DE19634828A1

DE19634828A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Zentrifugal-Adsorptionsprobenpräparation

Info

Publication number: DE19634828A1
Application number: DE19634828A
Authority: DE
Inventors: William Kopaciewicz; Ingeborg Cann; Donald G Sheer
Original assignee: Amicon Corp
Current assignee: Amicon Corp
Priority date: 1995-08-28
Filing date: 1996-08-28
Publication date: 1997-03-13
Also published as: GB9617127D0; US5833860A; GB2304603B; GB2304603A

Description

Die Erfindung betrifft Zentrifugalverfahren und -vorrichtungen zum Konzentrieren von Biomolekülen aus Lösungen und zum Gewinnen einer maximalen Menge konzentrierten Rückstands, adsorbierende Membranen (im folgenden Adsorptivmembranen), die zum Konzentrieren von Biomolekülen aus Lösungen wirksam sind, und ein Verfahren zum Einschließen (dichtes Einsetzen) der artiger Membranen in derartigen Vorrichtungen.

In der Biochemietechnik ist eine Vielzahl analytischer Ver fahren entwickelt worden, bei denen es erforderlich ist, Lösungsmittel aus Peptidlösungen zu entfernen, um eine kon zentriertere Peptidprobe zu haben, die wirksam analysiert werden kann, oder um Ionen geringen Molekulargewichts oder andere gelöste Substanzen zu entfernen oder auszutauschen. Es wurden auch viele weitere analytische Verfahren, die nicht nur Peptide, sondern allgemein Biomolekülarten (z. B. Oligonukleo tide) einschließen, entwickelt, bei denen es notwendig ist, eine biomolekulare Komponente in einer flüssigen Probe zu konzentrieren und/oder zu "entsalzen", da es gewöhnlich in der Biochemie und medizinischen Chemie notwendig ist, daß reine analytische Substanzen keine Salze, Detergentien und andere niedrigmolekulare Verunreinigungen aufweisen. Die Gegen wart dieser Substanzen kann dahingehend schädlich sein, daß sie häufig folgende chemische Analysen oder biochemische Assay′s stören.

Das Patent US 4,755,301 beschreibt ein Zentrifugalverfahren und eine -vorrichtung zum Konzentrieren von Biomolekülen ohne eine Filterung bis zur Trockenheit. Eine semipermeable Ultra filtrations-Membran trennt eine Probenreservoir von einer Filtratschale, und Filtratleitungen unterhalb der Membran sind von der Kante der Membran genügend einwärts versetzt, so daß wenn die Vorrichtung in einem Festwinkelzentrifugenrotor verwendet wird, die Filtration anhält, wenn der Rückstands- Meniskus die radiale Zentrifugalhöhe der äußersten Kante der äußersten Filtratleitung erreicht.

Solche Ultrafiltrationsgeräte werden gewöhnlich für die "Reinigung" und/oder Probenzubereitung von Biomolekülen und anderen Makromolekülen verwendet. Damit ein derartiges Ver fahren erfolgreich ist, muß eine Membran ausgewählt werden, die die interessierenden Moleküle zurückhält, jedoch die kleineren Verunreinigungen hindurchläßt. Obwohl diese Gestaltung für analytische Substanzen relativ einfach ist, die ein Molekulargewicht größer als ungefähr 10 000 aufweisen, wird sie für Substanzen zunehmend problematisch, die ein Molekulargewicht kleiner als ungefähr 5 000 aufweisen. Der Grund liegt in der Tatsache, daß die Membranporosität, die zum Zurückhalten der analytischen Substanz mit einem Molekular gewicht von ungefähr 10 000 so gering ist, daß die Wasser permeabilität (Flußrate) niedrig wird und die Verarbeitungs zeiten zu lang werden. Zum Beispiel beträgt eine typische Schleuder-"Drehzeit" für eine Vorrichtung unter Verwendung einer Membran, die für analytische Substanzen geeignet ist, welche ein Molekulargewicht von 30 000 oder mehr aufweisen, ungefähr 1 Stunde, während bis zu 6 Stunden für analytische Substanzen mit einem Molekulargewicht von ungefähr 1 000 erforderlich sein können. Außerdem verursacht eine derartige Langzeitaussetzung zu einer hohen g-Kraft häufig Gerätefehler.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine adsorbierende Zentrifugal-Probenpräparationsvorrichtung (im folgenden: Zentrifugal-Adsorptivprobenpräparationsvorrichtung) bereitzustellen, die Biomoleküle aus einer Lösung konzen trieren und/oder entsalzen kann.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein zentrifugales Gewinnungsverfahren für die Gewinnung einer maximalen Menge konzentrierter makromolekularer Rückstände aus einer Zentrifugalkonzentratorvorrichtung bereitzustellen.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen wiederverwendbaren zentrifugalen Mikrokonzentrator bereit zustellen.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen zentrifugalen Mikrovolumenkonzentrator bereitzustellen, der kostengünstig herstellbar ist.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Probenpräparationsvorrichtungen bereitzustellen, in denen Adsorptivmembranen einfach eingeschlossen werden.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Adsorptivmembran bereit zustellen, mit der ein herkömmliches Zentrifugalprobenpräparationsgerät nachrüstbar ist.

