CN101684138A - 一种应用纳米磁珠纯化核酸的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种应用纳米磁珠提取核酸的试剂盒，尤其可以从人血浆或血清或尿液中纯化出病毒及革兰氏阴性菌的核酸，可以快速、灵敏地大规模纯化核酸。该试剂盒由裂解液，磁珠缓冲液，洗涤缓冲液1，洗涤缓冲液2，洗涤缓冲液3，洗脱缓冲液，平衡液组成。本发明提取核酸速度快，灵敏度高，并且比传统核酸纯化方法具有自动化升级的潜力，使得核酸提取的大规模集成化，均一性成为可行。

Description

一种应用纳米磁珠纯化核酸的试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸(包括DNA和RNA)纯化产品，具体的说，涉及一种应用纳米磁珠从人体液中(如血浆或血清或尿液)纯化出病毒及革兰氏阴性菌核酸的试剂盒。

背景技术

核酸是一类生物信息高分子化合物，自它首次被从细胞中分离出来，经历了一百多年的历史，直至上个世纪中期以后科学家对核酸结构和功能的认识才取得了飞跃的发展。

核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，核苷酸是核酸的基本结构单位。DNA和RNA在动植物体中都有存在，但一种病毒只含有一种核酸，DNA或RNA。

1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型，极大地推动了核酸生物化学、分子生物学及分子遗传学等各类生命学科的发展，这些学科的发展为现代医学和工农业产业革命奠定了基础。例如，基因工程等正是在现代生物化学(核酸和蛋白质结构与功能研究)基础上发生和发展的。分子生物学的崛起为人类揭示生命现象的本质、健康与疾病的关系，为未来医学与工农业的发展提供了崭新的技术手段，并为生物技术产业发展开辟了新的领域。

正是由于核酸在整个分子生物学中的所具有的无可代替的作用，自分子生物学创立以来，一直是分子生物学研究的主要对象。因此核酸的提取和分离纯化也是分子生物学各类实验不可缺少的一个环节。在临床诊断中，常从人体组织，如血清或血浆、组织切片中分离纯化核酸，然后用于疾病的诊断和组织配型。近年来由国外传入的血液核酸筛查技术，对核酸的分离纯化提出了更高的要求。

经典的酚-氯仿法，由于提取的核酸纯度高，适用于各类分子生物学实验，到今天仍被广泛采用。但酚、氯仿等对人体有害，且容易造成环境污染，同时提取过程需要反复抽提，步骤繁琐，易造成样本的丢失与污染。

研究者在此基础上做了改进，如Miller等创立的盐析法、Loparev等创立的NaI法。后来发现固相载体，如二氧化硅、硅藻土等在一定条件下能够特异性的吸附核酸。目前在实验室中得到广泛应用的硅胶离心柱试剂盒也是使用硅基质材料载体来吸附核酸，再通过离心方式以去除其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类等。

与经典的酚-氯仿方法相比，固相吸附方法操作简便，不使用有毒有害试剂，但是固液分离时往往需要通过离心或抽滤等手段来进行试剂体系的交换和核酸的回收，不太适用于自动化平台。在标本数较少时，采用这种方法能够简便、快速的得到高质量的核酸。但当标本较多时，如为保障用血安全的血液病毒核酸筛查，通常需要处理大量的标本。临床上要求可以快速并且能够实现自动化的进行大规模的核酸纯化，尽量减小由于人为的因素带来的误差，得到最为精确、可靠的结果。这种方法就在自动化的升级潜力上显示了其瓶颈。另外，一般的柱提取法能检测到的DNA核酸拷贝数为每毫升1000拷贝；检测到的RNA核酸拷贝数为每毫升10000拷贝；检测灵敏度不够，造成临床上的漏检率居高。

用纳米磁珠提取核酸的各种研究正在进行。由于磁珠的主要原料为铁氧体，有很高的电阻率和磁导率，等效于电阻和电感串联，具有更好的高频率波特性，并在高频时呈现阻性，利用微性微粒及偶联技术能够快速将DNA提取出来，可应用于蛋白纯化、免疫学检测、核酸纯化和核酸杂交检测等领域。专利号200810008016.1的专利公开了一种“基于纳米磁珠动物组织病毒核酸提取的方法及应用”，专利号200710106001.4的专利公开了一种“基于纳米磁珠快速提取植物病毒核酸的方法及应用”，两者都用到磁珠提取核酸的技术。但是这两种方法主要应用于动植物组织的提取，不是专门针对服务于临床检验的人类体液作检测分析的方法。并且其主要步骤为：病毒颗粒沉淀→吸附病毒颗粒→裂解释放核酸，不是完全纯化，与临床针对性地处理人体体液样本的需求有差距。

提供一种高灵敏度、快速、能够实现自动化的，利用纳米磁珠制备的核酸分析试剂，对于满足临床进行大规模核酸纯化的需求是很必要的。

发明内容

为了开发一种快速、灵敏，具备自动化升级潜力的大规模纯化核酸方法，本发明提供一种由全液体试剂组成的应用纳米磁珠纯化核酸的试剂盒。

该试剂盒组分如下：裂解液，磁珠缓冲液，洗涤缓冲液1，洗涤缓冲液2，洗涤缓冲液3，洗脱缓冲液，平衡液。

所述的裂解液含有8mol/L GuHCl，50mmol/L Tris-HCl，体积分数为2％的Triton X-100，0.3mol/L的NaCl，25mmol/L EDTA，该裂解液的pH值为5-7。

