CN117701555A - 一种快速细菌基因组dna提取试剂盒、使用方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速细菌基因组DNA的提取试剂盒及使用方法。所述试剂盒的试剂包括：裂解液、加强液、清洗液和洗脱液。所述使用方法包括在样品中加入裂解液和加强液裂解、清洗液清洗、核酸洗脱液洗脱后的得到细菌核酸。本发明的快速细菌基因组DNA的提取试剂盒操作简单，最快能够在15分钟内获得核酸。核酸提取试剂不含有挥发性有机溶剂，不会对操作人员产生危害。且本发明的试剂盒可以从菌液、尿液、奶粉和唾液等多种复杂样品中获得细菌核酸，适用于临床应用及科研应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种快速提取细菌基因组DNA用的方法和试剂及其应用。
背景技术
病原菌感染对全球公共卫生安全具有极大危害。传统的病原菌检测技术如培养法需要耗费大量的时间，基于免疫学检测的方法灵敏度较低无法满足检测需求。基于分子生物学的检测方法如PCR等能够对病原菌进行高灵敏度、高特异性、快速检测。但是利用分子生物学的方法对进行核酸扩增的首要条件是进行核酸提取。核酸提取步骤获得的核酸浓度与纯度直接影响后续检测反应的成功与否。常见的核酸提取方法有基于磁珠的磁珠法和基于硅胶膜的离心柱法。磁珠法提核酸的原理是将磁珠表面进行不同材料或者集团的修饰。不同材料和集团与核酸的结合力不同，主要有离子键和共价键结合。因此，采用磁珠法提核酸的重中之重在于提高核酸与磁珠的结合能力。基于硅胶膜的离心柱法其原理主要是依靠正负电吸附核酸。硅胶膜表面的硅醇基团呈弱酸性，其水化后带负电。在高盐水溶液状态下，形成的阳离子桥能够中和DNA和硅醇基团之间的表面负电荷，从而使DNA牢固地吸附在硅胶膜表面。反之，处于低盐水溶液状态下时，由于硅胶膜的硅醇基团与DNA磷酸基团之间的静电排斥，硅胶膜释放DNA。采用磁珠法进行核酸提取，由于需要对磁珠表面进行不同集团的修饰，所以该方法的成本较高。并且磁珠法核酸提取依赖磁珠与核酸的结合力以及磁珠的磁性，所以磁珠法的提取效率往往比离心柱法低。而离心柱法的操作较为简单、成本更为低廉、提取的效果更有优势。
现有基于离心柱法提取核酸的试剂存在操作时间长，操作流程多，提取效果差的缺点。并且，提取试剂中广泛含有乙醇、异丙醇等挥发性有机试剂，这对操作人员的安全具有一定危害。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提出了一种快速细菌核酸提取试剂盒。整个提取过程不超过10分钟且提取试剂中不含有挥发性有机溶剂，可以最大程度的保护操作人员。该试剂盒具有核酸得率高、实验操作简单、生物安全性高、提取时间短等优点，可广泛用于病原菌核酸提取。
有鉴于此，本发明的第一个目的在于提供一种细菌快速核酸提取试剂盒。该试剂盒提取后的核酸可以用于RPA-Cas12a等温反应进行大肠杆菌检测。本发明的第二个目的在于提供一种无挥发性有机试剂的细菌核酸提取试剂盒，可以简单快速的对核酸进行纯化来满足RPA-Cas12a等温反应的需求。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种快速细菌基因组DNA提取试剂盒，所述试剂盒的试剂包括裂解液、加强液、清洗液和洗脱液，所述裂解液包括多种表面活性剂的组合物；所述加强液为盐酸胍和异硫氰酸胍一种或两种；所述清洗液包括盐酸胍、乙酸甲、糖原和MOPS中的一种或者多种组合；所述洗脱液包括TE缓冲液。
进一步的，所述表面活性剂为Triton X-100、SDS和NP-40；Triton X-100的浓度为1～10％，SDS的浓度为1～1％，NP-40的浓度为1～10％；优选的Triton X-100的浓度为5％，SDS的浓度为0.05％，NP-40的浓度为2％。
进一步的，所述裂解液还包括：EDTA浓度为1～10mM，优选1～5mM，最优选为2mM；NaCl浓度为10～100mM，优选20～60mM，最优选为50mM；海藻糖的浓度为0.1～5M，优选0.1～1M，最优选为0.5M；Tris-HCl调整PH为7～8之间。
