CN103789299B - 一种进行全血基因组快速扩增的方法 - Google Patents
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Abstract
一种应用于生物医学分子分析研究领域中的进行全血基因组快速扩增的方法，全血基因组快速扩增的方法是通过核酸释放剂及与之相匹配的PCR反应液来实现的，主要步骤为，取5μl核酸释放剂加入到PCR反应管中，然后取5μl血液与之混合，室温静止5‑10分钟，然后取40μl配置好的PCR反应液直接加入上述混合液中，最后上机扩增；所述核酸释放剂组成为0.4‑2%NaOH，0.02‑2%Chaps，0.5‑20%(NH4)2SO4，0.1%‑5%甲酰胺；（注1：比例应100%）所述PCR反应液组成为30mmol/L Tris‑HCl（PH7.5），10mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/LKCl，4.5mmol/LMgCl2。该发明省略复杂的血液核酸纯化过程、实现、血液核酸提取和扩增的“一室化”操作、避免核酸提取过程中导致的核酸损失、操作简单容易掌握、操作方法便捷、成本低廉、扩增效率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学分子分析研究领域中的一种进行全血基因组快速扩增的方法。
背景技术
近年来，应用PCR技术进行人类或动物遗传背景进行分析已经成为重要的技术分析手段。在进行遗传背景分析过程中，主要的样本材料为血液，由于血液中含有大量的DNA聚合酶抑制物质，如血红素，杂蛋白，脂肪等，因此用PCR方法直接对血液中的核酸进行扩增根本不可能。为了完成血液样本的核酸扩增，必须将核酸物质从血液中纯化出来才能进行。经典的血液核酸提取方法主要包括几个过程。一、通过低渗液涨破红细胞，将血红素物质释放出来，然后离心、清洗去除血红素。二、通过裂解液裂解白细胞，释放核酸物质。三、通过离心柱或纳米磁珠特异性的吸附核酸物质，除去其他杂质。四、通过漂洗液洗掉挂在离心柱或纳米磁珠表面的化学试剂残留和蛋白残留。五、加入洗脱液将核酸从离心柱或纳米磁珠上洗脱下来。在纯化过程中，由于步骤繁多，往往会导致核酸损失在80-90%以上。并且由于操作过于复杂，往往导致样本间出现交叉污染，导致后面PCR扩增分析失败。血液样本如果能够直接作为模板或经过简单处理就能够作为模板进行PCR扩增，这将非常有效的解决上述血液提取面对的难题。
为了解决血液严重抑制PCR扩增的这个难题，一些著名酶制剂公司，开发了一些特殊的酶制剂来解决这个问题，包括美国Thermo Scientific公司开发的Phusion热启动II高保真DNA聚合酶，美国KAPA Biosystems公司开发的KAPA第二代Taq酶，英国NEB公司开发的Hemo KlenTaq酶等等，这些酶制剂能够缓解血红素对PCR反应的抑制效应，从而使PCR扩增能够有效的进行下去。但是这种方法学由于使用了缺陷型的Taq酶，导致了由Taq酶引导的PCR扩增过程保真度较低，常常导致非特异性扩增，从而检测结果出现假阳性。同时，由于使用了这些特种Taq酶，也导致了检测和扩增成本非常高昂，是普通Taq酶扩增价格的20-30倍。这也导致了该方法由于成本过高推广难度非常大。因此，研究开发一种进行全血基因组快速扩增的方法是目前急待解决的新课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种进行全血基因组快速扩增的方法，该发明在核酸释放剂的作用下，核酸能够直接，快速的从血液中白细胞或细小细胞等有核细胞中释放出来，同时，核酸释放试剂又能够导致血红素和其他杂质蛋白变性，减少这些干扰物质对于后续PCR扩增的干扰,从而实现血液基因组快速PCR扩增检测。