所述的磁珠缓冲液中的磁珠由内核层与外壳两个层组成。

所述的内核层由核壳型磁性纳米粒子构成；所述外壳层是经过修饰的SiO₂。

所述的内核层外壳成分SiO₂，进行了羧基修饰。

所述磁珠直径如下：内核层的直径小于10nm，整个磁珠的直径在30-100nm。1.所述的洗涤缓冲液1含有：6mol/L GuHCl，50mmol/L Tris-HCl，0.3mol/L的NaCl，25mmol/L EDTA，该洗涤缓冲液1的pH值为5-7；所述的洗涤缓冲液3包含无水乙醇；所述的平衡液包含：0.9％的NaCl。

所述的洗涤缓冲液2含有体积分数为90％的乙醇，1/10体积的3mol/L的NaAc；该洗涤缓冲液2的PH值为6.0。

所述的洗脱缓冲液含有10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0。

本发明还提供了一种使用如权利要求1所述的试剂盒提取核酸的方法，步骤如下：使用裂解液以释放核酸；磁珠特异性吸附核酸；洗涤除去杂质；洗脱得到纯化的核酸溶液。

本技术方案提供的优选例还包括：

所述的磁珠缓冲液为纳米单分散相超顺磁性颗粒的水悬浊液，浓度为200g/L，pH值为7.0。

所述的磁珠缓冲液中的磁珠内核层为铁的氧化物、镍、镍-铁合金，或其组合。

所述的磁珠缓冲液的制备包括以下四个步骤：

1)纳米氧化物的制备

2)磁性纳米氧化物/SiO₂复合粒子的制备

3)SiO₂的表面修饰

4)悬浊液的制备

本试剂盒的工作原理：

在本发明提供的快速核酸纯化试剂盒中，裂解液中含有能使RNase强烈失活的chaotropic试剂GuHCl，在裂解细胞膜或病毒外壳的同时灭活RNase。裂解释放的核酸特异性的吸附在经羧基修饰的SiO₂外壳的具有超顺磁性的纳米颗粒——磁珠上，经过多次洗涤除杂，最后在适当的条件下将纯化的核酸从磁珠上洗脱下来。

本试剂盒可以以人类体液，优先为对如血液，尿液等为样本，进行核酸纯化。一般的柱提取法能检测到的DNA核酸拷贝数为每毫升1000拷贝，本试剂盒能检测到每毫升200拷贝；一般的柱提取法检测到的RNA核酸拷贝数为每毫升10000拷贝，本试剂盒能检测到每毫升500拷贝；故本试剂盒的灵敏度高。另外由于试剂盒由液体组成，故可以配合相应的仪器，即可实现自动化的大规模的纯化核酸。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，分子克隆实验指南(第三版)；或按照制造厂商所建议的步骤和条件。所有试剂为常规的化学分析纯试剂。

实施例1：试剂盒组成与配制

1.裂解液

本公司配制：8mol/L GuHCl，50mmol/L Tris-HCl，体积分数为2％的Triton X-100，25mmol/L EDTA，0.3mol/L的NaCl，该裂解液pH值为6.4。

2.磁珠缓冲液

采用液相沉积法制备内核为Fe₃O₄，外壳为经过羧基修饰的SiO₂的——纳米的单分散相超顺磁性颗粒的水溶液。

1)纳米Fe₃O₄的制备

将各50mL的0.2mol/L的二价铁盐(FeSO·7H₂O)和0.3mol/L的三价铁盐(FeCl₃·6H₂O)溶液混合在500mL的三口烧瓶中，剧烈搅拌(200-400r·min^-1)同时开启超声波发生器，水浴恒温(40℃)，滴液漏斗中加入0.5mol/L的沉淀剂氨水，在氮气氛下将滴加到反应体系中，使反应液pH值到11。搅拌30min后结束反应，用蒸馏水反复洗涤直至中性，倾去上层清液，在60℃下真空干燥后，研磨即得纳米Fe₃O₄粒子。

2)磁性纳米Fe₃O₄/SiO₂复合粒子的制备

称取适量的纳米Fe₃O₄粒子(TEOS与Fe₃O₄物质量比为1∶5)分散于无水乙醇中，加入几滴油酸，然后超声分散10分钟；将分散后的溶液转入250mL的三口瓶中，加入TEOS和NH₃·H₂O，使TEOS和NH₃·H₂O终浓度分别为0.6mol/L和1.2mol/L，40℃ 800rpm搅拌3小时；反应完成后，在磁场吸引的条件下，将溶液用蒸馏水反复洗涤，直至清洗后的溶液不再变浑浊；把得到的沉淀在70℃真空干燥，最后研细得到最终的复合粒子。