进一步的，所述加强液中盐酸胍的浓度为1M～10M；异硫氰酸胍的浓度为1M～10M；优选的盐酸胍的浓度为6M。
进一步的，所述清洗液中盐酸胍的浓度为0～1mM，醋酸钾的浓度为0～1mM，糖原的浓度为0～1m/v％，MOPS的浓度为1～20mM；优先的，盐酸胍的浓度为0.1M，醋酸钾的浓度为0.15M，糖原的浓度为0.05％m/v，MOPS的浓度为2mM。
进一步的，所述TE缓冲液包括10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA。
一种所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
步骤一.将样品溶液离心处理得到样品；
步骤二.在步骤一得到的样品中加入200μL裂解液和加强液，混匀后95℃加热5min；12000rpm离心1min，弃废液；
步骤三.在步骤二得到的样品中加入500μL清洗液，12000rpm离心1min，弃废液；
步骤四.在步骤三得到的样品中加入200μL洗脱液，56℃孵育5min，12000rpm离心1min，所得即为提取的细菌DNA。
一种所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒适用于菌液、尿液、唾液、奶粉等样品的细菌核酸提取。
本发明与现有的技术相比，具有如下优点：(1)本发明的试剂盒能够从多种样品类型中如奶粉、尿液、唾液等对细菌进行核酸提取。(2)本发明的操作简单，步骤流程少，提取时间短。(3)本发明的试剂盒中不含有挥发性的有机溶剂，可以最大程度的保护实验人员。(4)本发明无需复杂的核酸提取设备，只需简单的离心机和水浴锅即可。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术中所需要使用的附图作简单的介绍。
图1为实施例1提取的大肠杆菌菌液核酸的实时RPA-Cas12a等温反应检测结果图；
图2为实施例2提取的奶粉样品中的大肠杆菌核酸的实时RPA-Cas12a等温反应检测结果图；
图3为实施例3提取的尿液样品中的大肠杆菌核酸的实时RPA-Cas12a等温反应检测结果图；
图4为实施例4提取的唾液样品中的大肠杆菌核酸的实时RPA-Cas12a等温反应检测结果图。
具体实施方式
下面将结合附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明快速细菌基因组DNA提取试剂盒包括以下组分：裂解液、加强液、清洗液和洗脱液。
所述裂解液包括多种表面活性剂：Triton X-100、SDS和NP-40，金属螯合剂EDTA，盐溶液NaCl，Tris-HCl和海藻糖。所述裂解液包括以下物质组成：EDTA浓度为1～10mM，NaCl浓度为10～100mM，海藻糖的浓度为0.1～5M，Triton X-100的浓度为1～10％，SDS的浓度为1～1％，NP-40的浓度为1～10％。其中非离子表面活性剂Triton X-100、NP-40和阴离子表面活性剂SDS的作用是变性细胞膜蛋白使得细胞裂解释放核酸。金属离子螯合剂EDTA能够螯合金属离子从而降低DNase和RNase的酶活性。海藻糖则能够在核酸浓度表面形成保护层，使得其稳定存在于溶液中。最优选的Triton X-100终浓度为5％(V/V)，SDS终浓度为0.05％，EDTA终浓度为2mM，NaCl的浓度为50mM，海藻糖的浓度为0.5M，NP-40的终浓度为2％(V/V)并用Tris-HCl调整PH为7-8之间。
加强液包括盐酸胍或者异硫氰酸胍中的一种或多种。其中一种实施例中所述加强液包括1M～10M盐酸胍和1M～10M异硫氰酸胍中的一种或多种，用来加速细胞膜蛋白的变性和细胞的裂解。最优选的组合为6M盐酸胍。
清洗液包括了盐酸胍、乙酸甲、糖原和MOPS中的一种或者多种组合。其中一种实施例中所述清洗液包括0～1mM的盐酸胍，0～1mM的醋酸钾，0～1m/v％的糖原，1～20mM的MOPS。最优选的浓度为，0.1M的盐酸胍，0.15M的醋酸甲，0.05％(m/v)的糖原和2mM的MOPS溶液。
洗脱液包括TE缓冲液。其中一种实施例中所述洗脱液包括1X TE缓冲液(10mMTris-HCl和1mM EDTA组成)，PH为7.4。