本发明的目的是这样实现的：一种进行全血基因组快速扩增的方法，全血基因组快速扩增的方法是通过核酸释放剂及与之相匹配的PCR反应液来实现的，主要步骤为，取5μl核酸释放剂加入到PCR反应管中，然后取5μl血液与之混合，室温静止5-10分钟，然后取40μl配置好的PCR反应液直接加入上述混合液中，最后上机扩增；所述核酸释放剂组成为0.1-0.5M NaOH，5-50mM Chaps，75-750mM(NH4)2SO4，0.1-2M甲酰胺；所述PCR反应液组成为30mmol/L Tris-HCl（PH7.5），10mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/LKCl，4.5mmol/LMgCl2；所述PCR反应液中添加0.1-0.5M Betaine，0.01-0.1%Gelatin，0.5-5mg/ml BSA，50-500mmol/L海藻糖；所述PCR反应液中dNTPs的组成比例为：dATP:dCTP:dGTP:dTTP=1:1:1:1:1，其使用浓度为200-800μm，优选使用浓度为600μm；所述用于进行试验测试使用的引物序列分别为5'-TCGTATTGGGCGCCTGGTCAC-'3（SEQ ID NO：1），5'-TGGCAGTGATGGCA TGGACTG-'3（SEQ ID NO：2），所述用于试验测试的上下游引物使用浓度为10-30pmol，优选上下游引物使用浓度为20pmol，扩增片段长度为600bp；所述PCR扩增酶混合液包括热启动Taq酶、GP32蛋白；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，GP32蛋白的用量为0.05-0.2U/人份。
本发明的要点在于提供一种进行全血基因组快速扩增的方法。其基本原理是：发明一种具有快速释放细胞核酸物质功能的核酸释放剂，在其作用下，血液中白细胞或细小细胞等有核细胞中的核酸物质被快速释放出来。同时，核酸释放试剂又能够对血红素和其他杂质蛋白变性，减少这些干扰物质对于后续PCR扩增的干扰,从而实现血液基因组快速PCR扩增检测过程，其中核酸释放剂为含有强碱性物质的药品，所述用于PCR扩增检测的DNA聚合酶是普通的Taq酶。
一种进行全血基因组快速扩增的方法及应用与现有技术相比，具有省略复杂的血液核酸纯化过程、实现、血液核酸提取和扩增的“一室化”操作、避免核酸提取过程中导致的核酸损失、操作简单容易掌握、只需要移液器和PCR反应管常见实验器材就能操作、方法便捷、成本低廉、扩增效率高等优点，将广泛的应用于生物医学分子分析研究领域中。
附图说明
图1是本发明检测10份不同来源的人血液样本的检测结果图。
图2是本发明对来源于同一个样本的血液进行重复8次的检测结果图。
图3是本发明和市场类似产品的比较测试结果图。
具体实施方式
以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
实施例一
用移液器吸取5μl核酸释放剂（0.25M NaOH，20mM Chaps，250mM(NH4)2SO4，0.5M甲酰胺）加入到0.2mlPCR反应管中，然后取5μl血液样本与之简单混合，室温静止5分钟。然后在每个反应管中加入PCR反应液（PCR反应液组成为30mmol/L Tris-HCl（PH7.5），10mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/LKCl，4.5mmol/LMgCl2，0.1-0.5M Betaine，0.01-0.1%Gelatin，0.5-5mg/ml BSA，50-500mmol/L海藻糖），600μm/L dNTPs，20pmol/L上下游引物，以及5U热启动Taq酶和0.1U GP32蛋白。于Bio-Rad PCR仪中进行扩增。扩增完后，用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
所述实时PCR反应体系为50μl，PCR反应程序见表1。
表1PCR反应程序
实验结果分析如下：
（一）样本适用范围广：用本发明处理了10份不同来源的人血液样本，然后用人管家基因GAPDH引物进行PCR扩增，1.2%凝胶电泳分析表明，10份血液样本均扩增出600bp的条带，结果如图.1。这表明，本发明对不同血液样本适应能力强。
（二）样本重复性好：用本发明对来源于同一个样本的血液，进行8次重复PCR扩增。1.2%凝胶电泳分析表明，8份血液样本均扩增出600bp的条带，并且均一性很好。这表明，本发明具有可靠的重复性。
