DE10018788A1 - Prozessieren von Proteinen aus Gelen für massenspektrometrische Analysen - Google Patents
Prozessieren von Proteinen aus Gelen für massenspektrometrische AnalysenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen für den Verdau von kleinsten Proteinmengen in ausgeschnittenen Gelstückchen und für das Extrahieren der Verdaupeptide als Vorbereitung für eine massenspektrometrische Analyse. DOLLAR A Die Erfindung besteht darin, einen enzymatischen Verdau der Proteine innerhalb der Gelstückchen wandberührungsarm vorzunehmen und die Verdaupeptide anschließend durch mildes Zentrifugieren in Gefäßen mit durchlässigen, aber lyophoben Böden schnell und praktisch vollständig aus den Gelstückchen und aus den Gefäßen zu entfernen. Es ist vorteilhaft, die Peptide dann möglichst rasch an geeigneten Oberflächen reversibel zu binden. Die Gefäßböden können dafür peptidanlagernde Strukturen enthalten, die sich zum Waschen und späteren Eluieren der Peptide eignen. Eine Vielzahl von Gefäßen kann zu Platten zusammengeschlossen sein, die beispielsweise die Größe von Mikrotiterplatten besitzen.
Description
Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen für den Verdau von kleinsten Proteinmen
gen in ausgeschnittenen Gelstückchen und für das Extrahieren der Verdaupeptide als Vorbe
reitung für eine massenspektrometrische Analyse.
Die Erfindung besteht darin, einen enzymatischen Verdau der Proteine innerhalb der Gelstück
chen wandberührungsarm vorzunehmen und die Verdaupeptide anschließend durch mildes
Zentrifugieren in Gefäßen mit durchlässigen, aber lyophoben Böden schnell und praktisch
vollständig aus den Gelstückchen und aus den Gefäßen zu entfernen. Es ist vorteilhaft, die
Peptide dann möglichst rasch an geeigneten Oberflächen reversibel zu binden. Die Gefäßböden
können dafür peptidanlagernde Strukturen enthalten, die sich zum Waschen und späteren
Eluieren der Peptide eignen. Eine Vielzahl von Gefäßen können zu Platten zusammengeschlos
sen sein, die beispielsweise die Größe von Mikrotiterplatten besitzen.
Die zweidimensionale Gel-Elektrophorese gehört immer noch zu den besten und verbreitesten
Methoden der Trennung der Proteine eines Zellverbands, dem so genannten "Proteom". Die
Massenspektrometrie bietet die empfindlichsten Methoden zur Identifizierung und Strukturauf
klärung der einzelnen Proteine, wobei ein enzymatischer Verdau der Proteine zu Peptiden
vorgeschaltet wird. Das Verfahren und die dabei auftretenden Schwierigkeiten seien hier kurz
beschrieben.
Die Proteine werden nach ihrer Trennung im Gel angefärbt, kleine Gelstücke mit dem Protein
von Interesse werden um den Färbepunkt herum ausgeschnitten oder ausgestanzt. Die Gelstü
cke werden in ein kleines Gefäß gegeben und dort entfärbt. Auffüllen mit einer Enzymlösung
(beispielsweise Trypsin) führt zu einem gezielten Verdau an durch das Enzym vorgegebenen
Schnittstellen. Die Verdaupeptide haben bei Anwendung von Trypsin, das genau an zwei
bestimmten Aminosäuren schneidet, ein mittleres Molekulargewicht von etwa 1000 atomaren
Masseneinheiten mit breiter Streuung, die präzisen Massen der Verdaupeptide charakterisieren
das Protein meist eindeutig. Die Verdaupeptide können im Gel diffundieren, sie wandern durch
Diffusion langsam (in einigen Stunden) aus dem Gel in die umgebende Flüssigkeit.
Die in der Flüssigkeit enthaltenen Verdaupeptide werden gereinigt einer geeigneten massen
spektrometrischen Messmethode zugeführt. Die Ionisierung erfolgt dabei in der Regel durch so
genannte matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI), die Messung der präzisen Massen der
Verdaupeptide in einem Flugzeitmassenspektrometer (TOF). Andere Methoden der Ionisierung
sind bekannt und werden ebenfalls angewandt, meist mit Nachweis durch andere Arten von
Massenspektrometern. Für die MALDI-TOF-Analyse werden die Verdaupeptide auf geeigne
ten Probenträgern in kleine Kristalle von Matrixsubstanzen eingebracht und dort im Massenspektrometer
mit Laserpulsen beschossen. Über die Flugzeit der Ionen im TOF wird ihre präzi
se Masse bestimmt.
Auch wenn beim Prozessieren einige der Verdaupeptide verlorengehen, ergeben die präzise
gemessenen Massenwerte der noch verfügbaren Verdaupeptide mit geeigneten Suchprogram
men für Proteinsequenzdatenbanken überwiegend eine eindeutige Identifizierung des Proteins.
Mehrdeutige Identifizierungen können durch weitergehende Messungen von Fragmenten ein
zelner Verdaupeptide, die mit besonderen Methoden erzeugt werden und Aufklärung über
deren interne Struktur geben, aufgeklärt werden. Identifizierung in diesem Sinne heißt, dass
das Protein, wenn bekannt, mit einem Namen, einer Code-Bezeichnung, einer Herkunft und
einer Molekularstruktur belegt werden kann.
Auf die Messung von Fragmentionen und die weitergehenden Methoden zur de-novo-Sequen
zierung von Proteinen wird hier nicht weiter eingegangen.
Stand einige Jahre lang eine solch einfache Identifizierung der Proteine im Vordergrund, so
interessieren heute mehr und mehr die Unterschiede, die die untersuchten Proteine zu denen in
der Datenbank aufweisen. Diese Unterschiede beruhen auf mutativen oder posttranslationalen
Veränderungen der Proteine, heute und in Zukunft Brennpunkt des Interesses. Dazu ist es aber
erforderlich, nicht nur einige der Verdaupeptide messen zu können - was für eine reine Identi
fizierung meist ausreicht - sondern möglichst ausnahmslos alle Verdaupeptide. Bei dem oben
kurz geschilderten Verfahren gehen jedoch viele Verdaupeptide durch Wandadsorptionen
verloren.