Die Probleme des Standes der Technik können durch die vor liegende Erfindung überwunden werden, die eine Adsorptiv probenpräparationsvorrichtung und ein -verfahren bereitstellt, die zum Konzentrieren, Entsalzen und/oder Reinigen von analy tischen Substanzen in kurzen Zeitbereichen wirksam sind. Zu diesem Zweck wird eine Adsorptivmembran verwendet, um analy tische Substanzen (Analyte) zu binden, wobei die analytischen Substanzen dann mit einem geeigneten Desorptionsmittel abgelöst werden können.

Das erfindungsgemäße Adsorptivzentrifugalfiltrationssystem umfaßt:

(a) eine Adsorptivprobenpräparationsvorrichtung, die umfaßt:
- (1) ein Probenreservoir;
- (2) eine Basis, die unterhalb des Probenreservoirs angeordnet ist;
- (3) Adsorptivfiltermittel, die das Probenreservoir von der Basis trennen, welche Adsorptivfiltermittel eine Adsorptiv membran umfassen;
- (4) einen Träger für das Adsorptivfiltermittel;
- (5) eine oder mehrere Filtratleitungen, um den Durchtritt von Filtrat vom Filtermittel in die Basis zu ermöglichen;
- (6) Mittel zur Bereitstellung eines flüssigkeitsdichten Ver schlusses zwischen dem Rand des Probenreservoirs, der Membran und dem Membranträger;
- (7) Mittel zur Anbringung des Filtermittels an der Basis;
- (8) Mittel zur Anbringung des Probenreservoirs an dem Filter mittel; und
(b) ein Festwinkel- oder Schwingzellen-Zentrifugenrotor, um die Adsorptivprobenpräparationsvorrichtung aufzunehmen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Adsorptiv filtermittel eine teilchenbeladene, semipermeable (halbdurch lässige) Membran, bei der mindestens eine ihrer Hauptober flächen, vorzugsweise beide ihrer Hauptoberflächen, mit einem dünnen Gewebe bedeckt ist und die in der Lage ist, analytische Substanzen mit einem Molekulargewicht unterhalb von ungefähr 10 000, allgemein unterhalb von 5 000, zu binden, die typischerweise schwierig und langsam auf einer Ultrafil trationsmembran mit einem Abbruch (cut-off) bei 1 000 und/oder 3 000 Molekulargewichten zu entsalzen sind.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Konzentrieren von Biomolekülen oder zum Entsalzen oder Reinigen aus einer Lösung wird das Probenreservoir der oben beschriebenen Adsorptiv probenpräparationsvorrichtung mit einer Lösung einer analy tischen Substanz gefüllt, in einem Festwinkel- oder Schwing zellen-Zentrifugenrotor plaziert, die Lösung wird durch die Membran getrieben, die Membran wird gewaschen und die analy tische Substanz, die als ein Ergebnis der Adsorption an der Membran erhalten wurde, wird durch Herauslösen mit einem geeigneten Desorptionsmittel gewonnen.

Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden unter Bezug auf die Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 eine Explosionsdarstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zentrifugal-Adsorptivprobenprä parationsvorrichtung;

Fig. 2 eine Querschnittsansicht eines Bereiches des Gerätes gemäß Fig. 1;

Fig. 3 eine Detailansicht eines Bereiches des Geräts gemäß Fig. 2;

Fig. 4 eine Explosionsdarstellung einer alternativen Aus führungsform der erfindungsgemäßen Zentrifugal- Adsorptivprobenpräparationsvorrichtung;

Fig. 5 eine Querschnittsansicht eines Bereiches der Vor richtung gemäß Fig. 4;

Fig. 6 eine Kurvendarstellung der Adsorptionskapazität von verschiedenen Membranen;

Fig. 7 eine Kurvendarstellung der Adsorptionskapazität von verschiedenen Ausführungsformen von Adsorptions vorrichtung;

Fig. 8a ein Chromatogramm einer Kontroll-Peptidprobe gemäß Beispiel 2;

Fig. 8b ein Chromatogramm einer Peptidprobe gemäß Beispiel 2;

Fig. 9a ein Chromatogramm einer Kontroll-Peptidprobe gemäß Beispiel 3;

Fig. 9b ein Chromatogramm einer desorbierten Peptidprobe gemäß Beispiel 3;

Fig. 10a ein Chromatogramm einer Kontroll-Oligonukleotidprobe gemäß Beispiel 4;

Fig. 10b ein Chromatogramm einer desorbierten Oligonukleotid probe gemäß Beispiel 4;

Fig. 11 eine Scanning-Elektronenmikroskopansicht einer Adsorptivmembran, die für die vorliegende Erfindung geeignet ist;

Fig. 12 eine Scanning-Elektronenmikroskopansicht einer weiteren Adsorptivmembran, die zum Gebrauch mit der vorliegenden Erfindung geeignet ist;

Fig. 13 eine Explosionsansicht einer alternativen Ausfüh rungsform des erfindungsgemäßen zentrifugalen Adsorptivprobenpräparationsgeräts; und

Fig. 14 eine Querschnittsansicht der Vorrichtung gemäß Fig. 13.

Fachleute werden erkennen, daß viele verschiedene Adsorptiv membranen in Abhängigkeit von der gewünschten Aufgabe erfin dungsgemäß verwendet werden können. Die ideale Membran besitzt schnelle Adsorptionskinetiken, erfordert kein Chaotropie- Mittel (englisch: chaotropic agent), besitzt eine für die Anwendung geeignete Kapazität und Selektivität und erlaubt das Heraus lösen gebundener analytischer Substanz mit einem ver dampfbaren oder gefriertrockenbaren (englisch: lyophylizable) Desorptionsmittel. Geeignete Adsorptivmembranen sind polymer gebundene, teilchenbeladene Adsorptivmembranen wie solche, die in chromatographischen Kugeln (die funktionalisiert sein können) enthalten sind, die mit einem Bindemittel wie z. B. Polytetrafluorethylen-(PTFE)-Fasern aneinandergeheftet sind, wie es in den Fig. 10 und 11 gezeigt ist. Im einzelnen stellt Fig. 10 eine polymergebundene, teilchenbeladene Adsorp tivmembran dar, die unter dem Namen EMPORE durch das Unter nehmen "3M" hergestellt und verkauft und im Patent US 5,147,539 beschrieben wird, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme einbezogen wird. Dies ist eine Membran oder Scheibe mit starkem Kationenaustausch, die dazu vorgesehen ist, positiv geladene Polypeptide zu adsorbieren, und daher ideal zum Entfernen von nicht-proteinartigen, anionischen oder neutralen Verunreinigungen aus Peptidproben ist. Sie enthält sphärische Polystyren-Divinylbenzen-(PSDVB)-Kugeln mit einem Porendurchmesser von 80 Angström und einem Teilchendurchmesser von 8 Mikrometer, wobei die Kugeln mit einer schwefligen Säure (-SO₃⁻) funktionalisiert sind, und ist 0,020 +/- 0.002 Inch (0,051 ± 0,005 cm) dick, besitzt eine Durchflußrate von 15-30 ml/min_*cm² mit Wasser bei 10 psi (rd. 0,7 kg/cm²) (Raum temperatur) und enthält auf das Gewicht bezogen 90% (+/-2) Teilchen und 10% (+/-2) PTFE. Die Teilchen sind unlösliche, nicht-quellende sorptive Teilchen, die in einer PTFE-Faser matrix vernetzt sind. Diese Membran ergibt einen gemischt kationischen und hydrophoben Oberflächencharakter, der viele Arten von Biomolekülen adsorbiert, jedoch die meisten Salze, organischen und nicht-kationischen Detergentien hindurchläßt. Darüberhinaus können gebundene analytische Substanzen wirksam mit Säuren, Basen und/oder Salzen in der Gegenwart einer organischen Substanz desorbiert werden.

