DE10222275A1

DE10222275A1 - Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer flüssigen Probe

Info

Publication number: DE10222275A1
Application number: DE2002122275
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Goemann-Thos; Alexander Papra; Susanne Heins; Wilhelm Pluester; Renate Froendt
Original assignee: Eppendorf SE
Current assignee: Eppendorf SE
Priority date: 2002-05-18
Filing date: 2002-05-18
Publication date: 2003-12-04

Abstract

Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer flüssigen Probe mit folgenden Schritten: a) Vermischen der Probe mit einem Bindungspuffer, der so eingestellt ist, daß er die Löslichkeit der Nukleinsäuren soweit reduziert, daß die Nukleinsäuren kondensiert werden, b) Einleiten des Bindungspufferprobengemisches in einen Reaktionsraum, der von dem eingeleiteten Bindungspufferprobengemisch kontaktierte Innenwandbereiche aufweist, die mit einer Schicht von Polymerketten versehen sind und c) Entfernen des Bindungspufferprobengemisches aus dem Reaktionsraum.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus flüssigen Proben, das sich in besonders einfacher Weise im Miniaturmaßstab durchführen läßt.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß die die zu isolierenden Nukleinsäuren enthaltene flüssige Probe zunächst mit einem Bindungspuffer versetzt wird, der die Löslichkeit der Nukleinsäuren in dem Probenbindungspuffergemisch soweit erniedrigt, daß die Nukleinsäuren kondensiert werden. Bevorzugte Probenvolumina liegen zwischen 1 µl und 1 ml.

Unter Kondensation sollen alle durch äußere Umstände hervorgerufenen Konformationsänderungen verstanden werden, die Stauchungen des Nukleinsäuremoleküls bis hin zum unlöslichen Zustand umfassen. Die Stauchung des Nukleinsäuremoleküls geht einher mit abnehmender Flexibilität und zunehmender Komplexität der Molekülstruktur.

Vorzugsweise wird im Rahmen der Erfindung ein Bindungspuffer eingesetzt, der eine Substanz enthält, die die Löslichkeit des Nukleinsäuremoleküls reduziert. Es kann sich dabei insbesondere um PEG aber auch um z. B. Isopropanol oder dergleichen handeln. Bevorzugte Bindungspuffer enthalten zwischen 5% und 40% PEG (w/v; MW = 1000-500000 g/mol) und 0,5-4 M NaCl.

Denkbar ist aber auch, einen chaotropen Puffer mit einer bestimmten Salzkonzentration, z. B. ca. 2 M bis ca. 4 M einzusetzen.

Wichtig für das erfindungsgemäße Verfahren ist lediglich, daß der Bindungspuffer in der Lage ist, in den Nukleinsäurenmolekülen eine Konformationsänderung hervorzurufen, die einher geht mit einer Stauchung und einer Abnahme der Flexibilität des Moleküls.

In einem weiteren Schritt wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Bindungspufferprobengemisch ggf. nach kurzer Inkubation, in einen Reaktionsraum eingeleitet, der mit einer Schicht von Polymerketten versehene Innenwandbereiche aufweist, die nach Einleitung von dem Bindungspufferprobengemisch kontaktiert sind. Nach ggf. Inkubation über einen bestimmten Zeitraum wird das Bindungspufferprobengemische wieder aus dem Reaktionsraum entfernt, wobei ein Anteil der kondensierten Nukleinsäuremoleküle in der Polymerschicht zurückgehalten wird.

Der Reaktionsraum wird vorzugsweise mit einer Form ausgebildet, bei der das Flächenverhältnis der Innenwände zu dem von diesen umschlossenen Volumen groß ist. Um gute Ausbeuten zu erhalten ist es wichtig, daß möglichst große mit der Polymerkettenschicht versehene Innenwandbereiche mit möglichst wenig Bindungspufferprobengemisch kontaktiert werden können. Das Oberflächen/Volumenverhältnis des Reaktionsraums wird bevorzugt in einem Bereich von 0,01 cm²/µl bis 100 cm²/µl gewählt.

Ein geeigneter Reaktionsraum wäre daher z. B. der Innenraum einer Kanüle.

