CN105176969A - 一种用于生物样本的核酸提取方法及试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸提取领域，具体讲，涉及一种用于生物样本的核酸提取方法及试剂；具体方法为：将生物样本中先加入氢氧化钠溶液，然后加入裂解液进行裂解，得到裂解反应液；所述的裂解液中含有胍盐、乙二胺四乙酸二钠、表面活性剂和缓冲剂；再在裂解反应液中加入乙醇溶液，最后采用带有硅胶膜的无仪器核酸提取装置或离心柱实现核酸的吸附、清洗和洗脱。本发明采用了先加氢氧化钠预处理、再加入裂解剂进行裂解的方式，可以更好地溶解样本中的蛋白质，并促进核酸与吸附膜的结合。本发明还优化了裂解液组分，显著增强了核酸分子在高盐高pH条件下与硅胶膜的结合能力，确保了良好的核酸提取效率。

Description

一种用于生物样本的核酸提取方法及试剂

技术领域

本发明涉及核酸提取领域，具体讲，涉及一种用于生物样本的核酸提取方法及试剂。

背景技术

核酸提取是许多临床检验工作的首要环节。该环节下获得的核酸模板，其浓度和纯度直接影响了后续检验结果的准确性。离心柱法是临床检验中常见的核酸提取方法。该方法利用核酸分子在高盐低pH环境下与硅胶膜结合，低盐高pH环境下与硅胶模解离的特性，可从痰液、血液、尿液等多种类型的样本中特异性地富集和纯化核酸模板。配合高速离心机或自动化的核酸提取仪，离心柱法具有通量大、速度快、提取效率高、模板纯度好等优点，能满足大多数临床实验室的检验要求。除离心柱法外，市场上还出现了不依赖离心机的无仪器核酸提取装置。这种装置以注射器的手工推吸作用替代了离心机的离心沉降作用，使用时无需电源、且操作简便、通量灵活，更加符合基层医疗单位开展分子诊断工作的实际需求。

市场上现有的细菌或细胞基因组核酸提取产品，大多采用离心的方式，首先分离临床样本的沉淀物与上清液，并丢弃上清液，仅将沉淀物用于后续的核酸提取，以减少抑制物残留对后续检测结果的影响。这种“丢弃上清液、保留沉淀物”的核酸纯化方式仅适用于新鲜未降解的临床样本，而那些经过高温灭活或冷冻储存的临床样本，往往伴有细菌或细胞裂解的情况，其结果导致大量的基因组核酸游离在上清液中。丢弃上清液无疑将损失大量的核酸模板，降低后续检测的灵敏度，因此需要一种既能保留上清液，又能减小上清液中抑制物残留的核酸提取方法。

此外，如何充分裂解样本也是核酸提取的技术难点之一，这对无仪器核酸提取装置尤为重要。由于手工操作的力量远远小于高速离心机，无仪器核酸提取装置往往采用孔径更大的硅胶膜过滤样本，以减小滤膜堵塞的风险。但仅仅使用大孔径的滤膜和常规的核酸提取试剂还无法使该装置适用于蛋白质含量较高的临床样本，如全血、血浆等，因此需要一种溶解效果更好、裂解效率更高的核酸提取试剂。

针对上述两个问题，现已公开了一些改良的核酸提取技术和试剂：

专利ZL200910032536.0公开了一种硅胶膜型DNA快速提取及保存DNA的方法，该专利采用高盐低pH条件吸附DNA，通过一种含有细胞裂解剂、核酸酶抑制剂的溶液处理硅胶膜后，无需预先提取DNA的过程，直接将细胞裂解并将DNA吸附在硅胶膜上，同时由于核酸酶抑制剂的存在，该吸附DNA的硅胶膜可长期保存，避免DNA的降解。该专利中公开的方法虽然可以用于DNA的保存，但其裂解液为低pH条件，溶解蛋白质的能力较差，容易造成无仪器核酸提取装置的堵塞，因而仅适用于离心柱式的核酸提取方法。

