CN102174660A - 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括用于检测靶多核苷酸的探针、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和DNA聚合酶，其中，用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No.1序列。本发明试剂盒因为采用用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No.1序列，具有很好的特异性，应用本发明提供的试剂盒，可以对血清、血浆或乳汁等未知样本中的HBV-DNA浓度进行快速、准确测定，特异性好，能够检测出HBV的八个基因型。

Description

乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及医学检测领域，特别涉及一种荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒核酸的试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)的免疫学检测是诊断HBV感染的传统方法。一般认为，在血清或血浆中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的存在，就表明已感染乙肝病毒，但HBsAg的出现并不能提供病毒在体内复制活动的信息。单一e抗原(HBeAg)作为判断乙肝病毒复制是否活跃、传染性强弱的免疫指标是不够确切的。随着基因诊断技术的不断发展和临床应用，血清中HBV-DNA的水平被认为既能证明乙肝病毒的存在，又能反映病毒的活性，其可信值要高于免疫法，对临床诊断治疗合理用药和判断预后具有重要意义。

DNA检测的目的主要是判断患者体内病毒复制的程度及传染性。在判断乙肝的转归，用药疗效等方面DNA检测有很重要的作用，另外，DNA检测也是重要的用药指征，尤其是抗病毒治疗。现在基因检测技术已经广泛的应用于临床。

DNA的检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。

血清中病毒核酸的提取，目前主要有四种方法：

(1)直接煮沸法：向血清中加入核酸裂解液，直接煮沸，高速离心，上清即为模板。其优点是易于操作；缺点是不能有效去除血清中抑制PCR的因素，弱阳性经常无扩增。

(2)浓缩煮沸法：先将血清浓缩，再加裂解液，煮沸，高速离心，上清为模板，这种方法是目前国内临床通用的方法，其优点是能部分去除“直接煮沸法”中无法去除的抑制性因素；缺点是不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到。看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀的，使操作者无法确定吸弃上清时会不会把病毒一起吸弃，而导致病毒损失，导致定量不准或成为假阴性。

(3)柱提取法：血清通过裂解，过柱后核酸吸附到膜上，通过两次洗涤，最后洗脱下来的为模板。这种方法相对前两种提取方法而言，提取的核酸纯度大大提高，不但可用于下游PCR实验，还可用来做其他分子生物学实验，但缺点是手工操作过多，效率低，且无法自动化。

(4)磁分离方法：磁分离是利用功能化磁性纳米颗粒的表面配体(或受体)与受体(或配体)之间特异性相互作用来实现对靶向生物目标的快速分离。目前，磁分离方法已广泛应用于核酸(DNA和RNA)、蛋白质、酶、细胞等多种生物物质的分离与纯化。此方法具备上述所有方法的优点，并且能轻而易举实现自动化。不过，所用试剂基本上为国外所垄断，价格非常昂贵，从而限制了其在我国的广泛应用。

临床上定量检测HBV-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，实验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果。如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值(即定量检测)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。实验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测HBV-DNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的HBV-DNA提取方法主要是煮沸法，但是，有很多不足之处：1)特异性不是很好，不能检测出所有HBV的八个基因型(A～H)；2)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。3)检测灵敏度低，约在500IU/ml左右；定量范围窄，一般在1.00E+03IU/ml～1.00E+08IU/ml之间，对于临床高值(大于1.00E+08IU/ml)和低值(小于1.00E+03IU/ml)的样本无法准确定量；4)没有设置阳性内对照(即内标)，无法监控假阴性；5)一般没有预防PCR产物污染的措施；6)没有荧光归一化校正系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，解决现有技术中乙型肝炎检测试剂盒特异性差，不能检测出所有HBV的八个基因型的技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现：一种乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括用于检测靶多核苷酸的探针、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和DNA聚合酶，用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No.1序列。

优选地，用于扩增靶多核苷酸的上游引物具有SEQ No.2序列，下游引物具有SEQ No.3序列。

该试剂盒进一步包括内标，内标是由具有SEQ No.4序列的DNA插入到pUC 18T载体而构成的重组体。

优选地，用于检测上述内标的探针具有SEQ No.5序列。

该试剂盒进一步包括核酸释放剂，该核酸释放剂含有莎梵婷0.01～0.5mmol/L，氯化钾50～200mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2g/100ml以及乙醇0.05～1ml/100ml。

该试剂盒进一步包括酶混合液和dUTP，酶混合液包括耐热DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。

优选地，酶混合液中耐热DNA聚合酶的浓度为1U/μl～5U/μl，尿嘧啶DNA糖基化酶的浓度为0.05U/μl～0.2U/μl。

该述试剂盒进一步包括ROX参比染料，ROX参比染料的浓度为40～200mmol/L。

本发明试剂盒因为采用用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No.1序列，具有很好的特异性，应用本发明提供的试剂盒，可以对血清、血浆或乳汁等未知样本中的HBV-DNA浓度进行快速、准确测定，特异性好，能够检测出HBV的八个基因型。进一步地，因为本发明试剂盒加入内标，可以有效监控假阴性的存在；加入ROX参比染料起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善；加入适量的UNG酶可以预防PCR产物污染。进一步地，本试剂盒对HBV-DNA的提取方法进行优化，选择核酸释放的方法，采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，应用本发明提供的试剂盒检测待测样本时，无需单独提取样本核酸，只需将待测样本、核酸释放剂以及其他PCR必需的组分加入反应管中混匀即可用于检测，无需现有技术中提取DNA的加热、离心、去上清等操作，只需一个移液器，一步即可完成DNA的释放，在很大程度上简化了实验的步骤，而且检测灵敏度有了很大的提高。