Es interessieren dabei nicht nur die sehr konzentriert vorkommenden Proteine, die in Mengen
von etwa 10 bis 100 Picomol im Gel enthalten sind. Es interessieren häufig besonders die
Proteine kleiner Konzentrationen, die nur mit 10 bis 100 Femtomol vorhanden sind. Wenn nun
ein Verdaupeptid von beispielsweise 20 Femtomol Menge in 20 Mikroliter umgebende Flüs
sigkeit austritt, werden die einzelnen Verdaumoleküle dabei in der Flüssigkeit umherschwim
men und dabei im Stunden dauernden Diffusionsprozess vielfach mit der Wand des Gefäßes in
Berührung kommen. Diese Flüssigkeitsmenge von 20 Mikrolitern hat in einem kleinen Gefäß
von etwa drei Millimetern Durchmesser eine Wandberührungsfläche von etwa 40 Quadratmilli
metern. Ist diese Wand adsorptiv für eines der Verdaupeptide, so wird sie sich mindestens
monomolekular mit diesem Verdaupeptid bedecken. Dabei kann sie in dieser monomolekularen
Bedeckungsschicht insgesamt etwa 40 Picomol an Verdaupeptid des Molgewichts von 1000
atomaren Masseneinheiten aufnehmen, also etwa das 2000-fache dessen, was in unserem Bei
spiel überhaupt in der Lösung zur Verfügung steht. Selbst wenn die Adsorptivität der Gefäß
wand durch geeignete Maßnahmen auf ein Tausendstel reduziert werden könnte, würde immer
noch das interessierende Verdaupeptid vollständig adsorbiert werden können, und es wäre das
Peptid - im Falle einer häufig vorliegenden irreversiblen Bindung - durch keine Maßnahme
wieder in Lösung zu bringen.
Das hier gerechnete Beispiel von 20 Mikrolitern Probelösung betrifft eine Lösungsmenge, die
heute als groß erachtet wird. Geht man auf einen Mikroliter oder sogar 100 Nanoliter über (mit
gleicher Konzentration der Analytmoleküle), so steigen die Einflüsse der Wandkontakte noch
mals dramatisch an.
Es ist charakteristisch für die moderne Biochemie und Molekularbiologie, dass Proben in
großer Anzahl simultan prozessiert werden. Ein sichtbarerer Exponent dieser Entwicklung ist
die sogenannte Mikrotiterplatte mit ihren zunächst 96, dann 384 und jetzt 1536 Reaktionsge
fäßen. In jüngster Zeit wurde eine NanoWellTM-Platte mit 3456 Reaktionsgefäßen vorgestellt.
Eine Erhöhung dieser Anzahl ist nur eine Frage der Zeit und der zur Verfügung gestellten
Werkzeuge für das Prozessieren. Für die bisher üblichen Mikrotiterplatten sind entsprechende
Pipettier- und Bearbeitungsroboter mit Ablagesystemen für viele Mikrotiterplatten, mit Barco
de-Kennzeichnungen, mit Multipipettenköpfen und Mehrfachdispensersystemen entwickelt
worden.
Die benötigten Mengen an Probenmolekülen für die chemische, enzymatische und analytische
Prozessierung sind dabei immer geringer geworden, so dass auch Proteine mit sehr kleinen
Konzentrationen gemessen werden können. Die Prozessierung ist längst vom Nanomolbereich
in den Pico-, Femto- und sogar Attomolbereich vorgedrungen. Nachteilig ist aber, dass mit der
fortschreitenden Verkleinerung der prozessierten Flüssigkeitsmengen der relative Wandanteil
der umschließenden Cavitäten in Bezug auf das Volumen immer größer wird. Damit werden
chemische und physikalische Einflüsse der Cavitätswände auf das Prozessierungsgeschehen
immer kritischer.
Die Mikrotiterplatte bildet auch die ideale Grundlage für das Prozessieren der Proteine eines
Proteoms, beipielsweise in Verbindung mit einem automatisch arbeitenden Gel-Ausstecher.
Bisherige Mikrotiterplatten fangen aber einen großen Teil der Verdaupeptide weg.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, Verfahren und Vorrichtungen für die Probenvorbereitung
kleinster Proteinmengen aus Gelstückchen für die massenspektrometrische Analyse zu finden,
die sich durch besonders geringe Verluste an verlustgefährdeten Peptiden durch Wandadsorp
tion und hohe Ausbeute für alle Peptide auszeichnen.
Das Verfahren der Erfindung unter Benutzung von proteinhaltigen Gelstückchen und einem
enzymatischen, gelinternen Verdau der Proteine besteht im Einzelnen aus folgenden Schritten:
- 1. die Gelstückchen mit den Proteinen werden in Gefäße mit lyophob-porösem Boden einge füllt,
- 2. den Gelstückchen wird Enzymlösung zugegeben, aber nur so viel, wie von den Gelstück chen aufgenommen werden kann,
- 3. die Proteine in den Gelstückchen werden verdaut, und
- 4. die Gefäße mit den Gelstückchen werden zentrifugiert, so dass die Enzymlösung mit den Verdaupeptiden aus den Gelstückchen ausgepresst und aus den Gefäßen ausgeschleudert wird.
Besonders günstig ist es, wenn die Verdaupeptide in der ausgepressten Enzymlösung sofort an
reversibel peptidadsorptiven Oberflächen adsorbiert werden, so dass sie keiner unkontrollierten
Wandadsorption mehr zugänglich sind.
Unter einer lyophoben Oberfläche wird hier eine Fläche verstanden, die nicht nur wasserabwei
send ist (also nicht nur hydrophob), sondern auch abweisend für die in der Peptidchemie ver
wendeten organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Methylalkohol oder Acetonitril, zu
mindest in wässriger Lösung über weite Konzentrationsbereiche.