专利申请201010621890.X公开了一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂，该试剂溶液呈碱性并含有胍盐、铵根离子及表面活性剂成分，在碱性液相环境下能更充分裂解生物样品中的细胞，并能促进释放到细胞外的核酸(DNA/RNA)与固相材料的结合吸附，最后通过洗脱步骤将核酸从固相材料上分离下来。该专利申请中虽然公开了pH8～13的碱性裂解条件，但通过添加铵根离子仅能使裂解液的pH达到9左右。而通入氨气虽然能达到更高的碱性条件，但氨气易挥发，不便于长期稳定保存。

专利申请201410492307.8公开了一种从痰液样本中提取核酸的方法，其操作流程为：向痰液中加入1～5倍量的消化液KB，震荡混合均匀，再加入蛋白酶于37～65℃保温1～5小时后，加入痰液样本量0.5～3倍量的结合液BS，震荡混合均匀后将溶液全部通过核酸吸附柱，样品中的核酸将结合到吸附柱的硅胶膜上，再经过洗涤、洗脱等步骤后，获得纯化的核酸模板。与上述几种方法相比，该方法需要用蛋白酶消化样本，虽然显著提高了样本的溶解效果，但操作步骤过于复杂，而且耗时太长。

本发明针对现有技术的缺陷，提出了一种全新的核酸提取方法及试剂，不仅适用于新鲜的样本，也可用于多种经高温灭活或冷冻储存的临床样本。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出一种用于生物样本的核酸提取的方法。

本发明的第二发明目的在于提出一种用于生物样本的核酸提取的试剂。

为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种用于生物样本的核酸提取的方法，具体请问：将生物样本中先加入氢氧化钠溶液，然后加入裂解液进行裂解，得到裂解反应液；所述的裂解液中含有胍盐、乙二胺四乙酸二钠、表面活性剂、核酸助沉剂和缓冲剂；再向裂解反应液中加入乙醇溶液，最后采用无仪器核酸提取装置进行吸附、清洗和洗脱。

本发明的第一优选技术方案为：氢氧化钠溶液的浓度为1～4wt％，优选3～4wt％，最优选4wt％；氢氧化钠溶液的体积与生物样本溶液的体积比为6：1～3；优选6：2～3。

本发明的第二优选技术方案为：胍盐选自硫氰酸胍或盐酸胍，缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷，核酸助沉剂选自糖原，表面活性剂选自聚乙二醇辛基苯基醚；优选的，裂解液中含有胍盐4～8mol/L、乙二胺四乙酸二钠10～30mmol/L、糖原0.015～0.15mmol/L、三羟甲基氨基甲烷20～80mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.6～1.4v/v％；更优选的，裂解液中含有硫氰酸胍5～7mol/L、乙二胺四乙酸二钠15～25mmol/L、糖原0.03～0.12mmol/L、三羟甲基氨基甲烷40～60mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.8～1.2v/v％。

本发明的第三优选技术方案为：样本裂解的pH值为11～13，优选12～13；裂解的条件为常温处理或加热至90～100℃保温。

本发明的第四优选技术方案为：乙醇溶液的浓度为90～98v/v％，优选95～98v/v％；乙醇溶液所加入的体积为裂解反应液体积的0.5～1.5倍，优选1～1.2倍。

本发明的第五优选技术方案为：清洗液含浓度为5～35mmol/L的醋酸钠溶液，浓度优选10～30mmol/L，更优选10～25mmol/L。

本发明的第六优选技术方案为：洗脱液为浓度为0.25～1.25mmol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液，浓度优选0.25～1mmol/L，更优选0.25～0.75mmol/L。

本发明的第七优选技术方案为：生物样本选自分泌液、细胞克隆或培养液、体液、清洗液或排泄物；所述分泌液选自口腔粘膜、咽部、阴道、前列腺分泌液、唾液或痰液，所述体液选自血清、血浆、全血、脑脊液或组织液，清洗液选自口腔、伤口、脓疮的清洗液。