3)SiO₂表面修饰羧基

用0.1mol/L的HCl浸泡磁性纳米Fe₃O₄/SiO₂复合粒子30min，重新以去离子水洗涤至中性，然后再用乙醇、丙酮各洗涤一遍，在70℃真空干燥得到颗粒1。取干燥后的颗粒13.0g分散于30mL无水甲苯中，在氮气保护下加入环氧丙基丙氧基硅烷试剂(KH560，1.5mL)，在110℃下回流反应8h。将所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇/水(1∶1，V∶V)、甲醇洗涤并抽干。烘干得到颗粒2。将1.0g颗粒2与0.2g亚氨基二乙酸钠先后加于20mL甲醇中，搅拌下反应48h。产物以甲醇、水处理以除去过量的亚氨基二乙酸钠后，浸泡于pH值为3的稀HCl中。30min后，以去离子水洗涤产物至中性，再以甲醇、丙酮各洗涤一遍，过滤收集。烘干即得到二氧化硅表面修饰羧基的磁珠。

4)配制成200g/L，pH7.0的水悬浊液

3.洗涤缓冲液1

本公司配制：6mol/L GuHCl，50mmol/L Tris-HCl，0.3mol/L的NaCl，25mmol/L EDTA，该缓冲液pH值为6.4。

4.洗涤缓冲液2

本公司配制：体积分数为90％的乙醇，再加入10％的3mol/L的NaAc，该缓冲液pH值为6.0。

5.洗涤缓冲液3

无水乙醇

6.洗脱缓冲液

本公司配制：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，该缓冲液pH值为8.0。

7.平衡液

本公司配制：0.9％的NaCl。

实施例2：使用试剂盒提取乙肝患者血清核酸

1.使用前将裂解液置于室温平衡30分钟或用时在55℃水浴中预热5分钟。

2.在2ml的离心管中依次加入900μl裂解液，45μl磁珠缓冲液，900μl血清(不足时用平衡液补至900μl)，振荡混匀，每5min混匀一次，共15min。

3.靠磁，吸弃液体。

4.加入900μl洗涤缓冲液1，振荡混匀2min。靠磁，吸弃液体。

5.加入900μl洗涤缓冲液2，振荡混匀2min。靠磁，吸弃液体。

6.加入900μl洗涤缓冲液3，振荡混匀2min。靠磁，吸弃液体。

7.将2ml离心管开盖置于55℃金属浴中，10min。

8.加入90μl洗脱缓冲液，振荡混匀，置于55℃金属浴中，10min。

9.靠磁，将液体吸取到0.5ml的离心管中，立即使用或-20℃保存。

实施例3：使用试剂盒提取丙肝患者血清核酸

1.使用前将裂解液置于室温平衡30分钟或用时在55℃水浴中预热5分钟。

2.在2ml的离心管中依次加入900μl裂解液，45μl磁珠缓冲液，900μl血清(不足时用平衡液补至900μl)，振荡混匀，每5min混匀一次，共15min。

3.靠磁，吸弃液体。

4.加入900μl洗涤缓冲液1，振荡混匀2min。靠磁，吸弃液体。

5.加入900μl洗涤缓冲液2，振荡混匀2min。靠磁，吸弃液体。

6.加入900μl洗涤缓冲液3，振荡混匀2min。靠磁，吸弃液体。

7.将2ml离心管开盖置于55℃金属浴中，10min。

8.加入90μl洗脱缓冲液，振荡混匀，置于55℃金属浴中，10min。

9.靠磁，将液体吸取到0.5ml的离心管中，立即使用或-20℃保存。

Claims (10)

1.一种应用纳米磁珠纯化核酸的试剂盒，其组分如下：裂解液，磁珠缓冲液，洗涤缓冲液1，洗涤缓冲液2，洗涤缓冲液3，洗脱缓冲液，平衡液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的裂解液含有8mol/L GuHCl，50mmol/L Tris-HCl，体积分数为2％的Triton X-100，0.3mol/L的NaCl，25mmol/L EDTA，该裂解液的pH值为5-7。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的磁珠缓冲液中的磁珠由内核层与外壳两个层组成。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的内核层由核壳型磁性纳米粒子构成；所述外壳层是经过修饰的SiO₂。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的内核层外壳成分SiO₂，进行了羧基修饰。

6.如权利要求3或4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述磁珠直径如下：内核层的直径小于10nm，整个磁珠的直径在30-100nm。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的洗涤缓冲液1含有：6mol/LGuHCl，50mmol/L Tris-HCl，0.3mol/L的NaCl，25mmol/L EDTA，该洗涤缓冲液1的pH值为5-7；所述的洗涤缓冲液3包含无水乙醇；所述的平衡液包含：0.9％的NaCl。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的洗涤缓冲液2含有体积分数为90％的乙醇，1/10体积的3mol/L的NaAc；该洗涤缓冲液2的PH值为6.0。

9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的洗脱缓冲液含有10mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，该缓冲液pH值为8.0。

10.一种使用如权利要求1所述的试剂盒提取核酸的方法，步骤如下：使用裂解液以释放核酸；磁珠特异性吸附核酸；洗涤除去杂质；洗脱得到纯化的核酸溶液。