Die Vorrichtung der Erfindung besteht darin, die Gefäße mit den lyophob porösen Böden
bereitzustellen, wobei die Porösität der Böden durch eine oder mehrere lyophobisierte Kapil
larkanäle hergestellt wird. Diese können mit vliesartigen Membranen, Teilchenpackungen,
frittenartigen Strukturen oder offenporigen Festkörperschäumen verschlossen sein. Es können
viele Gefäße mit jeweils porösen Böden in einer Platte vereinigt sein, beispielsweise in der
Größe einer Mikrotiterplatte. Die Membranen, Teilchenpackungen, Fritten oder Festkörper
schäume dienen durch besondere Präparationen ihrer Oberflächen als Adsorptivoberflächen für
die Bindung der Peptide. Die kapillaren Kanäle in den Böden der Gefäße sind lyophobisiert,
um durch abstoßende Kapillarwirkung ein Ablaufen von frisch eingefüllten Flüssigkeiten aus
den Gefäßen unter normaler Schwerkraft zu verhindern, unter Zentrifugalkraft aber zu ermög
lichen. Die inneren Oberflächen der Gefäße können dabei ebenfalls lyophobisiert sein, um ein
schnelles Zusammenlaufen von Flüssigkeiten an diesen Oberflächen und ein schnelles Ablaufen
unter der Wirkung der Zentrifugalkräfte zu bewirken. Außerdem bewirken lyophobisierte
Oberflächen einen geringeren Wandkontakt, da berührende Flüssigkeiten an der Wand nicht
benetzend auseinanderlaufen.
Das Verfahren nach der Erfindung hat grundsätzlich das Ziel, die molekularen Wandkontakte
der gelösten Verdaupeptide, die proportional zum Produkt aus Wandberührungsfläche der
Lösung und Berührungsdauer sind, möglichst gering zu halten. Die Peptide werden dann nach
dem Verdau des Proteins möglichst rasch reversibel an geeigneten Oberflächen gebunden, so
dass sie baldmöglichst weiteren unkontrollierten Wandkontakten entzogen werden; das Ver
fahren wird dabei durch die Vorrichtung nach dieser Erfindung unterstützt. Die gewollte Bin
dung an geeignete Oberflächen erlaubt weiteres Prozessieren der Peptide wie beispielsweise
Waschen, und die Reversibilität der Bindung erlaubt die Zuführung der Peptide zu massenspektrometrischen
Messmethoden, beispielsweise die Überführung auf geeignete massenspek
trometrische MALDI-Probenträger.
Es ist besonders vorteilhaft, die Gelstückchen vor oder nach dem Einfüllen in Schritt 1) des
Verfahrens teilweise von der Quellflüssigkeit zu befreien. Die Quellflüssigkeit kann aus den
Gelen beispielsweise nach dem Einfüllen in die Gefäße durch Zentrifugieren, besser aber noch
durch partielles Vakuumtrocknen teilweise entfernt werden. Das Vakuumtrocknen ergibt eine
offenporige Struktur des Geh, günstig für die Aufnahme der Enzymlösung in Schritt 2); das
Trocknen darf jedoch nicht zu vollkommen getrockneten Gelen führen, da diese die Flüssigkeit
sehr schlecht wieder aufnehmen.
Die Zugabe der Enzymlösung in Schritt 2) des Verfahrens kann durch Pipettieren, gegebenen
falls mit Vielkopfpipetten, aber auch durch berührungsloses Dispensieren mit Piezo- oder
Solenoiddispensern vorgenommen werden. Die Aufnahme der Enzymlösung durch Quellen der
partiell getrockneten, porösen Gelstückchen bringt die Enzyme schnell und gleichmäßig in die
Gelstückchen, was bei nicht partiell getrockneten Gelen durch die dann notwendige Diffusion
der Enzyme nicht der Fall ist. Nach dem Aufsaugen der Enzymlösung durch das Gelstückchen
bestehen nur noch minimale Berührungsflächen mit der Wand des Gefäßes. Da innerhalb der
Gelstückchen die Diffusion der in Schritt 3) produzierten Verdaupeptide behindert ist, werden
die Verluste durch Wandadsorption vernachlässigbar klein.
Der Verdau in Schritt 3) des Verfahrens wird durch Erwärmen der Gefäße (Inkubieren) auf
Verdautemperatur begünstigt, bei optimaler Temperatur ist der Verdauvorgang in etwa zwei
bis vier Stunden abgeschlossen. Der Verdau ist somit der zeitbestimmende Schritt. Die Gefäße
sind während des Inkubierens gut zu verschließen, um ein Austrocknen der Gelstückchen zu
verhindern.
In Schritt 4) wird dann die Enzymflüssigkeit mit den Verdaupeptiden durch die Zentrifugal
kraft aus den Gelstückchen in Sekunden ausgetrieben und sofort durch die porösen Böden in
darunterliegende Gefäße ein- oder auf massenspektrometrische Probenträger aufgebracht. Es
genügen sehr moderate Zentrifugierbedingungen mit etwa 2000 Umdrehungen pro Minute.
Danach oder währenddessen können die Peptide an Oberflächen gebunden werden, entweder
an porösen Strukturen der Gefäßböden, an Oberflächen von Partikeln, die sich in den Auffang
gefäßen befinden, oder an Oberflächenbereichen der Probenträgerplatten. Die Partikel in den
Auffanggefäßen können beispielsweise magnetische Kügelchen mit geeignet präparierten Ober
flächen sein; diese lassen sich durch magnetische Kräfte halten oder sogar in bekannter Weise
durch wechselnde Magnetfelder hin und her durch die Waschflüssigkeiten ziehen. Im Fall der
Probenträger können Bereiche der Oberfläche mit adsorptiven Schichten, beispielsweise mit
Alkanketten C18, belegt sein, um ein anschließendes Waschen ermöglichen.
