CN106754880A - 尿液核酸快速提取试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了尿液核酸快速提取试剂盒，包括组分有：裂解结合液、蛋白酶K、磁珠、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液。采用的是96孔预分装深孔板模式，可配合中山大学达安基因股份有限公司的核酸自动提取仪smart32，自动提取核酸，可得大量、快速、有效地提取尿液中的DNA。

Description

尿液核酸快速提取试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及尿液核酸快速提取试剂盒。本发明还涉及使用磁珠法提取尿液中DNA的方法。
背景技术
在现代疾病诊断当中，核酸占据着非常重要的地位，其中DNA的作用更显突出，尿液中提取DNA来进行疾病检测在现代疾病检测中起着越来越重要的作用。在PCR分子诊断过程中，获得的DNA的总拷贝数和质量会直接影响到后续检验实验的结果。而尿液样本中的PCR抑制物含量高，含有尿素、尿酸等多种杂质，这些杂质对常规的核酸提取起到很大的抑制作用，使得核酸提取的效率极低。所以，从尿液中获得有效、可靠的DNA是PCR分子诊断在尿液PCR应用中的关键。
虽然传统的酚氯仿提取核酸的方法能够获得质量较好的核酸，但是其中用到的化学物质却有着不可忽视的毒性，而且整个提取过程耗时较长，浪费大量的时间和人力物力。进一步来说，现在普及的柱提法核酸提取试剂也能获得质量很好的核酸，毒性也可以忽略，但是耗费的时间同样不可忽视。
除去毒性和时间的因素以外，这两种试剂提取核酸的操作当中免不了各种洗涤液的添加和丢弃，这个过程极其容易导致样本之间的交叉污染。当样本量较多的情况下，还容易出错，致使工作效率低下。所以，发明一种快速、高效和操作方便的DNA提取方法势在必行。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供尿液核酸快速提取试剂盒：操作简单，可实现自动化提取，大幅减少了人工操作时间，提高了工作效率，降低了人为操作和实验产生的误差。
该试剂盒是由裂解结合液、蛋白酶K、结合液、磁珠、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液组成。其中裂解液中含有 Tris-HCl、盐酸胍、氢氧化钠、Nonidet P 40、异丙醇；洗涤液1含有Tris-HCl、乙醇；洗涤液2中含有CaCl2、乙醇；所述磁珠洗脱液中含有Tris-HCl、EDTA-2Na。
所述裂解液中：Tris-HCl的浓度为10mmol/L，pH为3.3；盐酸胍的浓度为2.5mol/L；氢氧化钠浓度为5mmol/L；NP-40的浓度为13%；异丙醇含量为33%。
所述洗涤液1中：Tris-HCl的浓度为60mmol/L，pH为7.5；乙醇的浓度为40%。
所述洗涤液2中：CaCl2的浓度为5mmol/L；乙醇的浓度为80%。
所述洗脱液中：Tris-HCl的浓度为20mmol/L，pH为8；EDTA-2Na的浓度为2mmol/L。
所述试剂盒采用96孔预分装深孔板模式，第1列和第7列预分装的是裂解液；第2列和第8列预分装的是洗涤液1；第3、4列和第9、10列预分装的是洗涤液2；第5列和第11列预分装的是磁珠；第6列和第12列预分装的是洗脱液。
所述试剂盒采用热封膜工艺进行封装，可有效防止96深孔板中的提取试剂漏液。
一种尿液核酸快速提取试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
1：将96孔预分装深孔板上下颠倒混匀，置于离心机中，1000rpm瞬时离心10秒，使液体落回至分装板底部。
2：将96孔预分装深孔板的封膜小心撕开，在预分装板的第1列和第7列加入200µl的样本和20µl的蛋白酶K。
3：将8孔磁套棒和96孔预分装深孔板置于smart32核酸提取仪器中后，启动程序开始提取。
4：提取结束后，第6列和第12列中即为核酸溶液。
本发明的主要优势在于：
（1）提高提取效率
与常规磁珠法提取试剂相比，本试剂盒中含有的裂解结合液，能够强力快速裂解样本释放大量的DNA，并能够抗拒尿液样本中的抑制物质干扰，同时对释放出来的DNA进行结合，一个步骤中完成裂解和结合两大功能，确保高效地完成核酸捕获。
（2）缩短提取时间
本试剂盒采用的是96孔预分装深孔板模式，人工操作时间只有几分钟，32个样本的提取全程能在40min以内完成，相对于柱提法等传统试剂，大大缩减了提取所需时间。
（3）自动化程度高，减少人为失误和实验误差
本试剂盒采用的是96孔预分装深孔板模式，除加样外其他实验操作均由仪器完成，大大解放了人力，并降低了操作中带入的人为失误和误差。
附图说明
图1 为本发明方法提取核酸时使用的96 孔深孔板的俯视图；
图2 为按照本发明方法向96孔深孔板各排中注入试剂的示意图。
具体实施方式：
1.尿液核酸快速提取试剂盒的配制方法：
a.裂解结合液的配置：先在容量瓶中加入称取的异硫氰酸胍并加入适量的灭菌纯水进行溶解，加入终浓度为10mmol/L、pH为3.3 Tris-HCl；加入终浓度为5mmol/L氢氧化钠；待异硫氰酸胍全溶解后，加入终浓度为13% NP-40混匀，加入无菌水至所需体积。
b.洗涤液1的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为60mmol/L、pH为7.5的Tris-HCl；加入终浓度为40%乙醇；混匀，加入无菌水至所需体积。
c.洗涤液2的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入终浓度为5mmol/LCaCl2；加入终浓度为80%乙醇；混匀，加入无菌水至所需体积。
d.洗脱液的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入终浓度为20mmol/L、pH为8.3 的Tris-HCl；加入终浓度为2mmol/L EDTA-2Na的；混匀，加入无菌水至所需体积。
第1列和第7列预分装的是裂解结合液；第2列和第8列预分装的是洗涤液1；第3、4列和第9、10列预分装的是洗涤液2；第5列和第11列预分装的是磁珠；第6列和第12列预分装的是洗脱液。
e.往96 孔深孔板的第1列和第7列预分装裂解结合液；第2列和第8列预分装洗涤液1；第3、4列和第9、10列预分装洗涤液2；第5列和第11列预分装磁珠；第6列和第12列预分装洗脱液。
f.封膜：在热封仪上，利用热封仪将96孔板封住。
2. 尿液核酸快速提取试剂盒的应用
以HCMV阳性和阴性尿液为样本，先将预分装深孔板颠倒混匀后瞬时离心10秒，随后小心撕开封膜，并在其第1列和第7列加入200µl的样本和50µl的蛋白酶K。然后按照下面表格在核酸提取仪器上设置提取程序，然后进行核酸提取。提取程序运行完成后取出预分装深孔板，其中第6列和第12列中的溶液即为核酸溶液。
3.实施例
两种试剂盒对尿液样本进行核酸提取比较
以4个HCMV阳性尿液样本和2个HCMV阴性尿液样本为样测试本，分别用本发明所述试剂盒和Epigentek公司的FitAmp Urine DNA Isolation Kit试剂盒进行核酸提取对比。
本发明所述试剂盒提取：按实施例2所述进行核酸提取；Epigentek公司的试剂盒提取：严格按照Epigentek公司的FitAmp Urine DNA Isolation Kit试剂盒的说明书进行核酸提取。
将本发明所述试剂盒和Epigentek公司的FitAmp Urine DNA Isolation Kit提取的核酸进行PCR检测，结果如表1所示。从表中结果可以看到，本发明所述试剂盒的提取效率高。
表1为本试剂盒与Epigentek公司的FitAmp Urine DNA Isolation Kit提取效率比较结果。
表1

