CN102827831A - 一种核酸释放试剂及核酸释放方法 - Google Patents

一种核酸释放试剂及核酸释放方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102827831A
CN102827831A CN2012103199056A CN201210319905A CN102827831A CN 102827831 A CN102827831 A CN 102827831A CN 2012103199056 A CN2012103199056 A CN 2012103199056A CN 201210319905 A CN201210319905 A CN 201210319905A CN 102827831 A CN102827831 A CN 102827831A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
acid releasing
reagent
sample
release reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012103199056A
Other languages
English (en)
Inventor
唐景峰
杨雪婷
王业富
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Original Assignee
WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd filed Critical WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority to CN2012103199056A priority Critical patent/CN102827831A/zh
Publication of CN102827831A publication Critical patent/CN102827831A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种核酸释放试剂及核酸释放方法，属于生物技术领域。所述核酸释放试剂由体积百分比浓度为0.5～2%的TritonX-100，质量-体积浓度为0.05～0.1mg/mL的蛋白酶K，1～10mg/mL的明胶和4～40mg/mL的NaOH组成，溶剂为无菌水。所述核酸释放方法包括：将上述核酸释放试剂平衡至室温摇匀，取适量加入PCR反应管再加入待测样本吸打混匀，再经过80～100℃，10min、4℃，1min处理。使用所述核酸释放试剂测定的结果准确、重复性好、特异性强、成本低廉并且用量少，所述核酸释放方法操作简便快速，适用于不同类型的PCR仪，可广泛应用于病原微生物的检测，基因突变的检测，法医学鉴定，组织和血液分型等领域。

Description

一种核酸释放试剂及核酸释放方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种核酸释放试剂及核酸释放方法。
背景技术
目前应用于荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）扩增的核酸提取方法主要有4种：（1）传统煮沸法：裂解液与血液样本混匀，高温裂解，离心得到核酸；（2）浓缩煮沸法：先用多聚糖浓缩沉淀病毒核酸，再加裂解液煮沸，离心得到核酸；（3）离心柱法：裂解后采用层析柱吸附核酸、再洗脱得到较纯的核酸；（4）磁珠法：用磁珠吸附核酸，再洗脱得到较纯的核酸。
上述前2种提取方法缺点是需要多次转管、移液、离心等步骤，样本处理耗时长，操作中难免会丢失部分核酸，使定量值偏低。离心柱法比2种煮沸法提取的核酸纯度大大提高，但手工操作多，效率低。磁珠法提取步骤简单，回收率高、纯度好，易于自动化，但产品价格十分昂贵，目前应用并不广泛。
发明内容
为了解决回收率低、操作复杂和生产成本高的问题，本发明实施例提供了一种核酸释放试剂及采用该核酸释放试剂的核酸释放方法，其技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种核酸释放试剂，由体积百分比浓度为0.5～2%的TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚），质量-体积浓度为0.05～0.1mg/mL的蛋白酶K，1～10mg/mL的明胶和4～40mg/mL的NaOH组成，溶剂为无菌水。该核酸释放试剂的制备方法是：采用常规方法，将各组分充分混合均匀而制成。