附图说明

图1A示出了本发明提供的乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒定量参考品A(5.00E+07IU/ml)、B(5.00E+06IU/ml)、C(5.00E+05IU/ml)和D(5.00E+04IU/ml)的扩增曲线图；

图1B出了本发明提供的乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒定量分析的标准曲线图；

图2A示出了特异性实验中八个样本(包括HBV八个基因型)扩增的结果图；

图2B示出了特异性实验中四例HBV阳性血清以及甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)等样本的扩增曲线图；

图3A示出了荧光归一化实验中对同样的12份样本，PCR体系中加入参比荧光(ROX)的扩增结果图；

图3B示出了荧光归一化实验中对同样的12份样本，PCR体系中不加入参比荧光(ROX)的扩增结果图；

图4A示出了PCR产物污染的预防实验中PCR体系中不加入UNG酶扩增结果图；

图4B示出了PCR产物污染的预防实验中PCR体系中加入UNG酶扩增结果图；

图5示出了临床样本的检测中15个临床阴性标本的扩增曲线图；

图6示出了临床样本的检测中15个临床阳性标本的扩增曲线图；

图7示出了临床样本的检测中浓度为5.0×10²IU/ml～5.0×10⁹IU/ml的8个梯度样本的扩增曲线图；

图8示出了临床样本的检测中浓度为5.0×10²IU/ml～5.0×10⁹IU/ml的8个梯度样本的标准曲线图；

图9A示出了临床样本的检测中500IU/ml样本各重复8次的扩增曲线图；

图9B示出了临床样本的检测中100IU/ml样本各重复8次的扩增曲线图；以及

图9C示出了临床样本的检测中50IU/ml样本各重复8次的扩增曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

在本发明的一种具体实施方式中，提供了一种乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组分：

(1)用于检测乙型肝炎病毒靶多核苷酸的探针HBV-P具有SEQ No.1序列，源于乙肝病毒表面抗原S基因的保守区域，SEQ No.1序列为(Invitrogen公司合成)：

SEQ No.1：5’-CCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGG-3’；

优选地，SEQ No.1羧基端用FAM标记，羟基端用BHQ1猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，还可以选用TET、JOE、HEX等荧光素标记，配合选用DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝灭基团。

(2)用于扩增乙型肝炎病毒靶多核苷酸的上游引物及下游引物，源于乙肝病毒表面抗原S基因的保守区域，扩增上游引物HBV-F具有SEQ No.2序列，扩增下游引物HBV-R具有SEQ No.3序列，(Invitrogen公司合成)：

SEQ No.2：5’-ATCGCTGGATGTGTCTGCTGCGTTTT-3’；

SEQ No.3：5’-CTGGAATTAGAGGACAAACGGGCAACAT-3’；

(3)10×PCR反应缓冲液：包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，30mmol/L氯化镁，500mmol/L氯化钾，0.2ml/100ml曲拉通和10ml/100ml甲酰胺(各组分购自Sigma公司)；

(4)脱氧核糖核苷三磷酸：为dATP、dCTP、dGTP和dTTP(均购自Promega公司)；

(5)DNA聚合酶(Taq酶)(购自Promega公司)。

根据本发明提供的试剂盒，因为采用了上述探针和上下游引物，所以具有很好的特异性，应用本发明提供的试剂盒，可以对血清、血浆或乳汁等未知样本中的HBV-DNA浓度进行快速、准确测定，特异性好，能够检测出HBV的八个基因型。

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括核酸释放剂：莎梵婷0.01～0.5mmol/L，氯化钾50～200mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2g/100ml，乙醇0.05～1ml/100ml(各组分购自Sigma公司)。选择核酸释放的方法，采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热，无需离心，只需一个移液器，即可完成DNA的释放和提取，而且检测灵敏度有了很大的提高。

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括内标(阳性内对照)：本发明采用的阳性对照品为一段长为97碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，浓度为1.00E+05copies/ml～1.00E+06copies/ml，97碱基对的序列SEQ No.4如下所示(Invitrogen公司合成)：

SEQ No.4：

5’-ATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATATCTTCCTCCATCCTGCTAGGTGCCTCATCTTCTTAGCTCTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAG-3’；

在本试剂盒中用于内标扩增的上游引物及下游引物与用于靶多核苷酸扩增的上游引物及下游引物相同，作为PCR扩增体系中的内标，可以预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性。

优选地，用于检测内标的探针HBVIC-P具有SEQ No.5序列：

SEQ No.5：5′-TTCCTCCATCCTGCTAGGTGCCTCATCTTCTTAGCT-3′；

优选地，SEQ No.5羧基端用HEX标记，羟基端用DABCYL猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，SEQ No.5还可以选用不同于SEQ No.1的荧光素标记，如TET、JOE、FAM等，配合选用BHQ1、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝灭基团。

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括参比染料，ROX参比染料(购自Roche公司)或其他适用于荧光定量PCR的参比染料。加入ROX参比染料起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括酶混合液和dUTP(购自Promega公司)，其中酶混合液包含浓度为1～5U/μl的耐热DNA聚合酶(Taq酶)和浓度为0.05～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用。

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括乙型肝炎病毒定量参考品：来源于经HBV DNA国家标准品(购自中国药品生物制品检定所)标定的HBV强阳性血清，以HBV阴性血清稀释而来，该乙型肝炎病毒定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为1.00～5.00E+07IU/ml(A)、1.00～5.00E+06IU/ml(B)、1.00～5.00E+05IU/ml(C)、1.00～5.00E+04IUs/ml(D)。

