CN111826374A - 一种rna病毒核酸提取液及提取方法 - Google Patents

一种rna病毒核酸提取液及提取方法 Download PDF

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CN111826374A CN202010832573.6A CN202010832573A CN111826374A CN 111826374 A CN111826374 A CN 111826374A CN 202010832573 A CN202010832573 A CN 202010832573A CN 111826374 A CN111826374 A CN 111826374A
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Abstract

本发明公开了一种RNA病毒核酸提取液，其特征在于，包括：200μl～400ul裂解液；400ul～600ul漂洗液A；400ul～600ul漂洗液B；50ul～100ul洗脱液；20ul～40ul磁珠；5～6μlCarrierRNA；所述裂解液中，以1升的含量计算，包括如下组分：50mM～100mMTris；10mM～50mMEDTA；0.1M～0.2MNACL；4.5M～5MGITC；0.1％～0.2％SDS；5％～8％Tween‑20；3％～5％TritonX‑100；0.05％～0.2％β‑ME。本发明还公开了提取方法。本发明通过在裂解液中加入β‑ME，抑制了Rnase酶活性，从而有效地防止了RNA的降解，通过控制上样比例在保证得率的同时，降低了提取时样本间的污染。另外本发明的方法20min即可实现核酸的提取，提取效率高。

Description

一种RNA病毒核酸提取液及提取方法
技术领域
本发明涉及核酸提取领域，具体涉及一种RNA病毒核酸提取液及提取方法。
背景技术
RNA病毒作为感染性疾病重要的病原之一，其检测对于临床治疗有重要的意义。在临床上病毒核酸检测可作为病毒感染重要的参考依据，而病毒的核酸提取是首要工作。然而由于RNase酶广泛存在，在提取的过程中，RNA病毒核酸极易降解，导致其在检测会出现假阴性的现象。
目前针对RNA病毒的核酸提取，大多采用硅基质膜吸附法，其利用离心吸附柱对RNA进行吸附，然后使用特定的漂洗液洗去蛋白、多糖等杂质从而达到分离纯化的目的。
硅基质膜吸附法的缺点在于需要反复离心，倾倒废液；操作繁琐和耗时长，在处理多个样本的时候容易交叉污染；由于样本是单管独立处理，难以形成自动化操作，满足不了临床高通量检测的需求。
而除此之外，TRIzol法中使用的重蒸酚具有毒性；磁珠法费用较高，且提取率不高；而普通的水煮法无法直接用于提取RNA，主要是因为样品中存在内源性的RNA酶，而这些RNA酶会将RNA降解。因此，本领域需要一种能够简便易操作且能够高效率提取RNA的方法。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种RNA病毒核酸提取液及提取方法。
为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：
一种RNA病毒核酸提取液，包括：
200μl～400ul裂解液；
400ul～600ul漂洗液A；
400ul～600ul漂洗液B；
50ul～100ul洗脱液；
20ul～40ul磁珠；
5～6μl CarrierRNA
所述裂解液中，以1升的含量计算，包括如下组分：
50mM～100mMTris；
10mM～50mMEDTA；
0.1M～0.2MNACL；
4.5M～5MGITC；
0.1％～0.2％SDS；
5％～8％Tween-20；
3％～5％TritonX-100；
0.05％～0.2％β-ME。
在本发明的一个优选实施例中，在所述漂洗液A当中，按1升的含量计算，包括如下组分：
5mM～15mMTris；
0.5M～1.0MNaOAc；
1.5％～2％Tween-20；
50％～60％EOH。
在本发明的一个优选实施例中，在所述漂洗液B当中，按1升的含量计算，包括如下组分：
5mM～20mMTris；
70％～80％EOH。
在本发明的一个优选实施例中，在所述洗脱液当中，按1升的含量计算，包括如下组分：
2.5mM～5mMTris。
在本发明的一个优选实施例中，所述磁珠为市售磁珠，浓度为50mg/ml。
在本发明的一个优选实施例中，所述CarrierRNA为1ug/ul的CarrierRNA。
在本发明的一个优选实施例中，所述裂解液、漂洗液A、漂洗液B及洗脱液的pH均为8.0。
一种RNA病毒核酸提取液的提取方法，其中，包括如下步骤：
