CN107893070A

CN107893070A - 磁笔式单人份核酸提取试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN107893070A
Application number: CN201711431201.7A
Authority: CN
Inventors: 金荣愉; 王岱桑; 陈思思; 周艳琼; 赵芯; 尤其敏
Original assignee: YOUSIDA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd HANGZHOU
Current assignee: Hangzhou Yousida Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2018-04-10
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: CN107893070B

Abstract

本发明公开了提供一种磁笔式单人份核酸提取试剂盒及其使用方法，包括七连管，所述七连管中预先分装有单人份的核酸提取试剂。本试剂盒采取试剂以单人份预分装的方式，用户只需要加入样本就可以放入配套的磁笔式仪器进行核酸提取，整个过程操作简单，安全无毒，样本量范围大0.005～3mL、提取的核酸纯度高且浓度大，实验结果重复性好，可直接用于酶切、PCR、恒温扩增、分子杂交等各种分子生物学实验。

Description

磁笔式单人份核酸提取试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种单人份核酸提取试剂盒。

背景技术

目前提取核酸的方式有手工提取和自动化提取；手工提取有煮沸法，酚-氯仿提取法，离心柱法和磁珠法；其中磁珠法较多用于自动化提取。

其中手工提取：煮沸法虽然使用较为广泛，操作简单，但是提取核酸的纯度较低；酚-氯仿提取法虽然能够去除痰液中多糖以及色素成分，但操作复杂要求高，而且氯仿等化学试剂对有毒；离心柱法需要多次离心，手工操作步骤较多。

目前的磁珠法自动化提取根据移液特点主要分为磁笔式和抽吸式两大类：抽吸式过程残留洗涤液中的盐和乙醇/异丙醇会直接影响后面的洗脱效率和扩增；磁铁设计在侧面的装置残留的液体相对较少，但其洗脱的效率不高，耗时长。另外该类仪器设备成本比较昂贵，所需耗材成本较高。

磁棒式：每一步的液体不会残留，因为磁棒只带走磁珠，然后转移到下一个步骤相应的反应孔中，且其编程简单，易维护；不足之处是：需要提前手工加试剂；样本量受限，只能小于1mL。

现有的磁笔试剂盒采用96孔板作为试剂的容器，受限于96孔板的孔大小(最大为2.2mL)，提取时使用的样本量需在0.005～0.5mL之间，无法操作大样本量的提取。

使用此种磁笔试剂盒，待测样本需离心、去上清、洗涤等繁琐的前处理步骤。目前市面主要流行的磁珠法为手工提取法，已有的少量磁笔试剂盒也需要客户补加醇类试剂，操作繁琐。

另外磁笔试剂盒需要一次一个96孔板，若没有凑齐16个样本，则存在试剂浪费的情况，不够灵活。

现有磁笔产品配有蛋白酶K用于样本裂解，蛋白酶K对温度敏感需低温保存，因此现有磁笔产品需2～8℃储存。

总之，截止目前，没有一种自动化、操作简单、用时短、安全无毒、样本量范围大、核酸纯度高且浓度大、无需在特定实验室进行操作的实验方法。

发明内容

本发明针对上述问题，提出了一种磁笔式单人份核酸提取试剂盒，以解决了现有技术的缺陷，达到无需前处理，使用灵活，保存简单的目的。

本发明采取的技术方案如下：

本发明提供一种磁笔式单人份核酸提取试剂盒，包括七连管，所述七连管中预先分装有单人份的核酸提取试剂。

进一步，所述试剂盒中装有裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠，其中裂解液成分不包括蛋白酶K，裂解液包括以下成分：硫氰酸胍3～5mol/L、盐酸胍0～5mol/L、氯化钠0.05～0.3mol/L、乙二胺四乙酸二钠10～30mmol/L、三羟甲基氨基甲烷10～30mmol/L、吐温-20，3～6wt％、聚乙二醇辛基苯基醚1～5wt％。

优选的，所述裂解液包括以下成分：硫氰酸胍3～4mol/L、盐酸胍3～4mol/L、氯化钠0.1～0.2mol/L、乙二胺四乙酸二钠15～30mmol/L、三羟甲基氨基甲烷20～30mmol/L、吐温-20，4～6wt％、聚乙二醇辛基苯基醚1～3wt％。

进一步，清洗液包括第一清洗液和第二清洗液，其中第一清洗液包括以下成分:盐酸胍3～5mol/L、三羟甲基氨基甲烷10～30mmol/L、50～70v/v％的乙醇溶液。

优选的，第一清洗液包括以下成分:盐酸胍3～4mol/L、三羟甲基氨基甲烷10～20mmol/L、50～60v/v％的乙醇溶液。

进一步，第二清洗液包括以下成分：60～85v/v％的乙醇溶液、吐温-20，0.5～2wt％。

优选的，第二清洗液包括以下成分：70～80v/v％的乙醇溶液、吐温-20 0.5～1wt％；

进一步，洗脱液为1～20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液，优选的，洗脱液为10～15mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液。