优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括乙型肝炎病毒阳性对照：来源于经HBV DNA国家标准品(购自中国药品生物制品检定所)标定的HBV强阳性血清，以HBV阴性血清稀释而来，其浓度为1.00～5.00E+05IU/ml；以及乙型肝炎病毒阴性对照：不含有乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒以及梅毒的灭活阴性血清。

将本发明乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR检测试剂盒用于检测血清、血浆等未知样本中的HBV-DNA浓度的操作步骤是：

1.试剂准备：

1)PCR反应液：包含10×PCR反应缓冲液，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，40mmol/L～200mmol/L ROX参比染料，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上游引物HBV-F以及下游引物HBV-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于检测靶多核苷酸的探针HBV-P，0.1μmol/L～0.2μmol/L用于检测内标的探针HBVIC-P；

2)根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D的量，按比例(反应液38～44μl/人份+酶混合液1～2μl/人份+内标0.2μl/人份)取相应量的PCR反应液、酶混合液及内标，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。

2.核酸释放

1)每个PCR反应管中加入该试剂盒中的核酸释放剂2～5μl，在实际操作中建议深吸浅打，避免出现气泡，并在不同的PCR反应管中加入待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D各3～5μl，吸打3-5次混匀(轻轻吸打，避免出现气泡)；

2)放置10分钟以上，每个PCR反应管加入PCR-mix 40～45μl，吸打混匀2-3次，盖上管盖(去除气泡后)，2000rpm离心30秒。

3.荧光PCR反应

1)将PCR反应管放入荧光定量PCR扩增仪，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度；

2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reportere：FAM，Quencher：None)检测HBV；选择HEX或VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：None)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为ROX；

3)荧光定量PCR反应条件为：

4.结果分析

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，通过4个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定值结果。如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且定值结果≥100IU/ml，可以判为阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示(Undet)或无定值结果显示，可以判为阴性。

特异性实验

采用本发明提供的乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒对HBV八个基因型(A～H)标准品、四例HBV阳性血清以及甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)已知样本进行检测，考查本试剂盒的特异性。各试剂配方以及操作过程如下：

本发明的乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒包括以下组分：

(1)核酸释放剂：莎梵婷(surfactin)0.01mmol/L，氯化钾50mmol/L，十二烷基磺酸钠(SDS)0.01g/100ml，乙醇0.05ml/100ml；

(2)采用上述内标(阳性内对照)；

(3)10×PCR反应缓冲液：包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，30mmol/L氯化镁溶液，500mmol/L氯化钾溶液，0.2ml/100ml曲拉通溶液和10ml/100ml甲酰胺溶液；

(4)ROX参比染料；

(5)脱氧核糖核苷三磷酸：为dATP、dCTP、dUTP、dGTP；

(6)本发明提供的用于靶多核苷酸扩增的上游引物及下游引物；

(7)本发明提供的用于检测靶多核苷酸的探针HBV-P，羧基端用FAM标记，羟基端用BHQ1猝灭基团修饰；

用于检测内标的探针HBVIC-P，羧基端用HEX标记，羟基端用DABCYL猝灭基团修饰；

(8)本发明提供的酶混合液：包含浓度为1U/μl的耐热DNA聚合酶(Taq酶)和浓度为0.05U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)；

(9)本发明提供的乙型肝炎病毒定量参考品，浓度分别为1.00E+07IU/ml(A)、1.00E+06IU/ml(B)、1.00E+05IU/ml(C)、1.00E+04IU/ml(D)；

(10)本发明提供的乙型肝炎病毒阳性对照，其浓度为1.00E+05IU/ml；

(11)本发明提供的乙型肝炎病毒阴性对照。

操作步骤：

1.试剂准备

1)PCR反应液：包含10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，200mmol/LROX参比染料，0.2μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上游引物HBV-F与下游引物HBV-R，0.2μmol/L用于检测靶多核苷酸的探针HBV-P，0.1μmol/L用于检测内标的探针HBVIC-P；

2)根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D的量，按比例(反应液38μl/人份+酶混合液2μl/人份+内标0.2μl/人份)取相应量的PCR反应液、酶混合液及内标，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用；

2.核酸释放

1)每个PCR反应管中加入核酸释放剂5μl，深吸浅打，避免出现气泡，并在不同的PCR反应管中加入待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D各5μl，吸打3-5次混匀(轻轻吸打，避免出现气泡)；

2)放置10分钟以上，每个PCR反应管加入PCR-mix 40μl，吸打混匀2-3次，盖上管盖(去除气泡后)，2000rpm离心30秒。

3.荧光PCR反应

1)将PCR反应管放入荧光定量PCR扩增仪，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度；

2)荧光检测通道选择(ABI 7500仪器为例)：选择FAM通道(Reportere：FAM，Quencher：None)检测HBV；选择HEX或VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：None)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为ROX；

3)荧光定量PCR反应条件为：

4.结果分析

荧光PCR扩增结束后，使用ABI 7500仪器自带的SDS 1.4软件进行自动分析，可得各样本的荧光扩增曲线。本特异性实验中，阳性对照和阴性对照的结果验证了实验的有效性，HBV八个基因型(A～H)标准品、四例HBV阳性血清以及甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)等样本的扩增曲线如附图2A、2B所示，Ct值统计如下表1所示。

