CN104762379A - 一种疟原虫检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种疟原虫检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于荧光定量PCR检测的PCR反应液。具体地，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物序列，且上游引物：5’-CGACTAGGTGTTGGATGAAAGTGT-3’；下游引物：5’-CCAGAACCCAAAGACTTTGATTTC-3’。在一种具体实施方式中，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸检测的探针序列，且探针序列为：5’-TTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTC-3’。本发明提供的试剂盒操作简便，灵敏度高，并可预防PCR产物污染，具有很好的特异性、重复性和稳定性，利用该试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测，可以确定血液样本中疟原虫的有无，可为灵敏、早期诊断是否被疟原虫感染提供可靠的实验证据。

Description

一种疟原虫检测试剂盒
技术领域
本发明属于检测试剂盒技术领域，具体涉及一种疟原虫荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
疟疾是全球最严重的由疟原虫引起的热带病之一，每年约有4亿人感染，其中大部分发生在撒哈拉以南的非洲(恶性疟)和东南亚等国家(间日疟)。疟疾每年给非洲造成的经济损失高达120亿美元。在针对疟疾的治疗过程中，病因的早期检测显得尤为的重要，现在国内外成熟的商品化疟原虫检测试剂多为免疫学平台产品。
疟原虫的检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。
国内成熟产品中，外周血中核酸的提取，目前主要有三种方法：1)直接煮沸法：向外周血中加入核酸裂解液，直接煮沸，高速离心，上清即为模板。其优点是易于操作；缺点是不能有效去除外周血中抑制PCR的因素，弱阳性经常无扩增。2)浓缩煮沸法：先将外周血浓缩，再加裂解液，煮沸，高速离心，上清为模板，这种方法是目前国内临床通用的方法，其优点是能部分去除“直接煮沸法”中无法去除的抑制性因素；缺点是不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到。看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀的，使操作者无法确定吸弃杂质时会不会把病毒一起吸弃，而导致病毒损失，导致成为假阴性。3)柱提取法：外周血通过裂解，过柱后核酸吸附到膜上，通过两次洗涤，最后洗脱下来的为模板。这种方法相对前两种提取方法而言，提取的核酸纯度大大提高，但步骤繁琐，时效性差。
临床上检测疟原虫的方法目前主要是免疫学方法，而基于实时荧光定量PCR技术(探针法)对疟原虫进行检测的报导较少。实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术；它使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，实验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了荧光探针。探针发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。实验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果。因此，该技术在靶 多核苷酸样品的检测分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
国内已有多种基于免疫学方法用于疟原虫检测的试剂盒，但暂无实时荧光定量PCR技术检测疟原虫的试剂盒应用于临床检测中。已有的这些试剂盒所提供的疟原虫提取和检测方法有很多不足之处：1)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，需要经过多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本丢失验证，核酸提取效率低；2)检测灵敏度低，在5000copies/ml左右；3)一般没有预防物污染的措施；4)没有荧光归一化校正系统，结果判定受主观因素影响较大；5)方法学时效性差且通量小。
因此，本领域需要研究开发一种操作简便、耗时短、高效、安全可靠且检测灵敏度高的疟原虫检测试剂盒。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种疟原虫荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括用于检测的探针、用于扩增的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和DNA聚合酶。该试剂盒操作简便，灵敏度高，并可预防PCR产物污染，具有很好的特异性、重复性和稳定性，利用该试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测，可以确定血液样本中疟原虫有无，可为灵敏、早期诊断是否被疟原虫感染提供可靠的实验证据。
因此，本发明提供一种疟原虫检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于荧光定量PCR检测的PCR反应液。具体地，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物序列，且所述上游引物的序列为：5’-CGACTAGGTGTTGGATGAAAGTGT-3’；所述下游引物的序列为：5’-CCAGAACCCAAAGACTTTGATTTC-3’。
