CN102827947A - 快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学临床诊断领域，具体说是快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒及检测方法。包括核酸释放试剂、核酸扩增试剂、对照品、标准品、内标和模板，所述核酸释放试剂SDS、3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(Chaps)、(NH4)₂SO₄和甲酰胺的水溶液，其中核酸释放试剂按体积百分比为0.25％SDS、0.25％Chaps、5％(NH4)₂SO₄、1％甲酰胺，余量为水。本发明的优点在于一种能够高效快速释放肝炎病毒核酸的释放试剂的发明和使用。在核酸释放剂的作用下，核酸能够直接从微量样品中释放出来，直接加入PCR反应液进行荧光定量检测，从而实现快速核酸检测。无需单独提取样本核酸，直接在PCR反应管内完成核酸提取与荧光定量PCR的检测。

Description

快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物医学临床诊断领域，具体说是快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒及检测方法。

背景技术

在我国多种流行性传染病的病原微生物，如艾滋病，病毒性肝炎，结核，梅毒等，对人类健康造成了巨大危害。临床上主要应用免疫学和微生物学等方法对各种病原微生物进行检测和诊断，由于其灵敏性低和周期长等限制，仍不能完全杜绝阳性病原体的漏检和不能及时准确地诊断。近年来核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优势，相比较免疫诊断技术具有灵敏度好、特异性强和可定量等优点。但这项技术在进行确定病原体载量时仍存在操作复杂，费时，容易导致假阳性等缺点。因此，检测技术需要改进和提高，进而降低污染和简化操作过程。

目前在临床核酸检测中使用较多的是荧光定量PCR技术，该技术已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。这项技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。可以对人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、梅毒螺旋菌、结核分枝杆菌、淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体等病原微生物进行定量测定。目前，常用的病原微生物实时荧光定量PCR技术包括探针类和染料类两种。

在实际医学检验操作中，进行荧光定量PCR实验的模板是核酸。作为模板的核酸物质往往要进行纯化，甚至几次纯化，这样才能避免核酸中的杂质(如血清蛋白，胆红素，脂类等)抑制PCR反应。核酸纯化过程比较复杂，繁琐，耗时较长。这也导致了在临床样本的实际检测中，单位时间内核酸检测效率比较低下。另外，核酸纯化过程需要多次离心或移管等操作，也导致核酸以气溶胶的形式外溢到环境中，很容易造成样品检测的假阳性污染，这也是临床核酸检测实验室条件要求很高的主要原因。

核酸纯化涉及到的基本原理基本上都是，首先使细胞膜破裂，染色体DNA和蛋白质变性，然后用有机溶剂抽提使核酸和蛋白分离或直接将核酸吸附于某些固体颗粒的表面，再进行沉淀或洗脱，从而获取高纯度的核酸。目前市场上的核酸检测试剂盒中核酸纯化方法主要有以下几种：(1)煮沸法。该方法主要是通过沸水浴裂解细胞，释放核酸物质，同时使蛋白质变性，然后通过离心沉淀的方式去除变性的蛋白质和杂质，最后回收核酸用于PCR扩增。该方法操作相对较简单，但是由于在高温变性蛋白质过程中，会导致部分核酸的损失。另外，这种方法获得的核酸仍然含有大量的杂质，因此也会产生PCR反应的抑制。(2)二氧化硅膜柱法。该方法首先是用异硫氰酸胍或盐酸胍作为细胞裂解和蛋白变性液来裂解细胞，然后核酸释放到上清液中。再将上清液过二氧化硅膜柱子，在异硫氰酸胍或盐酸胍作为离液盐的作用下，核酸被特异的吸附到二氧化硅膜柱上。然后用乙醇清洗膜柱，最后洗脱核酸进行PCR扩增。该方法获得核酸样品比较纯，但是，由于膜柱吸附效率较低，会导致部分核酸的丢失。(3)纳米磁珠法。该方法过程与二氧化硅膜柱法基本相同，只是用纳米磁珠法来代替二氧化硅膜柱。该方法获得的核酸纯度高，并且核酸回收率要远超二氧化硅膜柱法。以上三种市场主流核酸提取方法，虽然在原理上，操作上和回收得率上各不相同，每种方法都有其各自的优势和特点。但是，三种方法无一例外都有操作时间长，操作复杂，不利于人工大规模处理样本，以及核酸回收损失等这些缺点。