表1HBV特异性样本的检测结果

样本名称	检测结果Ct值
		HBV-A基因型标准品	33.42
HBV-B基因型标准品	33.69
		HBV-C基因型标准品	33.73
HBV-D基因型标准品	33.49
		HBV-E基因型标准品	33.42
HBV-F基因型标准品	33.98
		HBV-G基因型标准品	33.53
HBV-H基因型标准品	33.69
		HBV阳性血清-1	22.95
HBV阳性血清-2	25.30
		HBV阳性血清-3	29.05
HBV阳性血清-4	34.75
		HAV血清	Undet(阴性)
HCV血清	Undet(阴性)
		EBV血清	Undet(阴性)
CMV血清	Undet(阴性)

从附图2A、2B和上表1可以看出，HBV八个基因型(A～H)、四例HBV阳性血清样本均有明显S型扩增曲线，均有Ct值，均可明显判为阳性样本；而HAV、HCV、EBV、CMV四个样本的扩增曲线都平直，与阈值线无交点，没有Ct值(Undet)，均可明显判为阴性样本。说明本试剂盒的特异性好，可以检出HBV所有八个基因型样本，而非HBV样本均检测为阴性。

DNA不同提取方法对HBV检测的影响实验

选择常见的煮沸法和过柱法与本发明试剂盒中的核酸释放剂提取方法进行比较。试剂配方与检测步骤如下：

本发明的乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒包括以下组分：

(1)核酸释放剂：莎梵婷(surfactin)0.5mmol/L，氯化钾200mmol/L，十二烷基磺酸钠(SDS)0.01g/100ml，乙醇0.05ml/100ml；

(2)本发明提供的内标，浓度为1.00E+06copies/ml；

(3)本发明提供的10×PCR反应缓冲液；

(4)ROX参比染料；

(5)脱氧核糖核苷三磷酸：为dATP、dCTP、dGTP和dTTP；

(6)本发明提供的用于靶多核苷酸和内标扩增的上游引物HBV-F以及下游引物HBV-R，同特异性实验；

(7)本发明提供的用于检测靶多核苷酸的探针HBV-P和用于检测内标的探针HBVIC-P，同特异性实验；

(8)耐热DNA聚合酶(Taq酶)，浓度为5U/μl；

(9)本发明提供的乙型肝炎病毒定量参考品：其浓度分别为5.00E+07IU/ml(A)、5.00E+06IU/ml(B)、5.00E+05IU/ml(C)、5.00E+04IU/ml(D)；

(10)本发明提供的乙型肝炎病毒阳性对照：其浓度为5.00E+05IU/ml；

(11)本发明提供的乙型肝炎病毒阴性对照。

操作步骤

1.试剂准备：

1)血清样本制备：将HBV DNA国家标准品(购自中国药品生物制品检定所)标定的强阳性血清稀释至浓度为4.0E+08IU/ml作为初始样本，然后10倍梯度稀释至4.0E+03IU/mL，随后稀释至500IU/mL、200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL。

2)PCR反应液：包含10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，40mmol/LROX参比染料，0.4μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上游引物HBV-F与下游引物HBV-R，0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针HBV-P，0.2μmol/L用于检测内标的探针HBVIC-P。

2.样本中DNA的提取

方法一：本试剂盒的方法

1)根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D的量，按比例(反应液44μl/人份+酶混合液1μl/人份+内标0.2μl/人份)取相应量的PCR反应液、酶混合液及内标，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用；

2)每个PCR反应管中加入核酸释放剂2μl(深吸浅打，避免出现气泡)，并在不同的PCR反应管中加入待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D各3μl，吸打3-5次混匀(轻轻吸打，避免出现气泡)；

3)放置10分钟以上，每个PCR反应管加入PCR-mix 45μl，吸打混匀2-3次，盖上管盖(去除气泡后)，2000rpm离心30秒。

方法二：煮沸法

1)用移液枪吸取100μl样品处理液A(PEG-8000 20g/100ml、氯化钠2.5mol/L)于0.5ml离心管中，加入100μl血清样本；

2)盖上管盖，振荡混匀，13000rpm离心10分钟，吸弃上清；

3)加入25μl样品处理液B(十二烷基硫酸钠10.0g/100ml、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mmol/L(PH8.0)、曲拉通4.0ml/100ml、吐温-201.5ml/100ml)，振荡混匀；

4)2000rpm离心数秒后，100℃干浴或沸水浴10分钟；

5)13000rpm离心10分钟，取上清2μl加入装有50μl PCR-mix的PCR反应管中。

方法三：柱提取

1)用移液枪吸取20μl去抑制剂于0.5ml离心管中；

2)加入100μl血清样本，反复吸打3次混匀；

3)加入100μl样品处理液A(十二烷基硫酸钠10.0g/100ml、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mmol/L(PH8.0)、曲拉通4.0ml/100ml、吐温-201.5ml/100ml、乙二胺四乙酸0.5mmol/L(PH8.0))，盖上管盖，振荡混匀，2000rpm离心数秒后置70℃反应10分钟。

4)2000rpm离心数秒后，打开管盖，加入110μl无水乙醇，盖上管盖，振荡混匀。

5)将做好标记的核酸提取柱放入2ml离心管中，将上述所有液体移入核酸提取柱；

6)10000rpm离心1分钟，将提取柱放入一新的2ml离心管中，加入500μl样品处理液B(曲拉通2.0ml/100ml，氯化钾200mmol/L)，10000rpm离心1分钟；

