CN101713002A - 一步法病原体核酸荧光定量pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法,该方法是:针对待测病原体核酸选取保守基因序列,设计特异性引物探针,采用一种核酸快速释放试剂提取病原体核酸,直接加入相应的PCR反应液,实现PCR荧光定量检测。本发明操作简单快速,抗污染抗干扰能力强,提取的核酸无损失,快速准确,所用试剂制造成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸荧光定量PCR检测方法,尤其是涉及一种一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法。
背景技术
血清中病毒核酸的提取,目前主要有四种方法:(1)直接煮沸法:向血清中加入核酸裂解液,直接煮沸,高速离心,上清即为模板;其优点是易于操作;缺点是不能有效去除血清中抑制PCR的因素,弱阳性经常无扩增;(2)煮沸法:先将血清浓缩,再加裂解液,煮沸,高速离心,上清为模板,是目前国内临床通用的方法;这种方法能部分去除撝苯又蠓蟹″中无法去除的抑制性因素,缺点在于浓缩这一步,不同厂家的浓缩效果不一样,有的可以看到沉淀,有的无法看到,看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了,这样,导致后面加入裂解液时很难充分混匀;无法看到沉淀,使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸;(3)柱提取法:血清通过裂解,过柱后核酸吸附到膜上,通过两次洗涤,最后洗脱下来的为模板;这种方法相对前两种提取方法而言,提取的核酸纯度大大提高,不但可用于下游PCR实验,还可用来做其他分子生物学实验,缺点是手工操作过多,效率低,且无法自动化;(4)磁分离方法:磁分离是利用功能化磁性纳米颗粒的表面配体(或受体)与受体(或配体)之间特异性相互作用来实现对靶向生物目标的快速分离;目前,磁分离方法已广泛应用于核酸(DNA和RNA)、蛋白质、酶、细胞等多种生物物质的分离与纯化;磁分离方法提取核酸可称得上是提取核酸的终极方法,因为此方法具备上述所有方法的优点,并且能轻而易举实现自动化。不过,所用试剂基本上为国外所垄断,价格非常昂贵,从而限制了其在我国的广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单快速,抗污染,干扰能力强,提取的核酸无损失,快速准确,所用试剂制造成本低的一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法。
本发明的技术方案是:针对待测病原体核酸选取保守基因序列,设计特异性引物探针,采用一种核酸快速释放试剂提取病原体核酸,直接加入相应的PCR反应液,实现PCR荧光定量检测。
所述核酸快速释放试剂由0.01~0.5mM/L(与KCl水溶液的质量体积比)的表面活性肽溶解于50~200mM/L的KCl水溶液,0.01%~2%(与无菌水的质量体积比)的SDS(十二烷基磺酸钠)、LLS(Lithium lauryl sulfate,十二烷基硫酸锂)或Chelex-100(Chelex树脂),以及0.05%~1%(体积)的乙醇组成。
所述核酸快速释放试剂配制方法:以无菌水、KCl配制50~200mM/L的KCl溶液,加入表面活性肽,使表面活性肽浓度达到0.01~0.5mM/L,加入0.01%~2%(与无菌水的质量体积比))的SDS、LLS或Chelex-100,加入0.05%~1%(体积)的乙醇,即配成本发明之核酸释放试剂。
所述百分比以无菌水体积为计算基准(下同)。
本发明结果判断:理想的标准品扩增曲线:基线平整,NTC无模板,不产生引物二聚体,一直是水平线;指数区较明显,斜率大且固定;平台区汇于一起,线性范围广。理想的标准曲线:斜率接近于-3.322,一致性系数接近1.000,理想的重复性,同一样本CT值变异系数<10%,浓度变异系数<50%。
本发明优点:整个样本处理和检验过程在一个PCR反应管中即可完成,无需离心、振荡、更换离心管等一系列繁琐操作,不但简化了操作步骤,节省了耗材成本,而且无需加热,开/关管盖,移液等可能导致核酸丢失与污染的操作,抗污染能力强,实验结果的重复性大大提高,对操作人员的技术要求较低;还节省了时间成本,可以让临床医生及患者及早得到诊断结果,避免等待试验结果的焦虑。
总之,本发明一步法实现PCR荧光定量检测,操作简单快速,抗污染抗干扰能力强,提取的核酸无损失,所用试剂制造成本低。
附图说明
图1(a)为本发明方法检测HBV DNA标准品的荧光定量PCR扩增曲线;
图1(b)为本发明方法检测HBV DNA标准品所作标准曲线;
图2(a)为对照方法(离心柱法)提取HCV RNA并进行荧光定量PCR检测扩增曲线;
图2(b)为本发明方法重复性检测HCV RNA阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线;
