CN103789420B - 一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒。该试剂盒包括用于检测SEA、4.2和3.7型缺失的探针、用于扩增SEA、4.2和3.7型缺失的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和酶混合液。该试剂盒操作简便，灵敏度高，并可预防PCR产物污染，具有很好的特异性、重复性和稳定性，利用该试剂盒进行α-地中海贫血荧光定量PCR检测，可以确定外周血样本中α-地中海贫血的缺失类型，可为灵敏、早期诊断α-地中海贫血缺失类型提供可靠的实验证据。
Description
技术领域
本发明属于地中海贫血检测技术领域，涉及一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
α-地中海贫血是一种染色体隐性混乱的遗传性疾病，它的特征主要有血红细胞和血红蛋白缺乏引起的贫血，并且临床症状也从无症状转变为致死性溶血性贫血。现在被大多数有资质进行α-地中海贫血检测的医院使用的是Gap-PCR法，此方法需要操作人员十分熟悉普通PCR反应全过程，因为每一个步骤对结果的影响都非常大，故对临床遗传专业人员的实验操作水平要求很高。并且实验过程中致癌物质（EB）的污染问题、得到实验结果的时效性问题（约2～4天）以及昂贵的检测费用等问题都制约着该项疾病的安全有效诊断。
DNA的检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。
国内成熟产品中，外周血中核酸的提取，目前主要有三种方法：
（1）直接煮沸法：向外周血中加入核酸裂解液，直接煮沸，高速离心，上清即为模板。其优点是易于操作；缺点是不能有效去除外周血中抑制PCR的因素，弱阳性经常无扩增。
（2）浓缩煮沸法：先将外周血浓缩，再加裂解液，煮沸，高速离心，上清为模板，这种方法是目前国内临床通用的方法，其优点是能部分去除“直接煮沸法”中无法去除的抑制性因素；缺点是不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到。看得到沉淀的是因为将核酸与蛋白都浓缩了，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀的，使操作者无法确定吸弃杂质时会不会把核酸一起吸弃，而导致核酸损失，导致成为假阴性。
（3）柱提取法：外周血通过裂解，过柱后核酸吸附到膜上，通过两次洗涤，最后洗脱下来的为模板。这种方法相对前两种提取方法而言，提取的核酸纯度大大提高，不但可用于下游PCR实验，还可用来做其他分子生物学实验。
临床上检测α-地中海贫血缺失类型的方法目前主要是基于现在被大多数有资质进行α-地中海贫血检测的医院使用的是Gap-PCR法，国内已有多种基于Gap-PCR法用于α-地中海贫血缺失类型检测的试剂盒，但尚无实时荧光定量PCR技术（探针法）检测α-地中海贫血的试剂盒应用于临床检测中。已有的这些试剂盒所提供的α-地中海贫血提取方法有很多不足之处：1）核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，需要经过多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本丢失验证，核酸提取效率低；2）检测灵敏度低，约在起始模板样本量达到5000copies/ml左右；3）一般没有预防PCR产物污染的措施；4）没有荧光归一化校正系统，结果判定受主观因素影响较大。
因此，目前存在的问题是需要研究开发一种操作简便、耗时短、高效且安全可靠的α-地中海贫血缺失型检测技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括用于检测SEA、4.2和3.7型缺失的探针、用于扩增SEA、4.2和3.7型缺失的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和酶混合液。该试剂盒操作简便，灵敏度高，并可预防PCR产物污染，具有很好的特异性、重复性和稳定性，利用该试剂盒进行α-地中海贫血荧光定量PCR检测，可以确定外周血样本中α-地中海贫血的缺失类型，可为灵敏、早期诊断α-地中海贫血缺失类型提供可靠的实验证据。
为此，本发明一方面提供了一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒，其包括3种PCR反应液，所述3种PCR反应液中均含有用于靶多核苷酸扩增和检测的引物和探针，其中，
PCR反应液Ⅰ：含有源于人基因组16号染色体α1和α2基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血SEA缺失的引物和探针，且所述引物和探针的序列为，
上游引物α-SEA-F：5’-TCAGCCACCCGCAGACCAAGACCTA-3’；
下游引物α-SEA-R：5’-AGACAGCGTCACCCTCAGAGCCAT-3’；
探针α-SEA-P：5’-AAATGGATGAGGACGGAGCGATCTG-3’；
PCR反应液Ⅱ：含有源于人基因组16号染色体α1基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血3.7缺失的引物和探针，且所述引物和探针的序列为，
上游引物α-3.7-F：5’-GGGGTGTCACAGTGAACCACGACC-3’；
下游引物α-3.7-R：5’-GCCCCTGCCTTTTCCTACCCTATCC-3’；
探针α-3.7-P：5’-TGCGTCCTGGTGTTTGTTCCTTCCC-3’；
