CN110452903A - 一种无酶法全核酸提取试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种细菌全核酸提取纯化方面，是一种无酶法全核酸提取试剂盒，其特征在于试剂盒包括：裂解液、结合液、磁珠液、洗涤液A、洗涤液B、溶解液。通过裂解液裂解菌体细胞，释放核酸被磁珠捕捉，整个提取过程无需酶试剂，可以提取完整的核酸分子，纯度高，可直接应用下游生物实验，提取过程快速、无毒、操作简单，并可配合自动化仪器使用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及细菌核酸提取纯化方面。
背景技术
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA）。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，因而核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。核酸的研究可从本质上揭示微生物的结构、组成，甚至是致病机理的神秘面纱，可以更有效的研究如何预防、治疗由此产生的疾病，因此，对核酸的研究有着至关重要的意义。
细菌（学名：Bacteria）是生物的主要类群之一，属于细菌域，也是所有生物中数量最多的一类，形状相当多样，主要有球状、杆状，以及螺旋状。将细菌做革兰氏染色，可将细菌分为两大类，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G+），被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（G-）。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成，革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，没有磷壁酸，其细胞壁中游肽桥、肽尾和双糖形成的网状结构较为疏松，而脂类物质含量高，因此在核酸提取过程中，革兰氏阳性菌不易裂解，造成了一定提取困难，往往科学工作者会使用溶菌酶来破碎菌体细胞，不利于后续的纯化过程，影响产物的纯度。本发明的提取方法可应用于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，提取过程不需要使用任何酶试剂。
生物磁珠是指磁珠一般具有超强的顺磁性，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散；具有合适的且差别较小的粒径，保证了足够强的磁响应性又不会沉降；具有丰富的表面活性基团，以便可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。与传统的分离方法相比，把磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。通过在磁珠表面包被上特异性抗体、受体等，用于分离纯化样品中的靶体。磁珠已被广泛应用于免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等多个领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种无酶法全核酸提取试剂盒，可以快速安全地进行核酸提取，期间无需使用任何酶试剂，所得产物纯度高。
本发明提供了一种无酶法全核酸提取试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含：裂解液、结合液、磁珠液、洗涤液A、洗涤液B以及溶解液。
本发明的试剂盒配合了一种核酸提取纯化方法，具体操作步骤如下。
1）取1ml过夜培养的菌液，以10，000rpm的转速进行离心，所述时间为1～2分钟。
2）弃掉步骤1所述上清液。
3）向根据步骤2所述得到的菌体沉淀中加入裂解液，震荡混匀并静置5分钟，使菌体细胞完全裂解；
其中所述裂解液使用体积为300～600ul，所述的裂解液成分为2～5M 胍盐、10～50mM三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）、5～30mM乙二胺四乙酸（EDTA）、0.1～2M醋酸钠（NaAc）、0.01～1%（体积比）聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X100）；
所述胍盐可以是盐酸胍、硝酸胍、碳酸胍、乙酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍等任意一种，其优选浓度为4～5M，所述Tris-HCl优选浓度为10～30mM，所述EDTA优选浓度为10～20mM，所述Triton优选浓度为0.1～0.5%，所述NaAc优选浓度为0.5～1.2M。其中裂解液的PH值为8.2；
