CN101869855B - 核酸分离和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸分离和检测的方法及其适用于该方法的试管装置。所述试管包括本体，本体内设有空腔，所述空腔上部有一个开口，所述本体包括上、下密封连接的两部分，下部分为硬管，上部分为弹性软管。本发明所涉及的试管用于核酸提取装置中，上部分弹性软管与下部分塑料硬管结合，这样试管的打开和封闭状态通过夹持得以实现，能在需要加液或抽液的时候，松开夹持，弹性软管释放，加液管与抽液管得以进入；当试管内进行混匀、反应、或捕获的时候，弹性软管被夹持，试管处于封闭状态。由此可见，试管只在需要的时候打开，可以在最大限度内减小了样品之间的交叉污染。通过本发明，可以方便地实现核酸纯化中的自动化、标准化问题并能有效解决核酸诊断中的交叉污染问题。

Description

核酸分离和检测方法

技术领域

本发明适用于基因诊断(也称为核酸诊断)的各个应用分支如：各种疾病诊断、流行病预防；血库的血液筛查；进出口商品的检验检疫；食品安全检测；生物恐怖的防范、法医鉴定等领域，具体说涉及一种核酸分离和检测方法。 

本发明还涉及上述核酸分离和检测方法的载体，具体说是一种试管装置。 

背景技术

基因诊断也称核酸诊断，是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查核酸的存在状态或缺陷，从核酸结构、复制、转录或翻译水平分析核酸的功能，从而对人体状态与疾病做出诊断的方法。它的目标分子是DNA或RNA，反映核酸的结构和功能。检测的基因有内源性(即机体自身的基因)和外源性(如病毒、细菌等)两种，前者用于诊断基因有无病变，后者用于诊断有无病原体感染。常用的应用范围为：各种疾病诊断、流行病预防；血库的血液筛查；进出口商品的检验检疫；食品安全检测；生物恐怖的防范、法医鉴定等领域。 

核酸诊断的整个技术环节可以分为：核酸的分离和纯化、扩增和放大技术、检测技术三个过程。本发明主要集中于核酸的分离和纯化技术。核酸的分离与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。随着分子生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关等领域，核酸的分离与纯化技术也得到进一步发展。各种新方法、经完善后的传统经典方法以及商品试剂方法的不断出现，极大地推动了分子生物学的发展。核酸的分离和纯化是核酸诊断的第一步，纯化后核酸的质量和纯度直接决定了核酸诊断的质量和准确性。 

大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化。在商业上应用的主要几种方法为：离心法、膜分离法、基于纳米微粒的磁珠法等。 

国内离心法应用以达安基因、科华生物为代表等，其典型特征是经过高温煮沸后用离心机进行分离，通过取上清液和去上清液的办法进行核酸和其他大分子物质和其他杂质进行分析。其缺点是很难进行自动化操作，例如取上清、弃上清的过程很难用自动化的方式来实现。另外的缺点是操作繁琐，费时费力。一个操作熟练的技术人员一个上午也只能处理几十个标本，操作人员需要频繁操作金属、离心机等设备，操作人员全程暴露在生物污染之中。 

膜分离法以AXYGEN、Qiagen等国外公司为代表，常应用于科学研究等领域。一般以科研研究为主，成本很高，操作繁琐，在国内少见临床诊断用途。 

基于纳米微粒的磁珠法：磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒(即磁珠-DNA混合物)，再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。磁珠法不需要离心、不需要加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求，是未来核酸纯化方法发展的一个重要方向。 

核酸诊断相对于传统的免疫诊断等方法具有灵敏度高，特异性强等显著优于传统诊断方法的优点，但是也存在下述几个缺点： 

1自动化程度低，国内基本上无可以商业应用的核酸全自动自动提取和检测仪器；国外仅有Gene-Probe、Roche等两三家企业有FDA认可的自动化的核酸提取和检测系统。 

2标准化程度低；自动化的核酸提取和检测仪器严重匮乏，各种方法林立，没有统一的标准。 

3交叉污染难以克服；核酸诊断的优势在于灵敏度极高。但是由于灵敏度高带来的副作用就是交叉污染问题难以克服，在加热、振荡、加样等核酸提取的过程中非常微量的液体通过气溶胶的方式扩散到空气中，造成样品之间交叉污染，从而造成假阳性的出现一直是核酸诊断的普及的最大障碍之一。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种试管，该试管用于核酸提取装置中，可最大限度地降低样品和外界接触的可能，减少样品之间的交叉污染，提高检测灵敏度，并能通过该试管方便地实现检测核酸诊断的自动化、标准化。 