7)将提取柱放入一新的2ml离心管中，加入500μl样品处理液C(70ml/100ml乙醇)，10000rpm离心1分钟；

8)将提取柱放入一新的2ml离心管中，14000rpm离心1分钟；

9)将提取柱放入一新的2ml离心管中，小心将30μl灭菌纯化水加在柱中央，静置1分钟；

10)10000rpm离心1分钟，取收集液2μl加入装有50μl PCR-mix的PCR反应管中。

3.荧光PCR反应

1)将PCR反应管放入荧光定量PCR扩增仪，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度；

2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reportere：FAM，Quencher：None)检测HBV；选择HEX或VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：None)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为ROX；

3)荧光定量PCR反应条件为：

4.结果分析

三种方法提取DNA后进行PCR扩增反应，根据ABI 7500SDS 1.4软件自动分析，阳性对照和阴性对照的结果验证了实验的有效性，所得HBV检测结果如表2所示：

表2三种方法提取的DNA检测梯度稀释样本结果

由上表比较可知，本发明的核酸释放剂提取的DNA梯度稀释样本的检测值与理论值的双对数曲线线性相关系数为0.9931，而煮沸裂解法与柱提取法提取的DNA的检测值与理论值的双对数曲线线性相关系数分别为0.9604和0.9263，说明本发明的核酸释放剂定量检测结果的准确性更高。在灵敏度上，本发明的核酸释放剂提取的DNA有明显的优势，对于浓度为1.00E+02IU/mL、5.0E+01IU/mL的样本均检测为阳性，而煮沸裂解法和柱提取法提取的DNA的检测结果均为阴性，本发明的核酸释放剂提取的DNA和柱提取法提取的DNA对于浓度为2.00E+02IU/mL的样本均检测为阳性，而煮沸裂解法的检测结果均为阴性。另外，本发明核酸释放的方法，采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸。应用本发明提供的试剂盒检测待测样本时，无需单独提取样本核酸，只需将待测样本、核酸释放剂以及其他PCR必需的组分加入反应管中混匀即可用于检测，无需现有技术中提取DNA的加热、离心、去上清等操作，只需一个移液器，一步即可完成DNA的释放，在很大程度上简化了实验的步骤，而且检测灵敏度有了很大的提高。

荧光归一化实验

由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发效率的差异等偶然因素不可避免，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，以消除这些因素对实验结果的影响。这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料(称为参比荧光)来实现，如加入ROX参比荧光，ROX在PCR反应液中的浓度是恒定的，因此其信号的强度与反应体系的体积和荧光激发效率呈正相关，当反应体积变化或激发光效率发生变化时，ROX信号与目标基因的信号(如FAM)受到同等程度的影响(假设影响因子为s)，但是目标基因的信号与参比荧光信号的比值(即Rn＝(s.RFAM)/(s.RROX)＝RFAM/RROX)不受偶然因素的影响。因此，反应体系中加入参比荧光便于仪器自动分析，使检测结果的稳定性和重复性大大提高，便于准确定值。

本发明的乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒包括以下组分：

(1)核酸释放剂：莎梵婷(surfactin)0.1mmol/L，氯化钾80mmol/L，十二烷基磺酸钠(SDS)0.1g/100ml、乙醇0.5ml/100ml；

(2)本发明提供的内标，浓度为6.00E+05copies/ml；

(3)本发明提供的10×PCR反应缓冲液；

(4)ROX参比染料；

(5)脱氧核糖核苷三磷酸：为dATP、dUTP、dCTP和dGTP；

(6)本发明提供的用于靶多核苷酸和内标扩增的上游引物HBV-F以及下游引物HBV-R，同特异性实验；

(7)本发明提供的用于检测靶多核苷酸的探针HBV-P和用于检测内标的探针HBVIC-P，同特异性实验；

(8)酶混合液：包含浓度为3U/μl的耐热DNA聚合酶(Taq酶)和浓度为0.1U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)；

(9)本发明提供的乙型肝炎病毒定量参考品：其浓度分别为4.00E+07IUs/ml(A)、4.00E+06IUs/ml(B)、4.00E+05IUs/ml(C)、4.00E+04IUs/ml(D)；

(10)本发明提供的乙型肝炎病毒阳性对照：其浓度为4.00E+05IU/ml；

(11)本发明提供的乙型肝炎病毒阴性对照。

操作步骤

1.试剂准备：

1)PCR反应液-1：包含10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，100mmol/L ROX参比染料，0.3μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上游引物HBV-F与下游引物HBV-R，0.3μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针HBV-P，0.15μmol/L用于检测内标的探针HBVIC-P；

2)PCR反应液-2：包含10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.3μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上游引物HBV-F与下游引物HBV-R，0.3μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针HBV-P，0.15μmol/L用于检测内标的探针HBVIC-P；

需要说明的是：本实验中使用了两种PCR反应液，PCR反应液-2的配方与PCR反应液-1的不同之处仅在于PCR反应液-2中没有ROX溶液，不足的体积用灭菌水补充；

3)待测血清准备：本实验使用24份同一浓度的血清样本，分成两组，一组样本(12份)使用含有ROX溶液的PCR反应体系-1检测，另一组样本(12份)使用不含有ROX溶液的PCR反应体系-2检测。

4)根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D的量，按比例(反应液42μl/人份+酶混合液1μl/人份+内标0.2μl/人份)取相应量的PCR反应液-1或PCR反应液-2及内标，充分混匀成PCR-mix-1或PCR-mix-2，瞬时离心后备用。

2.DNA提取操作(乙型肝炎病毒定量参考品、乙型肝炎病毒阴性对照以及阳性对照参照待测样本做同步处理)

1)每个PCR反应管中加入核酸释放剂3μl(深吸浅打，避免出现气泡)，并依次加入待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D各4μl，吸打3-5次混匀(轻轻吸打，避免出现气泡)；