Die oberflächengebundenen Peptide können nach Abschluss des erfindungsgemäßen Verfah
rens in üblicher Form gewaschen und so von den Enzymen, Puffern, Salzen und allen übrigen
Verunreinigungen befreit werden. Durch eine Eluatlösung, beispielsweise 30% Acetonitril in
ionenfreiem Wasser, können die Peptide von den Oberflächen abgelöst der Massenspektro
metrie zugeführt, beispielsweise auf massenspektrometrisch eingesetzte Probenträger überführt
werden.
Auch ein sofortiges, direktes Aufbringen der Peptide auf MALDI-Probenträgerplatten während
des Zentrifugierens ohne eine adsorptive Bindung ist möglich, beispielsweise auf mit MALDI-
Matrixsubstanzen vorpräparierten Platten. Dabei ist es wiederum günstig, wenn in der Enzym
lösung für den Verdau keine alkalimetallischen Salze als Puffer vorhanden sind; diese können
für diesen Fall beispielsweise durch Ammoniumbikarbonat ersetzt werden.
Abb. 1 zeigt eine übliche Mikrotiterplatte nach dem Stande der Technik, hier mit 96
Gefäßen, die es aber auch mit 384, 1536 oder sogar mehr Gefäßen gibt.
Abb. 2 zeigt einen Querschnitt durch eine 384-Mikrotiterplatte nach dieser Erfindung mit
mit je einem lyophobisierten, kapillaren Kanal im Gefäßboden. Die Kanäle enthalten keine
chromatographische Packung. Gefäßdurchmesser ist hier 1,8 Millimeter, Kanaldurchmesser 0,2
Millimeter. Eingefüllte Flüssigkeiten werden durch abstoßende Kapillarkräfte im kapillaren
Kanal am Auslaufen gehindert. Erst Zentrifugieren kann die Kapillarkräfte überwinden und die
Flüssigkeit ausschleudern.
Abb. 3 zeigt einen vergrößerten Querschnitt durch eine 384-Mikrotiterplatte mit ausge
stanzten Gelstückchen in ihren Gefäßen, wobei die lyophoben Kanäle in leichten Erweiterun
gen chromatographische Packungen enthalten. Es handelt sich bei den Packungen um einen
offenporigen Festkörperschaum mit peptidadsorptiven Eigenschaften, der an Ort und Stelle
aufgeschäumt und polymerisiert wurde und eine feste Bindung mit der Wand hat, so dass er
das Zentrifugieren übersteht.
Es werde hier von zweidimensionaler Gelelektrophorese als Separationsverfahren für die Pro
teine ausgegangen. Es ist aber das Verfahren auch auf eindimensionale Geltrennungen ver
schiedener Art, also beispielsweise nur nach isoelektischem Punkt oder nur nach elektrophore
tischer Mobilität, anwendbar.
Ein besonders vorteilhaftes Verfahren bedient sich eines Stanzroboters, der die proteinhaltigen
Gelstückchen auf Grund ihrer Anfärbung automatisch erkennt, aus dem feuchten Gel ausstanzt
und in die Gefäße mit den porösen Böden einfüllt. Solche Stanzroboter sind in ersten Ausfüh
rungsformen bereits kommerziell erhältlich; sie enthalten zylindrische Hohlstanzer mit Durchmessern
zwischen 0,8 und 2 Millimetern, die ein rundes Stückchen Gel ausstanzen können. Die
Hohlstanzer befinden sich anstelle von Pipetten an beweglichen Köpfen, die die ausgestanzten
Gelstückchen vorteilhafterweise mit einer Pipettierflüssigkeit, weniger vorteilhaft mit Gas,
wieder aus den Hohlstanzern ausstoßen und so in den Gefäßen ablegen können. Die Stanzro
boter enthalten Kameras oder Scanner und eine Erkennungssoftware für die angefärbten Fle
cken; manuelle Nachbearbeitung am Bildschirm oder automatisch arbeitende Vergleichspro
gramme für mehrere Gele erlauben, bestimmte Auswahlen an Flecken und damit Proteinen zu
treffen.
Für geringere Anzahlen an Proteinen können auch mit gutem Erfolg Handstanzer eingesetzt
werden, die aber eine gut geführte manuelle Dokumentation der Gelpositionen und der Gefäß
codierungen erfordern, die bei Stanzrobotern automatisch anfällt.
Die Stanzer können zwischen den Stanzvorgängen gewaschen werden, es hat sich aber in der
Praxis erwiesen, dass eine Übertragung von Proteinen von einem Gelstückchen zum nächsten
praktisch nicht stattfindet.
Als Gefäße dienen zweckmäßigerweise die Cavitäten einer entsprechend der Erfindung aus
gestalteten Mikrotiterplatte. Diese kann 96, 384, 864 oder sogar 1536 Cavitäten im Raster von
9, 4,5, 3 oder 2,25 Millimeter enthalten; wobei die Durchmesser der Cavitäten etwa bei 1,5
bis 2 Millimetern liegen. Die Böden der Cavitäten sind so mit lyophobisierten Kanälen ausges
tattet, dass Flüssigkeiten unter der Wirkung normaler Schwerkraft nicht ausfließen können,
wohl aber unter der viel höheren Zentrifugalkraft einer Zentrifuge. Günstige Durchmesser der
kapillaren Kanäle sind etwa 0,2 bis 0,3 Millimeter.
Die Entwicklung der Mikrotiterplatten geht zu immer höheren Dichten an Cavitäten, wobei der
ursprüngliche Rasterabstand von neun Millimetern mit fortschreitend höheren Zahlen ganzzah
lig geteilt wird.
Zweckmäßigerweise wird zum Ausstoßen der Gelstückchen bereits eine Pipettierflüssigkeit
verwendet, die die Anfärbungen der Proteine beseitigt, sofern diese Anfärbungen einer späteren
massenspektrometrischen Analyse im Wege stehen. Nach Entfärbung der Gelstückchen wird
dann ein erstes Mal zentrifugiert, jedoch sehr vorsichtig, um nicht die Gelstückchen vollkom
men platt zu pressen. Es können ein oder mehrere Waschvorgänge folgen, die jedes Mal aus
Zupipettieren, Quellen und Zentrifugieren bestehen. Für diese und die folgenden Pipettier
schritte wird zweckmäßigerweise eine Vielkopfpipette mit beispielsweise 96 oder sogar 384
Pipetten benutzt, um mit wenigen Pipettierschritten alle Gefäße zu befüllen.