优选地，所述核酸释放试剂由体积百分比浓度为0.5～1%的TritonX-100，质量-体积浓度为0.06～0.08mg/mL的蛋白酶K，5～8mg/mL的明胶和8～20mg/mL的NaOH组成，溶剂为无菌水。
另一方面，本发明实施例提供了一种采用上述的核酸释放试剂的核酸释放方法，包括：
将上述储存于-20℃的核酸释放试剂平衡至室温后摇匀，取适量加入PCR反应管再加入待测样本吸打混匀，再经过80～100℃，10min、4℃，1min处理，得到目的核酸。
具体地，所述核酸释放试剂与待测样本的体积比为1:1～9。
具体地，所述待测样本包括全血、血清、血浆或分泌物。
具体地，所述目的核酸为DNA或RNA。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：采用本发明实施例提供的一种核酸释放试剂及核酸释放方法定量检测未知样本中的核酸含量时，其操作便捷，无需单独提取样本的核酸，只需将待测样本和所述核酸释放试剂在反应管中混匀，采用本发明实施例提供的核酸释放方法即可实现核酸的释放，免去了传统提取技术中的离心、弃上清和转管等操作，在很大程度上简化了实验步骤，减少了核酸的丢失，使检测灵敏度有了很大的提高。应用本发明实施例提供的核酸释放试剂可以对全血、血清、血浆或分泌物等未知样本中的核酸含量进行快速、准确的测定而且重复性好，特异性强。此外，本发明实施例提供的这种核酸释放试剂用量少、易于判别且成本较低、使用安全，适用于不同类型的PCR仪，可广泛应用于病原微生物的检测，基因突变的检测，法医学鉴定，组织和血液分型等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A是本发明实施例1提供的检测HBV-DNA的定量参考品A(10×107IU/mL)、B(1.0×106IU/mL)、C(1.0×105IU/mL)和D(1.0×104IU/mL)的荧光曲线图；
图1B是本发明实施例1提供的检测HBV-DNA的定量参考品的标准曲线图；
图2是本发明实施例1提供的检测HBV的阳性参考品和阴性参考品丙型肝炎病毒（HCV）和人类巨细胞病毒HCMV荧光曲线图；
图3是本发明实施例1提供的检测7个浓度梯度（1.0×102IU/ml～1.0×108IU/ml）的HBV阳性样本的荧光曲线图；
图4是本发明实施例2提供的检测HCV阳性样本的荧光曲线图；
图5是本发明实施例3提供的检测RV阳性样本的荧光曲线图；
图6是本发明实施例4提供的检测HPV阳性样本的荧光曲线图；
图7是本发明实施例5提供的用浓缩煮沸法、圣湘一步法和本发明方法检测HBV阳性血清样本的荧光曲线图的比较；
图8是本发明实施例6提供的检测低浓度HBV阳性样本的荧光曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
以下实施例中，实验所用仪器为SLAN-96P实时荧光定量PCR，购自上海宏石医疗科技有限公司；核酸释放试剂所用试剂均购自中华试剂网，除NaOH为分析纯外其他试剂纯度均为分子生物学级，PCR反应液所用试剂及酶均购自大连宝生物工程有限公司；引物和探针均由生工生物工程（上海）有限公司合成。
实施例1.HBV-DNA的荧光定量PCR检测
1、试剂准备
（1）核酸释放试剂配制：
核酸释放试剂各组分及终浓度如下（1mL配方）：
  试剂名称   终浓度   质量/体积
  TritonX-100   0.8%（体积百分比浓度）   8μL
  蛋白酶K   0.065mg/mL（质量-体积浓度）   65μg
  明胶   5mg/mL（质量-体积浓度）   5mg
  NaOH   8mg/mL（质量-体积浓度）   8mg
核酸释放试剂配制方法：按上表量取或称取各组分，加入无菌水至总体积为1mL，用常规方法将各组分充分混合均匀而制成。
（2）PCR反应液配制：
PCR反应液各组分及其在PCR反应体系中的终浓度如下：
  试剂名称及浓度   终浓度
  10×PCR buffer   1×
  MgCl2（25mM）   3.0mM
  dNTPs(2.5mM)   0.6mM
  dUTP(10mM)   0.3mM
  HBV正向引物(10μM)   0.3μM
  HBV反向引物(10μM)   0.3μM
  HBV探针(10μM)   0.1μM
  Taq酶（5U/μL）   0.05U/μL
  UNG酶（1U/μL）   0.01U/μL
其中dNTP/dUTP混合物中dATP:dCTP:dGTP:dTTP:dUTP为1:1:1:1:2，模板取27μL，反应体系总体积为50μL，PCR反应体系中加入UNG酶和dUTP，能够预防PCR产物污染，防止假阳性。