2)间隔10分钟以上，每管加入PCR-mix-1或PCR-mix-24 3μl，吸打混匀2-3次，盖上管盖(去除气泡后)，2000rpm离心30秒；

3.荧光PCR扩增反应

1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品的浓度；

2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reportere：FAM，Quencher：None)检测HBV；选择HEX或VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：None)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为ROX。

3)荧光定量PCR反应条件为：

4)实验结果分析

荧光PCR扩增结束后，输入乙型肝炎病毒定量参考品A～D的浓度，使用ABI 7500仪器自带的SDS 1.4软件进行自动分析，可得各样本的荧光扩增曲线以及各样本的定值结果(浓度值)，阳性对照和阴性对照的结果验证了实验的有效性。乙型肝炎病毒定量参考品A～D的扩增曲线和标准曲线如附图1A和1B所示；本实验中，对同一浓度的两组样本采用两种PCR反应体系分别检测，PCR反应体系-1(含ROX)、PCR反应体系-2(不含ROX)的荧光扩增曲线图分别如附图3A和附图3B所示，Ct值、浓度值及其均值以及变异系数统计如下表3所示：

表3两种PCR反应体系检测结果的Ct值、浓度值统计结果

从附图3A、图3B和表4可以看出，PCR反应体系1(含ROX)的扩增曲线一致性较好，Ct值一致性好，变异系数小(0.56％)，远小于PCR体系2(不含ROX)结果Ct值的变异系数(1.56％)，说明PCR体系中加入ROX参比荧光可以起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。

PCR产物污染的预防实验

DNA模板经PCR扩增后的产物浓度很高，在对PCR产物进行后续处理时，很容易产生气溶胶(含有阳性产物，浓度一般在1.0×10³copies/ml以下)，从而导致环境污染，引起以后实验的假阳性，因此在PCR反应体系中设置预防PCR产物污染的措施很重要。利用UNG酶可以降解含有dU的DNA链的特点，可以在PCR反应体系中设置UNG酶+dUTP组合的预防PCR产物污染的措施。其原理是，当PCR反应液中含有dUTP时，则DNA模板经PCR扩增后的PCR产物中含有dU，在下次PCR扩增时，首先运行UNG酶反应，则可降解PCR体系中可能存在的上次含有dU的PCR产物，从而起到预防污染的作用。具体实施方式如下所示：

本发明的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒包括以下组分：

(1)核酸释放剂：莎梵婷(surfactin)0.1mmol/L，氯化钾80mmol/L，十二烷基磺酸钠(SDS)0.1g/100ml、乙醇0.5ml/100ml；

(2)本发明提供的内标，浓度为6.00E+05copies/ml；

(3)本发明提供的内标，10×PCR反应缓冲液；

(4)ROX参比染料；

(5)脱氧核糖核苷三磷酸：为dATP、dUTP、dCTP和dGTP；

(6)本发明提供的用于靶多核苷酸和内标扩增的上游引物HBV-F以及下游引物HBV-R，同特异性实验；

(7)本发明提供的用于检测靶多核苷酸的探针HBV-P和用于检测内标的探针HBVIC-P，同特异性实验；

(8)酶混合液：包含浓度为3U/μl的耐热DNA聚合酶(Taq酶)和浓度为0.1U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)；

(9)本发明提供的乙型肝炎病毒定量参考品：其浓度分别为4.00E+07IU/ml(A)、4.00E+06IU/ml(B)、4.00E+05IU/ml(C)、4.00E+04IU/ml(D)；

(10)本发明提供的乙型肝炎病毒阳性对照；

(11)本发明提供的乙型肝炎病毒阴性对照。

操作步骤

1.试剂准备：

1)PCR反应液：包含10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，100mmol/LROX参比染料，0.3μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上游引物HBV-F与下游引物HBV-R，0.3μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针HBV-P，0.15μmol/L用于检测内标的探针HBVIC-P；

2)酶对比混合液，耐热DNA聚合酶(Taq酶)3U/μl，不含尿嘧啶DNA糖基化酶，不足体积用灭菌水补足；与酶混合液作为对比实施例，测定尿嘧啶DNA糖基化酶对实验效果的影响。

3)待测样本准备

①含dU的PCR产物(DNA链)的制备

取特异性试验中的阳性PCR产物(含有dU的DNA链)经紫外分光光度计测定OD₂₆₀值，按照如下公式计算阳性PCR产物中HBV目标片段(97bp)的浓度(copies/ml)：

$\frac{{\mathrm{OD}}_{260}\×50\×{10}^{-6}\×6.02\×{10}^{23}}{2\×97\mathrm{bp}\×324.5}$ (公式)

算出含有dU的PCR产物的原始浓度(8.32×10¹⁴copies/ml)后，稀释至1.0×10³copies/ml作为待测的含dU的PCR产物。

②已知浓度的阳性对照的制备

选择已知浓度的来自中国生物制品检定所的HBV标准品L5(4.33×10³IU/ml)，按照1IU/ml＝5.2copies/ml的换算关系，稀释至1.0×10³copies/ml作为阳性对照。

使用两种PCR体系，即采用酶对比混合液(不含UNG酶)的PCR反应体系和酶混合液(含UNG酶)的PCR反应体系，分别检测含dU的PCR产物和已知浓度的阳性对照的操作步骤如下：

