CN108913811B - 乙肝病毒核酸的快速扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乙肝病毒核酸的快速扩增方法，包括以下步骤：将含有乙肝病毒的样品与核酸释放剂混合后加入PCR预混液得到反应液，所述核酸释放剂包括莎梵婷、氯化钾、十二烷基磺酸钠和乙醇，所述PCR预混液包括脱氧核糖核苷三磷酸、如SEQ No.1序列所示的上游引物、如SEQ No.2序列所示的下游引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；将所述反应液置于PCR反应管中使所述反应液呈厚度小于等于0.1mm的薄膜状；将所述PCR反应管置于PCR扩增仪中按照以下反应条件进行PCR扩增：90～100℃预变性10s～600s，90～100℃变性0～1s，50～65℃退火延伸0～1s。本发明在确保扩增的准确性和有效性的前提下，每一个循环所需要的时间都显著地缩短了，实现了快速简单地扩增乙肝病毒核酸的目的。

Description

乙肝病毒核酸的快速扩增方法

技术领域

本发明涉及生物化学领域，特别是涉及一种乙肝病毒核酸的快速扩增方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，缩写HBV)是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)。全世界约有2.57亿感染HBV，中国有9300万HBV感染者。因此，对乙型肝炎病毒的研究在世界范围内得到了重视。而在乙型肝炎病毒的相关科学研究中，常常需要对乙肝病毒核酸进行非疾病诊断或治疗目的的扩增，以获得大量的乙肝病毒核酸，从而为各种科学试验提供样品。

聚合酶链式反应(PCR)是一种主要的核酸体外扩增技术，近年来发展迅速。PCR技术的特点是模拟生物体内DNA的复制过程，在合适的温度条件下，利用扩增所需要的模板、引物、聚合酶等原料，使目标DNA或RNA片段经过变性、退火和延伸的不断循环得到目标DNA或者RNA片段的指数倍扩增。PCR作为分子生物学研究的基础技术，促进了生命科学的发展，但由于一般的PCR方法复杂且耗时，限制了技术的进一步发展，不利于快速获得大量的乙肝病毒核酸样品。

发明内容

基于此，有必要提供一种操作简单且耗时较短的乙型肝炎病毒核酸的快速扩增方法。

一种乙肝病毒核酸的快速扩增方法，包括以下步骤：

将含有乙肝病毒的样品与核酸释放剂混合后加入PCR预混液得到反应液，所述核酸释放剂包括莎梵婷、氯化钾、十二烷基磺酸钠和乙醇，所述PCR预混液包括脱氧核糖核苷三磷酸、如SEQ No.1序列所示的上游引物、如SEQ No.2序列所示的下游引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；

将所述反应液置于PCR反应管中使所述反应液呈厚度小于等于0.1mm的薄膜状；

将所述PCR反应管置于PCR扩增仪中设定以下反应条件进行PCR扩增：预变性温度设为90～100℃，预变性时间设为10s～600s，变性温度设为90～100℃，变性时间设为0～1s，退火延伸温度设为50～65℃，退火延伸时间设为0～1s。

本发明的乙肝病毒核酸的快速扩增方法主要从两方面进行了优化，一方面在核酸的提取上，采用莎梵婷、氯化钾和十二烷基磺酸钠等强烈的蛋白变性剂快速破坏病毒外壳，彻底释放出病毒核酸，有利于PCR的快速扩增，且无需单独进行加热、离心、去上清等提取工作，只需将样品与核酸释放剂及其他PCR必须的组分加入反应管中混匀即可。而且所采用的上下游引物具有十分优异的扩增效率，灵敏度高，特异性强，能够检测出HBV的八个基因型，进一步为PCR的快速扩增奠定了基础。另一方面，通过将反应液置于PCR反应管中使反应液呈厚度小于等于0.1mm的薄膜状，可以显著地提高热传递效率，降低了反应液各部分的温度变化差异，提高了反应液整体的温度一致性和变温速度，为PCR的快速扩增提供了另一关键要素。在结合以上两方面的因素的情况下，本发明进而采用以下时间极短的的反应条件进行PCR扩增：90～100℃预变性10s～600s，90～100℃变性0～1s，50～65℃退火延伸0～1s。如此，在确保扩增的准确性和有效性的前提下，每一个循环所需要的时间都显著地缩短了，且随着循环数的增加，节省的时间和能耗愈加明显，实现了快速简单地扩增乙肝病毒核酸的目的，从而为各种科学研究提供足够多的核酸样品。