其中：HBV乙型肝炎病毒上游引物：5′-CGGCGTTTTATCATMTTCCTCT-3′；
HBV乙型肝炎病毒下游引物：5′-ACAAACGGGCAACATACCTTG-3′；
HBV乙型肝炎病毒探针：5′-(FAM)-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGG-(BHQ1)-3′。（其中上游引物中兼并碱基代码M＝A,C）
（3）样本梯度稀释：
将含高载量HBV病毒的血浆与阴性血浆混合后进行10倍稀释，共7个梯度（1.0×102IU/mL～1.0×108IU/mL），得到样本1-7。
2、核酸释放（目的核酸：DNA）
包括如下步骤：
（1）将本发明实施例储存于-20℃的核酸释放试剂平衡至室温后摇匀，取14个PCR管，在每个PCR管中加入本发明实施例提供的核酸释放试剂3μL，再分别加入已知阳性的待测样本1-7（血浆）、定量参考品A(1.0×107IU/mL)、B(1.0×106IU/mL)、C(1.0×105IU/mL)和D(1.0×104IU/mL)、阳性质控品、2个阴性质控品27μL，吹打混匀，稍离心除去气泡。定量参考品A-D含有约1.0×107IU/mL-1.0×104IU/mL的HBV基因的非传染性DNA片段，阳性质控品含有1.0×106IU/mL的HBV基因组DNA片段，阴性质控品1和2分别含有HCV基因和HCMV基因的非传染性RNA与DNA片段。
（2）80℃，10min；4℃，1min处理。
（3）直接加入本发明实施例提供的PCR反应液，补无菌水至总体积50μL并混匀，稍离心除去气泡。
3、荧光PCR反应
PCR反应程序为：
Figure BDA00002084849400041
Figure BDA00002084849400051
4、结果分析
如图1A和B所示检测HBV-DNA的定量参考品A、B、C和D的浓度分别为1.0×107IU/mL、1.0×106IU/mL、1.0×105IU/mL和1.0×104IU/mL，所得标准曲线斜率为-3.3111，一致性系数为0.9998。图2为本发明检测的HBV阳性质控品和阴性质控品丙型肝炎病毒HCV和人类巨细胞病毒HCMV的荧光曲线图。从图2中可以看出阳性质控品有明显的S型扩增，CT值为26.05，而阴性质控品HCV和HCMV样本扩增曲线无CT值为阴性，说明本法特异性好。
结合图3，乙型肝炎病毒HBV 7个梯度阳性样本检测结果如下表：
表1HBV 7个梯度阳性样本检测结果
  样本编号 检测结果（CT值）
  1 17.48
  2 21.32
  3 24.61
  4 27.83
  5 31.67
  6 34.50
  7 37.14
实施例2.HCV-RNA的荧光定量PCR检测
1、试剂准备
（1）核酸释放试剂配制：
核酸释放试剂各组分及终浓度如下（1mL配方）：
  试剂名称   终浓度   质量/体积
  TritonX-100   0.5%（体积百分比浓度）   5μL
  蛋白酶K   0.06mg/mL（质量-体积浓度）   60μg
  明胶   6mg/mL（质量-体积浓度）   6mg
  NaOH   12mg/mL（质量-体积浓度）   12mg
核酸释放试剂配制方法：按上表量取或称取各组分，加入无菌水至总体积为1mL，用常规方法将各组分充分混合均匀而制成。
（2）PCR反应液配制：PCR反应液各组分及其在PCR反应体系中的终浓度如下：
  试剂名称及浓度   终浓度
  反转录5×buffer   1×
  dNTPs(2.5mM)   0.3mM
  HCV正向引物(10μM)   0.3μM
  HCV反向引物(10μM)   0.3μM
  HCV探针(10μM)   0.2μM
  RNasin（40U/μL）   0.4U/μL
  Taq酶（5U/μL）   0.05U/μL
  反转录酶（200U/μL）   2.0U/μL
按上表配制PCR反应液，模板取5μL，总体系仍为50μL。
其中：HCV丙型肝炎病毒上游引物：5′-GTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3′；
HCV丙型肝炎病毒下游引物：5′-GCGGGTT DW TCCAAGAAAGGA-3′；
HCV丙型肝炎病毒探针：5′-(FAM)-CACCGGAATTGCCA-(MGB)-3′。
（其中下游引物中简并碱基代码D=G，A,T；W=A,T）
2、核酸释放（目的核酸：RNA）
包括如下步骤：