本发明还涉及一种用于生物样本的核酸提取的试剂，包括：用于样本前处理的氢氧化钠溶液、细胞裂解液、裂解后处理液、清洗液和洗脱液；

氢氧化钠溶液的浓度为1～4wt％，优选3～4wt％，最优选4wt％；

裂解液的组成为：胍盐4mol/～8mol/L、乙二胺四乙酸二钠10～30mmol/L、糖原0.015～0.15mmol/L、三羟甲基氨基甲烷20～80mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.60～1.40v/v％；优选为：硫氰酸胍5～7mol/L、乙二胺四乙酸二钠15～25mmol/L、糖原0.03～0.12mmol/L、三羟甲基氨基甲烷40～60mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.8～1.2v/v％；

裂解后处理液为90～98v/v％，优选95～98v/v％的乙醇溶液；

清洗液为浓度5～35mmol/L的醋酸钠溶液，优选10～30mmol/L，更优选10～25mmol/L；

洗脱液为浓度0.25～1.25mmol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液，优选0.25～1mmol/L，更优选0.25～0.75mmol/L。

下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。

本发明摒弃了“丢弃上清液、保留沉淀物”的核酸纯化方式，以及在高盐低pH条件下用硅胶膜吸附核酸分子的传统思路，一方面保留了临床样本的上清液组分，避免了因丢弃上清液损失核酸模板的风险，另一方面显著提高了裂解液的pH值，这不仅减弱了上清液中蛋白质分子在酸性条件下的凝集效应，而且也增强了裂解液对脂类物质的水解能力和蛋白质疏水性基团的变性能力，因而减少了抑制物残留对后续检测的影响。

本发明的核酸提取方法特别适用于无仪器核酸提取装置。本发明可用于多种无仪器核酸提取装置，并优选使用ZL200920312749.4中的无仪器核酸提取装置。由于无仪器核酸提取装置的使用为手工操作，其过滤样本的力度远小于高速离心机，因此一旦样本溶解不充分，极有可能发生滤膜堵塞的情况。本发明提出了一种适应于无仪器提取装置的全新的核酸提取方法，先采用氢氧化钠溶液对样品进行预处理，然后再加裂解液进行裂解；并且，本发明采用了高pH值(pH>11)的条件，彻底溶解样品中的蛋白质，确保在使用无仪器核酸提取装置时，样本溶液可顺利通过滤膜，从而使核酸分子与滤膜充分结合。当pH值低于10时，样本中的蛋白质还不能完全溶解，因而有可能造成滤膜的堵塞，并增加扩增抑制物的残留量。

本发明采用了先加氢氧化钠预处理、再加入裂解剂进行裂解的方式。氢氧化钠预处理的目的在于水解样本中的脂质和疏水蛋白质，降低样本的粘度，从而减小样本在裂解液中出现蛋白凝块的风险。如果将氢氧化钠与裂解液预先混合，而不是依次处理样本，不仅会降低对裂解液对粘液性样本的溶解能力，而且也会降低目标核酸的提取效率。

本发明的裂解液中含有胍盐、乙二胺四乙酸二钠、表面活性剂、核酸助沉剂和缓冲剂。其中胍盐的作用在于提供高盐环境，使硅胶膜具有吸附核酸分子的能力，同时灭活核酸内切酶，保护核酸分子；乙二胺四乙酸二钠的作用为螯合二价金属离子，抑制核酸内切酶的活性；表面活性剂的作用为裂解细菌或其他细胞的细胞膜，释放核酸分子；核酸助沉剂的作用为促进核酸分子的沉降，提高提取效率。

本发明的裂解过程可以根据样品的性质选择常温处理或者95～100℃保温处理。加热处理可以更加充分的裂解一些细胞壁较坚固的特殊病原体，如分枝杆菌；并且提高蛋白质的溶解度，减少蛋白质在硅胶膜上的残留；对于大多数常见的细菌或病毒，采用室温裂解即可达到较好的提取核酸的效果。

本发明在样本裂解后有加入乙醇的步骤。乙醇不仅可以竞争核酸分子周围的水分子，而且其介电常数比裂解液更低，可以促进溶液中带正电荷的钠离子中和核酸分子的磷酸根基团，从而降低核酸分子的溶解度，使其从溶液中沉淀析出。与此同时，裂解液中的核酸助沉剂也会在乙醇的作用下沉淀析出，使核酸分子与助沉剂产生共沉淀效应，促进核酸分子与硅胶膜的特异性吸附。