在其中一个实施例中，设定以下反应条件进行PCR扩增：预变性温度设为93～95℃，预变性时间设为60s，变性温度设为93～95℃，变性时间设为0s，退火延伸温度设为56～58℃，退火延伸时间设为0s。

在其中一个实施例中，所述PCR反应管的容纳腔为厚度小于等于0.1mm的扁平状容纳腔。

在其中一个实施例中，所述PCR预混液还包括如SEQ No.3序列所示的第一探针。

在其中一个实施例中，还包括以下步骤：在所述退火延伸和所述变性之间的升温变化过程中进行荧光采集。

在其中一个实施例中，所述PCR预混液还包括ROX参比染料。

在其中一个实施例中，所述第一探针的羧基端用FAM荧光基团修饰，羟基端用BHQ1淬灭基团修饰。

在其中一个实施例中，所述PCR预混液还包括如SEQ No.4序列所示的DNA插入到pUC18T载体而构成的内标和如SEQ No.5序列所示的第二探针。

在其中一个实施例中，所述第二探针的羧基端用HEX荧光基团修饰，羟基端用DABCYL淬灭基团修饰。

在其中一个实施例中，所述核酸释放剂中，莎梵婷的浓度为0.01～0.5mmol/L，氯化钾的浓度为50～200mmol/L，十二烷基磺酸钠的浓度为0.01～2g/100mL，乙醇的浓度为0.05～1mL/100mL。

附图说明

图1为传统的PCR反应条件示意图；

图2为一实施例的PCR反应条件示意图；

图3为一实施例的PCR反应管的结构示意图；

图4为传统的PCR反应管的结构示意图；

图5为实施例1～16的扩增曲线图；

图6为对比例1～16的扩增曲线图；

图7为实施例1～16与对比例1～16的相关性分析图；

图8为对比例17～32的扩增曲线图；

图9为对比例33～48的扩增曲线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例的乙肝病毒核酸的快速扩增方法，包括以下步骤S1～S3：

S1、将含有乙肝病毒的样品与核酸释放剂混合后加入PCR预混液得到反应液，核酸释放剂包括莎梵婷、氯化钾、十二烷基磺酸钠和乙醇，PCR预混液包括脱氧核糖核苷三磷酸、如SEQ No.1序列所示的上游引物、如SEQ No.2序列所示的下游引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液。

S2、将反应液置于PCR反应管中使反应液呈厚度小于等于0.1mm的薄膜状。

S3、将PCR反应管置于PCR扩增仪中设定以下反应条件进行PCR扩增：预变性温度设为90～100℃，预变性时间设为10s～600s，变性温度设为90～100℃，变性时间设为0～1s，退火延伸温度设为50～65℃，退火延伸时间设为0～1s。

如图1所示，传统的PCR反应条件是：94℃预变性5min左右，循环扩增阶段94℃变性30s(或更长时间)，57℃退火延伸45s(或更长时间)，进行若干个循环。因此，每个循环都在变性温度和退火延伸温度有一段时间的等待，虽然单独从一个循环来看只是几十秒的等待，但是以上过程都是需要经过不断循环来实现目标DNA或者RNA的扩增，所以随着循环的次数增大，所需要的时间也是累加增长，最终导致了大量时间的耗费。

本发明的乙肝病毒核酸的快速扩增方法主要从两方面进行了优化，一方面在核酸的提取上，采用莎梵婷、氯化钾和十二烷基磺酸钠等强烈的蛋白变性剂快速破坏病毒外壳，彻底释放出病毒核酸，有利于PCR的快速扩增，且无需单独进行加热、离心、去上清等提取工作，只需将样品与核酸释放剂及其他PCR必须的组分加入反应管中混匀即可。而且所采用的上下游引物具有十分优异的扩增效率，灵敏度高，特异性强，能够检测出HBV的八个基因型，进一步为PCR的快速扩增奠定了基础。另一方面，通过将反应液置于PCR反应管中使反应液呈厚度小于等于0.1mm的薄膜状，可以显著地提高热传递效率，降低了反应液各部分的温度变化差异，提高了反应液整体的温度一致性和变温速度，为PCR的快速扩增提供了另一关键要素。在结合以上两方面的因素的情况下，本发明进而采用以下时间极短的的反应条件进行PCR扩增：90～100℃预变性10s～600s，90～100℃变性0～1s，50～65℃退火延伸0～1s。如此，在确保扩增的准确性和有效性的前提下，每一个循环所需要的时间都显著地缩短了，且随着循环数的增加，节省的时间和能耗愈加明显，实现了快速简单地扩增乙肝病毒核酸的目的，从而为各种科学研究提供足够多的核酸样品。