PCR反应液Ⅲ：含有源于人基因组16号染色体α2基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血4.2缺失的引物和探针，且所述引物和探针的序列为，
上游引物α-4.2-F：5’-GGCAGCCTTGGGCAACCTGTCTAC-3’；
下游引物α-4.2-R：5’-GGGCGGCTCCAGATTCAGACTCCT-3’；
探针α-4.2-P：5’-GCAGCCTTGGGCAACCTGTCTAC-3’。
在本发明的一个优选实施例中，对所述探针α-SEA-P、探针α-3.7-P和探针α-4.2-P中至少一个的羧基端用荧光素标记，并对羟基端猝灭基团修饰，其中所述荧光素包括FAM、TET、JOE、HEX，所述猝灭基团包括BHQ1、DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3。优选所述荧光素为FAM，所述猝灭基团包括BHQ1。
本发明的试剂盒，因为采用了上述探针和上下游引物，所以具有很好的特异性，应用本发明提供的试剂盒，可以对外周血样本中的α1和α2基因进行快速、准确测定，特异性好，能够检测出α-地中海贫血的三种缺失类型。
根据本发明，所述3种PCR反应液中均含有PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、脱氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP）及参比染料。
在本发明的一个实施例中，每种所述PCR反应液中包含10×PCR反应缓冲液，0.1～0.4mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1～0.4mmol/L脱氧尿嘧啶核苷三磷酸，40～200mmol/L参比染料，0.2～0.4μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上下游引物和0.2～0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针。
根据本发明，所述PCR反应缓冲液包括pH7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，氯化镁，氯化钾，曲拉通和甲酰胺。脱氧核糖核苷三磷酸包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP（均购自Promega公司）。
本发明中，所述参比染料包括ROX参比染料（购自Roche公司）或其他适用于荧光定量PCR的参比染料。加入ROX参比染料起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。
在本发明的一个实施例中，所述10×PCR反应缓冲液：包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，30mmol/L氯化镁，500mmol/L氯化钾，0.2ml/100ml曲拉通，和10ml/100ml甲酰胺（各组分购自Sigma公司）。
根据本发明，所述试剂盒还包括酶混合液和α-地中海贫血阴性对照。
在本发明的一个实施例中，所述酶混合液包含浓度为1～5U/μl的耐热DNA聚合酶（Taq酶）和浓度为0.05～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶）。其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用。
在本发明的另一个实施例中，所述α-地中海贫血阴性对照为不含有α-地中海贫血三种缺失类型任意一种的灭活阴性外周血。
根据本发明，所述试剂盒还包括裂解液、蛋白酶K溶液、吸附柱、漂洗液、缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ。
在一个实施例中，例如，所述裂解液为裂解液CL。
在一个实施例中，例如，所述缓冲液Ⅰ为缓冲液GB。
在一个实施例中，例如，所述缓冲液Ⅱ为缓冲液GD。
在一个实施例中，例如，所述缓冲液Ⅲ为缓冲液TB。
在一个实施例中，例如，所述吸附柱为吸附柱CB3。
在一个实施例中，例如，所述漂洗液为漂洗液PW。
本发明另一方面还提供了一种使用如上所述的试剂盒进行α-地中海贫血荧光定量PCR检测的方法，其包括：
步骤K，将3种PCR反应液分别与酶混合液混合后制成3种PCR混合液；
步骤L，将3种PCR混合液离心处理，然后将经过离心处理的3种PCR混合液分别加入3组反应管，并分别向含有PCR混合液的各反应管中加入α-地中海贫血阴性对照和待测样品核酸，制成PCR反应样品，盖好管盖；
步骤M，将各反应管置于荧光定量PCR扩增仪上进行荧光PCR反应，检测并记录样品的扩增曲线与阈值线；
步骤N，根据样品的扩增曲线形状、扩增曲线与阈值线是否存在交点Ct，以及Ct值进行α-地中海贫血缺失分析；
其中，在步骤K中，PCR反应液的加入量为42～43μl/人份，酶混合液的加入量为1～2μl/人份。
根据本发明，在步骤L中，每个反应管中总液体加入量为50μl，待测样本核酸或α-地中海贫血阴性对照的加入量为3～5μl。
在本发明的一个实施例中，在PCR管盖上做好标记，低速离心数秒，而后分别加入已提取的待测样品核酸3～5μl，使反应总体积为50μl，低速离心数秒。每次实验可设置一个阴性对照，作为产品使用的质量控制。这样可以防止假阳性。
本发明中所述用语“Ct”（即cycle threshold）是指扩增曲线与阈值线的交点，而Ct值是指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。