Eine weitere geeignete, polymergebundene, teilchenbeladene Adsorptivmembran ist in Fig. 11 dargestellt. Diese Membran besteht aus ungefähr 60% sphärischem Silika, das mit einer schwefeligen Säure funktionalisiert ist, 20% PVDF-Bindemittel und 20% Träger und wird durch die Amicon Inc. hergestellt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden das Silika und das Bindemittel auf beiden Seiten eines Trägers vergossen. Der Träger kann dasselbe Spinfließ oder Gewebe auf Polyolefinbasis sein, das unten erwähnt wird. Andere funktionelle Membranen können sphärische Polystyren-Divinylbenzen-Kugeln (Beads) enthalten, die in einer PVDF-Matrix zusammengeheftet sind, und einen Träger enthalten, oder können weitere mikrometergroße, sphärische Harzteilchen umfassen, die mit anderen funktionellen Gruppen, einschließlich Anionenaustauscher auf PSDVB- oder Silika-Basis (quaternäre Amine, z. B. PSDVB(-N(CH₃)₃+), Umkehrphasenmedien, z. B. C₂, C₄, C₆, C₈ oder C₁₈ auf Silika- Basis, sowie mit PSDVB gemischte Ionenaustauscher (Kationen und Anionen) , derivativiziert sein, um eine Vielzahl von Anwendungen für Peptide, Oligonukleotide und andere Bio moleküle abzudecken ("Biomoleküle", wie es hier verwendet wird, enthalten Aminosäuren, Peptide (Molekulargewicht all gemein niedriger als ungefähr 5 000), kleine Proteine (Mole kulargewicht allgemein größer als 5 000 und niedriger als ungefähr 10 000) und Oligonukleotide). Fachleute werden erkennen, daß auch andere Matrizen mit alternativen Selek tivitäten (z. B. Anionenaustausch), speziell für Molekül klassen, die sich von Peptiden unterscheiden, verwendet werden können. Erfindungsgemäße Vorrichtungen können eine Vielzahl von funktionellen Membranen enthalten, die Harzmaterialien mit verschiedenen funktionellen Gruppen aufweisen, um analytische Substanzen zu fraktionieren, die sich hinsichtlich der Ladung und Hydrophobität unterscheiden. Alternativ kann eine Vielzahl von Vorrichtungen in Kombination verwendet werden, die ver schiedene einzelne funktionelle Membranen enthalten, um ein ähnliches Ergebnis zu erzielen.

Erfindungsgemäß muß die polymergebundene, teilchenbeladene Adsorptivmembran in der Probenpräparationsvorrichtung ein geschlossen sein, um ein Austreten der Probe aus diesem zu verhindern. Aus Sicht der geringen Größe vieler dieser Vor richtungen und daher der in diesen enthaltenen Membranen und aus Sicht der tonartigen Textur einiger dieser Adsorptiv membranen, ist die Handhabung der Membran und das Einschließen der Membran in das Gerät äußerst problematisch. Die Membran wird häufig während der Handhabung oder während des Ein schließvorgangs deformiert, zerteilt oder zerrissen, was einen Geräteausfall ergibt. Dementsprechend ist die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung durch die Bereitstellung einer dünnen, porösen Gewebeschicht über mindestens der Membran oberfläche, die zum Probenreservoir weist, vorzugsweise sowohl über diese Oberfläche als auch die Oberfläche, die zur Unter lage weist, vor dem Einschließen der Membran in das Gerät gekennzeichnet (diese Oberflächen werden gewöhnlich und auch im folgenden als die "Hauptoberflächen" der Membran bezeichnet) . Das poröse Gewebe erfüllt mehrere Funktionen einschließlich (1) Erhaltung der Membrangestalt und Ver besserung der Handhabbarkeit, insbesondere während des Membranschneidens und der Anordnung in der Probenpräparations vorrichtung, (2) Verhinderung von Membraneinschnitten an der Dichtverbindung in der Probenpräparationsvorrichtung, (3) Wirkung als ein Abstandsstück in der Probenpräparationsvor richtung, und (4) Unterstützung der Durchflußsteuerung durch Flachhaltung der Membran und Funktion als eine Durchfluß beschränkung. Die Durchflußbeschränkung vergrößert die Kontaktzeit der Flüssigkeit mit den Membranmedien und kann bei einigen Anwendungen nützlich sein.