在装有待测样本的试管中加入所述裂解液、所述CarrierRNA和所述磁珠后在磁力架上进行磁力混匀后静置至所述磁珠被完全吸附在试管管壁后弃去所述试管内的液体；
将所述试管从所述磁力架上取下后加入所述漂洗液A后混匀静置，再次放置在磁力架上进行磁力吸附至述磁珠被完全吸附在试管管壁后弃去所述试管内的液体；
将所述试管从所述磁力架上取下后加入所述漂洗液B后混匀静置，再次放置在磁力架上进行磁力吸附至述磁珠被完全吸附在试管管壁后弃去所述试管内的液体；
将所述试管从所述磁力架上取下后加入所述洗脱液对磁珠上的核酸进行洗脱，洗脱下来的核酸即为RNA溶液。
一种自动化RNA病毒核酸的提取方法其中，包括如下步骤：
步骤一，在提取板内加入如下试剂：
在第一孔内按顺序加入所述裂解液、待测样本、CarrierRNA以及所述磁珠；
在第二孔内加入所述漂洗液A；
在第三孔内加入所述漂洗液B；
在第五孔内加入所述洗脱液。
步骤二，按照表1所示来设定提取步骤后提取，所述第五孔内的溶液即为RNA病毒基因组核酸。
在本发明的一个优选实施例中，所述裂解液与所述待测样本的体积之比为1：1。
本发明的有益效果在于：
通过在裂解液中加入β-ME，抑制了Rnase酶活性，从而有效地防止了RNA的降解，通过控制上样比例在保证得率的同时，降低了提取时样本间的污染。另外本发明的方法20min即可实现核酸的提取，提取效率高。
附图说明
图1为HCV质控品提取的检测结果示意图。
图2为HIV质控品提取的检测结果示意图。
图3为新冠病毒假病毒提取的检测结果示意图。
图4为样本间污染测试的检测结果示意图。
具体实施方式
本发明的主要原理在于：通过在裂解液中加入β-ME，抑制了Rnase酶活性，从而有效地防止了RNA的降解。
通过控制上样比例(裂解液与待测样本的体积之比)，在保证得率的同时，降低了提取时样本间的污染。
本发明的RNA病毒核酸提取液的提取方法20min即可实现核酸的提取，提取效率高。
本发明的RNA病毒核酸自动化提取方法，可满足临床高通量的需求。
提取实施例1
一种RNA病毒核酸提取方法，包括如下步骤：
裂解样本：在1.5mlEP管中加入200μl样本后加入200μl裂解液、6μlCarrierRNA混匀，室温静置10min，将EP管放置磁力架上，吸附20s，待磁珠完全被吸附至EP管壁上时，吸弃EP管中液体；
洗涤核酸：从磁力架上取下EP管，在EP管中加入漂洗液A600ul，混匀，室温静置2min，将EP管放置磁力架上，吸附15s，待磁珠完全被吸附至EP管壁上时，吸弃EP管中液体；
洗涤核酸，从磁力架上取下EP管，在EP管中加入漂洗液B600ul，混匀，室温静置1min，将EP管放置磁力架上，吸附10s，待磁珠完全被吸附至EP管壁上时，吸弃EP管中液体，可重复一次；
洗脱核酸：从磁力架上取下EP管，加入50ul～100ul洗脱液洗脱磁珠上的核酸即为所述RNA溶液。
实施例1的提取方法整体耗时约20分钟，提取率达80％
提取实施例2
一种自动化RNA病毒核酸提取方法，包括如下步骤：
在提取板中加入以下试剂：
第1孔：200ul裂解液，200ul待测样本，5ulCarrierRNA，20ul磁珠，(按顺序依次加入)；
第2孔：600ul漂洗液A；
第3孔：600ul漂洗液B；
第5孔：50～100ul洗脱液；
使用苏州天隆生物的全自动核酸提取仪NP968-C进行提取，设定如表1的提取步骤，上机提取。提取完成后，第5孔即为样本所提核酸。
表1
Figure BDA0002638526820000051
实施例2的提取方法整体耗时约18分钟，提取率可达80％
提取实施例3
一种自动化RNA病毒核酸提取方法，包括如下步骤：
在提取板中加入以下试剂：
第1孔：200ul裂解液，200ul待测样本，5ulCarrierRNA，20ul磁珠，(按顺序依次加入)；
第2孔：600ul漂洗液A；
第3孔：600ul漂洗液B；
第5孔：50～100ul洗脱液；
使用上海之江的EX3600提取仪进行提取，执行运行程序“RNA Isolation”，进行提取，程序运行完成后，第5孔内溶液即为样本所提核酸。
实施例3的提取方法整体耗时约20分钟，提取率可达80％。
本发明可提取多种类型的RNA病毒核酸，可实现自动化，提取效率高，提取步骤简单，时间短，且可有效减少样本间污染，抽提出的RNA可直接用于PCR、NGS等子生物学下游相关实验，可满足临床快速、高通量、自动化的要求，且可有效提取时降低样本间污染。
下面将本发明的产品和方法应用到具体的提取项目当中：
应用例1：HCV质控品提取
1.裂解样本：将外购高浓度HIV质控品使用猪血浆稀释至100IU/mL浓度，取10人份至1.5mlEP管，每人份200ul。于每个EP管内加入200ul裂解液，5ulCarrierRNA，20ul磁珠，震荡混匀，室温静置10分钟。将EP管放置磁力架上，吸附20s，待磁珠完全被吸附至EP管壁上时，吸弃EP管中液体；
