，流体驱动单元的气源接口与微流控芯片的之间的对接是方式为，第一气源接口与第一气路通道相互连接；第二气源接口与第二气路通道相互连接；第三气源接口与第三气路通道相互连接；第四气源接口与第四气路通道相互连接；第五气源接口与第五气路通道相互连接；第六气源接口与第六气路通道相互连接；第七气源接口与第七气路通道相互连接。
8.一种流体驱动单元，其特征在于：包括七个电磁阀和一个蠕动泵；七个电磁阀通过组合连接排布构成七个气源接口；不同气源接口与微流控芯片的相应气路通道相互衔接；蠕动泵提供微流控芯片内部核酸提取过程中试剂流动所需的动力；具体包括：
第一电磁阀、第二电磁阀、第四电磁阀连接形成第一气源接口和第二气源接口；第一气源接口和第二气源接口位于第四电磁阀上；
所述第一电磁阀、第二电磁阀、第五电磁阀连接，形成第三气源接口和第四气源接口，所述第三气源接口和第四气源接口位于第五电磁阀上；
所述第一电磁阀、第三电磁阀、第六电磁阀连接，形成第五气源接口和第六气源接口，所述第五气源接口和第六气源接口位于第六电磁阀上；
第一电磁阀、第三电磁阀连接形成第七气源接口；所述第七气源接口位于第三电磁阀上；第一电磁阀与蠕动泵相互连接。
9.一种自动化核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、裂解样本：
1)取200μL样本注入微流控芯片核酸提取腔；
2)对于步骤1)，启动流体驱动单元的蠕动泵，将存在于微流控芯片裂解液存储腔的20μL蛋白酶K和200μL浓度为1摩尔的异硫氰酸胍，和浓度V/V为1％的Triton x-100注入核酸提取腔；
3)对于步骤2)得到的混合液，采用60℃加热10min，使样本裂解，释放核酸；
步骤二、结合核酸：
4)对于步骤3)得到的裂解混合液，启动蠕动泵，将存在于微流控芯片结合液存储腔的20μL DE@Fe3O4@APTES和80μL庚二亚氨酸二甲酯注入核酸提取腔；
5)对于步骤4)得到的液体进行混合操作，启动蠕动泵施加混合力于核酸提取腔和混合腔之间，使DE@Fe3O4@APTES充分吸附核酸；
步骤三、杂质清洗：
6)对于步骤5)得到的混合液，使用磁铁富集DE@Fe3O4@APTES，剩余裂解废液；
7)移出步骤6)得到的裂解废液；
8)对于步骤6)得到的DE@Fe3O4@APTES，启动蠕动泵，将存在于微流控芯片第一清洗液存储腔和第二清洗液存储腔中的1000μL 70％乙醇和1000μL去离子水依次注入核酸提取腔，充分清洗DE@Fe3O4@APTES；
步骤四、洗脱核酸：
9)对于步骤8)得到的DE@Fe3O4@APTES，启动蠕动泵，将存在于微流控芯片洗脱液存储腔的160μL NaHCO3注入核酸提取腔；
10)对于步骤9)得到洗脱液，设定温度60℃，混合时间5分钟，使核酸充分释放。
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