根据含dU的PCR产物和已知浓度的阳性对照、阴性对照以及定量参考品A～D的量，按比例(反应液42μl/人份+酶混合液1μl/人份+内标0.2μl/人份或反应液42μl/人份+酶对比混合液1μl/人份+内标0.2μl/人份)取相应量的PCR反应液、酶混合液或酶对比混合液及内标，充分混匀。

2.DNA提取操作(乙型肝炎病毒定量参考品、乙型肝炎病毒阴性对照以及阳性对照参照待测样本做同步处理)

1)每个PCR反应管中加入核酸释放剂3μl(建议深吸浅打，避免出现气泡)，并依次加入含dU的PCR产物和已知浓度的阳性对照、阴性对照以及定量参考品A～D各4μl，吸打3-5次混匀(轻轻吸打，避免出现气泡)；

2)间隔10分钟以上，每管加入PCR-mix 43μl，吸打混匀2-3次，盖上管盖(去除气泡后)，2000rpm离心30秒；

3.荧光PCR扩增反应

1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品的浓度；

2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reportere：FAM，Quencher：None)检测HBV；选择HEX或VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：None)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为ROX。

3)荧光定量PCR反应条件为：

4.结果分析

实验结束后，根据7500 SDS 1.4软件自动分析，阳性对照和阴性对照的结果验证了实验的有效性，不含UNG酶的PCR反应体系和含UNG酶的PCR反应体系的扩增曲线图分别如附图4A和附图4B所示。图4A中，不管是阳性对照还是含dU的PCR产物，都有明显的S型扩增曲线，都检测为阳性；图4B中有明显S型扩增曲线、检测为阳性的为阳性对照(1.0×10³copies/ml)，而扩增曲线平直、检测为阴性的为待测的含dU的PCR产物，说明UNG酶发挥了作用，降解了含dU的PCR产物。由此证明，PCR反应体系中加入适量的UNG酶可以预防PCR产物污染。

临床样本检测

本发明的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒包括以下组分：

(1)核酸释放剂：莎梵婷(surfactin)0.1mmol/L，氯化钾80mmol/L，十二烷基磺酸钠(SDS)0.1g/100ml、乙醇0.5ml/100ml；

(2)本发明提供的内标，浓度为6.00E+05copies/ml；

(3)本发明提供的10×PCR反应缓冲液；

(4)ROX参比染料；

(5)脱氧核糖核苷三磷酸：为dATP、dUTP、dCTP和dGTP；

(6)本发明提供的用于靶多核苷酸和内标扩增的上游引物HBV-F以及下游引物HBV-R，同特异性实验；

(7)本发明提供的用于检测靶多核苷酸的探针HBV-P和用于检测内标的探针HBVIC-P，同特异性实验；

(8)酶混合液：包含浓度为4.5U/μl的耐热DNA聚合酶(Taq酶)和浓度为0.1U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)；

(9)本发明提供的乙型肝炎病毒定量参考品：其浓度分别为3.00E+07IU/ml(A)、3.00E+06IU/ml(B)、3.00E+05IU/ml(C)、3.00E+04IU/ml(D)；

(10)本发明提供的乙型肝炎病毒阳性对照：其浓度为3.00E+05IU/ml；

(11)本发明提供的乙型肝炎病毒阴性对照。

操作步骤

1.试剂准备：

1)PCR反应液：包含10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，100mmol/LROX参比染料，0.3μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上游引物HBV-F与下游引物HBV-R，0.3μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针HBV-P，0.15μmol/L用于检测内标的探针HBVIC-P；

2)样本准备

①30例临床血清样本(其中阳性样本15例，阴性样本15例)；

②对高浓度的临床样本进行10倍梯度稀释至500IU/ml，考察定量结果的准确性以及线性定量范围；

③对线性定量范围的下限(500IU/ml)作进一步稀释以确定本发明的试剂盒的检测灵敏度。

3)根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D的量，按比例(反应液38μl/人份+酶混合液2μl/人份+内标0.2μl/人份)取相应量的反应液、酶混合液及内标，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。

2.DNA提取操作(乙型肝炎病毒定量参考品、乙型肝炎病毒阴性对照以及阳性对照参照待测样本做同步处理)

1)每个PCR反应管中加入核酸释放剂5μl(深吸浅打，避免出现气泡)，并依次加入待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D各5μl，吸打3-5次混匀(轻轻吸打，避免出现气泡)；

2)间隔10分钟以上，每管加入PCR-mix 40μl，吸打混匀2-3次，盖上管盖(去除气泡后)，2000rpm离心30秒；

3.荧光PCR扩增反应

1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品的浓度；

2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reportere：FAM，Quencher：None)检测HBV；选择HEX或VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：None)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为ROX。

3)荧光定量PCR反应条件为：

4.结果分析

PCR反应结束后，根据荧光PCR仪软件自动分析，阳性对照和阴性对照的结果验证了实验的有效性，15例阴性临床样本的扩增曲线见附图5，曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性；15个临床阳性标本扩增曲线见附图6，扩增曲线呈典型S型，均有Ct值，可明确判定为阳性，15个阳性样本的Ct值分别是19.28、39.13、18.80、37.96、38.92、28.23、22.45、30.74、33.93、19.81、38.04、35.42、34.05、15.43、25.48；软件自动分析所得15个临床阳性标本的乙型肝炎病毒浓度分别为：3.63×10⁸IU/ml、3.59×10²IU/ml、巧.7×10⁸IU/ml、8.13×10²IU/ml、4.17×10²IU/ml、7.12×10⁵IU/ml、3.99×10⁷IU/ml、1.24×10⁵IU/ml、1.34×10⁴IU/ml、2.51×10⁸IU/ml、7.67×10²IU/ml、4.74×10³IU/ml、1.24×10⁴IU/ml、5.28×10⁹IU/ml、4.83×10⁶IU/ml。