Die Erfinder haben festgestellt, daß Adsorptivmembranen, bei denen eine oder sogar beide ihrer Hauptoberflächen mit Gewebe bedeckt sind, überraschenderweise in verschiedenen Arten her kömmlicher Zentrifugal-Probenpräparationsvorrichtungen wirksam eingeschlossen werden können, ohne irgendeine Modifikation des Gerätes zu erfordern.

Die verwendeten Gewebe dürfen nicht den Durchfluß schädlich beeinflussen und sollten in Bezug auf die Komponenten der Probe, die gereinigt oder konzentriert wird, inert sein. Geeignete dünne Gewebe sind solche, die aus Spinfließ-Poly ester zusammengesetzt sind, wobei jedoch auch Gewebe auf Poly olefinbasis wie Polypropylen und/oder Polyethylen verwendet werden können. Die Dicke des Gewebes beträgt in Abhängigkeit von der Art der Probenpräparationsvorrichtung vorzugsweise ungefähr 0,0005 bis ungefähr 0.005 Inch (rd. 0,0013 bis 0,013 cm). Falls das Gewebe zu dünn ist, wird es nicht stark genug sein, die Membranmaße zu halten. Falls die Membran zu dick ist, kann diese die Zusammensetzung der Probenprä parationsvorrichtung behindern, so wie dort, wo eine "Schnapp verschluß"-Schließanordnung (englisch: "snap fit") in einer Ausführungsform verwendet wird, wie sie in den Fig. 1 und 2 dargestellt ist. Ein bevorzugtes dünnes Gewebe zum Gebrauch in der Schnappverschluß-Vorrichtung, die in Fig. 1 gezeigt ist, ist HOLYTEX-Gewebe, das von der Ahlstrom Filtration Inc. verfügbar ist und aus Polyester zusammengesetzt ist, das eine Dicke von 0,0015 +/-0.0003 Inch (rd. 0,004 + 0,0008 cm), ein Gewicht von 0,4-05 oz/yd³ (rd. 13,6 bis 17,0 g/m²), eine Luftdurchlässigkeit von 450-675 cfm/ft² (rd. 19,7 bis 29,6 l/s/m²), eine Zugfestigkeit von 2-6 lbs/inch (rd. 357 bis 1072 g/cm), MD, und 1,5-3,5 lbs/inch (rd. 268 bis 625 g/cm), CD, und eine Dehnung von 17-33%, MD, und 31-58%, CD, aufweist. Dickere Gewebe können bei Geräten verwendet werden, die unter Verwendung eine O-Ringes verschlossen werden, wie das in Fig. 4 gezeigte Gerät. Ein weiteres geeignetes Gewebe ist VILEDON (registrierte Marke) FO2432, das aus nicht gewebtem Poly propylen und/oder Polyethylen mit einem Gewicht von 30 g/m² zusammengesetzt ist und eine Zugfestigkeit in Bearbeitungs richtung oberhalb von 50 N/5 cm und in der Querrichtung ober halb 70 N/5 cm und eine Luftdurchlässigkeit bei 0,5 mBar von 700 dm³/s·m² aufweist.

Das Gewebe kann durch jedes geeignete Mittel der Membran zugeführt werden. Die Erfinder haben herausgefunden, daß das Gewebe dazu neigt, an der Membran von selbst anzuhaften, wobei kein Klebemittel notwendig ist. Das bevorzugte Verfahren der Zuführung des Gewebes auf die Membran erfolgt mit einem Stempel, der geeignet entsprechend der Gestalt der Membran geformt ist, die gewöhnlich kreisförmig ist. Auf einer Poly propylen-Schnittfläche wird Wachspapier angeordnet. Das Gewebe, das gewöhnlich als Wickelmaterial kommerziell verfüg bar ist, wird auf dem Wachspapier, gefolgt von einem Stück der Membran (verfügbar in 1′ _* 1′-Stücken, oder 30,5 cm _* 30,5 cm- Stücken) angeordnet. Ein zusätzliches Stück Gewebe kann dann über die Membran gelegt werden, wenn es gewünscht ist, beide Hauptoberflächen der Membran zu überdecken. Der Stempel wird dann herabgedrückt, wobei die Komponenten gleichzeitig über schichtet und in einer geeigneten Gestalt geschnitten werden.