（1）将本发明实施例储存于-20℃的核酸释放试剂平衡至室温后摇匀，取10个PCR管，在每个PCR管中加入本发明实施例提供的核酸释放试剂3μL，再分别加入已知阳性的待测样本（全血）4例、阳性质控品、阴性质控品和定量参考品A、B、C、D5μL，吹打混匀，稍离心除去气泡，其中，定量参考品A-D含有约1.0×107-1.0×104IU/ml的HCV基因的非传染性的DNA片段，阳性质控品为含1.0×106IU/mLHCV基因组的RNA片段，阴性质控品是含有HCMV基因的非传染性的DNA片段。
（2）90℃，10min；4℃，1min处理。
（3）直接加入本发明实施例提供的PCR反应液，补无菌水至总体积50μL并混匀，稍离心除去气泡。
3、荧光PCR反应
PCR反应程序为：
Figure BDA00002084849400071
4、结果分析
如图4所示，采用本发明实施例提供的核酸释放试剂及其荧光定量PCR检测方法检测HCV阳性样本4例，其扩增曲线有明显的S型，CT值分别为21.84、23.60、27.43和33.17，且阳性质控品与阴性质控品均正常。
实施例3.RV-RNA的荧光定量PCR检测
1、试剂准备
（1）核酸释放试剂配制：
核酸释放试剂各组分及终浓度如下（1mL配方）：
  试剂名称   终浓度   质量/体积
  TritonX-100   2%（体积百分比浓度）   20μL
  蛋白酶K   0.05mg/mL（质量-体积浓度）   50μg
  明胶   1mg/mL（质量-体积浓度）   1mg
  NaOH   4mg/mL（质量-体积浓度）   4mg
核酸释放试剂配制方法：按上表量取或称取各组分，加入无菌水至总体积为1mL，用常规方法将各组分充分混合均匀而制成。
（2）按实施例2配制PCR反应液，仅将HCV引物和探针换成RV特异的引物和探针，模板取10μL，总体系仍为50μL。
其中：RV风疹病毒上游引物：5′-GACCGGCGTGGTGTATGG-3′；
RV风疹病毒下游引物：5′-GAGTGAGCTGCCACCAATG-3′；
RV风疹病毒探针：5′-(FAM)-CCACTCCGCCCAGGTCTGCC-(BHQ1)-3′。
2、核酸释放（目的核酸：RNA）
包括如下步骤：
（1）将本发明实施例储存于-20℃的核酸释放试剂平衡至室温后摇匀，取12个PCR管，在每个PCR管中加入本发明实施例提供的核酸释放试剂3μL，再分别加入已知阳性的待测样本（血清）6例、阳性质控品、阴性质控品及定量参考品A、B、C、D各10μL，吹打混匀，稍离心除去气泡，其中，定量参考品A-D含有约1.0×107-1.0×104IU/ml的RV基因的非传染性的RNA片段，阳性质控品是含1.0×106IU/mL RV基因组RNA的片段，阴性质控品是含有HCV基因的非传染性RNA片段。
（2）90℃，10min；4℃，1min处理。
（3）直接加入本发明实施例1提供的PCR反应液，补无菌水至总体积50μL并混匀，稍离心除去气泡。
3、荧光PCR反应
按实施例2设置PCR反应程序。
4、结果分析
采用本发明实施例提供的核酸释放试剂及其荧光定量PCR检测方法检测RV阳性样本6例，其中标准曲线线性相关系数R2=0.9998，说明具有良好的线性关系，阳性质控品与阴性质控品均正常，验证了实验的有效性，6例RV阳性样本扩增曲线如图5所示，Ct值分别为37.35、32.67、33.64、35.23、30.71和21.05。
实施例4.HPV-DNA的荧光定量检测
1、试剂准备
（1）核酸释放试剂配制：
核酸释放试剂各组分及终浓度如下（1mL配方）：
  试剂名称   终浓度   质量/体积
  TritonX-100   1%（体积百分比浓度）   10μL
  蛋白酶K   0.08mg/mL（质量-体积浓度）   80μg
  明胶   8mg/mL（质量-体积浓度）   8mg
  NaOH   20mg/mL（质量-体积浓度）   20mg
核酸释放试剂配制方法：按上表量取或称取各组分，加入无菌水至总体积为1mL，用常规方法将各组分充分混合均匀而制成。
（2）按实施例1配制PCR反应液，仅将HBV引物和探针换成HPV特异的引物和探针，模板取20μL，总体系仍为50μL。
其中：HPV人乳头瘤病毒上游引物：5′-SWGYWGCAGCAYTATATTGG-3′；
HPV人乳头瘤病毒下游引物：5′-ATGTTGTAWWAYWGTWWGTCTTTG-3′；
HPV人乳头瘤病毒病毒LNA探针：5′-(FAM)-CAYTCWGGYGTGTCTCC-(BHQ1)-3′。
(其中引物和探针中的简并碱基代码S=C,G；W＝A,T；Y＝C,T）
2、样本处理