进一步，所述七连管为单条七连管，其中七连管的第一管的容量大于或等于3mL，优选的，为3-9mL。第二至第七管最大容积为2mL。其中第一个管放置裂解液；第二管放置磁珠；第3-5管放置清洗液，用于清洗杂质；第7管放置洗脱液，用于洗脱DNA。

本发明还提供一种上述的磁笔式单人份核酸提取试剂盒的使用方法，按样本数取出相应的七连管，将每个待测样本分别滴入相应七连管的第一管内，然后放入核酸自动提取仪中，按设定程序运行后，第七管中洗脱后的产物为提取后的核酸。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本试剂盒每人份独立包装、试剂盒中预装好裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠，通过胍盐和高温裂解样本中的细胞释放核酸后超顺磁性氧化硅纳米磁珠吸附核酸，再经过清洗和洗脱的步骤得到纯度高的核酸。

进一步的，本发明采用了单条7连管，第一个管的容量远大于现有技术的孔容量受限于96孔板的大小，相比于现有技术中的96孔，受限于96孔的最大容量为2.2mL，因此最大样本量不能超过0.5mL，而本发明使用样本量可达0.005～3mL，解决痰液、尿液、血液等大样本量核酸提取的问题。

本发明的裂解液可以直接裂解原液化样本，因此使用的样本无需离心、洗涤等前处理，直接加入即可实现检测。

本发明操作方法简单，试剂预装，用户只需要一步加样即可，全自动提取，无需手工提取；优化裂解液且无需手工提取，进而无需添加醇剂等。

本发明是单人份试剂，可用于少量样本的检测，有多少个样本放置多少条试剂，最多一次可以检测20个样本,不存在试剂浪费的问题。

本发明通过反复实验研究，优化裂解液组分，得到合理的成分和配比，改善了样本的裂解效率，达到了无需蛋白酶K辅助裂解的需求，因此试剂盒可在常温下保存。

本试剂盒采取试剂以单人份预分装的方式，用户只需要加入样本就可以放入配套的磁笔式仪器进行核酸提取，整个过程操作简单，安全无毒，样本量范围大0.005～3mL、提取的核酸纯度高且浓度大，实验结果重复性好，可直接用于酶切、PCR、恒温扩增、分子杂交等各种分子生物学实验。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，对本发明做详细描述。

实施例1

试剂盒：

预分装核酸提取试剂：在7连管试剂盒中分装提取过程需要的裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠。

裂解液包括：硫氰酸胍3mol/L、盐酸胍3mol/L、氯化钠0.05、mol/L、乙二胺四乙酸二钠10mmol/L、三羟甲基氨基甲烷10mmol/L、吐温-20 3wt％、聚乙二醇辛基苯基醚1wt％；

第一清洗液为盐酸胍3mol/L、三羟甲基氨基甲烷10mmol/L、50v/v％的乙醇溶液；

第二清洗液为60v/v％的乙醇溶液、吐温-20 0.5wt％，

洗脱液为10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液。

实施例2

裂解液包括：硫氰酸胍4mol/L、盐酸胍4mol/L、氯化钠0.2mol/L、乙二胺四乙酸二钠30mmol/L、三羟甲基氨基甲烷30mmol/L、吐温-20 6wt％、聚乙二醇辛基苯基醚3wt％；

第一清洗液盐酸胍4mol/L、三羟甲基氨基甲烷20mmol/L、60v/v％的乙醇溶液；

第二清洗液80v/v％的乙醇溶液、吐温-20 1wt％；

洗脱液为15mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液。

实施例3

裂解液包括：硫氰酸胍5mol/L、氯化钠0.3mol/L、乙二胺四乙酸二钠20mmol/L、三羟甲基氨基甲烷20mmol/L、吐温-20 4wt％、聚乙二醇辛基苯基醚5wt％；

第一清洗液盐酸胍5mol/L、三羟甲基氨基甲烷30mmol/L、70v/v％的乙醇溶液；

第二清洗液70v/v％的乙醇溶液、吐温-20 0.5wt％；

洗脱液为20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液。

应用实例1痰液样本的核酸提取

1.痰液液化后加入1mL到预分装核酸提取试剂(实施例1的7连管)的孔1。

2.将7连管放入Auto-Pure20全自动核酸提取仪中，装上磁棒套。

3.在Auto-Pure20全自动核酸提取仪上按下表编辑程序并点击运行。具体运行原理为：1)、将原本放入第一孔后程序运行加热第一孔至95℃，持续25min，进行样本裂解；2)、裂解步骤完成后关闭仪器加热功能使裂解溶液通过风扇冷却；3)、吸附磁珠并转移至第一孔中；4)、从第二孔转移的磁珠在第一孔中与DNA进行结合；5)、将结合有核酸的磁珠转移到3-5孔中逐步进行清洗；6)、加热第2/4加热片10min，使磁珠在溶液中洗脱核酸；7)、最后将洗脱完成的磁珠移动到第4孔弃除。