所述的菌体沉淀特征其为可以是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，若为革兰氏阴性菌，裂解时间可按5分钟静置裂解；若为革兰氏阳性菌，可将裂解时间增加至8～10分钟。
4）向根据步骤3所述得到的溶液中加入10～30ul磁珠液和200～300ul结合液，震荡混匀，室温静置3分钟；
其中所述磁珠液特征为包含20mg/ml 磁性微球、0.1～1M 氯化钠（NaCl）、10～50mMTris-HCl，其所述的磁性微球特征为表面修饰有硅羟基且具有超顺磁性，直径为50～1000nm。其中所述的结合液特征为包括60～80%乙醇（体积比）、10～30mM Tris-HCl、0.2～0.4M NaCl、0.1～0.5% 吐温80（Tween 80）（体积比）；
优选的磁性液成分为0.4～0.5M NaCl、15～25mM Tris-HCl。优选的结合液成分为65～75%乙醇、10～25mM Tris-HCl、0.2～0.25M NaCl、0.1～0.2% Tween 80。
5）将离心管放置于磁力架上吸附1～2分钟，吸出并弃掉上清液。
6）向离心管中加入600～1000ul的洗涤液A，震荡混匀，放置于磁力架上吸附30秒，吸出并弃掉上清液；
其中所述洗涤A特征为包括50～500mM柠檬酸钠、10～50mM Tris-HCl、10%～40%乙醇（体积比）；
优先的洗涤液A成分为150～250mM 柠檬酸钠、13～25mM Tris-HCl、15～25%乙醇。
7）根据所述步骤6的操作重复完成一次。
8）向离心管中加入600ul洗涤液B，震荡混匀，放置于磁力架上吸附30秒，吸出并弃掉上清液；
其中所述洗涤B特征为包括50～85%乙醇、10～30mM Tris-HCl；
优选地洗涤液B成分为60～75%乙醇、20～25mM Tris-HCl。
9）将离心管开盖置于55℃烘箱中2～3分钟。
10）向离心管中加入20～500ul溶解液，震荡混匀，放于56℃烘箱中2～3分钟后放于磁力架上吸附1分钟，吸取上清液转移至新的离心管中，做好标记放于-20℃保存；
其中所述溶解液的特征为包含10～50mM Tris-HCl、1～20mM EDTA；
优选地溶解液成分为15～25mM Tris-HCl、2～5mM EDTA；
其所述的溶解液PH值为8.2。
本发明实验操作简单便捷，可以在15到20分钟内完成提取工作，在提取过程中无需使用复杂、价格高的仪器或试剂，且试剂盒内中不含有酚氯仿等有毒的有机试剂，可以保证实验人员长期操作的安全性，并且在提取过程中无需应用任何的酶试剂，最后所得到的核酸包含有DNA和RNA，若菌体细胞含有质粒，产物中会存有少量质粒，其各类核酸片段完整性较好，产物纯度较高，260/280可在1.82～1.97之间，260/230可在1.93～2.02之间，可以很好应用于下游的各种检测、测序等实验。
附图说明
附图为实施例1的大肠杆菌的琼脂糖凝胶电泳检测图和实施例2的变形杆菌的琼脂糖凝胶电泳检测图，其中泳道1、2、3、4为实施例1提取效果，泳道5、6、7、8为实施例2提取效果。
具体实施方式
本发明的试剂盒目的是将细菌的核酸提取出来，得到纯度高、完整性好的DNA和RNA。试剂盒包括：裂解液、结合液、磁珠液、洗涤液A、洗涤液B、溶解液。以下实施例是通过具体实施方式对本发明进行更加明确的说明，但并不是说本发明仅局限于以下实施方式。
实施例1。
大肠杆菌全核酸的提取。
1）取1ml过夜培养的大肠杆菌菌液，以10，000rpm的转速进行离心2分钟。
2）弃掉步骤1所述上清液。
3）向根据步骤2所述得到的大肠杆菌菌体沉淀中加入400ul裂解液，震荡混匀并静置5分钟，使大肠杆菌菌体细胞完全裂解；
其中裂解液成分为4M 异硫氰酸胍、20mM Tris-HCl、12mM EDTA、0.8M NaAc、0.15%（体积比）Triton-X100。
4）向根据步骤3所述得到的溶液中加入10ul磁珠液和200ul结合液，震荡混匀后于室温静置3分钟；
磁珠液含有20mg/ml 磁性微球、0.4M NaCl、20mM Tris-HCl，其所述的磁性微球特征为表面修饰有硅羟基且具有超顺磁性，直径为300nm，其中结合液成分为70%乙醇（体积比）、25mM Tris-HCl、0.21M NaCl、0.1%（体积比） Tween 80。
5）将离心管放置于磁力架上吸附1分钟，吸出并弃掉上清液。
6）向离心管中加入600ul洗涤液A，震荡混匀，放置于磁力架上吸附30秒，吸出并弃掉上清液；
洗涤A成分为200mM柠檬酸钠、20mM Tris-HCl、20%（体积比）乙醇。
7）根据所述步骤6的操作重复完成一次。
8）向离心管中加入600ul洗涤液B，震荡混匀，放置于磁力架上吸附30秒，吸出并弃掉上清液；
洗涤B成分为65%乙醇、20mM Tris-HCl。
9）将离心管开盖置于55℃烘箱中3分钟。
10）向离心管中加入100ul的溶解液，震荡混匀，放于56℃烘箱中3分钟后放于磁力架吸附1分钟，吸取上清转移至新的离心管中，做好标记放于-20℃保存；