2.洗涤核酸：从磁力架上取下EP管，在EP管中加入漂洗液A600ul，混匀，室温静置2min，将EP管放置磁力架上，吸附15s，待磁珠完全被吸附至EP管壁上时，吸弃EP管中液体；
3.洗涤核酸：从磁力架上取下EP管，在EP管中加入漂洗液B600ul，混匀，室温静置1min，将EP管放置磁力架上，吸附10s，待磁珠完全被吸附至EP管壁上时，吸弃EP管中液体；
4.洗涤核酸：重复5一次
5.洗脱核酸：从磁力架上取下EP管，加入50ulul洗脱液，混匀15s,室温静置2min，将EP管转移至磁力架上，吸附20s,将EP管内洗脱液转移至新的EP管中，立即进行下游生物学实验或者-80℃存放。
8.检测
HCV检测体系如表2所示：
表2
PCR反应Mix 20ul
RNA模板 20ul
Total 40ul
HCV反应程序如表3所示：
表3
Figure BDA0002638526820000071
检测结果：扩增曲线如图1所示；CT值如下表4所示。
表4
编号 CT值
1 40.20
2 37.92
3 40.22
4 38.77
5 39.70
6 38.71
7 40.42
8 39.35
9 38.70
10 38.70
阳性率 100％
1～10号样本扩增曲线如图1所示，均有标准的S曲线，结合表4中检测CT值(均<40)，说明检测结果均为阳性。表明，本发明对于HCV的提取下限可达50IU/ml，能满足临床检测需求。
应用例2：HIV质控品提取
1.裂解样本：将外购高浓度HIV质控品使用猪血浆稀释至100IU/mL浓度，取10人份至1.5mlEP管，每人份200ul。于每个EP管内加入200ul裂解液，5ulCarrierRNA，20ul磁珠，震荡混匀，室温静置10分钟。将EP管放置磁力架上，吸附20s，待磁珠完全被吸附至EP管壁上时，吸弃EP管中液体；
2.洗涤核酸：从磁力架上取下EP管，在EP管中加入漂洗液A600ul，混匀，室温静置2min，将EP管放置磁力架上，吸附15s，待磁珠完全被吸附至EP管壁上时，吸弃EP管中液体；
3.洗涤核酸：从磁力架上取下EP管，在EP管中加入漂洗液B600ul，混匀，室温静置1min，将EP管放置磁力架上，吸附10s，待磁珠完全被吸附至EP管壁上时，吸弃EP管中液体；
4.洗涤核酸：重复5一次
5.洗脱核酸：从磁力架上取下EP管，加入50ul～100ul洗脱液，混匀15s,室温静置2min，将EP管转移至磁力架上，吸附20s,将EP管内洗脱液转移至新的EP管中，立即进行下游生物学实验或者-80℃存放。
8.检测：
HIV反应体系如表5所示：
表5
PCR反应Mix 20ul
RNA模板 5ul
HIV反应程序如表6所示：
表6
Figure BDA0002638526820000081
检测结果：扩增曲线如图2所示；CT值如下表7所示。
表7
编号 CT值
1 38.55
2 36.86
3 36.97
4 36.93
5 38.76
6 36.66
7 38.88
8 37.13
9 38.95
10 37.91
阳性率 100％
1～10号样本扩增曲线如图2所示，均有标准的S曲线，结合表7中检测CT值(均<40)，说明检测结果均为阳性。检测表明，本发明对于HIV的提取下限可达100IU/ml，能满足临床检测需求。
应用例3：新冠病毒假病毒提取
1.将外购高浓度新冠病毒假病毒使用0.9％NaCl稀释至300copies/mL
2.在提取板中加入以下试剂：
第1孔：200ul裂解液，200ul待测样本，5ulCarrierRNA，20ul磁珠，(按顺序依次加入)；
第2孔：600ul漂洗液A；
第3孔：600ul漂洗液B；
第5孔：70ul洗脱液。
3.使用苏州天隆全自动核酸提取仪NP968-C进行提取，设定如表8所示的提取步骤，上机提取。提取完成后，第5孔即为样本所提核酸。
表8
Figure BDA0002638526820000101
4.检测
新冠病毒检测体系如表9所示：
表9
PCR反应Mix 25ul
RNA模板 5ul
反应程序如表10所示：
表10
Figure BDA0002638526820000102
检测结果：扩增曲线如图3所示；CT值如下表11所示。
表11
Figure BDA0002638526820000103
Figure BDA0002638526820000111
1～10号样本扩增曲线如图3所示，均有标准的S型曲线，结合表11检测CT值(<40)，说明检测结果为阳性。表示本发明对于新冠病毒假病毒的提取下限可达300copies/mL，能满足临床检测的需求。
应用例4：样本间污染测试
1.准备107IU/ml浓度的HCV质控品6份，HCV阴性猪血浆6份，使用
