CN105018468A - 乙型肝炎病毒基因分型核酸检测试剂盒(荧光pcr法) - Google Patents
乙型肝炎病毒基因分型核酸检测试剂盒(荧光pcr法) Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种HBV病毒基因分型检测试剂盒，能同时对生物样本中HBV-B亚型、HBV-C亚型、HBV-D亚型进行定性检测，属于分子生物学技术领域，特别是涉及利用微量核酸释放剂提取、扩增HBV病毒基因分型的试剂盒及其使用方法；本试剂盒的优点在于采用微量核酸释放剂提取扩增，简便、灵敏、快速、准确，一次实验同时检测B、C和D型乙型肝炎病毒，而微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免检测过程的假阴性；本发明最低检测限可达1×103IU/ml；并在扩增的过程中加入了内标质控品，能有效的监控样本的提取、扩增效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及利用微量核酸释放剂提取、扩增HBV病毒基因分型的试剂盒及其使用方法。
背景技术
乙型肝炎病毒（HBV）感染呈全球分布，与肝硬化及肝癌的关系密切，是世界范围内重要的公共健康问题，全球人口的30%有血清学证据证实现症或既往感染HBV，在导致死亡的病因中位列第10（78.6万/年），WHO将病毒性肝炎列入主要的公共健康问题；HBV在不同地区的流行率和主要基因型不同，而不同流行程度的地区主要的传播模式也不同。
研究表明，HBV共有8种基因型，不同地区和不同民族基因型分布不同，而且不同基因型其HBV的传播方式、临床疾病谱、预后判断、疫苗预防及抗病毒治疗选择等都有差异，甚至同一HBV基因型的不同亚型在毒力和临床表现上也有区别；因此，近年来国内外掀起了HBV基因型分型研究的热潮。
不同基因型HBV存在典型的地域分布差异，A型发现于北欧、西欧、美国、印度及中部非洲；B型和C型明显分布于亚洲及太平洋地区，如中国、中国台北、印度尼西亚、越南及日本；D型分布在南欧、中东及印度；E型唯独地分布于非洲；F型分布在美洲中部和南部及玻利尼西亚地区；G型最近被定位在美国、法国、德国和墨西哥；H型由F型转化而来，主要分布在美国中部印第安人居住地区；目前我国HBV以B型和C型最为常见(分别为41％和53％)，B型主要分布于南方，而C型则多见于北方、中原和华东地区，兼有少量A型和D型；在香港、广州等南部地区及新疆也有少部分D型分布。
不同基因型HBV的流行病学特征不一样，同时其临床感染特点和致病性也不完全相同，D型与多种严重肝病如肝硬化及肝细胞癌密切相关，可预测年轻患者肝癌的发生；许多严重肝病的发生与基因型C的关系比与基因型B的关系更密切，基因型C很可能导致严重肝病；基因型B常表现出温和的肝纤维化，基因型C比基因型B更易引起浸润性的严重肝脏疾病，并发展成为肝硬化和肝癌，而且C型HBV对干扰素治疗反应不敏感，C基因型的BCP突变率比B基因型高，说明感染HBV基因型C的携带者预后比HBV基因型B的携带者的预后更差；众多的研究结果提示，HBV基因分型对慢性肝病的诊断有重要的指导意义，可根据不同的基因型对疾病发展进行有效预测，从而达到对疾病良好的预防和控制。
HBV分型对预测预后、评价药物治疗反应和选择治疗方案等都有很重要的指导意义，患者感染单一型别HBV与感染多种型别HBV的临床过程是不一样的，如感染血清型adwr的病人比单独感染adw或adr的病人具有更严重的肝脏疾病和更差的预后；不同基因型HBV与抗病毒治疗也有一定的关系，目前主要采用α一干扰素和拉米呋啶治疗乙肝，但是不同基因型对干扰素的应答不一样，含基因型C的患者血清中ALT值高，比基因型B更易发生核心启动子序列突变，并且对α一干扰素治疗敏感性降低，而基因型B对α一干扰素有更好的应答；B型和C型混合感染的病人与单独感染B型的病人对干扰素治疗的效果不一样 ，说明HBV基因型是影响乙型肝炎临床转归的主要决定因素之一，HBV基因型与拉米呋啶治疗的相关性资料不多且存在一定差异，B和C基因型的HBeAg血清转换率分别为23％和11％ ，耐药发生率分别为15％和22％ ，说明B型的应答优于C型；根据不同基因型对治疗药物的反应的不同，相应调整治疗方案，可更有效的指导临床用药。不同基因型的HBV可能有不同的生物学特性，病毒基因型可能与长期感染的病程进展及对干扰素的治疗反应有关；期望通过分型检测结果针对宿主免疫状态、病毒特性和肝病病程，为每一位乙型肝炎患者制订最好的治疗方案。
发明内容
本发明充分利用了Taqman 探针技术的优点，针对HBV 各基因型设计特异探针，各探针标记不同的荧光染料（FAM荧光通道检测HBV-B亚型或D亚型，HEX通道检测HBV-C亚型），从而达到分型的目的，可检测样品中B 、C 和D 型单独感染亦能检测B、C、D亚型混合感染；利用微量核酸释放剂提取具有操作简便、使用安全、成本低廉的优点，适合在临床基因检测中推广应用。