用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外或尿道口分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内或伸入尿道约2～4厘米，停留5秒钟，捻动棉拭子收集分泌物，将棉拭子放至装有0.5mL磷酸缓冲液（PBS）的无菌玻璃管搅拌、挤干后弃棉拭子（若无PBS，可用无菌生理盐水代替）。
3、核酸释放（目的核酸：DNA）
将本发明实施例储存于-20℃的核酸释放试剂平衡至室温后摇匀，取14个PCR管，在每个PCR管中加入本发明实施例提供的核酸释放试剂3μL，再分别加入已知阳性的HPV待测样本8例（分泌物）、阳性质控品、阴性质控品及定量参考品A、B、C、D各20μL，吹打混匀，稍离心除去气泡。100℃，10min；4℃，1min处理后，直接加入本发明实施例1提供的PCR反应液，补无菌水至总体积50μL并混匀，稍离心除去气泡，其中，定量参考品A-D含有约1.0×107-1.0×104IU/ml的HPV基因的非传染性DNA片段，阳性质控品是含1.0×106IU/mLHPV基因组DNA片段，阴性质控品是含有HBV基因的非传染性DNA片段。
4、荧光PCR反应
与实施例1设置的PCR反应程序相同。
5、结果分析
如图6所示，采用本发明实施例1提供的核酸释放试剂及其荧光定量PCR检测方法检测HPV阳性样本8例，其扩增曲线有明显的S型，且阳性质控品与阴性质控品均正常。
HPV阳性样本检测结果如下：
 HPV样本编号 检测结果（CT值）
  1   23.15
  2   28.83
  3   30.06
  4   25.83
  5   32.56
  6   22.33
  7   31.69
  8   33.60
实施例5.不同核酸提取方法检测HBV阳性样本的比较
比较用浓缩煮沸法、圣湘一步法和本发明实施例提供的核酸释放方法检测HBV阳性样本的结果。
1、试剂准备
（1）血清样本制备：将HBV-DNA国家标准品标定的强阳性血清，以10倍梯度倍比稀释至1.0×103IU/mL，取1.0×106IU/mL、1.0×105IU/mL、1.0×104IU/mL和1.0×103IU/mL共4个浓度作为待测样本进行试验。
（2）核酸释放试剂：方法三用本发明实施例1提供的核酸释放试剂。
（3）PCR反应液：除方法二外，其余用本发明实施例1提供的PCR反应液，模板取5μL，总体系仍为50μL。
2、血清样本核酸提取（目的核酸：DNA）
方法一：浓缩煮沸法
取待测血清各100μL，加入等体积量的溶液A（浓度为15%PEG 6000），混匀后13000rpm离心10min，弃上清，加入25μL溶液B，其中溶液B包括5mM pH8.0的EDTA、浓度为0.5%的TritonX-100、10mM pH8.0的Tris-HCl、浓度为1%的Chelex100、浓度为0.3%的NP-40（壬基酚聚氧乙烯（40）醚），充分混匀后，100℃加热10min，然后13000rpm离心10min，取上清5μL加入到本发明实施例1提供的PCR反应液，补无菌水至总体积50μL并混匀，稍离心除去气泡。
方法二：圣湘一步法（磁珠法）
根据圣湘乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒说明书，取380μL PCR反应液，加入20μL酶混合液和2μL内标，充分混匀制成PCR-Mix，稍离心备用。取10个PCR管，每管中加入圣湘核酸释放试剂5μL，然后将5μL的4例待测样本、阳性质控品、阴性质控品和定量参考品A、B、C和D分别加入不同的PCR管中，吹打混匀，稍离心除去气泡，室温放置10分钟以上，每管加入PCR-Mix混匀，稍离心除去气泡。
方法三：本发明的方法
取10个PCR管，在每个PCR管中加入本发明实施例1提供的核酸释放试剂3μL，然后将3μL的已知阳性的待测样本（血清），定量参考品A、B、C和D，阳性质控品，阴性质控品分别加入不同的PCR管中，吹打混匀，稍离心除去气泡。85℃，10min；4℃，1min处理后，直接加入本发明实施例提供的PCR反应液，补无菌水至总体积50μL并混匀，稍离心除去气泡。
其中，定量参考品A-D和阳性质控品与本发明实施例1相同，阴性质控品含有HPV基因的非传染性DNA片段。
3、荧光PCR反应
方法一、二、三的PCR反应体系均为50μL。
方法一和方法三的PCR反应程序为：
Figure BDA00002084849400111
方法二的PCR反应程序为：
Figure BDA00002084849400112
4、结果分析
三种方法提取4种不同浓度HBV-DNA，结合图7，其荧光定量PCR检测结果如下：
表2三种方法提取4种不同浓度HBV-DNA的荧光定量PCR检测结果
Figure BDA00002084849400113
Figure BDA00002084849400121