实施例1大肠杆菌菌液的核酸提取
(1)裂解结合：取新鲜培养的大肠杆菌1mL于1.5mL EP管中，12000rpm离心1min，弃去上清。加入200μL的裂解液和加强液95℃金属浴加热5min。加热结束后转移到硅胶柱中12000rpm离心1min，随后弃去废液。
(2)洗涤：向硅胶柱中加入500μL的清洗液，12000rpm离心1min，弃去废液。随后空离一次。
(3)洗脱：向硅胶柱中加入100μL的洗脱缓冲液，56℃加热混匀5min后将12000rpm离心1min。离心得到的液体即为提纯的DNA溶液。
该核酸提取物可直接用于RPA-Cas12a等温反应,也可置于-20℃保存。
核酸提取完成后，取2μL上述核酸作为模板加入到18μL的反应液中，总反应体积为20uL。20μL的反应体系包括500nM上下游引物、800nM F-Q报告探针、1X Reaction Buffer、14mM MgOAc、400nM CrRNA和800nM Cas12a蛋白。上游引物序列为5’-GAATTAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTCAT-3’，下游引物的序列为5’-ATTCACAAATATAAATAACTTGCTCATTCGATAG-3’。F-Q报告探针的序列为5’FAM-TTATT-BHQ1 3’。CrRNA的序列为
5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAUCCUCAGCUAUAGGGUG-3’。反应体系在酶标仪上37℃反应60min。荧光曲线结果如图1所示。从图1的检测结果可知，本试剂盒能够成功对大肠杆菌进行核酸提取。
实施例2奶粉样品中大肠杆菌的核酸提取
(1)样品准备：将大肠杆菌加入到1mL奶粉样品中混匀后制备成终浓度为1×107CFU/mL的人工加标样品。
(2)裂解结合：取1mL加标样品于1.5mL EP管中，12000rpm离心1min，弃去上清。加入200μL的裂解液和加强液95℃金属浴加热5min。加热结束后转移到硅胶柱中12000rpm离心1min，随后弃去废液。
(3)洗涤：向硅胶柱中加入500μL的清洗液，12000rpm离心1min，弃去废液。随后空离一次。
(4)洗脱：向硅胶柱中加入100μL的洗脱缓冲液，56℃加热混匀5min后将12000rpm离心1min。离心得到的液体即为提纯的DNA溶液。
该核酸提取物可直接用于RPA-Cas12a等温反应,也可置于-20℃保存。
核酸提取完成后，取2μL上述核酸作为模板加入到18μL的反应液中，总反应体积为20uL。反应体系在酶标仪上37℃反应60min。荧光曲线结果如图2所示。从图2的检测结果可知，本试剂盒能够成功对奶粉样品中的大肠杆菌进行核酸提取。
实施例3尿液样品中大肠杆菌的核酸提取
(1)样品准备：将大肠杆菌加入到1mL人造尿液样品中混匀后制备成终浓度为1×107CFU/mL的人工加标样品。
(2)裂解结合：取1mL加标样品于1.5mL EP管中，12000rpm离心1min，弃去上清。加入200μL的裂解液和加强液95℃金属浴加热5min。加热结束后转移到硅胶柱中12000rpm离心1min，随后弃去废液。
(3)洗涤：向硅胶柱中加入500μL的清洗液，12000rpm离心1min，弃去废液。随后空离一次。
(4)洗脱：向硅胶柱中加入100μL的洗脱缓冲液，56℃加热混匀5min后将12000rpm离心1min。离心得到的液体即为提纯的DNA溶液。
该核酸提取物可直接用于RPA-Cas12a等温反应,也可置于-20℃保存。
核酸提取完成后，取2μL上述核酸作为模板加入到18μL的反应液中，总反应体积为20uL。反应体系在酶标仪上37℃反应60min。荧光曲线结果如图3所示。从图3的检测结果可知，本试剂盒能够成功对尿液样品中的大肠杆菌进行核酸提取。
实施例4唾液样品中大肠杆菌的核酸提取
(1)样品准备：将大肠杆菌加入到1mL人造唾液样品中混匀后制备成终浓度为1×107CFU/mL的人工加标样品。