优选地，设定以下反应条件进行PCR扩增：预变性温度设为93～95℃，预变性时间设为60s，变性温度设为93～95℃，变性时间设为0s，退火延伸温度设为56～58℃，退火延伸时间设为0s。变性和退火延伸的时间指的是在PCR扩增仪上设定的参数条件，设为0秒即温度始终变化而不存在维持的阶段，如图2所示，如此，PCR反应在经过开始的预变性保持后，温度一直是一个变化的过程，因此整个过程对温控的精密度要求及实施温度控制的相应措施(如提前减慢升温、降温速度等)的要求低，即降低了对温度控制的技术难度，也节约了PCR仪的制造成本。

在一个实施例中，PCR反应管的容纳腔为厚度小于等于0.1mm的扁平状容纳腔，例如图3中PCR反应管的容纳腔A。目前通常用的PCR反应容器都为如图4所示的圆锥形盲孔容器，底部为倒锥形结构，虽然有利于最底部温度变化速度的提高，但对反应液整体的温度变化速度提高并不明显，在变温的过程中难以确保反应液边沿和中心温度的一致性，为了确保扩增的有效性和准确性，只能等待中心位置到达指定温度后再继续变温，降低了PCR扩增的速度，造成大量能耗和时间的浪费。本实施例通过PCR反应管的扁平化设计便于使液相物体在容器中的横切面厚度远远小于传统的圆锥管容器，反应容器中的液相物体与反应容器的直接接触面积大大增加，液相物体形成厚度小于等于0.1mm的薄膜状，显著提高了热传递效率，有助于加快PCR扩增速度。可以理解，PCR反应管的具体结构不限于图3所示的结构，只要能使反应液呈厚度小于等于0.1mm的薄膜状即可。

在一个实施例中，PCR预混液还包括如SEQ No.3序列所示的第一探针。在PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，有利于通过荧光监测系统进行核酸定量。优选地，第一探针的羧基端用FAM荧光基团修饰，羟基端用BHQ1淬灭基团修饰，可以理解，羧基端可以选用TET、JOE、HEX等荧光基团，羟基端可以选用DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3等淬灭基团，不限于此。

在一个实施例中，乙肝病毒核酸的快速扩增方法还包括以下步骤：在退火延伸和变性之间的温度变化过程中进行荧光采集。由于上述PCR反应条件参数的设置，在需要进行荧光定量时，在温度变化的过程中执行荧光采集即可，不需要保持长时间的恒定温度，可减少能量和时间的浪费。

在一个实施例中，PCR预混液还包括ROX参比染料。在需要进行荧光定量时，由于各种因素导致的误差难以避免，因此通过加入ROX参比染料可进行归一化校正，使检测结果的稳定性和重复性大大提高。

在一个实施例中，PCR预混液还包括如SEQ No.4序列所示的DNA插入到pUC18T载体而构成的内标和如SEQ No.5序列所示的第二探针，第二探针的羧基端用HEX荧光基团修饰，羟基端用DABCYL淬灭基团修饰。如此，通过加入内标，当样本中存在PCR干扰物质而导致扩增失败时能够快速地明确原因。可以理解，第二探针羧基端还可以选用不同于第一探针的荧光基团标记，如TET、JOE、FAM等，羟基端选用BHQ1、TAMRA、BHQ2、BHQ3等淬灭基团，不限于此。

在一个实施例中，核酸释放剂中，莎梵婷的浓度为0.01～0.5mmol/L，氯化钾的浓度为50～200mmol/L，十二烷基磺酸钠的浓度为0.01～2g/100mL，乙醇的浓度为0.05～1mL/100mL。