从图7中可以得出，本发明的核酸释放试剂、圣湘一步法和浓缩煮沸法提取4个梯度稀释样本的检测值与理论值的双对数曲线的线性相关系数分别为0.9998、0.9994和0.9966，说明本发明实施例提供的核酸释放试剂定量检测的准确性更高。在准确性上，由表2样本浓度与3种提取方法检测结果对比可知本发明实施例提供的核酸释放方法和圣湘一步法提取的DNA对于低浓度样本1.0×103IU/mL检测准确性均高于浓缩煮沸法，样本浓度大于1.0×103IU/mL时，煮沸法的准确性略低于本发明而明显高于圣湘一步法，并且采用本发明实施例提供的核酸释放方法做出的扩增曲线效果更好，准确性更高。说明本发明的方法定量检测的灵敏度高于其他两种方法。
实施例6.低浓度HBV样本的荧光定量PCR检测
1、试剂准备
（1）核酸释放试剂配制：
核酸释放试剂各组分及终浓度如下（1mL配方）：
  试剂名称   终浓度   质量/体积
  TritonX-100   2%（体积百分比浓度）   20μL
  蛋白酶K   0.1mg/mL（质量-体积浓度）   100μg
  明胶   10mg/mL（质量-体积浓度）   10mg
  NaOH   40mg/mL（质量-体积浓度）   40mg
核酸释放试剂配制方法：按上表量取或称取各组分，加入无菌水至总体积为1mL，用常规方法将各组分充分混合均匀而制成。
（2）按实施例1配制PCR反应液，模板取3μL，总体系仍为50μL。
2、核酸释放（目的核酸：DNA）
包括如下步骤：
（1）将本发明实施例储存于-20℃的核酸释放试剂平衡至室温后混匀，取18个PCR管，在每个PCR管中加入本发明实施例提供的核酸释放试剂3μL，再分别加入已知阳性的待测样本（全血），定量参考品A、B、C和D，阳性质控品，阴性质控品3μL，吹打混匀，稍离心除去气泡。其中，定量参考品A-D、阳性质控品和阴性质控品与本发明实施例5相同。
（2）95℃，10min；4℃，1min处理。
（3）直接加入本发明实施例提供的PCR反应液，补无菌水至总体积50μL并混匀，稍离心除去气泡。
3、荧光PCR反应
按实施例1设置PCR反应程序。
4、结果分析
采用本发明实施例提供的核酸释放试剂及其荧光定量PCR检测方法检测HBV样本12例，其中标准曲线的线性相关系数R2=0.9998，说明具有良好的线性关系，阳性质控品与阴性质控品均正常，验证了实验的有效性，12例HBV临床样本的扩增曲线如图8所示，其Ct值分别为29.24、28.94、37.11、36.23、38.93、35.87、33.06、32.81、33.43、34.81、34.00和39.06，软件自动分析得到该12例样本的HBV浓度分别为2.78×104IU/mL、3.44×104IU/mL、1.01×102IU/mL、1.89×102IU/mL、27.61IU/mL、2.45×102IU/mL、1.82×103IU/mL、2.18×103IU/mL、1.40×103IU/mL、5.22×102IU/mL、9.31×102IU/mL和25.15IU/mL。
定量参考品曲线的斜率最好为-3.33±0.1，相关系数在0.99以上为有效。本法有效定量范围在5×102～1.0×109IU/mL，检测下限即灵敏度为500IU/mL。对超出该有效范围的高浓度样本使用阴性血进行适当稀释后测定，对低于500IU/mL的样本建议复核后再报告。
采用本发明实施例提供的一种核酸释放试剂及核酸释放方法定量检测未知样本中的核酸含量时，其操作便捷，无需单独提取样本核酸，只需将待测样本和所述核酸释放试剂在反应管中混匀，采用本发明实施例提供的核酸释放方法即可实现核酸的释放，免去了传统提取技术中的离心、弃上清和转管等操作，在很大程度上简化了实验步骤，使检测灵敏度有了很大的提高，应用本发明实施例提供的核酸释放试剂可以对全血、血清、血浆或分泌物等未知样本中的核酸含量进行快速、准确的测定而且成本低廉，而且重复性好，特异性强。此外，本发明实施例提供的这种核酸释放试剂用量少、易于判别且成本较低、使用安全，适用于不同类型的PCR仪，可广泛应用于病原微生物的检测，基因突变的检测，法医学鉴定，组织和血液分型等领域。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种核酸释放试剂，其特征在于，由体积百分比浓度为0.5～2%的TritonX-100，质量-体积浓度为0.05～0.1mg/mL的蛋白酶K，1～10mg/mL的明胶和4～40mg/mL的NaOH组成，溶剂为无菌水。
2.根据权利要求1所述的核酸释放试剂，其特征在于，由体积百分比浓度为0.5～1%的TritonX-100，质量-体积浓度为0.06～0.08mg/mL的蛋白酶K，5～8mg/mL的明胶和8～20mg/mL的NaOH组成，溶剂为无菌水。