In Fig. 1 ist allgemein mit dem Bezugszeichen 1 eine Proben präparationsvorrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung gezeigt. Die Vorrichtung 1, die allgemein zur Ultra filtration von Probenvolumina von ungefähr 0,5 ml geeignet ist, umfaßt ein Probenreservoir 2, eine Basis 3 und ein Glas fläschchen 4 mit einem Flaschendeckel 5. Eine polymer gebundene, teilchenbeladene Adsorptivmembran 6 ist zwischen dem Reservoir 2 und der Basis 3 angeordnet und mit einem dünnen Gewebe 7 und 7a auf Polyesterbasis auf jeder Haupt oberfläche bedeckt.

Die Fig. 2 und 3 stellen den Schnappverschluß-Verriege lungsmechanismus der Vorrichtung dar, der die Flüssigkeits dichtung bereitstellt. Für diesen Zweck besitzt das Reservoir 2 eine erste ringförmige Rille 9, die einen Winkel von ungefähr 45° aufweist und eine entsprechend gewinkelte ring förmige obere Oberfläche 8 der Basis 3 aufnimmt. Eine zweite ringförmige Rille 10 des Reservoirs 2 enthält einen ersten ringförmigen gewinkelten Bereich 10a und einen zweiten ring förmigen vertikalen Bereich 10b und endet in einer ring förmigen gewinkelten Aufnahme 10c. Diese zweite ringförmige Rille 10 nimmt einen entsprechenden ringförmigen Vorsprung 11 der Basis 3 auf. Wenn das Reservoir 2 in die Basis 3 ein geschnappt ist (oder umgekehrt), so verriegelt die Aufnahme 10c im Reservoir 2 die Basis 3 dadurch in Position, indem der ringförmige Vorsprung 11 der Basis 3 gehindert wird, sich vertikal abwärts zu bewegen. Die Länge "a" des Bereichs des Reservoirs 2 ist derart gewählt, daß, wenn das Reservoir 2 zusammengesetzt und in der Basis 3 verriegelt wird, die ring förmige Unterlage 12 des Reservoirs 3 dicht gegen das dünne Gewebe der Adsorptivmembran anliegt, wie es gezeigt ist. Eine oder mehrere Durchtrittskanäle oder Leitungen sind unterhalb der Membran 6 als Ergebnis von Rillen in der Basis gebildet, um den Durchtritt in die Basis 3 (und schließlich in das Glasfläschchen 5) von nicht auf der Membran 6 adsorbierter Probe zu ermöglichen.

Die in den Fig. 1 bis 3 gezeigte Vorrichtung zeigt eine hohe Extraktionseffektivität bei kurzen Drehzeiten. Die Kapazität für Peptide reicht in Abhängigkeit von der Probe und vom für die Zentrifugierung verwendeten Rotortyp von ungefähr 150 bis ungefähr 400 µgs/Gerät, wobei Festwinkelrotoren eine geringere Kapazität ermöglichen als horizontale Rotoren. Für eine maximale Adsorption sollte die ermittelte Gesamtionen stärke der Probe nicht 0.1 M in einem 500 µl-Volumen über steigen. Falls die Ionenstärke unbekannt ist, kann ein Ver fahren von Verdünnungsserien verwendet werden, um sicher zustellen, ob konkurrierende Ionen die Adsorption verdichten (oder verstopfen, engl.: impact). Gelöste Substanzen müssen einen positiv geladenen Anteil wie ein primäres, sekundäres oder tertiäres Amin aufweisen, damit die Adsorption statt findet. Allgemein sollte der Proben-pH-Wert auf einen Wert unterhalb des pKa- oder pI-Wertes der analytischen Substanz eingestellt sein. Zum Beispiel können Ammoniumhydroxid oder alkoholische HCl (1M) verwendet werden, um die Probe abzu lösen. Fachleute erkennen, daß das spezielle, verwendete Ablösemittel von der Identität der analytischen Substanz abhängt und leicht bestimmt werden kann.