根据本发明的一个优选实施方案，该试剂盒组分如下：微量核酸释放剂、促释放剂、HBV-B/C-PCR反应液、HBV-D-PCR反应液、内标、阴性质控品、HBV-B/C阳性及弱阳性质控品、HBV-D阳性及弱阳性质控品；微量核酸释放剂含有 5～500m M/L的 KCl、0. 5～20％ Triton X-100 、1～100mg/ml的蛋白酶K、1～20mM的NaOH；促释放剂含有pH值5～8的DMSO、终浓度0.5～10%的BSA；HBV-B/C-PCR反应液含有HBV-B亚型及C亚型保守区域引物探针、内标探针、MgCl2、脱氧核糖核苷酸；HBV-D-PCR反应液含有HBV-D亚型保守区域引物探针、内标探针、MgCl2、脱氧核糖核酸。
HBV-B型上游引物序列：5′-CACCCRHGTGTCYTGGCCAA-3′。
HBV-B型下游引物序列：5′-AGCGATAACCAGGACAAATTGG-3′。
HBV-B型荧光探针物序列及荧光素标记物：
FAM--5′-TCTCCARTCACTCACYAACYTGTTGTCCT-3′BHQ-1。
HBV-C型上游引物序列：5′-CGCAGTCCCCAACCTCCA-3′。
HBV-C型下游引物序列：5′-ACGCCGCAGACACATCCAG-3′。
HBV-C型荧光探针物序列及荧光素标记物：
HEX--5′-ACCTCTTGTCCTCCAAYTTGTCCTGGCT-3′BHQ-1 。
HBV-D型上游引物序列：5′-ATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAA-3′。
HBV-D型下游引物序列：5′-TTTRGTACAGCAACAGGAGGGAT-3′。
HBV-D型荧光探针物序列及荧光素标记物：
FAM--5′-CCACCAGCACGGGACCMTGCMGA-3′BHQ-1。
内标上游引物序列：5′-AATTGGTCAACATGTGAAAGC-3′。
内标下游引物序列：5′-GAATGTGGCCAAGGTTCCGTCATTTGG-3′。
内标荧光探针物序列及荧光素标记物：
CY5--5′-AATCTTCTAATTACTGTATATGGAAG-3′BHQ-2 。
在优选的情况下，微量核酸释放剂配制方法为：在灭菌去离子水中加入KCl，使其终浓度为5～500mM；灭菌去离子水中加入Triton X-100 ，使其终浓度为0. 5～20％；蛋白酶K终浓度1～100mg/ml；NaOH终浓度为1～20mM；质量或体积百分比以提取试剂体积为计算基准；配制的试剂长期保存需-20℃冻存。
具体的，在一个优选的实施方案中，本发明所述方法包括如下步骤：
1）取微量核酸释放剂5μl加入等体积的血清或血浆样本，用移液器吹打混匀10次；
2）盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：
第一步：95℃，10分钟；第二步：4℃，5分钟；
3）将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，小心打开管盖，每管加入2.5μl促释放剂并用移液器反复吹打混匀10次；
4）每管加入35μl的HBV-B/C-PCR-mix（或HBV-D-PCR-mix），瞬时离心，置于荧光定量PCR仪扩增。
根据本发明的一个优选实施方案，本试剂盒的最低检出限可达可达1×103 IU/ml。
本试剂盒的优点在于采用微量核酸释放剂提取扩增，简便、灵敏、快速、准确，一次实验同时检测B 、C 和D 型乙型肝炎病毒，而微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免检测过程的假阴性；在扩增的过程中加入了内标质控品，能有效的监控样本的提取、扩增效率。
附图说明
图1为HBV-B/C体系阳性参考品（P1～P8）扩增曲线。
图2为HBV-D体系阳性参考品（P1～P8）扩增曲线。
图3为HBV-B/C体系和HBV-D体系阴性参考品（N1～N8）扩增曲线。
图4为HBV-B/C体系B亚型最低检出限（L-B）扩增曲线。
图5为HBV-B/C体系C亚型最低检出限（L-C）扩增曲线。
图6为HBV-D体系D亚型最低检出限（L-D）扩增曲线。
图7为HBV-B/C体系B亚型精密度（E1-B、E2-B）扩增曲线。
图8为HBV-B/C体系C亚型精密度（E1-C、E2-C）扩增曲线。
图9为HBV-D体系D亚型精密度（E1-D、E2-D）扩增曲线。
具体实施方式
以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。
实施例1：用本发明方法对企业参考盘阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品、最低检出限参考品进行提取。
试剂准备(在试剂准备区进行)
1）取出试剂盒中各组份，待其充分溶解并恢复室温后混匀瞬时离心；
2）根据待测样本的数量，准备相应量的PCR反应管备用；
3）根据待测样本的数量，按比例（HBV-B/C型 PCR反应液34μl/人份+内标1μl/人份）取相应量的HBV-B/C型 PCR反应液及内标，充分混匀成PCR-B/C mix，瞬时离心后备用；
4）根据待测样本的数量，按比例（HBV-D型 PCR反应液34μl/人份+内标1μl/人份）取相应量的HBV-D型 PCR反应液及内标,充分混匀成PCR-D mix，瞬时离心后备用。
样本处理(在样本处理区进行)
1）取5μl核酸释放剂，加入PCR反应管中；