Sind die Gelstückchen genügend gewaschen, so werden sie teilweise von der Quellflüssigkeit
befreit. Das kann zunächst durch vorsichtiges Zentrifugieren wie schon bei den Waschvorgän
gen geschehen, und wird vorzugsweise durch partielles Vakuumtrocknen ergänzt. Ein schnel
les, kurzzeitiges Vakuumtrocknen bringt die Quellflüssigkeit zum Sieden unter erniedrigtem
Druck; die Siedeperlen erzeugen eine offenporige Struktur des Gels, günstig für die Aufnahme
der Enzymlösung im nächsten Schritt. Das Trocknen darf jedoch nicht zu vollkommen ausge
trockneten Gelen führen, da diese die Flüssigkeit sehr schlecht wieder aufnehmen.
Die Zugabe der Enzymlösung in Schritt 2) des Verfahrens kann durch wiederum durch Pipet
tieren erfolgen, wobei die Abgabe der geringen Menge an Enzymlösung ein Berühren des Gels
durch die Pipettiertröpfchen verlangt. Die Praxis zeigt, dass dabei praktisch keine Proteine von
einem Gelstückchen mit den Pipettenspitzen zum nächsten übertragen werden. Bei der Benut
zung von Vielkopfpipetten wird diese Gefahr nochmals herabgesetzt, weil nur wenige Pipettier
schritte erforderlich sind und ein Waschen der Pipettenspitzen zwischendurch ohne wesentliche
Zeitverluste möglich ist. Es kann die Enzymlösung aber auch durch berührungsloses Dispensie
ren mit Piezo- oder Solenoiddispensern zugeführt werden, um jede Verschleppung von Prote
inspuren von einem Gelstückchen zum anderen sicher zu vermeiden.
Die Aufnahme der Enzymlösung durch kapillares Eindringen und Quellen der partiell getrock
neten und leicht porösen Gelstückchen bringt die Enzyme schnell und gleichmäßig in die Gel
stückchen, was bei nicht partiell getrockneten Gelen durch die dann notwendige, langsame
Diffusion der Enzyme nicht so vorteilhaft der Fall ist.
Nach dem Aufsaugen der Enzymlösung durch das Gelstückchen bestehen nur noch minimale
Berührungsflächen der Enzymlösung mit der Wand des Gefäßes. Eine Lyophobisierung der
Wandflächen verringert diese Berührungsflächen nochmals, da kein Auseinanderlaufen der
Flüssigkeit durch Benetzung der Oberfläche stattfindet. Die Wandkontakte der allmählich
entstehenden Verdaupeptide sind einerseits durch die Verkleinerung der Berührungsflächen,
andererseits dadurch herabgesetzt, dass innerhalb der Gelstückchen die Diffusion der Verdau
peptide stark behindert ist. Somit werden die Verluste durch Wandadsorption vernachlässigbar
klein.
Der Verdau der Proteine an den durch das Enzym vorgegebenen Schnittstellen wird durch
Erwärmen der Gefäße auf eine günstige Verdautemperatur eingeleitet und begünstigt; der
Verdauvorgang durch Trypsin beispielsweise ist bei einer optimalen Temperatur von 37°C in
etwa zwei bis vier Stunden abgeschlossen. Die Gefäße sind während des Inkubierens gut zu
verschließen, um ein Austrocknen der Gelstückchen zu verhindern. Der Verdau durch Inkubie
ren ist aber nach wie vor der zeitbestimmende Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die
gelinterne Verdauung ist besonders effektiv, da die Proteine vollkommen entfaltet vorliegen
und einem Angriff der Enzyme daher ohne schützende Faltung der Proteine ausgesetzt sind.
Außerdem zeigt die Erfahrung, dass der Selbstverdau der Enzyme im Gel gemindert ist.
Nach dem Verdau wird die Enzymflüssigkeit mit den Verdaupeptiden durch Zentrifugalkraft
aus den Gelstückchen ausgetrieben. Dazu sind nur einige Sekunden erforderlich. Die Flüssig
keit tritt sofort durch die porösen Böden in in darunterliegende Auffanggefäße. Es genügen
sehr moderate Zentrifugierbedingungen mit etwa 2000 Umdrehungen pro Minute, um den
größten Teil der Flüssigkeit auszutreiben; Ultrazentrifugen sind nicht notwendig oder sogar
schädlich.
In einer Ausführungsform werden die Enzymlösungen mit den Verdaupeptiden direkt auf die
unterliegenden, mit Matrixsubstanzen vorpräparierten Probenträgerplatten für die massen
spektrometrische Analyse aufgebracht. Dort werden sie eingetrocknet und sind dann fertig für
die Analyse. Dabei können sich auf den Platten lyophile Anker in lyophober Umgebung befin
den, um die Lösungen aus den verschiedenen Gefäßen voneinander zu trennen.
In einer weiteren Ausführungsform befinden sich auf den lyophilen Ankern der Probenträger
platten chemisch kovalent gebundene Belegungen mit Alkanketten, beispielsweise C18, die die
Verdaupeptide reversibel adsorbieren. Die Peptide können dann gewaschen und besonders von
allen alkalimetallischen Ionen befreit werden. Durch Zugabe einer in wässriger Acetonitrillö
sung gelösten Matrixsubstanz und anschließendem Eintrocknen kann die Präparation für die
massenspektrometrische Analyse mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption
(MALDI) abgeschlossen werden.
