CN1621529A - 微量核酸释放剂 - Google Patents
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Abstract
技术领域：本项发明属医学生物技术生物制品领域。技术问题：微量核酸释放剂(MNRR)组成如下：1N的氢氧化钠、0.01％Triton X－100、5mg/L的蛋白酶K、0.001％的石绿及0.01％的明胶；将待测血清直接加到PCR扩增管中，可使用血清质控品与血清样本在同时进行核酸释放和扩增。技术方案：MNRR可使血清蛋白等干扰PCR扩增的物质封闭、沉淀且使HBV DNA充分析出。操作步骤：将3μl核酸释放剂和3μl待测血清直接加到PCR扩增管中，轻轻混匀，加30μl无菌石蜡油，置PCR扩增仪85℃处理10min→4℃置1min，直接加入PCR扩增液，进入PCR扩增程序。用途：实现标准质控品与待测标本同步提取和扩增，避免反复离心和开盖所引起的污染和核酸丢失，实现PCR检测的“一步法”和“一室化”操作。
Description
技术领域 本项发明属医学生物技术生物制品领域。发明的微量核酸释放剂在世界上首先实现“一步乙肝病毒DNA提取”操作，即微量核酸释放剂与微量待测血清直接进入PCR扩增管，不需离心，不需振荡，只需一个吸头即可完成乙肝病毒DNA(HBV DNA)提取，使乙肝病毒DNA定量检测真正实现一室化“无污染”、“快速”及“重复性良好”的PCR检测。
背景技术 目前常用的HBV DNA提取方法有：(1)煮沸发：将50μl～100μl的病毒裂解液与50μl～100μl待测血清振荡混匀，100℃煮沸10min，4℃放置30min～60min，高速离心，吸取上清液进行PCR扩增。(2)浓集煮沸法：将100μl～200μl的病毒促沉液与50μl～100μl待测血清振荡混匀，高速离心10min，使病毒颗粒沉淀，弃去上清液，收集沉淀病毒，然后加入病毒裂解液，100℃煮沸10min，高速离心5min～10min，吸取上清液进行PCR扩增。(3)Trizol裂解提取法：将300μl～500μl Trizol裂解液与100μl～150μl待测血清充分混匀，加入氯仿混匀后离心使分层，取上层液体与异丙醇混匀使DNA沉淀，用75％的乙醇洗涤1次，65℃烤干10min，加洗脱液溶解，吸取上清液进行PCR扩增。以上3种方法需经2～5次的离心、3～7次的开盖等开放操作，提取30个标本的DNA约需1～3个小时，需严格的实验要求，不但费时费力，易导致操作过程中的污染、并且导致核酸丢失的因素较多、检测结果重复性较差。
发明内容 本项目发明的“微量核酸释放剂”，使HBV DNA完全释放到液相，而且将待测血清中的蛋白等物质封闭沉淀，消除其对PCR扩增的干扰，使血清直接从采血管中进入PCR扩增管，不需离心、不需振荡、只需一个吸头即可完成DNA的提取过程。整个处理过程只需15min左右，不但操作快速、简便，更重要的避免了操作过程中的污染问题，并且检测结果具有良好的重复性，准确反映血清中病毒的含量，可使乙肝病毒DNA定量检测实现“一室化”检测。该技术若能推广应用将导致PCR检测的一场革命，对全面提高我国的HBV DNA诊断技术具有重要意义。
具体实施方式 将3μl核酸释放剂和3μl待测血清直接加到PCR扩增管中，轻轻混匀，加30μl无菌石蜡油，置PCR扩增仪99℃处理10min→4℃置1min，直接加入PCR扩增液，进入扩增程序。
Claims (2)
1.按权利要求规定，“一步法”乙肝病毒DNA提取，其特征是3μl本项发明的微量核酸释放剂和3μl待测血清混匀，置99℃处理10min到4℃放置1min，直接加入PCR反应液，进入PCR扩增程序。
2.本项发明的微量核酸释放剂具有使血清中蛋白质封闭沉淀的作用，从而对PCR扩增无干扰。
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