2）分别取企业参盘阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品、最低检出限参考品（HBV-B/C体系、HBV-D体系各一份）各5μl加入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打混匀10次；
3）将PCR反应管放置在PCR仪中进行裂解，反应温度及时间设定如下：
第一步：95℃，10分钟；第二步：4℃，5分钟；
4）将经过裂解处理后的PCR反应管从普通PCR仪中取出，小心打开管盖，每管加入2.0μl促释放剂，并用移液器在管底吹打混匀10次；
5）每管对应（HBV-B/C体系、HBV-D体系）悬空加入35μl的PCR-mix，瞬时离心30s。
PCR扩增(在扩增与分析区进行)
将离心后的PCR反应管放入荧光PCR检测仪样品槽，按照对应顺序设置样品名称，记录样本摆放顺序。
扩增程序设置
1) HBV-B亚型选FAM通道，HBV-C亚型选HEX（VIC）通道，HBV-D亚型选FAM通道，内标为CY5通道；
2）循环参数设置：
第一步：UNG酶反应，50℃2分钟，1个循环；
第二步：预变性，95℃5分钟，1个循环；
第三步：包括变性、退火、延伸及荧光采集；变性，95℃15秒，40个循环；
退火、延伸及荧光采集， 62℃35秒，40个循环；
第四步：仪器冷却，25℃10秒，1个循环。
质量控制
1）内标通道应出现S型扩增曲线，且Ct值≤28；
2） HBV阴性参考品的靶基因FAM和HEX（VIC）通道均无S型扩增曲线；内标通道有S型扩增曲线，且Ct值≤28；
3） HBV-B/C型阳性参考品在HBV-B/C型PCR反应体系的FAM、HEX（VIC）通道均有S型扩增曲线，且Ct值应≤36，内标通道有S型扩增曲线，且Ct值≤28；
4） HBV-D型阳性参考品在HBV-D型PCR反应体系的FAM通道有S型扩增曲线，且Ct值应≤30，内标通道有S型扩增曲线，且Ct值≤28；
以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效。
结果判断
1）从附图1、2可以看出，阳性参考品P1、P2、P7、P8在HBV-B/C体系FAM通道均有S型扩增曲线，且Ct值应≤36，内标通道Ct值≤28；P3、P4、P7、P8在HBV-B/C体系HEX通道均有S型扩增曲线，且Ct值应≤36，内标通道Ct值≤28；P5、P6在HBV-D体系FAM通道均有S型扩增曲线，且Ct值应≤36，内标通道Ct值≤28；，内标通道Ct值≤28；
2）从附图3可以看出，阴性参考品HBV-B/C体系、HBV-D体系靶基因通道（FAM、HEX/VIC通道）均无Ct值；
3）从附图4、5、6可以看出，试剂盒最低检出限为1×103IU/ml，分别检测最低检出限参考品(L-B)、（L-C）、（L-D）各检测8次结果应均为阳性，内标通道Ct值≤28；
4）从附图7、8、9可以看出，精密度参考品（E1-B、E2-B，E1-C、E2-C，E1-D、E2-D）E1和E2测定8次，CV（%）≤5%，内标通道Ct值≤28。
实施例2：提供本试剂盒的临床应用。
本次临床试验研究共检测520例血清样本，考核试剂检测结果为阳性的样本为449例，阴性样本71例；参比试剂检测为阳性的样本449例，阴性样本71例；本次临床试验研究共检测179例B基因型血清样本，246例C基因型血清样本，24例D基因型血清样本，考核试剂检测结果与参比试剂检测结果一致，阳性符合率为100%，阴性符合率为100%，总符合率为100%，Kappa为1；选取同一患者不同样本类型血清和血浆样本，并进行检测，选择B基因型17例，C基因型44例，D基因型5例，阴性样本3例，结果均符合，达到高度一致；本发明提供一种乙型肝炎病毒基因分型核酸检测试剂盒(荧光PCR法)与对照试剂检测结果一致性较好，为病人的治疗、预后提供临床辅助证明。
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV--B型上游引物序列
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CACCCRHGTG TCYTGGCCAA 20
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV--B型下游引物序列
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AGCGATAACC AGGACAAATT GG 22
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV--B型荧光探针序列
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<220>
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CCACCAGCAC GGGACCMTGC MGA 23
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Gaatgtggcc aaggttccgt catttgg 27
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aatcttctaa ttactgtata tggaag26