4.每一条7连管的第7孔的洗脱产物即为提取好的核酸溶液。

5.用湖南圣湘生物科技有限公司的结核分枝杆菌(TB)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行扩增，结果如表1。

6.痰液样本判定阴阳性采用分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(厂家：CapitalBio)进行定性，核酸的提取和扩增步骤按照产品说明书进行。

表1痰液样本提取结果

应用实例2血清样本的核酸提取

1.加入0.2mL血清样本到预分装核酸提取试剂(实施例2的7连管)的孔1。

2.将7连管放入Auto-Pure20全自动核酸提取仪中，装上磁棒套。

3.在Auto-Pure20全自动核酸提取仪上按下表编辑程序并点击运行。

4.每一条7连管的第7孔的洗脱产物即为提取好的核酸溶液。

5.用丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(厂家：达安)进行扩增，结果如表2。

6.血清样本判定阴阳性采用丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(厂家：达安)进行核酸的提取和扩增。

表2血清样本提取结果

应用实例3卡介苗菌的核酸提取

1.加入1mL4％NaOH和10μL卡介苗菌到预分装核酸提取试剂(7连管)的孔1，卡介苗菌液的浓度为1E3CFU/μL，1E4CFU/μL，1E5CFU/μL，1E6CFU/μL，每组5个平行。

2.将7连管放入Auto-Pure20全自动核酸提取仪中，装上磁棒套。

4.每一条7连管的第7孔的洗脱产物即为提取好的核酸溶液。对提取后的模板进行PCR定量核酸扩增，检测并计算核酸的提取效率，结果如表3所示。

5.PCR定量核酸扩增采用湖南圣湘生物科技有限公司的结核分枝杆菌(TB)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，核酸扩增操作依据产品说明书进行。

表3卡介苗菌液的提取效率

浓度	提取效率	平均提取效率	提取效率的CV
				1E4CFU	59.0％～66.3％	62.4％	3.15％
1E5CFU	67.0％～67.8％	67.0％	1.51％
				1E6CFU	60.0％～67.8％	63.6％	3.15％
1E7CFU	60.0％～66.7％	62.1％	2.65％

如表1所示，采用实施例1的试剂和方法，提取卡介苗菌液中的核酸的提取效率均在60％以上，提取效率高且稳定。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此即限制本发明的专利保护范围，凡是运用本发明说明书内容所作的等效结构变换，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的保护范围内。

Claims

1.磁笔式单人份核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括七连管，所述七连管中预先分装有单人份的核酸提取试剂。

2.根据权利要求1所述的磁笔式单人份核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中装有裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠，其中裂解液成分不包括蛋白酶K，裂解液包括以下成分：硫氰酸胍3～5mol/L、盐酸胍0～5mol/L、氯化钠0.05～0.3mol/L、乙二胺四乙酸二钠10～30mmol/L、三羟甲基氨基甲烷10～30mmol/L、吐温-20，3～6wt％、聚乙二醇辛基苯基醚1～5wt％。

3.根据权利要求2所述的磁笔式单人份核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括以下成分：硫氰酸胍3～4mol/L、盐酸胍3～4mol/L、氯化钠0.1～0.2mol/L、乙二胺四乙酸二钠15～30mmol/L、三羟甲基氨基甲烷20～30mmol/L、吐温-20，4～6wt％、聚乙二醇辛基苯基醚1～3wt％。

4.根据权利要求2所述的磁笔式单人份核酸提取试剂盒，其特征在于，清洗液包括第一清洗液和第二清洗液，其中第一清洗液包括以下成分:盐酸胍3～5mol/L、三羟甲基氨基甲烷10～30mmol/L、50～70v/v％的乙醇溶液。

5.根据权利要求4所述的磁笔式单人份核酸提取试剂盒，其特征在于，第一清洗液包括以下成分:盐酸胍3～4mol/L、三羟甲基氨基甲烷10～20mmol/L、50～60v/v％的乙醇溶液。

6.根据权利要求4所述的磁笔式单人份核酸提取试剂盒，其特征在于，第二清洗液为60～85v/v％的乙醇溶液、吐温-20，0.5～2wt％。

7.根据权利要求2所述的磁笔式单人份核酸提取试剂盒，其特征在于，洗脱液为1～20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液。

8.根据权利要求1所述的磁笔式单人份核酸提取试剂盒，其特征在于，所述七连管为单条七连管，其中七连管的第一管的容量大于或等于9mL。

9.一种如权利要求1-8任意一项所述的磁笔式单人份核酸提取试剂盒的使用方法，其特征在于，按样本数取出相应的七连管，将每个待测样本分别滴入相应七连管的第一管内，然后放入核酸自动提取仪中，按设定程序运行后，第七管中洗脱后的产物为提取后的核酸。