Die Peptide werden in einer anderen Ausführungsform des Verfahrens an die Oberflächen der
porösen Strukturen der Gefäßböden gebunden. Dazu sind die Böden der Cavitäten in besonde
rer Form auszubilden. Die kapillaren Bohrungen werden mit Packungen von chromatographi
schen Phasen versehen, wie in Abb. 3 sichtbar. Dabei können viele der in der Flüssig
keitschromatographie verwendeten Phasen zur Anwendung kommen, insbesondere Umkehr
phasen für Umkehrphasen-Chromatographie und Affinitätsphasen. Die Belegung sollte den
oberen, lyophobisierten Eingang der kapillaren Bohrungen frei halten, damit die zum Teil sehr
hydrophilen Phasen eingefüllte Flüssigkeiten aus den Cavitäten nicht sofort aufsaugen und zum
Auslaufen bringen. Eine Erweiterung der Kapillaren im unteren Bereich zum Einfüllen der
chromatographischen Phasen erleichtert das Einbringen der Phasen.
Die Mikrotiterplatten mit den porösen, lyophoben Kanälen können aus Metall oder Kunststoff
gefertigt sein. Die kapillaren Kanäle können bereits durch die Matrizenform für die Herstellung
der Mikrotiterplatten vorgegeben sein, aber auch später durch Bohren oder Laserbohren hin
zugefügt werden. Es hat sich in der Praxis gezeigt, dass die Gelstückchen auch bei glatten
Bodenformen der Gefäße nicht in der Lage sind, die Kanalausgänge aus den Gefäßen so zu
verschließen, dass keine Flüssigkeit mehr ausfließt. Es ist aber vorteilhaft, die Gefäßböden um
die Bohrungen herum mit schmalen, reliefartig erhabenen Rippen oder vertieften Rillen zu
versehen, die ein Ablaufen der Flüssigkeit beim Zentrifugieren begünstigen.
Unter einer lyophoben Oberfläche wird hier eine Fläche verstanden, die nicht nur Wasser ab
weist (also nicht nur hydrophob ist), sondern auch die meisten organischen Lösungsmittel wie
beispielsweise Methylalkohol, Aceton oder Acetonitril.
Es sind in jüngster Zeit mehrere Verfahren zur Erzeugung extrem lyophober Oberflächen
bekannt geworden, die sich für die Lyophobisierung der Kanaloberflächen, der Gefäßwände
oder sogar der ganzen Mikrotiterplatten einsetzen lassen; die bekannteste ist die Beschichtung
mit perfluorierten Substanzen wie PTFE (beispielsweise mit Teflon®). Diese sind nicht nur
hydrophob, sondern auch oliophob. Während man früher annahm, dass sich Hydrophobie und
Oliophobie gegenseitig ausschlössen, ist der Gegensatz heute durch neuere Kenntnisse aufge
hoben. Zu den lyophobisierenden Mitteln gehören aber auch die neuartigen organisch-anorga
nischen Sol-Gel Nanocompositmaterialien (DE 41 18 184), siehe beispielsweise R. Kasemann,
H. Schmidt, S. Brück, Bol. Soc. Esp. Ceram. Vid. 31-6, Vol. 7, (1992), 75. Diese Nanocom
positmaterialien lassen sich auf Metallen, Glas oder Kunststoffen als wenige Mikrometer dün
ne, kratzfeste Schichten einbrennen. Auch Beschichtungen mit PTFE lassen sich durch Zugabe
keramischer Bestandteile höchst kratzfest machen. Formteile aus geeigneten Kunststoffen wie
beispielsweise Polyethylen lassen sich auch oberflächlich in einem durch elektrische Entladung
erzeugten Fluorplasma perfluorieren, wodurch ebenfalls eine lyophobe Oberfläche ausgebildet
wird.
Die Beschichtungen mit Lotos-Effekt (W. Barthlott und C. Neinhuis, "Purity of the sacred
lotus, or escape from contamination in biological surfaces", Planta 202 (1997), 1) gehören nur
bedingt zu dieser Gruppe der gleichzeitig hydrophoben und oliophoben Oberflächen. Sie ver
stärken lediglich den abweisenden Effekt einer an sich bereits hydrophoben oder lyophoben
Oberfläche durch eine besondere Art der Mikrostrukturierung. Diese Verstärkung der Lyo
phobizität kann in den Gefäßen und Kanälen nach dieser Erfindung ebenfalls eingesetzt wer
den.
Für die Bindung der Peptide und ihre Reinigung sind in der jüngsten Zeit besondere, offenpori
ge Festschäume bekannt geworden, beispielsweise PorosTM als Kügelchen oder ZipTipTM als
chromatographische Füllungen in Pipettenspitzen. Diese offenporigen Festschäume bestehen
aus Polymeren, die als Monomerlösungen in die kapillaren Bohrungen eingebracht, dort aufge
schäumt und auspolymerisiert werden können (wie in Abb. 3 dargestellt). Sie eignen sich
besonders gut und bequem für das Binden und Reinigen von Peptiden. Diese Packungen kön
nen einige Male regeneriert werden, es ist also eine beschränkte Wiederverwendbarkeit der
Mikrotiterplatten zu erreichen.
Durch Eluierungslösungen wie beispielsweise 30% Acetonitril in Wasser lassen sich die Pepti
de wieder ausschwemmen; es versteht sich von selbst, dass die Peptidlösungen dann sofort der
massenspektrometrischen Messung zugeführt werden müssen, um Verluste durch Wandad
sorptionen zu vermeiden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Unterseite der Mikrotiterplatte mit
einer vliesartigen Membran belegt, die durch eine Gegenplatte mit weiteren, verlängernden
Kanälen fest angepresst wird. Die Kanalausgänge sind also hier durch die Membran porös
verschlossen. Die Membran kann in bekannter Weise peptidadsorptiv gemacht werden. Die
Membran kann leicht ausgewechselt werden, wodurch die Mikrotiterplatten beliebig oft wie
derverwendbar werden.