在本发明的一个具体实施方式中，在步骤N中，如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值，且Ct值≥36，可以判为阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示或无定值结果显示，则判为阴性。
在本发明的一个具体实施方式中，所述方法还包括提取待测样本核酸的操作，其包括：
步骤A，裂解红细胞及蛋白；
步骤B，去除杂质；
步骤C，洗涤；
步骤D，洗脱。
在本发明的一个具体实施方式中，所述提取待测样本核酸的操作包括：
步骤A，裂解红细胞及蛋白；其包括，
1）根据样本数取相应量的1.5ml离心管，做好标记。
2）取血液样品200ul，加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀（如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次）（如果较彻底，液体应该是较澄亮透明的），向离心收集到的细胞核沉淀中加200ul缓冲液GS，振荡至彻底混匀。
3）加入20ul蛋白酶K溶液，混匀。
4）加200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮（如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）。
步骤B，去除杂质：其包括，
5）加200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
6）将上一步得到的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
步骤C，洗涤；其包括，
7）向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8）向吸附柱CB3中加入700ul漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
9）向吸附柱CB3中加入500ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
10）将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3放置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
步骤D，洗脱；其包括，
11）将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
在步骤D之后还包括反应准备步骤：
12)在PCR管盖上做好标记，低速离心数秒，而后分别加入已提取的待测样品核酸3～5μl，使反应总体系为50μl，低速离心数秒。每次实验可设置一个阴性对照，作为产品使用的质量控制。
本发明在对人基因组第16号染色体短臂上的α1和α2基因的序列进行比对的基础上，在三种引起α-地中海贫血的缺失类型两端，共设计了多对引物，经定量PCR优化，每种缺失类型筛选出了扩增效果最好的一对引物，可检测出α-地中海贫血SEA、3.7、4.2三种缺失类型，但不能检测出非α-地中海贫血病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。同时，对α1和α2基因DNA的提取方法进行了优化，选择了柱提取的方法释放出目的基因DNA，应用本发明提供的试剂盒检测待测样本时，在很大程度上简化了实验的步骤，而且检测灵敏度可达1000copies/ml。另外，对PCR反应体系进行了优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；在PCR反应体系中增加了ROX参比染料，通过ROX荧光归一化校正，减少人员操作误差以及设备或耗材引起的实验误差，提高实验结果的稳定性和分析的准确性。荧光定量PCR扩增结束后，经仪器可以确定外周血样本中α-地中海贫血的缺失类型，可为灵敏、早期诊断α-地中海贫血缺失类型提供可靠的实验证据。
本发明是基于实时荧光定量PCR的技术（探针法）及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，实验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了荧光染料。染料发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。实验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
特异性实验表明：本发明的快速检测试剂盒能可以检出α-地中海贫血SEA、3.7和4.2三种缺失类型样本，而非α-地中海贫血样本均检测为阴性。
DNA不同提取方法对α-地中海贫血检测的影响实验表明：本发明提取的DNA比煮沸裂解法提取的DNA检测结果的灵敏度更高。另外，用本发明提取DNA无需现有技术中提取DNA无加热等繁琐步骤，在很大程度上简化了实验的步骤，也有明显的优势。
荧光归一化实验表明：本发明的快速检测试剂PCR反应体系中加入了ROX归一化校正系统，扩增曲线一致性较好，Ct值一致性好，变异系数小（0.56%），远小于无归一化校正系统的Ct值的变异系数（1.56%），说明PCR体系中加入ROX参比荧光可以起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。