在实际进行核酸检测的过程中，为了排除假阴性结果和确定PCR的反应效率，需要在PCR反应体系中加入内标(内对照分子)。内标可以监控PCR反应，避免样本抑制物、DNA(RNA)提取过程的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因造成的定量误差进行修正。如中国专利申请CN1203366A采用珠蛋白基因等作为内标，CN1664098A采用beta-肌动蛋白作为内标，CN1687454A采用res-1基因作为内标，CN1940087A采用了RNA内标。然而，相对于PCR检测方法，人们对内标的研究工作却相对很少，特别是竞争性内标，其设计有一定的技术难点。

正是由于PCR反应具有强大的扩增效率，也导致其易污染的缺点，极微量的污染可导致阳性结果，灵敏度过高可能会导致假阳性率增加。在导致PCR假阳性的因素中，产物污染是最严重的因素之一。为防止PCR产物污染，以避免假阳性和提高PCR诊断技术的准确性，已成为急待解决的问题。在PCR产物中引入dU代替dT。这种dU化的PCR产物与尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)一起孵育，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。采用UNG酶，在进行PCR之前对模板及其它反应物进行处理，可以防止因产物污染所致的假阳性。目前我国国家药政部门在接受PCR相关检测试剂盒申报时，已经把是否采用了UNG酶作为审批条件之一。但在目前仍然存在一些技术性问题，如UNG酶的活性保存非常重要。今后，UNG酶及其相应的系统将成为常规PCR检测试剂盒的组份。

检测肝炎病毒核酸的方法目前已有很多，且有很多商业化试剂盒生产。但目前定量试剂盒大部分技术仍存在操作复杂和灵敏性低，准确性差等缺点，检测技术需要改进和提高。需要解决的技术关键是进一步提高检测的特异性和灵敏度，降低污染的机会，简化操作方法。针对这些问题，本发明应用核酸释放剂快速获得肝炎病毒的核酸，实现一步法和一管法完成荧光快速定量检测过程，并采用竞争性内标和防污染系统降低假阳性和假阴性，大大提高了检测效率，灵敏度和准确性。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒及检测方法。

一种快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒，包括核酸释放试剂、核酸扩增试剂、对照品、标准品和内标，所述核酸释放试剂为SDS、3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(Chaps)、(NH₄)₂SO₄和甲酰胺的水溶液，其中核酸释放试剂按体积百分比为0.25％SDS、0.25％Chaps、5％(NH₄)₂SO₄、1％甲酰胺，余量为水。

所述标准品为：为非感染性肝炎病毒DNA或RNA；所述对照品为：阴性对照为无菌双蒸水，阳性对照为非感染性肝炎病毒DNA或RNA。

所述核酸扩增试剂为1.5-5mM的MgCl₂，20-50mM Tris-HCl，pH8.3-8.5，35-75mM的KCl，2.5-4mM的dNTP，1.25-5U Taq酶，0.1-0.5U UNG酶，50-200nM探针，50-200nM内标探针，50-750nM肝炎病毒上下游引物。

所述模板为DNA时，酶混合液为Taq酶5U和UDG酶0.5U；模板为RNA时，酶混合液为Taq酶5U、UDG酶0.5U和反转录酶100U。

所述dNTPs的组成比例为：dATP∶dCTP∶dGTP∶dUTP＝1∶1∶1∶1∶2(体积比)；所述的PCR增强剂为0.1～5mg/mlBSA，5～500mmo l/L海藻糖，0.1～5MBetaine和0.01％～1％明胶的混合水溶液。

所述肝炎病毒为乙肝HBV时。

探针：5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3

上游引物：5’ACACCTCCTTTCCATGGCTGC’3；

下游引物：5’AGCGCCGACGGGACGTAGAC’3；

内标探针：5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3；其中探针和内标探针分别标记FAM、Alexa546、JOE、HEX和TET中的一种荧光基团。

所述肝炎病毒为丙肝HCV时。

探针：5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3

上游引物：5’GAGAGCCATAGTGGTCTG’3；

下游引物：5’GCGGGTTGATCCAAGAAAGG’3；

内标探针：5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3，其中探针和内标探针分别标记FAM、Alexa546、JOE、HEX和TET中的一种荧光基团。