本发明采用以下技术方案： 

一种试管，包括本体，本体内设有空腔，所述空腔上部有一个开口，所述本体包括上、下密封连接的两部分，下部分为硬管，上部分为弹性软管。 

优选地，所述弹性软管采用硅胶。 

优选地，所述下部分为PP聚丙烯塑料管。 

进一步地，所述本体包括底部和侧壁，在底部一侧与侧壁之间设有斜面。 

进一步地，所述斜面包括位于最低处的根部，自根部起至对面侧壁之间，形成沉淀区。 

优选地，多个试管排成一列集成于一面板上，该面板上设有多个通孔，每个通孔对应一个试管，通孔下设有支架，支架末端套于所述下部分硬管的管口上。 

本发明所涉及的试管用于核酸提取装置中，上部分弹性软管与下部分塑料硬管结合，弹性软管上设有一对夹持部，这样试管的打开和封闭状态得以实现，能在需要加液或抽液的时候，松开夹持，弹性软管释放，加液管与抽液管得以进入；当试管内进行混匀、反应、或捕获的时候，弹性软管被夹持，试管处于封闭状态。由此可见，试管只在需要的时候打开，既减小了交叉污染，同时也方便了打开和封闭。 

斜面结构可使磁珠在最短时间最短距离吸附到斜面，磁珠被集中吸附在斜面的时候，可进行抽液，抽液管插入沉淀区内，而磁珠不会被吸走。同时，也方便了清洗步骤，提取物始终在试管内，避免了与外界接触。欲抽取提取物时，在斜面上方加入检测液，检测液将磁珠沿着斜面冲刷进沉淀区内，方便了磁珠的提取。 

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种核酸分离和检测方法，该方法不仅能实现核酸的提取，而且能减小交叉污染的可能，并可以方便地实现核酸分离、放大、检测的全自动操作。 

本发明采用以下技术方案： 

一种核酸分离和检测方法，用于该方法的试管包括本体，本体内设有空腔，所述空腔上部有一个开口，所述本体包括上、下密封连接的两部分，下部分为硬管，上部分为弹性软管，当加液或抽液时，所述弹性软管释放，试管被打开；在其它步骤中，试管处于被夹持的封闭状态。 

进一步地，所述本体包括底部和侧壁，在底部一侧与侧壁之间设有斜面，核酸提取包括核酸分离步骤，分离出的核酸被捕获，并形成磁珠，磁钢贴在所述斜面外将试管内的磁珠吸附于斜面上。 

优选地，对分离后的核酸提取物清洗，按以下步骤进行，并重复多次： 

a.抽出废液，磁钢保持吸附磁珠； 

b.加入洗涤液，撤离磁钢； 

c.试管振荡混匀； 

d.磁钢贴于斜面上，将试管内磁珠再次吸附于斜面上。 

优选地，清洗后，加检测液，撤离磁钢，检测液自斜面上方加入试管，冲刷磁珠并聚集在所述沉淀区中。 

本发明通过对弹性软管的夹持，试管一直处于封闭状态，只有在加液或抽液时才打开， 极大地减小了交叉污染的机会，且方便对试管的开闭状态的控制。 

另外，试管底部设有斜面，磁珠被吸附在斜面上。提取物能最短时间最短距离聚集在一起，当抽废液时，磁珠在斜面上，这样抽液管能深入试管底部的沉淀区，保证磁珠不会被抽走。同时，也方便了清洗步骤，提取物始终在试管内，避免与外界接触。欲抽取提取物时，在斜面上方加入检测液，检测液将磁珠沿着斜面冲刷进沉淀区内，方便了磁珠的提取。 