PCR产物污染的预防实验表明：PCR反应体系中加入适量的UNG酶可以预防PCR产物污染。
临床样本的检测实验表明：本发明的快速检测试剂盒的检测下限即灵敏度为1000copies/mL。
综上所述，本发明的α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒包括用于检测SEA、4.2和3.7型缺失的探针、用于扩增SEA、4.2和3.7型缺失的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和DNA聚合酶。该试剂盒操作简便，灵敏度高，并可预防PCR产物污染，具有很好的特异性、重复性和稳定性，利用该试剂盒进行α-地中海贫血荧光定量PCR检测，可以确定外周血样本中α-地中海贫血的缺失类型，可为灵敏、早期诊断α-地中海贫血缺失类型提供可靠的实验证据。
附图说明
图1为实施例5中3.7型缺失样本扩增曲线图。
图2为实施例5中4.2型缺失样本扩增曲线图。
图3为实施例5中SEA型缺失样本扩增曲线图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例
实施例1：提供一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒
一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒，其至少由以下几种独立存在的组分组成：
（1）PCR反应液Ⅰ：含有源于人基因组16号染色体α1和α2基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血SEA缺失的引物和探针，且探针α-SEA-P、扩增上游引物α-SEA-F以及扩增下游引物α-SEA-R（Invitrogen公司合成）的序列为：
上游引物α-SEA-F：5’-TCAGCCACCCGCAGACCAAGACCTA-3’；
下游引物α-SEA-R：5’-AGACAGCGTCACCCTCAGAGCCAT-3’；
探针α-SEA-P：5’-AAATGGATGAGGACGGAGCGATCTG-3’；
优选地，对所述探针α-SEA-P羧基端用FAM标记，羟基端用BHQ1猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，还可以选用TET、JOE、HEX等荧光素标记，配合选用DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝灭基团。
（2）PCR反应液Ⅱ：含有源于人基因组16号染色体α1基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血3.7缺失的引物和探针，且探针α-3.7-P、扩增上游引物α-3.7-F以及扩增下游引物α-3.7-R（Invitrogen公司合成）的序列为：
上游引物α-3.7-F：5’-GGGGTGTCACAGTGAACCACGACC-3’；
下游引物α-3.7-R：5’-GCCCCTGCCTTTTCCTACCCTATCC-3’；
探针α-3.7-P：5’-TGCGTCCTGGTGTTTGTTCCTTCCC-3’；
优选地，探针α-3.7-P羧基端用FAM标记，羟基端用BHQ1猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，还可以选用TET、JOE、HEX等荧光素标记，配合选用DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝灭基团。
（3）PCR反应液Ⅲ：含有源于人基因组16号染色体α2基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血4.2缺失的引物和探针，且探针α-4.2-P、扩增上游引物α-4.2-F以及扩增下游引物α-4.2-R（Invitrogen公司合成）的序列为：
上游引物α-4.2-F：5’-GGCAGCCTTGGGCAACCTGTCTAC-3’；
下游引物α-4.2-R：5’-GGGCGGCTCCAGATTCAGACTCCT-3’；
探针α-4.2-P：5’-GCAGCCTTGGGCAACCTGTCTAC-3’。
优选地探针α-4.2-P羧基端用FAM标记，羟基端用BHQ1猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，还可以选用TET、JOE、HEX等荧光素标记，配合选用DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝灭基团。
每种所述PCR反应液中包含10×PCR反应缓冲液，0.1～0.4mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1～0.4mmol/L脱氧尿嘧啶核苷三磷酸，40～200mmol/L参比染料，0.2～0.4μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上下游引物和0.2～0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针。
其中，10×PCR反应缓冲液：包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，30mmol/L氯化镁，500mmol/L氯化钾，0.2ml/100ml曲拉通和10ml/100ml甲酰胺（各组分购自Sigma公司）。脱氧核糖核苷三磷酸：为dATP、dCTP、dGTP和dTTP，均购自Promega公司。脱氧尿嘧啶核苷三磷酸dUTP：购自Promega公司。参比染料：所述参比染料包括ROX参比染料（购自Roche公司）或其他适用于荧光定量PCR的参比染料。