快速定量检测病原微生物核酸的试剂盒的检测方法：将待测样品，标准品和对照品分别加入核酸释放剂混合均匀，室温静止10分钟后，加入核酸扩增试剂进行PCR扩增；所述核酸释放试剂SDS、3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(Chaps)、(NH4)₂SO₄和甲酰胺的水溶液，其中核酸释放试剂按体积百分比为0.25％SDS、0.25％Chaps、5％(NH4)₂SO₄、1％甲酰胺，余量为水。

所述肝炎病毒为乙肝HBV时。

探针：5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3

上游引物：5’ACACCTCCTTTCCATGGCTGC’3；

下游引物：5’AGCGCCGACGGGACGTAGAC’3；

内标探针：5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3；其中探针和内标探针分别标记FAM、Alexa546、JOE、HEX和TET中的一种荧光基团。

所述肝炎病毒为丙肝HCV时。

探针：5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3

上游引物：5’GAGAGCCATAGTGGTCTG’3；

下游引物：5’GCGGGTTGATCCAAGAAAGG’3；

内标探针：5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3，其中探针和内标探针分别标记FAM、Alexa546、JOE、HEX和TET中的一种荧光基团。

所述的待检样品为人源或动物源的血清、血浆、精液或唾液等。

本发明的优点及所产生的积极的技术效果是：

1、本发明的优点在于一种能够高效快速释放肝炎病毒核酸的释放试剂的发明和使用。该释放剂与其他释放剂相比，成份不含有生物活性成分，如蛋白酶K，莎梵婷(surfactin)，能够有效和快速地灭活样本中的各种具有生物活性的物质，如DNA酶，RNA酶等。该试剂的适用样本范围宽，可以是血清、血浆、唾液、人体组织细胞和细菌等等。其次，该释放剂对于核酸扩增试剂和Taq酶、UDG酶和反转录酶没有任何抑制效应。再者，该释放剂裂解效果稳定，无需加热，在室温18-30℃条件下，即可将肝炎病毒中的核酸释放出来。应用该核酸释放剂可以实现无需单独提取核酸样本，直接进行PCR扩增反应，实现了核酸提取零耗时。整个样本处理和检验过程简单、快捷、高效、灵敏度高，是快速且定量检测肝炎病毒核酸的最佳选择。同时这避免了核酸提取过程中导致的核酸损失，以及因为核酸提取过程导致了核酸气溶胶的产生。

2、检测技术灵敏性强，特异和精确：本发明采用竞争性内标和UDG酶系统完成对样品中提取的肝炎病毒核酸的实时PCR检测，降低了交叉污染的可能性；优化的PCR反应体系，降低样本中干扰物质对PCR荧光信号的影响(如血清蛋白，胆红素，脂类等)使检测灵敏度达到100IU/ml，达到7个数量级的动态范围。

3、操作极其简便，应用范围广泛：本发明操作极其简单，容易掌握，只需要移液器，PCR反应管和PCR检测仪就能完成样品的快速定量检测。本发明操作简便、快速、成本低廉，并且易于开发为自动化检测系统，并对小量样品的进行快速定量筛检。

本发明检测一些HBV和HCV的阳性样品，与目前市场主流核酸诊断试剂相比，本发明有更宽的线性范围，有更高的灵敏度。

附图说明

图1为本发明实施例提供的检测临床检验中心HBV血清标准物质；

图2为本发明实施例提供的检测HBV国家线性灵敏度参考品的检测结果和理论结果的符合度；

图3为本发明实施例提供的检测国家阴性参考品时的内标检测情况；

图4为本发明实施例提供的检测4份HCV阳性样本结果

具体实施方式

实施例1 HBV阴阳性血清的检测

用带滤芯吸嘴取5μl核酸释放剂(0.25％SDS，0.25％Chaps，5％(NH₄)₂SO₄，1％甲酰胺组成。)加入到PCR反应管中。然后分别吸取5μl待测的血清样本，阳性对照，阴性对照，已知浓度的HBV DNA阳性病毒血清(1000IU/ml，500IU/ml)，加入到核酸释放剂中，移液器轻轻吸打5-8次，室温静止10分钟。然后根据反应数在每管中加入1μl内标(已知的阳性内对照-500copies/μl)，最后加入40μl已配置好的PCR反应液，反应液组成如下，于Bio-Rad IQ5进行荧光定量PCR扩增，程序如下。