Claims (8)

1.尿液核酸快速提取试剂盒，其特征在于，试剂盒的组成为：裂解结合液、磁珠、蛋白酶K、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液。
2.根据权利要求1 所述的尿液核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述裂解结合液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为10mmol/L，pH为3.3；盐酸胍的浓度为2.5mol/L；氢氧化钠浓度为5mmol/L；NP-40的浓度为13%；异丙醇含量为33%。
3.根据权利要求1所述的尿液核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液1中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为60mmol/L，pH为7.5；无水乙醇的浓度为40%。
4.根据权利要求1所述的尿液核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液2中各成分分别为：CaCl2的浓度为5mmol/L；无水乙醇的浓度为80%。
5.根据权利要求1 所述的尿液核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为20mmol/L，pH为8.3；EDTA-2Na的浓度为2mmol/L。
6.根据权利要求1 所述的尿液核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用96孔预分装深孔板模式，第1列和第7列预分装的是裂解结合液；第2列和第8列预分装的是洗涤液1；第3、4列和第9、10列预分装的是洗涤液2；第5列和第11列预分装的是磁珠；第6列和第12列预分装的是洗脱液。
7.根据权利要求1 所述的尿液核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可配合中山大学达安基因股份有限公司的核酸自动提取仪smart32，自动提取核酸，一次性可提取32人份，耗时约40min。
8.根据权利要求1 所述的尿液核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述配合中山大学达安基因股份有限公司的核酸自动提取仪smart32提取程序为下表：
。
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