溶解液成分为20mM Tris-HCl、2mM EDTA。
所得100ul产物使用Nanodrop 2000进行荧光分光光度检测，其A260值为9.31，核酸浓度为465.5 ng/µl，A260/A280值为1.95，A260/A230值为2.08；
对大肠杆菌提取纯化得率为46.5微克/ml菌液。
实施例2。
变形杆菌全核酸的提取。
1）取1ml过夜培养的变形杆菌菌液，以10，000rpm的转速进行离心2分钟。
2）弃掉步骤1所述上清液。
3）向根据步骤1和步骤2所述得到的变形杆菌菌体沉淀中加入500ul裂解液，震荡混匀并静置10分钟，使变形杆菌菌体细胞完全裂解；
裂解液成分为4.5M 盐酸胍、30mM Tris-HCl、10mM EDTA、1.2M NaAc、0.5%（体积比）Triton-X100。
4）向根据步骤3所述得到的溶液中加入20ul磁珠液和250ul结合液，震荡混匀后于室温静置3分钟；
其中磁珠液成分为20mg/ml 磁性微球、0.42M NaCl、20mM Tris-HCl，其磁性微球为表面修饰有硅羟基且具有超顺磁性，直径为300nm，其中结合液成分为包括75%乙醇（体积比）、15mM Tris-HCl、0.24M NaCl、0.2% 吐温80（Tween 80）（体积比）。
5）将离心管放置于磁力架上吸附2分钟，吸出并弃掉上清液。
6）向离心管中加入600ul洗涤液A，震荡混匀，放置于磁力架上吸附30秒，吸出并弃掉上清液；
洗涤A成分为200mM柠檬酸钠、20mM Tris-HCl、20%（体积比）乙醇。
7）根据所述步骤6的操作重复完成一次。
8）向离心管中加入600ul洗涤液B，震荡混匀，放置于磁力架上吸附30秒，吸出并弃掉上清液；
洗涤B成分为65%乙醇、20mM Tris-HCl。
9）将离心管开盖置于55℃烘箱中3分钟。
10）向离心管中加入100ul溶解液，震荡混匀，放于56℃烘箱中3分钟后放于磁力架吸附1分钟，吸取上清转移至新的离心管中，做好标记放于-20℃保存；
溶解液成分为20mM Tris-HCl、2mM EDTA。
所得100ul产物使用Nanodrop 2000进行荧光分光光度检测，其A260值为7.82，核酸浓度为390.8 ng/µl，A260/A280值为2.02，A260/A230值为1.98；
对变形杆菌提取纯化得率为39.1 ug/ml菌液。
Claims (8)
1.一种无酶法全核酸提取试剂盒，所述试剂盒其特征在于内含裂解液、结合液、磁珠液、洗涤液A、洗涤液B以及溶解液。
2.根据权利要求1所述的裂解液，其特征在于裂解液成分为2～5M 胍盐、10～50mM 三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、5～30mM乙二胺四乙酸（EDTA）、0.1～2M醋酸钠（NaAc）、0.01～1%（体积比）聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X100）,所述胍盐可以是盐酸胍、硝酸胍、碳酸胍、乙酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍等任意一种，所述Triton-X100可以用NP40、吐温20、吐温80等洗涤剂替换，所述裂解液PH值为6.0～10.0。
3.根据权利要求1所述的磁珠液，其特征在于所述的磁珠液包含20mg/ml 磁性微球、0.1～1M 氯化钠（NaCl）、10～50mM Tris-HCl，其所述的磁性微球特征为表面修饰有硅羟基且具有超顺磁性，直径为50～1000nm,所述磁性微球表面修饰基团也可以是羟基、羧基、 氨基等活性基团，其中所述的结合液特征为包括60～80%乙醇（体积比）、10～30mM Tris-HCl、0.2～0.4M NaCl、0.1～0.5% 吐温80（Tween 80）（体积比）,所述磁性液及结合液PH值为7.0～7.5。
4.根据权利要求1所述的洗涤液A，其特征在于包括50～500mM柠檬酸钠、10～50mMTris-HCl、10%～40%乙醇（体积比）,所述洗涤液A的PH值为6.0～8.0。
5.根据权利要求1所述的洗涤液B，其特征在于包括50～85%乙醇、10～30mM Tris-HCl,所述洗涤液B的PH值为7.5～8.5。
6.根据权利要求1所述的溶解液，其特征在于包含10～50mM Tris-HCl、1～20mM EDTA，其所述的溶解液PH值为7.5～8.5。
7.根据权利要求1所述的试剂盒操作对象可以为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等微生物。
8.根据权利要求1所述的试剂盒可以配合溶菌酶、蛋白酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶等其中任意一种或多种酶试剂的配合提取。
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