在本发明的一种实施方式中，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸检测的探针序列，且所述探针序列为：5’-TTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTC-3’。本发明中，所述探针的羧基端用荧光素标记，并对羟基端用猝灭基团修饰，其中所述荧光素选自FAM、TET、JOE和HEX，所述猝灭基团选自BHQ1、DABCYL、TAMRA、BHQ2和BHQ3。优选所述荧光素为FAM，所述猝灭基团为BHQ1。
本发明的试剂盒，因为采用了上述探针和上下游引物，所以具有很好的特异性和灵敏性，应用本发明提供的试剂盒，可以对血液样本中的疟原虫进行快速、准确测定，特异性好，能够检测出是否存在疟原虫感染。
在本发明的另一种实施方式中，所述试剂盒中还含有40～200mmol/L的参比染料。本发明中，所述参比染料包括ROX参比染料(购自Roche公司)或其他适用于荧光定量PCR 的参比染料。加入ROX参比染料起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。
本发明中，所述试剂盒中还包括酶混合液和疟原虫阴性对照，且所述酶混合液包含浓度为1～5U/μl的耐热DNA聚合酶(Taq酶)和浓度为0.05～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用。在本发明的另一个实施例中，所述疟原虫阴性对照为不含有疟原虫任意一种型别的灭活阴性外周血。
本发明的PCR反应中优选地包括PCR反应缓冲液。在本发明的一个实施例中，所述10×PCR反应缓冲液包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、30mmol/L氯化镁、500mmol/L氯化钾、0.2ml/100ml曲拉通、和10ml/100ml甲酰胺(各组分购自Sigma公司)。
本发明还提供一种使用如上所述的试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测的方法，其包括：步骤K，将PCR反应液与酶混合液混合后制成PCR混合液；步骤L，将PCR混合液离心处理，然后将经过离心处理的PCR混合液加入多个反应管，并向含有PCR混合液的反应管中分别加入阴性对照或待测样本核酸，制成PCR反应样品，盖好管盖；步骤M，在荧光定量PCR扩增仪上进行荧光PCR反应，检测并记录样品的扩增曲线与阈值线；步骤N，根据样品的扩增曲线形状、扩增曲线与阈值线是否存在交点Ct，以及Ct值大小进行疟原虫分析；其中，在步骤K中，PCR反应液的加入量为42～43μl/人份，酶混合液的加入量为1～2μl/人份。
优选地，在步骤L中，每个反应管中阴性对照或待测样本核酸的加入量为3～5μl。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1
本实施例提供一种疟原虫荧光定量PCR检测试剂盒，它包括如下组分。
1)用于检测疟原虫的引物探针序列(Invitrogen公司合成)，其源于疟原虫各型别的保守区域。
上游引物PT-F：5’-CGACTAGGTGTTGGATGAAAGTGT-3’；
下游引物PT-R：5’-CCAGAACCCAAAGACTTTGATTTC-3’；
探针PT-P：5’-TTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTC-3’；
优选地，探针羧基端用FAM标记，羟基端用BHQ1猝灭基团修饰。在本发明的其他实施方式中，还可以选用TET、JOE、HEX等荧光素标记，配合选用DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝灭基团。
2)10×PCR反应缓冲液：包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，30mmol/L氯化镁，500mmol/L氯化钾，0.2ml/100ml曲拉通和10ml/100ml甲酰胺(各组分购自Sigma公司)；
3)脱氧核糖核苷三磷酸：为dATP、dCTP、dGTP和dTTP(均购自Promega公司)；
4)dUTP：购自Promega公司，它与尿嘧啶DNA糖基化酶配合用于预防PCR产物污染。 
上述组分1)～4)可混合构成PCR反应液。
5)ROX参比染料：ROX参比染料购自Roche公司，或使用其他适用于荧光定量PCR的参比染料。加入ROX参比染料起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。
6)酶混合液：购自Promega公司，其中酶混合液包含浓度为1～5U/μl的耐热DNA聚合酶(Taq酶)和浓度为0.05～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)；其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用。
7)疟原虫阴性对照：不含有疟原虫各型别中任意一种的灭活阴性外周血。
实施例2
本实施例为使用实施例1的试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测。
1.试剂准备： 
1)提取待测样本中核酸：
①根据样本数取相应量的1.5ml离心管，做好标记。
②取血液样品200ml，加入2-2.5倍体积的灭菌生理盐水，颠倒混匀，振荡至彻底混匀。
③加入200ul裂解液，混匀，振荡至彻底混匀。
④将上一步得到的溶液，99度放置10min，其间颠倒混匀数次。
⑤将上一步得到的溶液，12000rpm离心5min，将上清收集到离心管中。
⑥在PCR管盖上做好标记，低速离心数秒，而后分别加入已提取的待测样品3～5μl，使反应总体系为50μl，低速离心数秒。每次实验可设置一个阴性质控，作为产品使用的质 量控制。