实施例2：提供一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒
一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒，其除了含有实施例1中独立存在的各组分外还含有以下几种独立存在的组分：
（1）酶混合液：DNA聚合酶（Taq酶）（购自Promega公司）；
（2）α-地中海贫血阴性对照：不含有α-地中海贫血三种缺失类型任意一种的灭活阴性外周血；
其中，酶混合液包含浓度为1～5U/μl的耐热DNA聚合酶（Taq酶）和浓度为0.05～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶），其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用。
实施例3：提供一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒
一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒，其至少由以下十几种独立存在的组分组成：
（1）PCR反应液Ⅰ：含有源于人基因组16号染色体α1和α2基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血SEA缺失的引物和探针，且探针α-SEA-P、扩增上游引物α-SEA-F以及扩增下游引物α-SEA-R（Invitrogen公司合成）的序列为：
上游引物α-SEA-F：5’-TCAGCCACCCGCAGACCAAGACCTA-3’；
下游引物α-SEA-R：5’-AGACAGCGTCACCCTCAGAGCCAT-3’；
探针α-SEA-P：5’-AAATGGATGAGGACGGAGCGATCTG-3’；
优选地，对所述探针α-SEA-P羧基端用FAM标记，羟基端用BHQ1猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，还可以选用TET、JOE、HEX等荧光素标记，配合选用DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝灭基团。
（2）PCR反应液Ⅱ：含有源于人基因组16号染色体α1基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血3.7缺失的引物和探针，且探针α-3.7-P、扩增上游引物α-3.7-F以及扩增下游引物α-3.7-R（Invitrogen公司合成）的序列为：
上游引物α-3.7-F：5’-GGGGTGTCACAGTGAACCACGACC-3’；
下游引物α-3.7-R：5’-GCCCCTGCCTTTTCCTACCCTATCC-3’；
探针α-3.7-P：5’-TGCGTCCTGGTGTTTGTTCCTTCCC-3’；
优选地，探针α-3.7-P羧基端用FAM标记，羟基端用BHQ1猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，还可以选用TET、JOE、HEX等荧光素标记，配合选用DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝灭基团。
（3）PCR反应液Ⅲ：含有源于人基因组16号染色体α2基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血4.2缺失的引物和探针，且探针α-4.2-P、扩增上游引物α-4.2-F以及扩增下游引物α-4.2-R（Invitrogen公司合成）的序列为：
上游引物α-4.2-F：5’-GGCAGCCTTGGGCAACCTGTCTAC-3’；
下游引物α-4.2-R：5’-GGGCGGCTCCAGATTCAGACTCCT-3’；
探针α-4.2-P：5’-GCAGCCTTGGGCAACCTGTCTAC-3’。
优选地探针α-4.2-P羧基端用FAM标记，羟基端用BHQ1猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，还可以选用TET、JOE、HEX等荧光素标记，配合选用DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝灭基团。
每种所述PCR反应液中包含10×PCR反应缓冲液，0.1～0.4mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1～0.4mmol/L脱氧尿嘧啶核苷三磷酸，40～200mmol/L参比染料，0.2～0.4μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上下游引物和0.2～0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针。
其中，10×PCR反应缓冲液：包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，30mmol/L氯化镁，500mmol/L氯化钾，0.2ml/100ml曲拉通和10ml/100ml甲酰胺（各组分购自Sigma公司）。脱氧核糖核苷三磷酸：为dATP、dCTP、dGTP和dTTP，均购自Promega公司。脱氧尿嘧啶核苷三磷酸dUTP：购自Promega公司。参比染料：所述参比染料包括ROX参比染料（购自Roche公司）或其他适用于荧光定量PCR的参比染料。
