CN101713002A - 一步法病原体核酸荧光定量pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法，该方法是：针对待测病原体核酸选取保守基因序列，设计特异性引物探针，采用一种核酸快速释放试剂提取病原体核酸，直接加入相应的PCR反应液，实现PCR荧光定量检测。本发明操作简单快速，抗污染抗干扰能力强，提取的核酸无损失，快速准确，所用试剂制造成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸荧光定量PCR检测方法，尤其是涉及一种一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法。
背景技术
血清中病毒核酸的提取，目前主要有四种方法：(1)直接煮沸法：向血清中加入核酸裂解液，直接煮沸，高速离心，上清即为模板；其优点是易于操作；缺点是不能有效去除血清中抑制PCR的因素，弱阳性经常无扩增；(2)煮沸法：先将血清浓缩，再加裂解液，煮沸，高速离心，上清为模板，是目前国内临床通用的方法；这种方法能部分去除撝苯又蠓蟹″中无法去除的抑制性因素，缺点在于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀，使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸；(3)柱提取法：血清通过裂解，过柱后核酸吸附到膜上，通过两次洗涤，最后洗脱下来的为模板；这种方法相对前两种提取方法而言，提取的核酸纯度大大提高，不但可用于下游PCR实验，还可用来做其他分子生物学实验，缺点是手工操作过多，效率低，且无法自动化；(4)磁分离方法：磁分离是利用功能化磁性纳米颗粒的表面配体(或受体)与受体(或配体)之间特异性相互作用来实现对靶向生物目标的快速分离；目前，磁分离方法已广泛应用于核酸(DNA和RNA)、蛋白质、酶、细胞等多种生物物质的分离与纯化；磁分离方法提取核酸可称得上是提取核酸的终极方法，因为此方法具备上述所有方法的优点，并且能轻而易举实现自动化。不过，所用试剂基本上为国外所垄断，价格非常昂贵，从而限制了其在我国的广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单快速，抗污染，干扰能力强，提取的核酸无损失，快速准确，所用试剂制造成本低的一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法。
本发明的技术方案是：针对待测病原体核酸选取保守基因序列，设计特异性引物探针，采用一种核酸快速释放试剂提取病原体核酸，直接加入相应的PCR反应液，实现PCR荧光定量检测。
所述核酸快速释放试剂由0.01～0.5mM/L(与KCl水溶液的质量体积比)的表面活性肽溶解于50～200mM/L的KCl水溶液，0.01％～2％(与无菌水的质量体积比)的SDS(十二烷基磺酸钠)、LLS(Lithium lauryl sulfate，十二烷基硫酸锂)或Chelex-100(Chelex树脂)，以及0.05％～1％(体积)的乙醇组成。
所述核酸快速释放试剂配制方法：以无菌水、KCl配制50～200mM/L的KCl溶液，加入表面活性肽，使表面活性肽浓度达到0.01～0.5mM/L，加入0.01％～2％(与无菌水的质量体积比))的SDS、LLS或Chelex-100，加入0.05％～1％(体积)的乙醇，即配成本发明之核酸释放试剂。
所述百分比以无菌水体积为计算基准(下同)。
本发明结果判断：理想的标准品扩增曲线：基线平整，NTC无模板，不产生引物二聚体，一直是水平线；指数区较明显，斜率大且固定；平台区汇于一起，线性范围广。理想的标准曲线：斜率接近于-3.322，一致性系数接近1.000，理想的重复性，同一样本CT值变异系数＜10％，浓度变异系数＜50％。
本发明优点：整个样本处理和检验过程在一个PCR反应管中即可完成，无需离心、振荡、更换离心管等一系列繁琐操作，不但简化了操作步骤，节省了耗材成本，而且无需加热，开/关管盖，移液等可能导致核酸丢失与污染的操作，抗污染能力强，实验结果的重复性大大提高，对操作人员的技术要求较低；还节省了时间成本，可以让临床医生及患者及早得到诊断结果，避免等待试验结果的焦虑。
总之，本发明一步法实现PCR荧光定量检测，操作简单快速，抗污染抗干扰能力强，提取的核酸无损失，所用试剂制造成本低。
附图说明
图1(a)为本发明方法检测HBV DNA标准品的荧光定量PCR扩增曲线；
图1(b)为本发明方法检测HBV DNA标准品所作标准曲线；
图2(a)为对照方法(离心柱法)提取HCV RNA并进行荧光定量PCR检测扩增曲线；
图2(b)为本发明方法重复性检测HCV RNA阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；
图3为本发明方法检测沙眼衣原体(CT)阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1用于HBV DNA的荧光定量PCR检测
用带滤芯吸嘴吸取5微升核酸释放试剂[0.1mM/L的表面活性肽溶于80mM/L KCl无菌水溶液，加入0.1％(质量体积比)SDS、0.5％(体积)乙醇配制而成]，5微升待测样本(标准品、阴性、阳性对照，未知浓度的HBV DNA阳性的血清或血浆)，加入PCR反应管中，移液枪头吸打5-10次混匀，静置约5min后，用带滤芯吸嘴吸取40微升已配好的PCR反应液，于Stratagene Mx3000P或ABI7300/7500系列PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。
PCR反应各成分浓度及比例如下：
| 成分 | 单人份用量 |
| (上游)引物HBV-F1(50pmol/μl) | 0.2μl |