2)PCR反应液：包含10×PCR反应缓冲液，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，40mmol/L～200mmol/L ROX参比染料，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上游引物PT-F以及下游引物PT-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于检测靶多核苷酸的探针PT-P；
3)PCR-mix：根据待测样本和阴性对照的量，按比例(PCR反应液42～43μl/人份+酶混合液1～2μl/人份)取相应量的PCR反应液及酶混合液，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。
2.荧光PCR反应
1)将PCR反应管放入荧光定量PCR扩增仪，按对应顺序设置待测样本名称；
2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测疟原虫有无；参比荧光(Passive Reference)设置为ROX；
3)荧光定量PCR反应条件为： 
3.结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且定值结果≥1000copies/ml，可以判为阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示(Undet)或无定值结果显示，可以判为阴性。
本发明提供的试剂盒可检测出疟原虫各种型别，但不能检测出非疟原虫病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。同时，本发明提供的试剂盒检测灵敏度可达1000copies/ml。另外，对PCR反应体系进行了优化组合，优选地利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；在PCR反应体系中增加了ROX参比染料，通过ROX荧光归 一化校正，减少人员操作误差以及设备或耗材引起的实验误差，提高实验结果的稳定性和分析的准确性。荧光定量PCR扩增结束后，经仪器可以确定血液样本中疟原虫的有无，可为灵敏、早期诊断是否被疟原虫感染提供可靠的实验证据。
另外，用本发明提取DNA无需现有技术中提取DNA等繁琐步骤，在很大程度上简化了实验的步骤，也有明显的优势。而荧光归一化实验表明：本发明的快速检测试剂PCR反应体系中加入了ROX归一化校正系统，扩增曲线一致性较好，Ct值一致性好，变异系数小(0.56％)，远小于无归一化校正系统的Ct值的变异系数(1.56％)，说明PCR体系中加入ROX参比荧光可以起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。
从上述具体实施方式可以看出，本发明的疟原虫荧光定量PCR检测试剂盒操作简便，灵敏度高，并可预防PCR产物污染，具有很好的特异性、重复性和稳定性，利用该试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测，可以确定血液样本中疟原虫的有无，可为灵敏、早期诊断是否被疟原虫感染提供可靠的实验证据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种疟原虫检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于荧光定量PCR检测的PCR反应液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物序列，且
所述上游引物的序列为：5’-CGACTAGGTGTTGGATGAAAGTGT-3’；
所述下游引物的序列为：5’-CCAGAACCCAAAGACTTTGATTTC-3’。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸检测的探针序列，
且所述探针序列为：5’-TTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTC-3’。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的羧基端用荧光素标记，并对羟基端用猝灭基团修饰，其中所述荧光素选自FAM、TET、JOE和HEX，所述猝灭基团选自BHQ1、DABCYL、TAMRA、BHQ2和BHQ3。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光素为FAM，所述猝灭基团为BHQ1。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有40～200mmol/L的参比染料。
7.根据权利要求1～6中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括酶混合液和疟原虫阴性对照，且所述酶混合液包含浓度为1～5U/μl的耐热DNA聚合酶和浓度为0.05～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶。
8.一种使用如权利要求1～7中任意一项所述的试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测的方法，其包括：
步骤K，将PCR反应液与酶混合液混合后制成PCR混合液；
步骤L，将PCR混合液离心处理，然后将经过离心处理的PCR混合液加入多个反应管，并向含有PCR混合液的反应管中分别加入阴性对照或待测样本核酸，制成PCR反应样品，盖好管盖；
步骤M，在荧光定量PCR扩增仪上进行荧光PCR反应，检测并记录样品的扩增曲线与阈值线；
步骤N，根据样品的扩增曲线形状、扩增曲线与阈值线是否存在交点Ct，以及Ct值大小进行疟原虫分析；
其中，在步骤K中，PCR反应液的加入量为42～43μl/人份，酶混合液的加入量为1～2μl/人份。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤L中，每个反应管中阴性对照或待测样本核酸的加入量为3～5μl。
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