Die Fig. 4 und 5 stellen eine zweite Ausführungsform der Erfindung dar, die allgemein zur Ultrafiltration von Proben volumen von ungefähr 2,0 ml anwendbar ist. Die Vorrichtung in Fig. 4 verwendet einen kalt geformten Bördelverschlußmechanis mus, in dem ein O-Ring über der Membran angeordnet ist, die in die Basis gelegt worden ist. Das Reservoir wird dann in die Basis eingeführt und die überstehende Kante der Basis wird über die Reservoirkante geformt, um diese in Position zu halten. Somit enthält das Reservoir 2′ eine ringförmige Kante oder einen Kragen 16, der in einen ringförmigen Flansch 17 der Basis 3′ einschnappt und durch diesen verriegelt ist. Die Basis des ringförmigen Kragens 16 steht mit dem O-Ring 13 in Eingriff, um die Dichtung zu bewirken. Da der O-Ring 13 geringfügig kompressibel ist, ist die Dicke des Gewebes 7a (und optional 7b) nicht kritisch, die die Adsorptivmembran 6 bedeckt, wobei dickere Gewebe verwendet werden können, ohne die Dichtfähigkeit der Vorrichtung zu verschlechtern.

Die Fig. 13 und 14 zeigen eine dritte Ausführungsform der Erfindung, die allgemein zur Ultrafiltration von Probenvolumen von ungefähr 250 µl verwendet wird. Bei dieser Vorrichtung bilden die Basis und das Reservoir eine integrale, einzeln geformte Einheit, wobei somit das Glasröhrchen 4′′ die Funktion ausführt, die bei den Ausführungsformen der Fig. 1 bis 3 und 4 bis 5 durch die Basis ausgeführt wurden, indem sie Flüssigkeit aufnimmt, die durch die Membran 6 hindurchtritt), und eine Druckpassung wird verwendet, um die Membran in dem Gerät einzuschließen. Im einzelnen enthält eine Basis-/ Reservoir-Einheit 100 (im folgenden: Basis-Reservoir) eine Vielzahl von Leitungen oder Durchtrittskanälen 15′, die auf der Bodenoberfläche der Basis 103 unterhalb der Membran 6 gebildet sind, um zu ermöglichen, daß die Probe vom Basis/ Reservoir 100 in ein Glasröhrchen 4 ausgegeben wird. Die Membran 6 und Gewebeschicht 7 (und/oder Gewebeschicht 7a) sind mit einem hohlen, zylindrischen Druckpassungsrohr 200 auf der Basis 103 schichtartig in Position gebracht (die Basis 103 des Teils Basis-Reservoirs 100 dient daher als eine Membran halterung) . Der Außendurchmesser des Rohres 200 ist gering fügig größer als der Innendurchmesser des Basis-Reservoirs 100, so daß, wenn das Rohr 200 in das Basis-Reservoir 100 mit Druck eingepaßt wird, ein wasserdichter Verschluß gebildet wird. Das Rohr 200 wird hinabgedrückt, um so die Membran 6 (oder die Gewebeschicht 7 auf der Membran 6) zu berühren, wie es in Fig. 14 gezeigt ist. Die Wandreibung hält das Rohr 200 in dem Basis-Reservoir 100 in Position. Wenn sich das Rohr 200 in Position befindet, dient das innere Volumen des Rohrs 200 als das Probenreservoir. Das Basis-Reservoir 100 enthält einen ringförmigen Flansch 101, der einen Außendurchmesser ausweist, der größer als der Durchmesser der Oberseite des Glasröhrchens 4′′ ist, so daß wenn das Basis-Reservoir 100 in dem Glas röhrchen 4′′ zur Zentrifugierung positioniert wird, der ring förmige Flansch 101 verhindert, daß das Basis-Reservoir 100 in das Glasröhrchen 4′′ fällt, und einen weiteren Zugriff ermöglicht. Vorzugsweise ist ein Deckel 5, mit dem Glas röhrchen 4′′ verbunden und in geeigneter Weise gestaltet, um in die Öffnung 102 in der Oberseite des Basis-Reservoirs 100 zu passen.

Fachleute werden erkennen, daß die Prinzipien der vorliegenden Erfindung nicht auf irgendein Teilchenvolumen-Zentrifugalgerät beschränkt sind. Geeignete Geräte enthalten solche Vorrich tungen, die von 0,2 ml- bis 15 ml-Geräten reichen.