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<212> DNA
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<220>
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<400> 13
gaggattggg gaccctgcga cgaacatggg gaacatcaca tcaggattcc taggacccct 60
gctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc ctcacaatac cgcagagtct 120
agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggatca cccgtgtgtc ttggccaaaa 180
ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcctgt cctccaattt gtcctggtta 240
tcgctggatg tgtc 254
<210> 14
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<212> DNA
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ttgttggttc ttctggacta tcaag 205
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV -D型质控品序列
<400> 15
tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat cttcctcttc atcctgctgc tatgcctcat 60
cttcttgttg gttcttctgg actatcaagg tatgttgccc gtttgtcctc taattccagg 120
atcatcaacc accagcgtgg gaccatgcag aacctgcacg actactgctc aaggaacctc 180
tatgtatccc tcctgttgct gtaccaaacc ttcggacgga aattgcacct gtattcccat 240
cccatcatcc tgggc 255
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<211> 209
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内标质粒序列
<400> 16
aaaatctttt cttacaaggg aagtccccaa ttggtcaaca tgtgaaagca cgtgtcatgt 60
tcttactttt gtttgggtaa tcttctaatt actgtatatg gaagatgtga atgaagtttt 120
ggtcctgaat gtggccaagg ttccgtcatt tggagatacg aaatcaaatc tcctttaaga 180
ttttgttttt ataatgtgtt cttccatcc 209
Claims (3)
1.一种利用微量核酸释放剂提取乙型肝炎病毒基因分型核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，能同时对生物样本中HBV-B亚型、HBV-C亚型、HBV-D亚型进行定性检测。
2.该试剂盒含有核酸释放剂、促释放剂、HBV-B/C-PCR反应液、HBV-D-PCR反应液、内标、阴性质控品、HBV-B/C阳性及弱阳性质控品、HBV-D阳性及弱阳性质控品；核酸释放剂含有KCl、Triton X-100 、蛋白酶K、NaOH；促释放剂含有DMSO、BSA；HBV-B/C-PCR反应液含有HBV-B亚型及C亚型保守区域引物探针、内标探针、MgCl2、脱氧核糖核苷酸；HBV-D-PCR反应液含有HBV-D亚型保守区域引物探针、内标探针、MgCl2、脱氧核糖核苷酸。
3.该技术采用微量核酸释放剂(MNRR)，可在一管中进行DNA核酸提取；取5μl的微量核酸释放剂加入等体积血清或血浆样本，反复吹打混匀10次，加入30μl封闭剂，置于PCR仪94℃裂解10分钟，然后迅速降至4℃，小心打开管盖加入2.5μl促释放剂并混匀，所得的混合液每管加入35μl的HBV-B/C-PCR-mix（或HBV-D-PCR-mix），瞬时离心，置于荧光定量PCR仪扩增。
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| CN201510448326.5A CN105018468A (zh) | 2015-07-28 | 2015-07-28 | 乙型肝炎病毒基因分型核酸检测试剂盒(荧光pcr法) |
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