本发明还优化了清洗液和洗脱液组分，以保障良好的核酸提取效率。清洗液含有醋酸钠，可以中和核酸分子负电荷，减少清洗过程中的核酸损失。清洗液中含微量乙二胺四乙酸二钠，使洗脱体系维持在pH值8.0的弱碱性环境。与中性和酸性条件相比，弱碱性条件具有更好地洗脱能力。

本发明的提取方法为：

1.样本前处理：取生物样本，如分泌液、细胞克隆或培养液、体液、清洗液或排泄物等，按氢氧化钠溶液与生物样本溶液体积比为6：1～3、优选6：2～3的比例加入氢氧化钠溶液进行前处理；氢氧化钠溶液优选现配现用；

2.裂解样本：取前处理样本，加入裂解液得到裂解反应液，吹打混匀，常温处理或95～100℃水浴10分钟；前处理样本与裂解液的体积比为5：2～6，优选5：3～5；

3.吸附：待样本冷却至室温，加入95％～98％乙醇混匀，用无仪器核酸提取装置抽吸裂解的待测样本，将待测样本中的核酸分子吸附在滤膜上，弃去滤液；乙醇溶液所加入的体积为裂解反应液体积的0.5～1.5倍，优选1～1.2倍；

4.清洗：用无仪器核酸提取装置抽吸清洗液，清洗滤膜，弃去滤液；并可重复1～2次；

5.洗脱：用无仪器核酸提取装置抽吸洗脱液，静置1分钟，洗脱液流经滤膜将吸附在膜上的核酸成分洗脱，得到核酸水溶液。

本发明的有益效果为：

1.核酸模板的产量高：以1ml过夜培养的大肠杆菌培养液为例，经本专利可获得8-12μg的基因组核酸；

2.核酸模板的提取效率高：对不同浓度的核酸模板均有良好的提取效率，在不同类型的临床样本均有出色表现；

3.提取得到的核酸模板纯度高，可满足多种检测需求。

本发明在核酸提取前无需分离样本的上清液和沉淀，即使样本中的病原体已经裂解，也不会影响提取效率。因此，对于有传染风险的临床样本，可以先灭活样本，再提取病原体核酸，从而降低生物危害风险，保护操作人员的健康。

本发明优化了高pH值条件下的核酸提取流程，在确保良好的纯化效率的同时，更进一步减少了抑制物残留的影响。

本发明可与无仪器核酸提取装置联合使用，大大简化了临床样本的核酸提取流程。

本发明的具体实施方式仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构成限制。

具体实施方式

实施例1

1.样本前处理：向<5ml的痰液中加入2倍体积的4％NaOH，充分震荡混匀，室温放置20～30分钟使其充分液化，即无明显固状物且吸出时无拖丝现象；

2.裂解样本：取0.25ml前处理样本，加入0.15ml裂解液，吹打混匀，100℃水浴10分钟；体系中pH值为13；裂解液中含有盐酸胍6mol/L、乙二胺四乙酸二钠20mmol/L、糖原0.15mmol/L、三羟甲基氨基甲烷60mmol/L和聚乙二醇辛基苯基醚1.2v/v％；

3.吸附：待样本冷却至室温，加入0.4ml≥95％乙醇混匀，使用ZL200920312749.4中的无仪器核酸提取装置抽吸待测样本，将待测样本中的核酸分子吸附在滤膜上，弃去滤液；

4.清洗：用微量核酸提取装置抽吸0.5ml清洗液，清洗滤膜，弃去滤液；并重复清洗一次；清洗液为15mmol/L的醋酸钠溶液；

5.洗脱：用微量核酸提取装置抽吸50μl洗脱液，洗脱液为0.25mmol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液，静置1分钟，洗脱液流经滤膜将吸附在膜上的核酸成分洗脱，得到核酸水溶液。

实施例2

1.样本前处理：口腔粘膜、咽部、阴道、前列腺分泌液等棉拭子取样后，将棉拭子在1ml生理盐水中洗脱，搅动数次后，丢弃棉签；取0.15ml洗脱液加入0.1ml2％NaOH，混匀备用；