3.一种采用权利要求1所述核酸释放试剂的核酸释放方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的核酸释放试剂平衡至室温后摇匀，取适量加入PCR反应管，再加入待测样本吸打混匀，然后经过80～100℃，10min、4℃，1min处理，得到目的核酸。
4.根据权利要求3所述的核酸释放方法，其特征在于，所述核酸释放试剂与待测样本的体积比为1:1～9。
5.根据权利要求3或4所述的核酸释放方法，其特征在于，所述待测样本包括全血、血清、血浆或分泌物。
6.根据权利要求3所述的核酸释放方法，其特征在于，所述目的核酸为DNA或RNA。
CN2012103199056A 2012-08-31 2012-08-31 一种核酸释放试剂及核酸释放方法 Pending CN102827831A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012103199056A CN102827831A (zh) 2012-08-31 2012-08-31 一种核酸释放试剂及核酸释放方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012103199056A CN102827831A (zh) 2012-08-31 2012-08-31 一种核酸释放试剂及核酸释放方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102827831A true CN102827831A (zh) 2012-12-19

Family

ID=47331143

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012103199056A Pending CN102827831A (zh) 2012-08-31 2012-08-31 一种核酸释放试剂及核酸释放方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102827831A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105441421A (zh) * 2014-09-30 2016-03-30 深圳华大基因研究院 一种细胞裂解方法
CN108977580A (zh) * 2018-08-13 2018-12-11 郑州安图生物工程股份有限公司 一种2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒
CN112266910A (zh) * 2020-12-04 2021-01-26 南京求臻基因科技有限公司 一种核酸释放剂及其核酸释放方法
CN112322797A (zh) * 2021-01-04 2021-02-05 北京昱晟达医疗科技有限公司 检测新冠病毒的方法及试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1621529A (zh) * 2003-11-27 2005-06-01 王海滨 微量核酸释放剂
US7122309B2 (en) * 2000-01-15 2006-10-17 Avigenics, Inc. High throughput screening assay for detecting a DNA sequence
CN101613696A (zh) * 2009-08-05 2009-12-30 公安部物证鉴定中心 提取纯化dna的试剂

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7122309B2 (en) * 2000-01-15 2006-10-17 Avigenics, Inc. High throughput screening assay for detecting a DNA sequence
CN1621529A (zh) * 2003-11-27 2005-06-01 王海滨 微量核酸释放剂
CN101613696A (zh) * 2009-08-05 2009-12-30 公安部物证鉴定中心 提取纯化dna的试剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王文静等: "微量血DNA提取前处理方法改良的探讨", 《劳动医学》 *