PCR反应液组分

成分	用量
		10×Buffer	5.0μl
dNTPS	5.0μl
		HotStar Taq酶(5U/μl)	0.25μl
UDG(1U/μl)	0.1μl
		上游引物HBV-For(20μM)	0.5μl
上游引物HBV-Rev(20μM)	0.5μl
		HBV探针(FAM标记，20μM)	0.2μl
内标探针(HEX标记，20μM)	0.2μl
		去RNase水	18.25μl

PCR反应程序

(1)临床检验中心HBV血清标准物质的检测：用正常人血清进行系列稀释成为，1.2×10⁶IU/ml，1.2×10⁵IU/ml，1.2×10⁴IU/ml，1.2×10³IU/ml。然后用这四个样本做标准曲线，重复三次，结果表明(参见图1)，Ct值的变异系数分别为0.62％，0.13％，0.15％和0.69％，线性关系为r＝0.998％。这表明本发明的试剂盒检测血清样本的重复性很好。

(2)中检所HBV国家阴阳性参考品检测：以中检所HBV国家标准品的阴阳性参考品作为待检样本，采用上述步骤进行检测，检验阴阳性符合率，其中阴阳性符合率为100％。这表明本发明的试剂具有良好的特异性。

(3)中检所HBV国家线性灵敏度参考品检测：以临床检验中心的HBV血清标准物质的系列稀释物(1.2×10⁶IU/ml，1.2×10⁵IU/ml，1.2×10⁴IU/ml，1.2×10³IU/ml)为标准曲线，检测中检所HBV国家线性灵敏度参考品(L0-L6)(参见表1)。分析检测值和理论值之间的符合度(参见图2)。其理论浓度和检测浓度的双对数曲线线性相关系数(r)为0.998。因此采用本发明的快速检测试剂进行PCR定量，结果准确可靠。

表1

(4)内标性能测试：以中检所HBV国家标准品中的8个阴性参考品作为待检样本，检测结果表明，8个样本都没有检出信号，内标全都有信号，并且内标的重复性非常好，能够真正的起到监测假阴性的目的(图.3)。

实施例2.本发明和主流厂家试剂盒比较分析

用本试剂盒和国内主流厂家试剂盒同时对3份HBV DNA阳性的血清进行检测。本发明操作方法同上。主流厂家试剂盒具体过程为：用带滤芯吸嘴分别取100μl待测样本、阳性对照，阴性对照，3份HBV DNA阳性的血清，加入到离心管中，然后加入100μl样品处理液A，振荡混匀。12000rpm转速离心10分钟，然后弃掉上清液，在沉淀中加入25μl样品处理液B，用移液器吸打8-10次。将离心管放入100℃沸水中煮10分钟，然后取出离心管进行12000rpm转速离心10分钟，最后取2微升上清液进行PCR扩增。

本发明的检测试剂检测HBV临床阳性样本的结果如下(参见表2)。本实施例检测出的定量结果与国内主流厂家试剂盒符合度很好，操作极其简便，比主流厂家试剂盒容易操作，节省时间。

表2

样本	厂家试剂盒(IU/ml)	本发明试剂(IU/ml)
			1	3.62×107	3.10×107
2	5.45×106	6.03×106
			3	2.83×104	2.61×104

实施例3 快速检测HCV临床样本

用带滤芯吸嘴取5μl核酸释放剂(0.25％SDS，0.25％Chaps，5％(NH4)₂SO₄，1％甲酰胺组成。)加入到PCR反应管中。然后分别吸取5μl待测的血清样本，阳性对照，阴性对照和已知浓度的4份HCV RNA阳性病毒血清，加入到核酸释放剂中，移液器轻轻吸打5-8次，室温静止10分钟。然后根据反应数在每管中加入1μl内标(已知的阳性内对照-500copies/μl)，最后加入40μl已配置好的PCR反应液，反应液组成如下，于Bio-Rad IQ5进行荧光定量PCR扩增，扩增程序如下。