2.裂解样本：取0.25ml前处理样本，加入0.15ml裂解液，吹打混匀，常温处理10分钟；体系中pH值为11；裂解液中含有硫氰酸胍6mol/L、乙二胺四乙酸二钠25mmol/L、糖原0.08mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50mmol/L和聚乙二醇辛基苯基醚0.8v/v％；

3.吸附：待样本冷却至室温，加入0.4ml≥98％乙醇混匀，使用ZL200920312749.4中的无仪器核酸提取装置抽吸待测样本，将待测样本中的核酸分子吸附在滤膜上，弃去滤液；

4.清洗：用微量核酸提取装置抽吸0.5ml清洗液，清洗滤膜，弃去滤液；并重复清洗一次；清洗液为25mmol/L的醋酸钠溶液；

5.洗脱：用微量核酸提取装置抽吸50μl洗脱液，洗脱液为0.75mmol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液，静置1分钟，洗脱液流经滤膜将吸附在膜上的核酸成分洗脱，得到核酸水溶液。

实施例3

1.细菌克隆：用牙签取少量细菌溶于0.15ml生理盐水，加入0.1ml3％NaOH，混匀备用；

2.裂解样本：取0.25ml前处理样本，加入0.15ml裂解液，吹打混匀，常温处理或95～100℃水浴10分钟；体系中pH值为12；裂解液中含有硫氰酸胍6mol/L、乙二胺四乙酸二钠25mmol/L、糖原0.08mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50mmol/L和聚乙二醇辛基苯基醚0.8v/v％；

3.吸附：待样本冷却至室温，加入0.5ml≥95％乙醇混匀，使用ZL200920312749.4中的无仪器核酸提取装置抽吸待测样本，将待测样本中的核酸成分吸附在滤膜上，弃去滤液；

4.清洗：用微量核酸提取装置抽吸0.5ml清洗液，清洗滤膜，弃去滤液；并重复清洗一次；清洗液为25mmol/L的醋酸钠溶液；

5.洗脱：用微量核酸提取装置抽吸50μl洗脱液，洗脱液为0.75mmol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液；静置1分钟，洗脱液流经滤膜将吸附在膜上的核酸成分洗脱，得到核酸水溶液。

实施例4

1.血清、血浆、全血、漱口水、细胞培养液、尿液：取0.15ml样本，加入0.1ml4％NaOH，混匀备用；

2.裂解样本：取0.25ml前处理样本，加入0.15ml裂解液，吹打混匀，常温处理10分钟；体系中pH值为13；裂解液中含有硫氰酸胍6mol/L、乙二胺四乙酸二钠25mmol/L、糖原0.08mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50mmol/L和聚乙二醇辛基苯基醚0.8v/v％；

3.吸附：待样本冷却至室温，加入0.4ml≥95％乙醇混匀，使用ZL200920312749.4中的无仪器核酸提取装置抽吸待测样本，将待测样本中的核酸成分吸附在滤膜上，弃去滤液；

4.清洗：用微量核酸提取装置抽吸0.5ml清洗液，清洗滤膜，弃去滤液；并重复清洗一次；清洗液为25mmol/L的醋酸钠溶液；

5.洗脱：用微量核酸提取装置抽吸50μl洗脱液，洗脱液为0.75mmol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液；静置1分钟，洗脱液流经滤膜将吸附在膜上的核酸成分洗脱，得到核酸水溶液。

实施例5

一种用于生物样本的核酸提取的试剂，包括：用于样本前处理的氢氧化钠溶液、细胞裂解液、裂解后处理液、清洗液和洗脱液；其组成如表1所示：

表1：用于生物样本的核酸提取的试剂(一人份)

实施例6

一种用于生物样本的核酸提取的试剂，包括：用于样本前处理的氢氧化钠溶液、细胞裂解液、裂解后处理液、清洗液和洗脱液；其组成如表2所示：

表2：用于生物样本的核酸提取的试剂(十人份)