（4）酶混合液：DNA聚合酶（Taq酶）（购自Promega公司）；
（5）α-地中海贫血阴性对照：不含有α-地中海贫血三种缺失类型任意一种的灭活阴性外周血；
其中，酶混合液包含浓度为1～5U/μl的耐热DNA聚合酶（Taq酶）和浓度为0.05～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶），其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用。
（6）裂解液：裂解液CL；
（7）蛋白酶K溶液；
（8）吸附柱：吸附柱CB3；
（9）漂洗液：漂洗液PW；
（10）缓冲液Ⅰ：缓冲液GB；
（11）缓冲液Ⅱ：缓冲液GD；
（12）缓冲液Ⅲ：缓冲液TB。
实施例4：使用实施例3的试剂盒提取待测样本中核酸
1）根据样本数取相应量的1.5ml离心管，做好标记。
2）取血液样品200ul，加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀（如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次），向离心收集到的细胞核沉淀中加200ul缓冲液GS，振荡至彻底混匀。
3）加入20ul蛋白酶K溶液，混匀。
4）加200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，56度放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮（如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）。
5）加200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
6）将上一步得到的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7）向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8）向吸附柱CB3中加入700ul漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
9）向吸附柱CB3中加入500ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
10）将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3放置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11）将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
12)在PCR管盖上做好标记，低速离心数秒，而后分别加入已提取的待测样品核酸3～5μl，使反应总体系为50μl，低速离心数秒。每次实验可设置一个阴性对照阴性质控，作为产品使用的质量控制。
实施例5：使用实施例2或3的试剂盒进行α-地中海贫血荧光定量PCR检测
1.试剂准备：
1）PCR反应液：包含10×PCR反应缓冲液，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，40～200mmol/L ROX参比染料，0.2～0.4μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上游引物SEA-F、3.7-F、4.2-F以及下游引物SEA-R，3.7-R，4.2-R，0.2～0.4μmol/L用于检测靶多核苷酸的探针SEA-P、3.7-P、4.2-P；
2）根据待测样本、α-地中海贫血阴性对照的量，按比例（反应液42～43μl/人份+酶混合液1～2μl/人份）取相应量的PCR反应液及酶混合液，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。
2.荧光PCR反应
1）将PCR反应管放入荧光定量PCR扩增仪，按对应顺序设置待测样本名称；
2）荧光检测通道选择：选择FAM通道（Reportere:FAM,Quencher:None）检测α-地中海贫血缺失类型；参比荧光（Passive Reference）设置为ROX；
3）荧光定量PCR反应条件见表1；
表1
3.结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析（也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析），然后记录样本Ct值和定值结果。3.7型缺失样本扩增曲线，见图1，4.2型缺失样本扩增曲线见图2，SEA型缺失样本扩增曲线见图3。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct（即cyclethreshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值）；如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且Ct值≥36，可以判为阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示（Undet）或无定值结果显示，可以判为阴性。