第1孔：200ul裂解液，5ulCarrierRNA，20ul磁珠，(按顺序依次加入)；
第2孔：600ul漂洗液A；
第3孔：600ul漂洗液B；
第5孔：70ul洗脱液
2.按下表HCV质控品-HCV阴性猪血浆间隔排布的方式于第1孔中加入200ul待测样本；
3.使用上海之江的EX3600提取仪进行提取，执行运行程序“RNA Isolation”，进行提取；
4.按实例1中检测过程进行检测。
5.检测结果：扩增曲线如图4所示；CT值如下表12所示：
表12
Figure BDA0002638526820000112
Figure BDA0002638526820000121
如图4所示，高浓度HCV质控品(1、3、5、5、7、9、11号)样本扩增曲线为标准的S曲线，HCV阴性猪血浆(2、4、6、8、10、12)号样本扩增曲线为水平的直线。
如表12所示，高浓度HCV质控品(1、3、5、5、7、9、11号)样本扩增检测CT值均在20左右，说明检测结果准确；HCV阴性猪血浆(2、4、6、8、10、12)号样本均为检测CT值，说明检测结果为阴性。
综上，所示的检测结果表明，本发明的提取产品和方法对于高浓度样本提取，无污染现象。这主要是由于本发明合理控制了裂解液和待测样品的比例在合理范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种RNA病毒核酸提取液，其特征在于，包括：
200μl～400ul裂解液；
400ul～600ul漂洗液A；
400ul～600ul漂洗液B；
50ul～100ul洗脱液；
20ul～40ul磁珠；
5～6μl CarrierRNA
所述裂解液中，以1升的含量计算，包括如下组分：
50mM～100mMTris；
10mM～50mMEDTA；
0.1M～0.2MNACL；
4.5M～5MGITC；
0.1％～0.2％SDS；
5％～8％Tween-20；
3％～5％TritonX-100；
0.05％～0.2％β-ME。
2.如权利要求1所述的一种RNA病毒核酸提取液，其特征在于，在所述漂洗液A当中，按1升的含量计算，包括如下组分：
5mM～15mMTris；
0.5M～1.0MNaOAc；
1.5％～2％Tween-20；
50％～60％EOH。
3.如权利要求1所述的一种RNA病毒核酸提取液，其特征在于，在所述漂洗液B当中，按1升的含量计算，包括如下组分：
5mM～20mMTris；
70％～80％EOH。
4.如权利要求1所述的一种RNA病毒核酸提取液，其特征在于，在所述洗脱液当中，按1升的含量计算，包括如下组分：
2.5mM～5mMTris。
5.如权利要求1所述的一种RNA病毒核酸提取液，其特征在于，所述磁珠为市售磁珠，浓度为50mg/ml；所述CarrierRNA为1ug/ul的CarrierRNA。
6.如权利要求1所述的一种RNA病毒核酸提取液，其特征在于，所述裂解液、漂洗液A、漂洗液B及洗脱液的pH均为8.0。
7.如权利要求1-6当中任意一项所述的一种RNA病毒核酸提取液的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
在装有待测样本的试管中加入所述裂解液、所述CarrierRNA和所述磁珠后在磁力架上进行磁力混匀后静置至所述磁珠被完全吸附在试管管壁后弃去所述试管内的液体；
将所述试管从所述磁力架上取下后加入所述漂洗液A后混匀静置，再次放置在磁力架上进行磁力吸附至述磁珠被完全吸附在试管管壁后弃去所述试管内的液体；
将所述试管从所述磁力架上取下后加入所述漂洗液B后混匀静置，再次放置在磁力架上进行磁力吸附至述磁珠被完全吸附在试管管壁后弃去所述试管内的液体；
将所述试管从所述磁力架上取下后加入所述洗脱液对磁珠上的核酸进行洗脱，洗脱下来的核酸即为RNA溶液。
8.如权利要求1-6当中任意一项所述的一种自动化RNA病毒核酸提取液的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，在提取板内加入如下试剂：
在第一孔内按顺序加入所述裂解液、待测样本、CarrierRNA以及所述磁珠；
在第二孔内加入所述漂洗液A；
在第三孔内加入所述漂洗液B；
在第五孔内加入所述洗脱液
步骤二，按照表1所示来设定提取步骤后提取，所述第五孔内的溶液即为RNA病毒基因组核酸。
9.如权利要求7所述的一种RNA病毒核酸提取液的提取方法，其特征在于，所述裂解液与所述待测样本的体积之比为1：1。
10.如权利要求8所述的一种自动化RNA病毒核酸提取液的提取方法，其特征在于，所述裂解液与所述待测样本的体积之比为1：1。
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