图3为本发明方法检测沙眼衣原体(CT)阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1用于HBV DNA的荧光定量PCR检测
用带滤芯吸嘴吸取5微升核酸释放试剂[0.1mM/L的表面活性肽溶于80mM/L KCl无菌水溶液,加入0.1%(质量体积比)SDS、0.5%(体积)乙醇配制而成],5微升待测样本(标准品、阴性、阳性对照,未知浓度的HBV DNA阳性的血清或血浆),加入PCR反应管中,移液枪头吸打5-10次混匀,静置约5min后,用带滤芯吸嘴吸取40微升已配好的PCR反应液,于Stratagene Mx3000P或ABI7300/7500系列PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。
PCR反应各成分浓度及比例如下:
成分 | 单人份用量 |
(上游)引物HBV-F1(50pmol/μl) | 0.2μl |
(下游)引物HBV-F1(50pmol/μl) | 0.2μl |
HBV探针HBV-P1(50pmol/μl) | 0.1μl |
ROX溶液(10μmol/L) | 1μl |
成分 | 单人份用量 |
dNTPs | 0.4μl |
10×PCR buffer | 5μl |
灭菌纯化水 | 32.1μl |
h-Taq(5U/ul) | 1ul |
总量 | 40μl |
PCR反应程序为:
结果分析:如附图1(a)、(b)中检测了HBV DNA标准品A、B、C、D,浓度分别为4×107IU/ml、4×106IU/ml、4×105IU/ml、4×104IU/ml,以此标准品浓度做标准曲线,分析斜率为3.31,一致性系数为0.9995。
实施例2用于HCV RNA的荧光定量PCR检测
用带滤芯吸嘴吸取5微升核酸释放试剂[0.05mM/L的表面活性肽溶于100mM/L KCl无菌水溶液,加入0.01%(质量体积比)SDS、0.05%(体积)乙醇],5微升待测样本(标准品、阴阳性对照,已知HCV RNA阳性的血清或血浆),加入PCR反应管中,移液枪头吸打混匀,静置约5min后,用带滤芯吸嘴吸取40μl已配好的PCR反应液,于Stratagene Mx3000P或ABI7300/7500系列PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。
HCV PCR反应液由引物、探针、dNTPs、5×PCR buffer、灭菌纯化水、ROX溶液、酶等组34成。每人份HCV PCR反应液40μl,单人份用量配方如下:
物料名称 | 单人份用量 |
引物HCV-F1(50pmol/μl) | 0.2μl |
引物HCV-R1(50pmol/μl) | 0.2μl |
探针HCV-P1(50pmol/μl) | 0.1μl |
内标引物IC-F2(50pmol/μl) | 0.16μl |
物料名称 | 单人份用量 |
内标引物IC-R2(50pmol/μl) | 0.16μl |
内标探针IC-P1(50pmol/μl) | 0.06μl |
ROX溶液(10μmol/L) | 1μl |
dNTPs | 0.4μl |
Tth酶(5U/μl) | 1μl |
5×PCR buffer | 10μl |
灭菌纯化水 | 25.72μl |
Mn(oAc)2(150mM) | 1ul |
总量 | 40ul |
PCR反应程序为:
对照例:采用离心柱方法提取HCV RNA并进行荧光定量PCR扩增。如附图2(a),提取了HCV RNA的4个标准品并扩增,浓度分别为5×107IU/ml、5×106IU/ml、5×105IU/ml、5×104IU/ml,从扩增曲线上看,离心柱法提取检测的扩增曲线指数区较不明显,没有明显的平台区。
结果分析:如附图2(b),采用了本发明的方法6次重复性检测浓度为1×104IU/ml阳性样本,从扩增曲线看,基线平整,一直是水平线;指数区较明显,平台区汇于一起,同一个样本6次检测ct值的变异系数<2%,浓度值变异系数<50%。
实施例3用于性病系列病原体DNA的荧光定量PCR检测
用棉试子擦净尿道口,再用另一棉试子插入尿道内轻轻转动后取出,将试子置含0.5ml生理盐水的EP管搅拌、挤干后,弃拭子,用带滤芯吸嘴吸取上述含含分泌物的样本5μl,加入到核酸释放试剂中(可按实施例1中比例配好核酸释放试剂,与水以2∶3的比例将核酸释放试剂进行稀释后使用),移液枪头吸打混匀,静置约5min后,用带滤芯吸嘴吸取40μl已配好的PCR反应液,于Stratagene Mx3000P或ABI7300PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。针对沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)、淋球菌(NGH)和单纯疱疹病毒2型(HSV2)设计相应的引物探针序列,PCR反应各成分浓度及比例如下:
成分 | 单人份用量 |
(上游)引物F1(50pmol/μl) | 0.16μl |
(下游)引物F2(50pmol/μl) | 0.16μl |
探针P1(50pmol/μl) | 0.1μl |
ROX溶液(10μmol/L) | 1μl |
dNTPs | 0.4μl |
10×PCR buffer | 5μl |
灭菌纯化水 | 32.18μl |
h-Taq(5U/ul) | 1ul |
总量 | 40μl |
PCR反应程序为:
结果分析:如附图3,应用本发明的方法对沙眼衣原体DNA进行检测,原液浓度为5×108IU/ml,以生理盐水10倍梯度稀释至5×103IU/ml,同时以生理盐水做阴性对照,从扩增的曲线上看,基线平整,阴性对照(NTC)无模板,不产生引物二聚体,一直是水平线;指数区较明显,斜率大且固定;平台区汇于一起,线性范围广。
Claims (1)
1.一种一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法,包括针对待测病原体核酸选取保守基因序列,设计特异性引物探针步骤,其特征在于,采用一种核酸快速释放试剂提取病原体核酸,直接加入相应的PCR反应液,实现PCR荧光定量检测;
所述核酸快速释放试剂由0.01~0.5mM/L(与KCl水溶液的质量体积比)的表面活性肽溶解于50~200mM/L的KCl水溶液,0.01%~2%(与无菌水的质量体积比)的SDS、LLS或Chelex-100,以及0.05%~1%(体积)的乙醇组成。
所述百分比以无菌水体积为计算基准。
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Cited By (6)
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CN102174660A (zh) * | 2011-02-25 | 2011-09-07 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒 |
CN103060452A (zh) * | 2013-01-10 | 2013-04-24 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 沙眼衣原体ct检测试剂盒 |
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CN103184214A (zh) * | 2011-12-27 | 2013-07-03 | 上海复星医学科技发展有限公司 | 一种乙型肝炎病毒核酸快速提取试剂 |
CN112301150A (zh) * | 2019-07-26 | 2021-02-02 | 杭州丹威生物科技有限公司 | 一种直接荧光pcr检测呼吸道病毒的方法 |
CN114561380A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-05-31 | 予果生物科技(北京)有限公司 | 细菌核酸提取检测试剂、试剂盒及其方法和应用 |
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Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102174660A (zh) * | 2011-02-25 | 2011-09-07 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒 |
CN102174660B (zh) * | 2011-02-25 | 2013-04-24 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒 |
CN103184214A (zh) * | 2011-12-27 | 2013-07-03 | 上海复星医学科技发展有限公司 | 一种乙型肝炎病毒核酸快速提取试剂 |
CN103184214B (zh) * | 2011-12-27 | 2016-02-10 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | 一种乙型肝炎病毒核酸快速提取试剂 |
CN103060452A (zh) * | 2013-01-10 | 2013-04-24 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 沙眼衣原体ct检测试剂盒 |
CN103173565A (zh) * | 2013-01-10 | 2013-06-26 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 低危型人乳头瘤病毒hpv6/11检测试剂盒 |
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