(2)裂解结合：取1mL加标样品于1.5mL EP管中，12000rpm离心1min，弃去上清。加入200μL的裂解液和加强液95℃金属浴加热5min。加热结束后转移到硅胶柱中12000rpm离心1min，随后弃去废液。
(3)洗涤：向硅胶柱中加入500μL的清洗液，12000rpm离心1min，弃去废液。随后空离一次。
(4)洗脱：向硅胶柱中加入100μL的洗脱缓冲液，56℃加热混匀5min后将12000rpm离心1min。离心得到的液体即为提纯的DNA溶液。
该核酸提取物可直接用于RPA-Cas12a等温反应,也可置于-20℃保存。
核酸提取完成后，取2μL上述核酸作为模板加入到18μL的反应液中，总反应体积为20uL。反应体系在酶标仪上37℃反应60min。荧光曲线结果如图4所示。从附图1的检测结果可知，本试剂盒能够成功对唾液样品中的大肠杆菌进行核酸提取。
最后说明的是，以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及等效物界定。
Claims (8)
1.一种快速细菌基因组DNA提取试剂盒，所述试剂盒的试剂包括裂解液、加强液、清洗液和洗脱液，其特征在于：所述裂解液包括多种表面活性剂的组合物；所述加强液为盐酸胍和异硫氰酸胍一种或两种；所述清洗液包括盐酸胍、乙酸甲、糖原和MOPS中的一种或者多种组合；所述洗脱液包括TE缓冲液。
2.根据权利要求1所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为Triton X-100、SDS和NP-40；Triton X-100的浓度为1 ~ 10%，SDS的浓度为1 ~ 1%，NP-40的浓度为1 ~ 10%；优选的Triton X-100的浓度为5%，SDS的浓度为0.05%，NP-40的浓度为2%。
3.根据权利要求2所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液还包括：EDTA浓度为1 ~ 10 mM，优选1 ~ 5 mM，最优选为2 mM；NaCl浓度为10 ~ 100 mM，优选20 ~ 60 mM，最优选为50 mM；海藻糖的浓度为0.1 ~ 5 M，优选0.1 ~ 1 M，最优选为 0.5M；Tris-HCl调整PH为7 ~ 8之间。
4.根据权利要求1所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述加强液中盐酸胍的浓度为1 M ~ 10 M；异硫氰酸胍的浓度为1 M ~ 10 M；优选的盐酸胍的浓度为6M。
5.根据权利要求1所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液中盐酸胍的浓度为0 ~ 1 mM，醋酸钾的浓度为0 ~ 1 mM，糖原的浓度为0 ~ 1 m/v%，MOPS的浓度为 1 ~ 20 mM；优先的，盐酸胍的浓度为0.1 M，醋酸钾的浓度为0.15 M，糖原的浓度为0.05%m/v，MOPS的浓度为 2 mM。
6.根据权利要求1所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述TE缓冲液包括10 mM的Tris-HCl和1 mM的EDTA。
7.一种根据权利要求1-6任一项所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤一.将样品溶液离心处理得到样品；
步骤二.在步骤一得到的样品中加入200 μL裂解液和加强液，混匀后95 ℃加热5 min；12000 rpm离心1 min，弃废液；
步骤三.在步骤二得到的样品中加入500 μL清洗液，12000 rpm离心1 min，弃废液；
步骤四.在步骤三得到的样品中加入200 μL洗脱液，56 ℃孵育5 min， 12000 rpm离心1 min，所得即为提取的细菌DNA。
8.一种根据权利要求1-7任一项所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒适用于菌液、尿液、唾液、奶粉等样品的细菌核酸提取。
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