从上述实施例可以看出，本发明的α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒操作简便，灵敏度高，并可预防PCR产物污染，具有很好的特异性、重复性和稳定性，利用该试剂盒进行α-地中海贫血荧光定量PCR检测，可以确定外周血样本中α-地中海贫血的缺失类型，可为灵敏、早期诊断α-地中海贫血缺失类型提供可靠的实验证据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒，其包括3种PCR反应液，所述3种PCR反应液中均含有用于靶多核苷酸扩增和检测的引物和探针，其中，
PCR反应液Ⅰ：含有源于人基因组16号染色体α1和α2基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血SEA缺失的引物和探针，且所述引物和探针的序列为，
上游引物α-SEA-F：5’-TCAGCCACCCGCAGACCAAGACCTA-3’；
下游引物α-SEA-R：5’-AGACAGCGTCACCCTCAGAGCCAT-3’；
探针α-SEA-P：5’-AAATGGATGAGGACGGAGCGATCTG-3’；
PCR反应液Ⅱ：含有源于人基因组16号染色体α1基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血3.7缺失的引物和探针，且所述引物和探针的序列为，
上游引物α-3.7-F：5’-GGGGTGTCACAGTGAACCACGACC-3’；
下游引物α-3.7-R：5’-GCCCCTGCCTTTTCCTACCCTATCC-3’；
探针α-3.7-P：5’-TGCGTCCTGGTGTTTGTTCCTTCCC-3’；
PCR反应液Ⅲ：含有源于人基因组16号染色体α2基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血4.2缺失的引物和探针，且所述引物和探针的序列为，
上游引物α-4.2-F：5’-GGCAGCCTTGGGCAACCTGTCTAC-3’；
下游引物α-4.2-R：5’-GGGCGGCTCCAGATTCAGACTCCT-3’；
探针α-4.2-P：5’-GCAGCCTTGGGCAACCTGTCTAC-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，对所述探针α-SEA-P、探针α-3.7-P和探针α-4.2-P中至少一个的羧基端用荧光素标记，并对羟基端猝灭基团修饰，其中所述荧光素包括FAM、TET、JOE、HEX，所述猝灭基团包括BHQ1、DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光素为FAM，所述猝灭基团包括BHQ1。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述3种PCR反应液中均含有PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、脱氧尿嘧啶核苷三磷酸及参比染料。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，每种所述PCR反应液中包含10×PCR反应缓冲液，0.1～0.4mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1～0.4mmol/L脱氧尿嘧啶核苷三磷酸，40～200mmol/L参比染料，0.2～0.4μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上下游引物和0.2～0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合液和α-地中海贫血阴性对照。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合液和α-地中海贫血阴性对照。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合液和α-地中海贫血阴性对照。
9.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括裂解液、蛋白酶K溶液、吸附柱、漂洗液、缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ；其中，所述缓冲液I为缓冲液GB，所述缓冲液II为缓冲液GD，所述缓冲液III为缓冲液TB。
10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括裂解液、蛋白酶K溶液、吸附柱、漂洗液、缓冲液I、缓冲液II、缓冲液III；其中，所述缓冲液I为缓冲液GB，所述缓冲液II为缓冲液GD，所述缓冲液III为缓冲液TB。
11.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括裂解液、蛋白酶K溶液、吸附柱、漂洗液、缓冲液I、缓冲液II、缓冲液III；其中，所述缓冲液I为缓冲液GB，所述缓冲液II为缓冲液GD，所述缓冲液III为缓冲液TB。
12.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括裂解液、蛋白酶K溶液、吸附柱、漂洗液、缓冲液I、缓冲液II、缓冲液III；其中，所述缓冲液I为缓冲液GB，所述缓冲液II为缓冲液GD，所述缓冲液III为缓冲液TB。
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