对高值(5.28×10⁹IU/ml)的临床样本进行10倍梯度依次稀释至5.0×10⁸IU/ml、5.0×10⁷IU/ml、5.0×10⁶IU/ml、5.0×10⁵IU/ml、5.0×10⁴IU/ml、5.0×10³IU/ml、5.0×10²IU/ml，扩增曲线见附图7，均有Ct值，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。同时以5.0×10²IU/ml～5.0×10⁹IU/ml作为定值的标准品，输入浓度后进行标准曲线分析(如图8)，线性相关系数R²＝0.9998，说明具有良好的线性关系，证明高值(5.0×10⁹IU/ml)的临床样本定量准确，同时也说明线性定量范围为5.0×10²IU/ml～5.0×10⁹IU/ml。

对线性定量范围下限(500IU/ml)进一步稀释至100IU/ml和50IU/ml，对500IU/ml、100IU/ml和50IU/ml的3种浓度的样本各重复8次检测，扩增曲线分别见附图9-A(500IU/ml)、图9-B(100IU/ml)和图9-C(50IU/ml)，由图可以看出，500IU/ml和100IU/ml的样本均有明显的S型扩增曲线，Ct值分别在36～39左右，均可以判定为阳性；而50IU/ml的8个样本中，有2个样本的扩增曲线平直，无Ct值，可以判为阴性，其余6个样本为阳性曲线，阳性率为75％，因此可以判定本发明的试剂盒的检测灵敏度可达100IU/ml。

综合上述实验结果可以看出：

特异性实验表明：试剂盒能够检测HBV八个基因型(A～H)，而对HAV、HCV、EBV、CMV等样本均保持良好的阴性结果。

DNA不同提取方法对HBV检测的影响实验表明：本发明的核酸释放剂提取的DNA比煮沸裂解法与柱提取法提取的DNA定量检测结果的准确性比更高。在灵敏度上，本发明的核酸释放剂提取的DNA也有明显的优势。

荧光归一化实验表明：本发明的快速检测试剂PCR反应体系中加入了ROX归一化校正系统，扩增曲线一致性较好，Ct值一致性好，变异系数小(0.56％)，远小于无归一化校正系统的Ct值的变异系数(1.56％)，说明PCR体系中加入ROX参比荧光可以起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。

PCR产物污染的预防实验表明：PCR反应体系中加入适量的UNG酶可以预防PCR产物污染。

临床样本的检测实验表明：本发明的快速检测试剂盒的定量线性范围为500IU/mL～5.0E+09IU/mL，检测下限即灵敏度为100IU/mL。

本发明在对HBV所有已知基因型(A、B、C、D、E、F、G、H)的序列进行比对的基础上，在HBV的最保守区域，针对表面抗原前S区共设计了两对引物和探针，经定量PCR优化，筛选出了扩增效果最好的一对引物和探针，可检测出HBV所有已知八个基因型，但不能检测出非HBV病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。同时，对HBV-DNA的提取方法进行了优化，选择了核酸释放的方法，采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，应用本发明提供的试剂盒检测待测样本时，无需单独提取样本核酸，只需将待测样本、核酸释放剂以及其他PCR必需的组分加入反应管中混匀即可用于检测，无需现有技术中提取DNA的加热、离心、去上清等操作，只需一个移液器，一步即可完成DNA的释放，在很大程度上简化了实验的步骤，而且检测灵敏度可达100IU/ml，定量线性范围为500IU/ml～5.0×10⁹IU/ml。另外，对PCR反应体系进行了优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性；在PCR反应体系中增加了ROX参比染料，通过ROX荧光归一化校正，减少人员操作误差以及设备或耗材引起的实验误差，提高实验结果的稳定性和定量分析的准确性。荧光定量PCR扩增结束后，通过试剂盒中配备的已知浓度的定量参考品(经HBV国家标准品标定浓度)经仪器自带软件自动分析制作的标准曲线可以定量血清、血浆等未知样本中的HBV-DNA浓度，可为灵敏、早期诊断乙型肝炎病毒感染提供可靠的实验证据，同时由于能准确定量，所以可对临床用药进行有效监测。

以上结合较佳实施例对本发明的实施方式作了描述，但这些实施方式仅是出于示例的目的而不是限制本发明。应该理解的是，本领域技术人员可以在不背离本发明的范围和精神的前提下，对于具体实施方式进行变化和修改。同样地，除了以上提到的实施方式，在所附的权利要求中还可以发现许多具体实施方式。

Claims (8)

1.一种乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括用于检测靶多核苷酸的探针、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和DNA聚合酶，其特征在于，所述用于检测靶多核苷酸的探针具有SEQ No.1序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物具有SEQ No.2序列，所述下游引物具有SEQ No.3序列。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括内标，所述内标是由具有SEQ No.4序列的DNA插入到pUC18T载体而构成的重组体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括用于检测内标的探针，所述用于检测内标的探针具有SEQ No.5序列。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括核酸释放剂，所述核酸释放剂含有莎梵婷0.01～0.5mmol/L，氯化钾50～200mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2g/100ml，乙醇0.05～1ml/100ml。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括酶混合液和dUTP，所述酶混合液包括耐热DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液中耐热DNA聚合酶的浓度为1U/μl～5U/μl，尿嘧啶DNA糖基化酶的浓度为0.05U/μl～0.2U/μl。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括ROX参比染料，所述ROX参比染料的浓度为40～200mmol/L。

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