（三）结果准确可靠：通过凝胶提取试剂盒，将上述凝胶中的电泳条带回收回来。然后进行测序，测序结果表明，扩增序列与克隆的靶基因序列完全吻合，证明扩增的条带为目的基因。
实施例二
与市场中相似产品对比
本发明操作具体步骤如下：用移液器吸取5μl核酸释放剂（0.1M NaOH，5mM Chaps，750mM(NH4)2SO4，0.1M甲酰胺）；加入到0.2mlPCR反应管中，然后取5μl血液样本与之简单混合，室温静止5分钟。然后在每个反应管中加入PCR反应液（PCR反应液组成为30mmol/L Tris-HCl（PH7.5），10mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/LKCl，4.5mmol/LMgCl2，0.1-0.5M Betaine，0.01-0.1%Gelatin，0.5-5mg/ml BSA，50-500mmol/L海藻糖），600μm/L dNTPs，20pmol/L上下游引物，以及5U热启动Taq酶和0.1U GP32蛋白。于Bio-Rad PCR仪中进行扩增。扩增完后，用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
市场中相似产品具体操作过程如下：首先取50μl PCR Mix反应液加入到0.2ml PCR反应管中，随后取1μl DNA聚合酶加入到PCR反应液中，最后在这PCR反应系统中加入2.5μl全血。然后于Bio-Rad PCR仪中进行扩增。扩增完后，用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
用本发明和对照产品对8份不同来源的血液样本同时扩增。扩增后的电泳结果表明，本发明的扩增结果非常均一，而对照产品的均一性较差，个别样本扩增产量很低，表明血液对于该产品具有一定抑制性。
Claims (7)
1.一种进行全血基因组快速扩增的方法，其特征在于：全血基因组快速扩增的方法是通过核酸释放剂及与之相匹配的PCR反应液来实现的，主要步骤为，取5μl核酸释放剂加入到PCR反应管中，然后取5μl血液与之混合，室温静止5-10分钟，然后取40μl配置好的PCR反应液直接加入上述混合液中，最后上机扩增；
所述核酸释放剂组成为0.1-0.5M NaOH，5-50mM Chaps，75-750mM(NH4)2SO4，0.1-2M甲酰胺；
所述PCR反应液组成为30mmol/L Tris-HCl，10mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/LKCl，4.5mmol/LMgCl2。
2.如权利要求1所述的一种进行全血基因组快速扩增的方法，其特征在于：所述PCR反应液中添加0.1-0.5M Betaine，0.01-0.1％Gelatin，0.5-5mg/ml BSA，50-500mmol/L海藻糖。
3.如权利要求1所述的一种进行全血基因组快速扩增的方法，其特征在于：所述PCR反应液中dNTPs的组成比例为：dATP:dCTP:dGTP:dTTP＝1:1:1:1，其使用浓度为200-800μm。
4.如权利要求3所述的一种进行全血基因组快速扩增的方法，其特征在于：所述PCR反应液中dNTPs的使用浓度为600μm。
5.如权利要求1所述的一种进行全血基因组快速扩增的方法，其特征在于：所述PCR反应液中用于进行试验测试使用的引物序列分别为5'-TCGTATTGGGCGCCTGGTCAC-'3，5'-TGGCAGTGATGGCATGGACTG-'3，所述用于试验测试的上下游引物使用浓度为10-30pmol，扩增片段长度为600bp。
6.如权利要求5所述的一种进行全血基因组快速扩增的方法，其特征在于：所述用于试验测试的上下游引物使用浓度为20pmol。
7.如权利要求1所述的一种进行全血基因组快速扩增的方法，其特征在于：所述PCR反应液中PCR扩增酶混合液包括热启动Taq酶、GP32蛋白；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，GP32蛋白的用量为0.05-0.2U/人份。
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