实施例7

一种用于生物样本的核酸提取的试剂，包括：用于样本前处理的氢氧化钠溶液、细胞裂解液、裂解后处理液、清洗液和洗脱液；其组成如表3所示：

表3：用于生物样本的核酸提取的试剂(一百人份)

实施例8

一种用于生物样本的核酸提取的试剂，包括：用于样本前处理的氢氧化钠溶液、细胞裂解液、裂解后处理液、清洗液和洗脱液；其组成如表4所示：

表4：用于生物样本的核酸提取的试剂(五十人份)

实验例1

向4组0.15ml牛血清样本中加入10μl浓度分别为1×10³copy/μl，1×10⁴copy/μl，1×10⁵copy/μl，1×10⁶copy/μl的乙肝病毒DNA，每组5份重复样本。按照实施例4的方法提取核酸，用艾康生物技术(杭州)有限公司的乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒(PCR荧光法)定量提取得到的HBVDNA浓度，计算提取效率，如表5所示。

表5：

牛血清+HBV DNA	提取效率	平均提取效率
			1×104copies	57.8％～79.1％	67.7％
1×105copies	57.3％～71.3％	64.3％
			1×106copies	71.5％～83.5％	76.8％
1×107copies	62.1％～73.9％	66.9％

实验例2

本实验例以结核病诊断阴性的液化痰液，乙型肝炎诊断阴性的血浆、全血和尿液样本为例。

向0.25ml痰液样本中加入10μl浓度为1×10⁵copy/μl的卡介苗基因组DNA，向血浆、全血和尿液样本中加入10μl浓度为1×10⁵copy/μl的乙肝病毒DNA。每种样本类型各5份标本。分别按照实施例1和实施例4的方法提取核酸。痰液样本提取后用凯杰生物工程(深圳)有限公司的结核分枝杆菌(TB)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)定量卡介苗基因组浓度，其他样本提取后用艾康生物技术(杭州)有限公司的乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒(PCR荧光法)定量HBVDNA浓度，并计算各样本的提取效率，如表6所示。

表6：

样本类型	提取效率	平均提取效率
			痰液	55.5％～85.0％	64.7％
血浆	55.0％～85.6％	71.5％
			全血	39.6％～58.4％	49.0％
尿液	38.9％～57.6％	49.8％

采用ThermoFisherScientific公司的NanoDrop2000超微量分光光度计测定上述样本经提取后的A260/A280数值，以此评估提取后的核酸纯度，如表7所示。

表7：

样本类型	A260/A280
		痰液	1.78～1.88
血浆	1.66～1.85
		全血	1.62～1.83
尿液	1.82～1.94

对比例1～3

对比例1：同实施例4方法，区别在于步骤1中，将氢氧化钠与裂解剂混合后，加入到样本中；

对比例2：同实施例4方法，区别在于步骤1中，减少氢氧化钠溶液的添加量，调整裂解反应的pH值为10；

对比例3：同实施例4方法，区别在于步骤1中，减少氢氧化钠溶液的添加量，调整裂解反应的pH值为9；

向3组0.15ml牛血清样本中加入10μl浓度为1×10⁵copy/μl的乙肝病毒DNA，每组5份重复样本。采用上述对比例的方法进行检测(具体方法同实施例1)；计算提取效率，如表8所示。

表8：

样品	牛血清+HBV DNA	提取效率	平均提取效率
				对比例1	1×106copies	37.3％～51.2％	42.9％
对比例2	1×106copies	20.5％～32.8％	25.5％
				对比例3	1×106copies	滤膜堵塞	滤膜堵塞

对比例4～5

对比例4：同实施例4方法，区别在于步骤2中，裂解液不添加糖原；

对比例5：同实施例4方法，区别在于步骤3中，不添加乙醇溶液；

向两组0.15ml牛血清样本中加入10μl浓度为1×10⁵copy/μl的乙肝病毒DNA，每组5份重复样本。采用上述对比例的方法进行检测(具体方法同实施例1)；计算提取效率，如表9所示。

表9：

样品	牛血清+HBV DNA	提取效率	平均提取效率
				对比例4	1×106copies	28.5％～43.3％	32.6％
对比例5	1×106copies	1.4％～6.9％	2.7％