以下为具体实施例，需要说明的是，为了体现PCR扩增是否准确有效，以下实施例均加入第一探针和ROX参比染料，并相应进行荧光采集，在实际进行乙肝病毒核酸的扩增时，可根据需要选择是否加入第一探针和ROX参比染料。在荧光定量PCR中，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个样品的Ct值与该样品的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可得到标准曲线，横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得样品的Ct值，即可根据标准曲线计算出该样品的起始拷贝数及其对数(LOG值)。

操作步骤如下：

提供储备液：包含扩增缓冲液、0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸、40mmol/L～200mmol/L ROX参比染料、0.2μmol/L～0.4μmol/L上游引物及下游引物、0.2μmol/L～0.4μmol/L第一探针。提供酶溶液：包含浓度为1U/μL的Taq酶。提供核酸释放剂：包含莎梵婷(surfactin)0.01mmol/L、氯化钾50mmol/L、十二烷基磺酸钠0.01g/100mL和乙醇0.05mL/100mL。

按38～44μL储备液与1～2μL酶溶液的比例混匀得到PCR预混液，瞬时离心后备用。使用如图3所示的容器作为PCR反应管，每个PCR反应管中加入核酸释放剂2～5μL和样品3～5μL，吸打3～5次混匀，每个PCR反应管加入PCR预混液40～45μL，吸打混匀2～3次，盖上管盖2000rpm离心30秒。将PCR反应管放入荧光定量PCR扩增仪，按照所设定的反应条件进行PCR扩增。反应结束后，仪器自动保存结果，获得Ct值、LOG值、扩增曲线等数据。

实施例1～16

按照操作步骤，对16份含有乙肝病毒的样品进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性0s，57℃退火延伸0s，40个循环并在每个循环的57℃升温至94℃的过程中进行荧光采集，扩增程序总时间为15min。使用的PCR仪为金诺美生物技术有限公司生产的GNM-C7-8实时荧光定量PCR仪。扩增曲线如图5所示，可见实施例1～16的扩增曲线保持了良好的形态，具有较高的扩增效率，对数值(LOG值)如表1所示。

此外，按照实施例1～16的方法对空白样品(不含乙肝病毒的样品)进行扩增，没有出现假阳性结果。

对比例1～16

按照操作步骤，对相同的16份含有乙肝病毒的样品进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性15s，57℃退火延伸30s及荧光采集，45个循环，扩增程序总时间为72min。使用的PCR仪为金诺美生物技术有限公司生产的GNM-C7-8实时荧光定量PCR仪。扩增曲线如图6所示，样品浓度和LOG值如表1所示。

表1

根据表1可知，实施例1～16的LOG值与采用传统的PCR反应条件的对比例1～16的LOG值相差很小，说明实施例1～16核酸扩增的有效性和准确性与对比例1～16相同，但是所花费的时间明显减少，每个样品的Ct值与该样品的起始浓度的对数保持良好的相关性。对实施例1～16的LOG值与对比例1～16的LOG值进行相关性分析，结果如图7所示，也可证明相关性较好。

对比例17～32

按照操作步骤，对相同的16份含有乙肝病毒的样品进行扩增，与实施例1～16的区别在于：

试剂准备：提供DNA提取液和HBV-PCR反应液备用，DNA提取液的组分为chelex100、Tris-HCL、NaOH、Triton-100、NP-40和EDTA，HBV-PCR反应液的组分为引物、探针、dN(U)TP、缓冲液、DNA聚合酶和UNG酶，其引物的序列与SEQ No.1和SEQ No.2不同。将HBV-PCR反应液加入离心管中震荡混匀，瞬时离心后，向每一个PCR反应管中分装45uL。

DNA提取：100uL样品加入等量的DNA浓缩液(PEG6000、NaCl)振荡混匀5秒，10000rpm离心10分钟，去上清，沉淀中加入30uL DNA提取液，剧烈振荡混匀10秒，瞬时离心数秒，100℃恒温处理10分钟，10000rpm离心5分钟备用。PCR扩增：向准备好的每个PCR反应液管中分别加入处理后的样品上清液5uL，瞬时离心备用。将PCR反应管放入荧光定量PCR扩增仪，按照实施例1～16的PCR反应条件进行PCR扩增。扩增曲线如图8所示，LOG值如表2所示。