附图说明

图1为本发明所涉及的试管的结构示意图。 

图2为本发明所涉及的核酸提取装置的装配示意图，该核酸提取装置包括多个试管排成一列组合而成。 

图3为本发明所涉及的核酸提取装置的结构示意图。 

图4为本发明所涉及的核酸提取装置从另一个角度显示的结构示意图。 

图5～图15显示了核酸提取过程，其中： 

图5为试管初始状态，试管通过夹紧片封闭。 

图6为加入核酸提取液，试管开管-闭管。 

图7为加入样本，试管开管-闭管。 

图8为试管振荡混匀。 

图9为样本裂解。 

图10为捕获核酸。 

图11为磁珠被磁钢吸附于斜面上。 

图12为抽取废液。 

图13为清洗磁珠，包括往试管加入洗涤液-闭管并振荡混匀-吸附磁珠-抽取废液。 

图14为加入检测液，试管开管-闭管。 

图15为转移检测液混合物。 

具体实施方式

参见图1～2，为用于本发明所涉及的核酸分离和检测装置。包括一面板17，所述面板17上设有多个通孔18，每个通孔18下都连接试管10。该试管10包括本体，本体内设空腔11，该空腔11只有一个开口12，本体由上下两部分组成，上半部分为柱状弹性软管13，下半部 分为硬质的塑料管14。试管10的上下材质不同，上半部分所采用的材质偏软，能弹性地收拢或张开，当有外力对弹性软管13侧壁施加时，管口被关闭，可以阻断与外界的流通；当撤除外力后，弹性软管13回复，管口被打开。因此弹性软管13所采用的为弹性材料，如硅胶等。弹性软管13套于塑料管14上，与塑料管14密封连接，形成完整的试管10。塑料管14为PP聚丙烯材质。在本实施例中，塑料管14与弹性软管13连接的管口上外套与面板17连接的支架19，该支架19不仅是连接件，同时也不致使试管变形。软管、硬管和面板可以一体注塑成形。软管开口与通孔可以是一体的。多个试管10排成一列形成如图3～4所示的核酸提取装置。 

在弹性软管13侧壁上设有夹具，如图5所示，相应地，在弹性软管13上设有夹持部29。该夹具为一对夹紧片20，所述夹紧片20穿过两两试管之间的间隙，因此能夹持弹性软管13的一对夹持部29。当夹紧片20夹紧状态时，弹性软管13侧壁贴紧，试管10封闭；夹紧片20松开，弹性软管13回复而释放，试管10与外界连通。由此可见，通过夹紧片20可控制试管10的开闭。在加液或抽液的时候，试管10打开；其它时候试管10被夹紧，最大可能地减小了试剂与外界交叉污染的机会。 

核酸分离和检测方法根据以下步骤进行： 

1)试管10初始处于闭管状态。夹紧片20夹紧弹性软管13，断绝了与外界的流通，见图5。 

2)向试管10加入核酸提取液21，夹紧片20打开试管10，注液管23得以伸入试管10加提取液21。加完后，注液管23退出，夹紧片20再一次闭管，见图6。 

3)接着，加样本22与提取液21混合。再次控制夹紧片20，试管10开管-闭管，见图7。 

4)使试管10振荡，提取液21与样本22混匀，见图8。 

5)裂解。在60℃下，金属浴保持8分钟，见图9。 

6)捕获，在常温(25℃)下，见图10。在本发明所涉及的方法中，核酸分离采用磁珠法，磁珠法是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异地吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒，再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的提取物。 

7)吸附磁珠24，见图11。通过在试管10上增置磁钢25来吸附磁珠24。磁珠24材料是铁氧体，磁钢25可以是天然磁体。由图可知，试管10的底部包括一斜面15，斜面15延伸至侧壁，该斜面15可以是45°的倾斜面，磁钢25贴在斜面15上，可以将试管10内的磁珠24吸附在该面上。也就是说，此时核酸分子都集中在磁珠24上，达到了核酸分离的效果。 

8)接下来对试管10清洗，以得到纯净的提取物。由图12～13可知，先抽取废液。由于试管10的斜面15设计，该斜面15为流线型的曲线，使试管10底部相对于斜面15的另一边形成一沉淀区16，即自斜面15根部至另一边侧壁的区域，斜面15上的物质可沿着斜面15进入沉淀区16，当磁钢吸附磁珠时，磁珠被吸附后形成单点，从而保证磁珠不会在抽废液时抽走。抽液管26能深入到试管10底部，即沉淀区16进行废液抽取。由于此时磁珠24被吸附在斜面15上，因此不必担心分离出的核酸分子随着废液抽出，而且还尽可能地将废液抽取干净。然后，添加洗涤液27，闭管，撤离磁钢25，磁珠24随洗涤液27散化，振荡混匀，再次通过磁钢25将磁珠24吸附于斜面15上，并由抽液管26抽深入试管10底部抽取废液。上述操作过程重复3次，即能达到提纯的效果。该清洗方法由于磁珠24-磁钢25的运用，而使需提取的核酸始终驻留在试管10内，避免了与外界气溶胶的接触。 