Es muss die Adsorption der Peptide an Oberflächen nicht schon in den Kanälen der Mikrotiter
platten erfolgen. In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens werden die Peptide erst in
den Auffanggefäßen des Zentrifugierens an die Oberfläche von Partikeln gebunden. Diese
Partikel können bevorzugt als magnetische Kügelchen mit adsorptiv präparierten Oberflächen
in einer sehr konzentrierten Aufschwemmung in den Auffanggefäßen vorhanden sein. Nachdem
die Enzymlösungen mit den Peptiden durch Zentrifugieren zugegeben wurden, können die
Kügelchen durch eine Ultraschallbehandlung oder durch wechselnde Magnetfelder in so ge
nannten "Magnetschaukeln" in der Lösung verteilt oder durch die Lösung wiederholt hin
durchbewegt werden, um alle Peptide zu binden. Das Reinigen der Peptide an den Magnetkü
gelchen und die anschließende Überführung auf MALDI-Platten sind weithin bekannt.
Die Mikrotiterplatten mit den Gefäßen nach dieser Erfindung sind zweckmäßigerweise mit
automatisch lesbaren individuellen Kennungen versehen, die eine Verwechslung ausschließen
und eine sehr genaue Verfolgung und Protokollierung der Proben und ihrer Prozessierung in
den Bearbeitungsrobotern erlauben. Die Kennungen können beispielsweise aufgedruckte Bar
codes oder auch eingearbeitete Transponder sein, die von den Bearbeitungsrobotern gelesen
werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein wichtiger Schritt einer Analyse eines Proteoms. Unter
Proteom wird die Gesamtheit der Proteine eines Zellverbandes verstanden. Dieses Verfahren
zur Analyse eines Proteoms läuft folgendermaßen ab:
Zunächst werden die Eiweiße eines Zellverbandes 2D-gelelektrophoretisch getrennt und mit
einem Färbemittel angefärbt. Sehr gute Verfahren der Gelelektrophorese liefern dabei etwa
5000 getrennt sichtbare Proteine, zufriedenstellende Verfahren liefern etwa 2000 Proteine. Das
Färbemittel wird so gewählt, dass es entweder die nachfolgende Analyse nicht stört oder später
wieder entfernt werden kann. In Pipettierrobotern werden aus dem Gel runde Gelstückchen
von etwa einem Millimeter Durchmesser ausgestochen. Ausstechen und Ablegen in einem
Gefäß in einer 384-Mikrotiterplatte dauern etwa sechs Sekunden, damit sind vier 384-Platten
in etwa 2,5 Stunden mit 1536 Gelstückchen befüllt. In drei Zyklen können so in knapp 8 Stun
den etwa 4600 Proteine ausgestanzt und zumindest teilweise weiterbehandelt werden.
Die feuchten Gelstückchen werden vom Stanzroboter automatisch in den Gefäßen der erfin
dungsgemäßen Mikrotiterplatte abgelegt, wo sie in der zum Ausstoßen benutzten Flüssigkeit
schwimmen. Die Flüssigkeit kann beispielsweise eine Entfärbeflüssigkeit für die Proteine sein.
Die Flüssigkeit schützt die Gelstückchen vor Austrocknung während der langdauernden Stanz
vorgänge.
Wie oben geschildert, findet jetzt das erfindungsgemäße Verfahren zum Verdau der Proterine
zu Verdaupeptiden, das Auszentrifugieren und das Anbinden der Peptide an Oberflächen statt,
wie oben ausführlich geschildert. Anschließend werden die Verdaupeptide üblicherweise in
ihrer immobilierten Stellung gewaschen. Es können zweckmäßigerweise immer vier 384-
Mikrotiterplatten parallel behandelt werden, der Zyklus für Inkubieren, Zentrifugieren, Wa
schen, Adsorbieren und Überführen auf MALDI-Probenträger hält in etwa mit dem Ausstanzen
der Proteine für die nächsten vier Mikrotiterplatten Schritt.
Es werde für die folgende Beschreibung angenommen, dass eine MALDI-TOF-Analyse vorge
nommen werden soll. Für andere Arten der massenspektrometrischen Analyse kennt der Fach
mann entsprechende Schritte der weiteren Probenvorbereitung.
Eine Lösung von α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure in 30% Acetonitril und Wasser desorbiert
die Verdaupeptide. Diese Lösung mit den Verdaupeptiden wird dann sofort auf MALDI-
Trägerplatten aufgebracht und dort eingetrocknet. Die MALDI-Trägerplatten haben ebenfalls
Größe und Form von Mikrotiterplatten, sie können die gleiche Anzahl von Proben aufnehmen,
wie die benutzten erfindungsgemäßen Mikrotiterplatten für das erfindungsgemäße Verfahren.
Die Peptide werden in die als MALDI-Matrix dienenden Kriställchen der Zimtsäure eingebaut,
die sich während des Trocknens bilden. Die getrocknete Trägerplatte ist nun fertig für die
Aufnahme eines MALDI-Flugzeitmassenspektrums der Verdaupeptide. Aus deren genau be
stimmten Massen lässt sich das Protein in einer Proteinsequenzdatenbank in üblicher Weise
suchen.
Ein Proteom mit etwa 4600 Proteinen lässt sich somit in etwa acht Stunden automatisch aus
stechen und in etwa zwölf 384-Mikrotiterplatten prozessieren. Jeweils vier Platten werden für
den Verdau gemeinsam inkubiert und dann auch gemeinsam zentrifugiert. Die Verdaupeptide
auf den MALDI-Platten können automatisch im Massenspektrometer gemessen werden, wozu
bei heute erhältlicher Technik etwa 12 Stunden erforderlich sind. Mit automatisch arbeitenden
Massenspektrometern lassen sich so die Verdaupeptide eines vollen Proteoms in einer Nacht
messen. Die Identifizierung der Proteine erfolgt in Echtzeit während der Spektrenaufnahme der
nächsten Probe.
Proteine, die wie in der Einleitung beschrieben gegenüber der Proteinsequenzdatenbank in der
Länge veränderte Peptide besitzen, können anschließend durch die Aufnahme von PSD-
Tochterionenspektren einzelner Verdaupeptide in ihrer Sequenz oder ihren Veränderungen
bestimmt werden. Verluste durch wandadsorbierte Peptide treten mit der erfindungsgemäßen
Technik praktisch nicht auf.