陈兴等: "用于细胞破裂的微流控生物芯片的研制", 《分析化学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105441421A (zh) * 2014-09-30 2016-03-30 深圳华大基因研究院 一种细胞裂解方法
CN108977580A (zh) * 2018-08-13 2018-12-11 郑州安图生物工程股份有限公司 一种2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒
CN112266910A (zh) * 2020-12-04 2021-01-26 南京求臻基因科技有限公司 一种核酸释放剂及其核酸释放方法
CN112322797A (zh) * 2021-01-04 2021-02-05 北京昱晟达医疗科技有限公司 检测新冠病毒的方法及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102174660B (zh) 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒
CN113215313A (zh) 一种冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的检测试剂盒与其应用
GB2607805A (en) Novel coronavirus detection reagent and detection method
CN102154510B (zh) 丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
CN104450963B (zh) 一种hbv dna数字pcr定量检测试剂盒及其应用
CN101886138A (zh) 肠道病毒71型、柯萨奇病毒a16型和肠道病毒其它各亚型三色荧光rt-pcr联合检测方法及其试剂盒
CN102827831A (zh) 一种核酸释放试剂及核酸释放方法
CN103060473B (zh) 一种疱疹类病毒ebv检测试剂盒
CN103710338B (zh) 一种人类全血白细胞中dna提取试剂盒
CN103184214B (zh) 一种乙型肝炎病毒核酸快速提取试剂
CN101586162B (zh) 一种提取靶核酸并进行pcr扩增检测的方法
CN102329888A (zh) 一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量PCR检测方法及其试剂盒
Yu et al. Comparative evaluation of three preprocessing methods for extraction and detection of influenza A virus nucleic acids from sputum
CN103184295B (zh) 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法与试剂盒
CN106755584B (zh) 一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒及检测方法
CN102559930A (zh) 一种荧光定量rt-pcr检测丙型肝炎病毒的试剂盒
CN107312874A (zh) 高灵敏实时荧光定量检测hbv核酸的引物、探针及试剂盒和方法
CN101333568B (zh) 一种环境水体中肠道病毒的定量检测方法
CN105112558B (zh) 口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒
CN102827947B (zh) 快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒及检测方法
CN101713002A (zh) 一步法病原体核酸荧光定量pcr检测方法
CN105483289A (zh) 一种肠道病毒三重直接荧光rt-pcr的检测试剂盒和反应体系
CN109182600A (zh) 一种同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1型的荧光定量pcr试剂盒
CN105238880A (zh) 肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒
CN105039599A (zh) 分型定性检测乙型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20121219