9)加检测液，见图14。撤离磁钢25，开管，注液管23于斜面15一侧加试剂，将磁珠24冲刷至沉淀区16，振荡混匀，此时提取物聚集在沉淀区16内。 

10)转移检测液混合物，见图15。抽液管26深入至沉淀区16，将检测液混合物抽出，并移至PCR微孔板28上。 

试管10为长圆形管口设计，流线型斜面结构。流线型斜面结构使磁珠24能在最短时间内，以最短的距离被吸附到试管10侧壁上。长圆形管口设计使抽废液时，磁珠24被吸附到流线型斜面15，废液吸头冲原理斜面15的圆孔位置下抽取废液。保证磁珠24不会被吸走。 

本发明通过该试管10和试剂中的磁性微粒和该装置外的磁铁可以实现核酸的提取和纯化过程。样品中的核酸(DNA、RNA)可以和磁性微粒中的核酸吸附物质相结合，而外部的磁铁可以吸附和放开磁性微粒，配合外部的试剂和冲洗试剂可以从样品中提取和纯化待测的核酸。另外，在试管外加上荧光激发和读数装置可以实现全自动核酸提取、纯化、放大、检测的全过程。 

在本发明中，试管10上半部分所采用的弹性软管13设计结合夹紧片20可实现对试管10 的关闭和打开控制，在需要加样的时候才打开试管10，最大可能地减小了核酸与气溶胶交叉污染。试管10的斜面15结构，及利用磁钢25吸附磁珠24，可使磁珠24吸附于侧壁上，这样为抽取废液提供方便。利用该方法，还改变了清洗方式，在清洗过程中，提取物始终在试管10内，避免与外界接触。 

Claims (5)

1.一种核酸分离和检测方法，用于该方法的试管(10)包括本体，本体内设有空腔(11)，所述空腔(11)上部有一个开口(12)，所述本体包括上、下密封连接的两部分，下部分为硬管，上部分为弹性软管(13)，包括以下步骤：

1)向试管加入核酸提取液；

2)向试管加样本，与核酸提取液混合；

3)试管振荡，核酸提取液与样本混匀；

4)裂解；

5)采用磁珠法捕获核酸分子，实现核酸分离；

6)清洗试管；

7)加检测液，试管振荡混匀；

8)将检测液混合物抽出并转移；

其特征是：当加液或抽液时，所述弹性软管(13)释放，试管(10)被打开；在其它步骤中，试管(10)处于被夹持的封闭状态。

2.根据权利要求1所述的核酸分离和检测方法，其特征是：所述本体包括底部和侧壁，在底部一侧与侧壁之间设有斜面(15)，核酸提取包括核酸分离步骤，分离出的核酸被捕获，并形成磁珠(24)，磁钢(25)贴在所述斜面(15)外将试管(10)内的磁珠(24)吸附于斜面(15)上。

3.根据权利要求2所述的核酸分离和检测方法，其特征是：所述斜面(15)包括位于最低处的根部，自根部起至对面侧壁之间，形成沉淀区(16)，抽液时，磁钢(25)吸附磁珠(24)，抽液管(26)插入所述沉淀区(16)中进行抽液。

4.根据权利要求3所述的核酸分离和检测方法，其特征是对分离后的核酸提取物清洗，按以下步骤进行，并重复多次：

a.抽出废液，磁钢(25)保持吸附磁珠(24)；

b.加入洗涤液(27)，撤离磁钢(25)；

c.试管(10)振荡混匀；

d.磁钢(25)贴于斜面(15)上，将试管(10)内磁珠(24)再次吸附于斜面(15)上。

5.根据权利要求4所述的核酸分离和检测方法，其特征是：清洗后，加检测液，撤离磁钢(25)，检测液自斜面(15)上方加入试管(10)，冲刷磁珠(24)并聚集在所述沉淀区(16)中。

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