PCR反应液组分

成分	用量
		10×Buffer	5.0μl
dNTPS	5.0μl
		HotStar Taq酶(5U/μl)	0.25μl
M-MLV反转录酶(200U/ul)	0.5μl
		UDG(1U/μl)	0.1μl
上游引物HBV-For(20μM)	0.5μl
		上游引物HBV-Rev(20μM)	0.5μl
HBV探针(FAM标记，20μM)	0.2μl
		内标探针(HEX标记，20μM)	0.2μl
去RNase水	18.25μl

PCR反应程序

本发明检测4份HCV阳性样本，全部检出，病毒载量在5×10⁸-5×10⁴IU/ml之间(参见图4)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒，包括核酸释放试剂、核酸扩增试剂、对照品、标准品和内标，其特征在于：所述核酸释放试剂为SDS、3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(Chaps)、(NH₄)₂SO₄和甲酰胺的水溶液，其中核酸释放试剂按体积百分比为0.25％SDS、0.25％Chaps、5％(NH₄)₂SO₄、1％甲酰胺，余量为水。

2.按权利要求1所述的快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述标准品为：为非感染性肝炎病毒DNA或RNA；所述对照品为：阴性对照为无菌双蒸水，阳性对照为非感染性肝炎病毒DNA或RNA。

3.按权利要求1所述的快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述核酸扩增试剂为1.5-5mM的MgCl₂，20-50mM Tris-HCl，pH8.3-8.5，35-75mM的KCl，2.5-4mM的dNTP，1.25-5U Taq酶，0.1-0.5UUNG酶，50-200nM探针，50-200nM内标探针，50-750nM肝炎病毒上下游引物。

4.按权利要求3所述的快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述模板为DNA时，酶混合液为Taq酶5U和UDG酶0.5U；模板为RNA时，酶混合液为Taq酶5U、UDG酶0.5U和反转录酶100U。

5.按权利要求3所述的快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述dNTPs的组成比例为：dATP∶dCTP∶dGTP∶dUTP＝1∶1∶1∶1∶2(体积比)；所述的PCR增强剂为0.1～5mg/mlBSA，5～500mmol/L海藻糖，0.1～5M Betaine和0.01％～1％明胶的混合水溶液。

6.按权利要求3所述的快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述肝炎病毒为乙肝HBV时；

探针：5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3

上游引物：5’ACACCTCCTTTCCATGGCTGC’3；

下游引物：5’AGCGCCGACGGGACGTAGAC’3；

内标探针：5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3；其中探针和内标探针分别标记FAM、Alexa546、JOE、HEX和TET中的一种荧光基团。

7.按权利要求3所述的快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述肝炎病毒为丙肝HCV时；

探针：5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3

上游引物：5’GAGAGCCATAGTGGTCTG’3；

下游引物：5’GCGGGTTGATCCAAGAAAGG’3；

内标探针：5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3，其中探针和内标探针分别标记FAM、Alexa546、JOE、HEX和TET中的一种荧光基团。

8.一种按照权利要求1所述的快速定量检测病原微生物核酸的试剂盒的检测方法，其特征在于：将待测样品，标准品和对照品分别加入核酸释放剂混合均匀，室温静止10分钟后，加入核酸扩增试剂进行PCR扩增；所述核酸释放试剂SDS、3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(Chaps)、(NH4)₂SO₄和甲酰胺的水溶液，其中核酸释放试剂按体积百分比为0.25％SDS、0.25％Chaps、5％(NH4)₂SO₄、1％甲酰胺，余量为水。

9.按权利要求8所述的快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述肝炎病毒为乙肝HBV时；

探针：5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3

上游引物：5’ACACCTCCTTTCCATGGCTGC’3；

下游引物：5’AGCGCCGACGGGACGTAGAC’3；

内标探针：5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3；其中探针和内标探针分别标记FAM、Alexa546、JOE、HEX和TET中的一种荧光基团。

10.按权利要求8所述的快速定量检测肝炎病毒核酸的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述肝炎病毒为丙肝HCV时；

探针：5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3

上游引物：5’GAGAGCCATAGTGGTCTG’3；

下游引物：5’GCGGGTTGATCCAAGAAAGG’3；

内标探针：5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3，其中探针和内标探针分别标记FAM、Alexa546、JOE、HEX和TET中的一种荧光基团。

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