Claims (9)

1.一种用于生物样本的核酸提取的方法，其特征在于，将生物样本中先加入氢氧化钠溶液，然后加入裂解液进行裂解，得到裂解反应液；所述的裂解液中含有胍盐、乙二胺四乙酸二钠、表面活性剂、核酸助沉剂和缓冲剂；再在裂解反应液中加入乙醇溶液，最后采用无仪器核酸提取装置进行吸附、清洗和洗脱。

2.根据权利要求1所述的用于生物样本的核酸提取的方法，其特征在于，氢氧化钠溶液的浓度为1～5wt％，优选3～4wt％，最优选4wt％；氢氧化钠溶液的体积与生物样本溶液的体积比为6：1～3；优选6：2～3。

3.根据权利要求1所述的用于生物样本的核酸提取的方法，其特征在于，所述胍盐选自硫氰酸胍或盐酸胍，缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷，核酸助沉剂选自糖原，表面活性剂选自聚乙二醇辛基苯基醚；优选的，所述裂解液中含有硫氰酸胍或盐酸胍4～8mol/L，乙二胺四乙酸二钠10～30mmol/L、糖原0.015～0.15mmol/L、三羟甲基氨基甲烷20～80mmol/L和聚乙二醇辛基苯基醚0.6～1.4v/v％；更优选的，所述裂解液中含有硫氰酸胍5～7mol/L，乙二胺四乙酸二钠15～25mmol/L、糖原0.03～0.12mmol/L、三羟甲基氨基甲烷40～60mmol/L和聚乙二醇辛基苯基醚0.8～1.2v/v％。

4.根据权利要求1所述的用于生物样本的核酸提取的方法，其特征在于，样本裂解的pH值为11～13，优选12～13；裂解的条件为常温处理或加热至90～100℃保温。

5.根据权利要求1所述的用于生物样本的核酸提取的方法，其特征在于，所述乙醇溶液的浓度为90～98v/v％，优选95～98v/v％；乙醇溶液所加入的体积为裂解反应液体积的0.5～1.5倍，优选1～1.2倍。

6.根据权利要求1所述的用于生物样本的核酸提取的方法，其特征在于，所述清洗液浓度为5～35mmol/L的醋酸钠溶液，浓度优选10～30mmol/L，更优选10～25mmol/L。

7.根据权利要求1所述的用于生物样本的核酸提取的方法，其特征在于所述洗脱液为浓度为0.25～1.25mmol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液，优选0.25～1mmol/L，更优选0.25～0.75mmol/L。

8.根据权利要求1所述的用于生物样本的核酸提取的方法，其特征在于，所述的生物样本选自分泌液、细胞克隆或培养液、体液、清洗液或排泄物；所述分泌液选自口腔粘膜、咽部、阴道、前列腺分泌液、唾液或痰液，所述体液选自血清、血浆、全血、脑脊液或组织液，清洗液选自口腔、伤口、脓疮的清洗液。

9.一种用于生物样本的核酸提取的试剂，其特征在于，所述试剂包括：用于样本前处理的氢氧化钠溶液、细胞裂解液、裂解后处理液、清洗液和洗脱液；

所述氢氧化钠溶液的浓度为1～4wt％，优选3～4wt％，最优选4wt％；

所述裂解液的组成为：胍盐4～8mol/L、乙二胺四乙酸二钠10～30mmol/L、糖原0.015～0.15mmol/L、三羟甲基氨基甲烷20～80mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.60～1.40v/v％；优选的，所述裂解液的组成为：硫氰酸胍5～7mol/L、乙二胺四乙酸二钠15～25mmol/L、糖原0.03～0.12mmol/L、三羟甲基氨基甲烷40～60mmol/L、聚乙二醇辛基苯基醚0.8～1.2v/v％；

所述裂解后处理液为90～98v/v％，优选95～98v/v％的乙醇溶液；

所述清洗液为5～35mmol/L的醋酸钠溶液，优选10～30mmol/L，更优选10～25mmol/L；

所述洗脱液为0.25～1.25mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，优选0.25～1mmol/L，更优选0.25～0.75mmol/L。