表2

根据图8和表2可知，对比例17～32大部分都无法呈现出扩增曲线，也就无法得到Ct值，少部分能够得到Ct值的对比例其LOG值与采用传统的PCR反应条件的对比例1～16的LOG值相差甚远，说明对比例17～32核酸扩增的有效性和准确性很差，扩增失败，每个样品的Ct值与该样品的起始浓度的对数无法保持良好的相关性。

对比例33～48

按照操作步骤，对相同的16份含有乙肝病毒的样品进行扩增，与实施例1～16的区别在于，PCR反应管使用如图4所示的圆锥形盲孔容器。扩增曲线如图9所示，LOG值如表3所示。

表3

根据图9和表3可知，对比例33～48都无法呈现出扩增曲线，也就无法得到Ct值，说明对比例33～48核酸扩增的有效性和准确性很差，扩增失败，每个样品的Ct值与该样品的起始浓度的对数无法保持良好的相关性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 湖南圣湘生物科技有限公司

<120> 乙肝病毒核酸的快速扩增方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Hepatitis B virus

<400> 1

atcgctggat gtgtctgctg cgtttt 26

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> Hepatitis B virus

<400> 2

ctggaattag aggacaaacg ggcaacat 28

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> Hepatitis B virus

<400> 3

cctcttcatc ctgctgctat gcctcatctt cttattgg 38

<210> 4

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatat cttcctccat cctgctaggt gcctcatctt 60

cttagctcta tgttgcccgt ttgtcctcta attccag 97

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcctccatc ctgctaggtg cctcatcttc ttagct 36

Claims (9)

1.一种非疾病的诊断和治疗目的的乙肝病毒核酸的快速扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

将含有乙肝病毒的样品与核酸释放剂混合后加入PCR预混液得到反应液，所述核酸释放剂包括莎梵婷、氯化钾、十二烷基磺酸钠和乙醇，所述PCR预混液包括脱氧核糖核苷三磷酸、如SEQ No.1序列所示的上游引物、如SEQ No.2序列所示的下游引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；

将所述反应液置于PCR反应管中使所述反应液呈厚度小于等于0.1mm的薄膜状；

将所述PCR反应管置于PCR扩增仪中设定以下反应条件进行PCR扩增：预变性温度设为93～95℃，预变性时间设为60s，变性温度设为93～95℃，变性时间设为0s，退火延伸温度设为56～58℃，退火延伸时间设为0s。

2.根据权利要求1所述的乙肝病毒核酸的快速扩增方法，其特征在于，所述PCR反应管的容纳腔为厚度小于等于0.1mm的扁平状容纳腔。

3.根据权利要求1所述的乙肝病毒核酸的快速扩增方法，其特征在于，所述PCR预混液还包括如SEQ No.3序列所示的第一探针。

4.根据权利要求3所述的乙肝病毒核酸的快速扩增方法，其特征在于，还包括以下步骤：在所述退火延伸和所述变性之间的升温变化过程中进行荧光采集。

5.根据权利要求3所述的乙肝病毒核酸的快速扩增方法，其特征在于，所述PCR预混液还包括ROX参比染料。

6.根据权利要求3所述的乙肝病毒核酸的快速扩增方法，其特征在于，所述第一探针的羧基端用FAM荧光基团修饰，羟基端用BHQ1淬灭基团修饰。

7.根据权利要求3所述的乙肝病毒核酸的快速扩增方法，其特征在于，所述PCR预混液还包括如SEQ No.4序列所示的DNA插入到pUC18T载体而构成的内标和如SEQ No.5序列所示的第二探针。

8.根据权利要求7所述的乙肝病毒核酸的快速扩增方法，其特征在于，所述第二探针的羧基端用HEX荧光基团修饰，羟基端用DABCYL淬灭基团修饰。

9.根据权利要求1～8任一项所述的乙肝病毒核酸的快速扩增方法，其特征在于，所述核酸释放剂中，莎梵婷的浓度为0.01～0.5mmol/L，氯化钾的浓度为50～200mmol/L，十二烷基磺酸钠的浓度为0.01～2g/100mL，乙醇的浓度为0.05～1mL/100mL。

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