Bevorzugt wird der Reaktionsraum jedoch als Kanal oder flache Kavität in einem Kunststoffreaktionsgefäß (Einmalartikel) ausgebildet. Das Reaktionsgefäß kann dabei z. B. zwei den Kanal bzw. die Kavität kontaktierende Öffnungen aufweisen, die zum Befüllen und Entleeren des Reaktionsraumes dienen. Denkbar ist aber auch lediglich eine Öffnung zum Befüllen und Entleeren vorzusehen, wobei dann allerdings noch eine zusätzliche mit dem Raum kommunizierende Belüftungsöffnung vorgesehen sein muß.

Der Reaktionsraum und die mit ihm in Verbindung stehende mindestens eine Öffnung sind bevorzugt so beschaffen, daß sich der Reaktionsraum mit einer übliche Pipette befüllen und auch wieder entleeren läßt. Der hydrodynamische Widerstand im Inneren des Reaktionsraumes sollte also nicht zu groß sein.

Weiterhin sollte der Reaktionsraum möglichst so ausgebildet sein, daß er sich mittels einer laminaren Strömung befüllen läßt, um die Bildung von Luftblasen etc. beim Befüllen zu vermeiden.

Denkbar ist, den Reaktionsraum weiterhin als Durchflußraum auszubilden, bei dem durch eine Öffnung die Flüssigkeit hinein pipetiert und durch die andere Öffnung wieder abgezogen wird. Bevorzugt wird jedoch das Bindungspufferprobengemisch in die Kammer pipetiert und über eine bestimmte Dauer stehen gelassen und dann z. B. durch dieselbe Öffnung wieder entfernt.

Bevorzugt erfolgt eine Inkubation des Bindungspufferprobengemischs im Reaktionsraum über einen Zeitraum von 5 min bei Raumtemperatur. Geeignete Inkubationszeiten liegen zwischen O (Durchfluß) bis 60 min. Selbstverständlich können im Rahmen der Erfindung auch längere Zeiten zum Einsatz kommen, wobei aber davon auszugehen ist, daß damit kein nennenswerter Vortiel erzielbar ist. Bevorzugt eingesetzte Inkubationstemperaturen liegen im Bereich zwischen 15°C und 90°C.

Bei Kontakt des Bindungspufferprobengemisches mit der Polymerschicht in dem Reaktionsraum werden die kondensierten Nukleinsäuremoleküle wie oben erwähnt selektiv in der Schicht zurückgehalten. Da dieser Effekt mit unterschiedlichen Polymerketten unter unterschiedlichen Bedingungen (saurer pH-Wert, alkalischer pH-Wert) eintritt, wird zur Zeit davon ausgegangen, daß die Isolierung im wesentlichen auf mechanischen Effekten beruht.

Die an den Innenwandbereichen des Reaktionsraumes vorgesehene Polymerschicht besteht vorzugsweise aus einzelnen Ketten, die mit ihrem einen Ende an der Wand befestigt sind und deren anderes Ende frei ins Innere des Reaktionsraumes ragt.

Denkbar ist aber selbstverständlich auch, daß die Ketten untereinander teilweise vernetzt sind. Diese Vernetzung kann bis zur Ausbildung von hydrogelartigen Strukturen gehen, die ebenfalls im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können.

Es sind unterschiedliche Polymere zur Ausbildung der Ketten geeignet. Wichtig ist, daß die eingesetzten Polymere wasserlöslich sind und in Gegenwart des Bindungspufferprobengemisches nicht kollabieren, sondern in von dem Innenwandbereich abstehender Form vorliegen, wie z. B. in einer Polymer-Brush.

Geeignet sind, ohne daß diese Aufzählung abschließend ist, z. B. Polyacrylate, Polymethacrylate sowie deren Derivate, wie z. B. Aminoethylmethacrylate und Polyethlenglycolmethacrylate, Polyvinyile, Polyethylenglycole, Polysaccharide oder Polypeptide.

Die Herstellung der Polymerkettenschicht kann z. B. mittels eines Verfahrens erfolgen, das als Grafting bezeichnet wird. Dieses Verfahren ist gut beschrieben, und besteht im wesentlichen darin, daß an einer Oberfläche, die insbesondere aus Kunststoff besteht, ein Fotoinitiator absorbiert wird. Die Oberfläche wird dann mit einer Monomerlösung überschichtet und anschließend mittels UV-Strahlung eine radikale Polymerilisation an der Grenzfläche gestartet.