Dieses Verfahren mit erfindungsgemäßem Prozessieren in den erfindunggemäßen Vorrichtun
gen hat folgende Vorteile:
- 1. Das Verfahren ist schnell; die Analyse eines Proteoms mit einer einfachen Identifizie rung der Proteine kann in etwa zwei bis drei Tagen abgeschlossen werden, wodurch weitgehend vermieden wird, dass sich die empfindlichen Proteine, die sich nur in der natürlichen Umgebung in ihrer Zelle stabil halten, zersetzen und damit nicht mehr ana lysiert werden können. Die weitergehende Aufklärung von Strukturunterschieden, die aufwendige interaktive Leistungen erfordert, ist allerdings nicht eingeschlossen.
- 2. Die Analyse ist sehr einfach; an der Automatisierbarkeit wird noch gearbeitet.
- 3. Die Auffindungsrate für die einzelnen Verdaupeptide eines Proteins ist groß; gegenüber bisher üblicher Prozessierung in Gefäßen gibt es eine wesentlich höhere Findungsrate für die Verdaupeptide. Besonders die stark hydrophoben Peptide gingen bei bisheriger Technik häufig durch Wandeinflüsse verloren; sie wurden in der massenspektrometri schen Messung gar nicht mehr gefunden. Da die Proteomforschung sich in zunehmen der Weise auf die Abweichungen zwischen realen Proteinen und den Sequenzen der Proteindatenbanken konzentriert, sind diese Verluste an Verdaupeptiden nicht mehr hinzunehmen.
Jedem Fachmann auf dem Gebiet des Mikroprozessierens wird es mit den Kenntnissen über
diese Erfindung und ihre Anwendung möglich sein, seine speziellen Bedürfnisse an Prozessie
rungen mit den hier angegebenen Grundprinzipien zu verwirklichen, auch wenn die spezielle
Art der Prozessierung hier nicht beschrieben sein sollte. Beispielsweise wird es ihm ein Leich
tes sein, das Verfahren für eine andere Art der massenspektrometrischen Analyse umzuformen.
So ist es beispielsweise leicht möglich, die eluierten Verdaupeptide einer Mikrosäulen-Flüssig
keitschromatographie zuzuführen, wobei die separierten Peptide dann über eine online-Nano
elektrospray-Einrichtung ionisiert und beipielsweise mit einem Ionenfallenmassenspektrometer
gemessen werden können.
Claims (18)
1. Verfahren für die Probenvorbereitung kleinster Proteinmengen aus Gelstückchen für die
massenspektrometrische Analyse unter Verwendung eines enzymatischen Abbaus der Pro
teine zu Verdaupeptiden im Gel, das aus folgenden Schritten besteht:
- 1. die Gelstückchen mit den Proteinen werden in Gefäße mit lyophob-porösem Boden ein gefüllt,
- 2. den Gelstückchen werden jeweils Enzymlösungen beigegeben, aber nur so viel, wie je weils von den Gelstückchen aufgenommen werden kann,
- 3. die Proteine werden in den Gelstückchen verdaut, und
- 4. durch Zentrifugieren werden die Enzymlösungen mit den Verdaupeptiden aus den Gelstückchen ausgepresst und aus den Gefäßen ausgeschleudert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdaupeptide der Enzym
lösungen nach oder während des Ausschleuderns an reversibel peptidadsorptiven Oberflä
chen adsorbiert werden.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymlö
sungen mit den Verdaupeptiden sofort auf eine unter den Gefäßen liegende MALDI-
Probenträgerplatte aufgebracht werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdaupeptide aus den
Enzymlösungen auf Belegungen der Probenträgerplatte reversibel gebunden und einer Rei
nigung zugeführt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymlö
sungen mit den Verdaupeptiden während des Zentrifugierens in darunterliegenden Gefäßen
aufgefangen und weiter prozessiert werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdaupeptide aus den
Enzymlösungen in den darunterliegenden Gefäßen an Partikeloberflächen reversibel gebun
den und an den Partikeln einer Reinigung zugeführt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel einen magnetischen
Kern haben, die sie in Magnetfeldern festhaltbar oder bewegbar machen.
8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdaupeptide aus den
Enzymlösungen an porösen Strukturen der Gefäßböden reversibel adsorptiv oder adhäsiv
gebunden werden, so dass sie einer Reinigung durch eine Waschflüssigkeit mit anschlie
ßender Eluierung durch eine Eluationsflüssigkeit unterworfen werfen können.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass auch die Waschprozesse und
der Eluierungsprozess durch Zentrifugieren unterstützt werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die
Gelstückchen vor dem Zugeben der Enzymlösungen partiell getrocknet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Trocknen zumindest teil
weise durch Evakuieren erfolgt.
12. Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, dass in einer Platte mehrere Gefäße mit lyophob porösen Böden enthalten
sind, wobei die lyophobe Porösität der Böden durch eine oder mehrere kapillare Kanäle mit
lyophoben Innenoberflächen gegeben ist, so dass eine eingefüllte Flüssigkeit unter Einwir
kung normaler Schwerkraft am Durchlaufen gehindert wird.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Platte Größe und Form
einer Mikrotiterplatte besitzt, und dass die Gefäße im Raster von neun Millimetern oder ei
nem ganzzahligen Bruchteil davon angeordnet sind.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die
Böden der Gefäße um die kapillaren Kanäle herum schmale Rippen oder Rillen aufweisen.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die kapil
laren Kanäle durch eine untergepresste, vliesartige Membran porös verschlossen sind, wo
bei die Membran reversibel peptidadsorbierend ist.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die kapil
laren Kanäle unten durch eine Packung mit flüssigkeitschromatographischen Partikelchen
porös verschlossen sind.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die kapil
laren Kanäle unten durch einen oberflächenaktiven, offenporigen Festkörperschaum ver
schlossen sind.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass auch die
Innenwände der Gefäße oberhalb der kapillaren Kanäle lyophobisiert sind.
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