| (下游)引物HBV-F1(50pmol/μl) | 0.2μl |
| HBV探针HBV-P1(50pmol/μl) | 0.1μl |
| ROX溶液(10μmol/L) | 1μl |
| 成分 | 单人份用量 |
| dNTPs | 0.4μl |
| 10×PCR buffer | 5μl |
| 灭菌纯化水 | 32.1μl |
| h-Taq(5U/ul) | 1ul |
| 总量 | 40μl |
PCR反应程序为：
结果分析：如附图1(a)、(b)中检测了HBV DNA标准品A、B、C、D，浓度分别为4×107IU/ml、4×106IU/ml、4×105IU/ml、4×104IU/ml，以此标准品浓度做标准曲线，分析斜率为3.31，一致性系数为0.9995。
实施例2用于HCV RNA的荧光定量PCR检测
用带滤芯吸嘴吸取5微升核酸释放试剂[0.05mM/L的表面活性肽溶于100mM/L KCl无菌水溶液，加入0.01％(质量体积比)SDS、0.05％(体积)乙醇]，5微升待测样本(标准品、阴阳性对照，已知HCV RNA阳性的血清或血浆)，加入PCR反应管中，移液枪头吸打混匀，静置约5min后，用带滤芯吸嘴吸取40μl已配好的PCR反应液，于Stratagene Mx3000P或ABI7300/7500系列PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。
HCV PCR反应液由引物、探针、dNTPs、5×PCR buffer、灭菌纯化水、ROX溶液、酶等组34成。每人份HCV PCR反应液40μl，单人份用量配方如下：
| 物料名称 | 单人份用量 |
| 引物HCV-F1(50pmol/μl) | 0.2μl |
| 引物HCV-R1(50pmol/μl) | 0.2μl |
| 探针HCV-P1(50pmol/μl) | 0.1μl |
| 内标引物IC-F2(50pmol/μl) | 0.16μl |
| 物料名称 | 单人份用量 |
| 内标引物IC-R2(50pmol/μl) | 0.16μl |
| 内标探针IC-P1(50pmol/μl) | 0.06μl |
| ROX溶液(10μmol/L) | 1μl |
| dNTPs | 0.4μl |
| Tth酶(5U/μl) | 1μl |
| 5×PCR buffer | 10μl |
| 灭菌纯化水 | 25.72μl |
| Mn(oAc)2(150mM) | 1ul |
| 总量 | 40ul |
PCR反应程序为：
对照例：采用离心柱方法提取HCV RNA并进行荧光定量PCR扩增。如附图2(a)，提取了HCV RNA的4个标准品并扩增，浓度分别为5×107IU/ml、5×106IU/ml、5×105IU/ml、5×104IU/ml，从扩增曲线上看，离心柱法提取检测的扩增曲线指数区较不明显，没有明显的平台区。
结果分析：如附图2(b)，采用了本发明的方法6次重复性检测浓度为1×104IU/ml阳性样本，从扩增曲线看，基线平整，一直是水平线；指数区较明显，平台区汇于一起，同一个样本6次检测ct值的变异系数＜2％，浓度值变异系数＜50％。
实施例3用于性病系列病原体DNA的荧光定量PCR检测
用棉试子擦净尿道口，再用另一棉试子插入尿道内轻轻转动后取出，将试子置含0.5ml生理盐水的EP管搅拌、挤干后，弃拭子，用带滤芯吸嘴吸取上述含含分泌物的样本5μl，加入到核酸释放试剂中(可按实施例1中比例配好核酸释放试剂，与水以2∶3的比例将核酸释放试剂进行稀释后使用)，移液枪头吸打混匀，静置约5min后，用带滤芯吸嘴吸取40μl已配好的PCR反应液，于Stratagene Mx3000P或ABI7300PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。针对沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)、淋球菌(NGH)和单纯疱疹病毒2型(HSV2)设计相应的引物探针序列，PCR反应各成分浓度及比例如下：
| 成分 | 单人份用量 |
| (上游)引物F1(50pmol/μl) | 0.16μl |
| (下游)引物F2(50pmol/μl) | 0.16μl |
| 探针P1(50pmol/μl) | 0.1μl |
| ROX溶液(10μmol/L) | 1μl |
| dNTPs | 0.4μl |
| 10×PCR buffer | 5μl |
| 灭菌纯化水 | 32.18μl |
| h-Taq(5U/ul) | 1ul |
| 总量 | 40μl |
PCR反应程序为：
结果分析：如附图3，应用本发明的方法对沙眼衣原体DNA进行检测，原液浓度为5×108IU/ml，以生理盐水10倍梯度稀释至5×103IU/ml，同时以生理盐水做阴性对照，从扩增的曲线上看，基线平整，阴性对照(NTC)无模板，不产生引物二聚体，一直是水平线；指数区较明显，斜率大且固定；平台区汇于一起，线性范围广。
Claims (1)
1.一种一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法，包括针对待测病原体核酸选取保守基因序列，设计特异性引物探针步骤，其特征在于，采用一种核酸快速释放试剂提取病原体核酸，直接加入相应的PCR反应液，实现PCR荧光定量检测；
所述核酸快速释放试剂由0.01～0.5mM/L(与KCl水溶液的质量体积比)的表面活性肽溶解于50～200mM/L的KCl水溶液，0.01％～2％(与无菌水的质量体积比)的SDS、LLS或Chelex-100，以及0.05％～1％(体积)的乙醇组成。
所述百分比以无菌水体积为计算基准。
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