Es gibt noch weitere Möglichkeiten, Polymere auf Oberflächen anzuordnen, die dem Fachmann geläufig ist sind und auf die hier nicht weiter eingegangen werden soll.

Vorzugsweise wird die Polymerschicht auf der gesamten inneren Oberfläche, mindestens auf 50% der inneren Oberfläche, des Reaktionsraums vorgesehen, wobei die Molmasse der Polymere bevorzugt zwischen 3000 und 500000 g/mol liegen kann.

Die Verwendung von Polymer-Brushes zur Bindung und Detektion biologischer Moleküle wie z. B. Nukleinsäuren ist z. B. aus der WO 01/02452 bekannt. Dort werden Substrate beschrieben, auf deren Oberfläche eine Schicht aus Polymerketten vorgesehen ist. Die Polymerketten weisen zwei Enden auf, zwischen denen ein wasserlöslicher Zwischenbereich vorgesehen ist. Eines der Enden ist frei, während das andere an dem Substrat gebunden ist. In den wasserlöslichen Zwischenbereich sind funktionelle Gruppen vorgesehen, an die Sonden gebunden werden, die ihrerseits spezifisch Biomoleküle binden. Diese bekannten Polymer- Brushes sind für vollkommen andere Zwecke konzipiert, als die erfindungsgemäßen Reaktionsräume. Bei den bekannten Polymer-Brushes werden spezifisch Biomoleküle an dauerhaft mit der Polymer-Brush verbundenen Sondenmolekülen gekoppelt. Eine unspezifische Isolierung sämtlicher in einer flüssigen Probe enthaltenen Nukleinsäuren mit den bekannten Substraten ist nicht bekannt.

Bei der vorliegenden Erfindung hat sich überraschend herausgestellt, daß Schichten von Polymerketten auch ohne spezifische funktionalisierte Gruppen etc. in der Lage sind, Nukleinsäuremoleküle in kondensiertem Zustand zurück zuhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann theoretisch mit der Isolierung der kondensierten Nukleinsäuremoleküle in der Polymerkettenschicht enden. Denkbar wäre nach Entfernung des Bindungspufferprobengemisches aus dem Reaktionsraum z. B. gleich eine PCR oder dergleichen anzuschließen.

Üblicherweise wird man jedoch bevorzugt einen Waschschritt mit z. B. Ethanol, bevorzugt 50-100% Ethanol, besonders bevorzugt 75% Ethanol, oder dergleichen durchführen.

Anschließend an den Waschschritt kann sich dann ein Elutionsschritt, bei dem die Nukleinsäuren mittels eines geeigneten Elutionspuffers wie z. B. Wasser wieder in Lösung gebracht werden. Die gelösten Nukleinsäuremoleküle verlassen dann die Polymerkettenschicht und können mit dem Elutionspuffer aus dem Reaktionsraum entfernt und weiter verarbeitet werden. Das Volumen des eingesetzten Elutionspuffers liegt vorzugsweise zwischen dem 0,1 bis 10fachen des Volumens des Reaktionsraums.

Im folgenden soll die Erfindung anhand eines beispielhaften Arbeitsprotokolls näher erläutert werden:

1. Pro Probe werden 100 µl Blut mit 300 µl gekühltem PBS-Puffer versetzt, gut gemischt und 10 min auf Eis inkubiert.
2. Die Proben werden dann für 5 min bei 3500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird mit einer Pipette abgenommen.
3. Weist das Pellet noch eine stark rötliche Farbe auf, so sollten Schritt 1) und 2) wiederholt werden.
4. Das Pellet wird in 50 µl Lysispuffer (10 mM Tris-CI, pH 8, 0.1 M EDTA, pH 8, 0.5% (w/v) SDS) versetzt mit 5 µl Proteinase Lsg. (20 mg/ml in dd H2O) aufgenommen.
5. Das Probengemisch wird 15 min bei 70°C inkubiert.
6. Man läßt das Probengemisch abkühlen lassen und vermischt dann 1 : 1 mit (50 µl) Bindungspuffer (20% PEG 8000, 2.5 M NaCl).
7. Das Bindungspufferprobengemisch wird mit Hilfe einer 100 µl Pipette langsam in einen in einer Mikrokartusche in Form eines Kanals mit zwei Öffnungen ausgebildeten Reaktionsraum eingefüllt. Der Kanal hat mit einer Länge von ca. 100 mm, einem Bodendurchmesser von ca. 120 µm und einem oberen Durchmesser von ca. 300 µm ein Füllvolumen von ca 12 µl und eine innere Oberfläche von ca. 1,7 cm². Die innere Oberfläche ist im wesentlichen vollflächig mit einer Schicht aus Polyacrylsäure versehen, wobei die Polymere eine durchschnittliche Molmasse von ca. 50000 g/mol aufweisen. Beim Einfüllen läßt man bis auf die letzten 12 µl (maximales Füllvolumen des Reaktionsraums) die Lösung den Reaktionsraum im Durchfluss passieren. Die letzten 12 µl Probengemisch läßt man 5 min bei Raumtemperatur im Reaktionsraum inkubieren.
8. Die 12 µl Probengemisch werden mit Hilfe einer Pipette aus dem Reaktionsraum entfernt.
9. Der Reaktionsraum wird mit 100 µl 75%igem Ethanol im Durchfluss gespült.
10. Der Reaktionsraum wird mit Hilfe einer Pipette trocken gesaugt.
11. Der Reaktionsraum wird dann mit 12 µl dd H₂O befüllt und 5 min inkubiert (ggf. etwas erwärmen).
12. Das Wasser, in dem die DNA nun gelöst vorliegt, mit Hilfe einer Pipette entnehmen. Das Produkt kann jetzt in einer PCR weiter eingesetzt werden.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer flüssigen Probe mit folgenden Schritten:

a) Vermischen der Probe mit einem Bindungspuffer, der so eingestellt ist, daß er die Löslichkeit der Nukleinsäuren soweit reduziert, daß die Nukleinsäuren kondensiert werden, und

b) Einleiten des Bindungspufferprobengemisches in einen Reaktionsraum, der von dem eingeleiteten Bindungspufferprobengemisch kontaktierte Innenwandbereiche aufweist, die mit einer Schicht von Polymerketten versehen sind und

c) Entfernen des Bindungspufferprobengemisches aus dem Reaktionsraum.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verweildauer (Inkubation) des Bindungspufferprobengemischs im Reaktionsraum im Schritt b zwischen 0 min (Durchfluß) und 60 min beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation des des Bindungspufferprobengemischs im Reaktionsraum im Schritt b bei Temperaturen zwischen 15°C und 90°C erfolgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß sich ein Waschschritt anschließt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Waschschritt mit Ethanol erfolgt, vorzugsweise mit 50-100% Ethanol, besonders bevorzugt mit 75% Ethanol.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß nach Entfernen des Bindungspufferprobengemisches und dem ggf. vorgesehen Waschschritt in den Reaktionsraum ein Elutionspuffer gegeben wird, der die Nukleinsäuren wieder in den löslichen Zustand überführt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen des eingesetzten Elutionspuffers zwischen dem 0,1 und 10fachen des Volumens des Reaktionsraums liegt.

8. Verfahren nach einen der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerketten in einem im wesentlichen nicht vernetzten Zustand in der Schicht vorgesehen sind, wobei ihr eines freies Ende an dem Innenwandbereich befestigt ist und das andere Ende von diesem absteht.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerketten in Form eines Hydrogels vorliegen.

10. Verfahren nach einen der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerketten eine Molmasse zwischen 3000 g/mol und 500000 g/mol aufweisen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionsraum in einem Reaktionsgefäß ausgebildet ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionsraum in Form eines Kanals oder einer flachen Kavität ausgebildet ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der inneren Oberfläche des Reaktionsraums zu seinem Volumen zwischen 0,01 bis 100 cm²/µl liegt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens 50% der inneren Oberfläche des Reaktionsraums mit der Polymerschicht versehen sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspuffer PEG enhält.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspuffer zwischen 5-40% PEG mit einem MW zwischen 1000 bis 500000 g/mol und 0,5-4 M NaCl enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspuffer zwischen 20% PEG mit einem MW von 8000 g/mol und 2,5 M NaCl enthält.