Durch Minimieren der Membranoberflächen-Fläche für die erfor derlichen Volumina kann eine optimale Adsorption/Desorption der analytischen Substanzen in der Probe erzielt werden. Studien haben gezeigt, daß diese Vorrichtungen die erforder liche Probendurchtrittsrate erzielen, die für eine quanti tative Aufnahme analytischer Substanzen langsam genug und zur Ermöglichung des Lösungsmitteldurchtritts schnell genug ist, um die erforderliche Analyse durchzuführen. Ergebnisse zeigen, daß das Lösungsmittel durch die Membran mit rund 35 ml/min fließen muß. Dem Durchtritt der analytischen Substanz und des Lösungsmittels durch die Membran mittels Zentrifugierung folgend sind die interessierenden Spezies auf der Membran adsorbiert, und sie werden darauffolgend entfernt, indem vorzugsweise zuerst die Membran gewaschen wird, um un gebundene, unerwünschte Verunreinigungen wie Detergentien, Salze usw. zu beseitigen, und dann ein geringes Volumen eines niedrigpolaren Lösungsmittels verwendet wird, das in der Lage ist, die adsorbierten Spezies durch die funktionale Extraktionsmembran zu verschieben und abzulösen. Falls eine Entfernung von locker gebundenen Verunreinigungen gewünscht ist, kann ein verdünntes Desorptionsmittel (wie ein Desorptionsmittel mit einer Konzentration, die ungefähr 1/10 der Konzentration zur vollständigen Desorption beträgt) für das Waschen verwendet werden. Falls das Ablösevolumen kleiner als das ursprüngliche Probenvolumen ist, wird eine Nettokon zentration erzielt.

Im Vergleich mit herkömmlichen Extraktionsgeräten, z. B. vom Typ mit einer Schüttschicht, zeigt die erfindungsgemäße Vor richtung als Ergebnis des Harzaustauschers geringer Größe, der in die Bindemittel-Fasermatrix (z. B. PTFE) eingewirkt ist, eine verbesserte Leistungsfähigkeit, die eine hohe Extraktions wirksamkeit und schnelle Durchflußraten erlaubt, ohne die Erhaltung eines gleichförmigen Flusses einzuschränken, während die Kontaktplätze für analytische Substanzen maximiert werden.

BEISPIEL 1

Eine Auswahl dünner Gewebe verschiedener Dicke wurde bei Adsorptivmembranen des Typs EmPore-SCX (registrierte Marke) eingesetzt und in den Probenpräparationsvorrichtungen gemäß Fig. 1 eingeschlossen. Dann wurde die Fähigkeit der Geräte, selektiv zu absorbieren, unter Verwendung bekannter Mengen von Cytochrom c bestimmt. Obwohl Cytochrom c ein Protein mit einem Molekulargewicht (12 000) ist, das größer ist, als für solche Geräte bevorzugt wird, wurde dieses als Grenzfall ("worst case"-Fall) verwendet, da solche großen Moleküle langsamer diffundieren. Ferner besitzt es eine sichtbare Absorption bei 410 nm, wodurch ein Mittel zur bequemen Quantifizierung bereitgestellt wird. Das Protein wurde in einer gegebenen Einheit eingeführt, um die Gerätekapazität zu bestimmen. Diese Menge wurde durch eine kalorimetrische Probe bestimmt, die die Menge von ungebundenem oder freiem (F) Cytochrom c gemessen hat, das in das Filtrat hindurchtrat. Die optimale Leistungs fähigkeit wurde durch komplexe (oder schwierige, engl.: challenging) Geräte mit steigenden Mengen von Cytochrom c bestimmt, um die maximale Polypeptid-Adsorptionskapazität zu ermitteln. In Fig. 6 sind Ergebnisse gezeigt, die Vorrich tungen vergleichen, die mit einer unbedeckten Membran ("Kein Htex"), einer Membran, bei der nur die zum Probenreservoir weisende Hauptoberfläche mit MOLLYTEX-Polyestergewebe bedeckt ist ("1 Htex"), und einer Membran vorbereitet wurde, bei der beide Hauptoberflächen mit HOLLYTEX-Gewebe ("2 Htex") bedeckt ist. Diese Daten zeigen, daß mehr Cytochrom c bei Vorrich tungen gebunden (B) ist, wo eine oder beide Hauptoberflächen der Membran mit Gewebe bedeckt waren. Zusätzlich diente bei den Proben, bei denen die zum Probenreservoir weisende Ober fläche der Membran mit Gewebe bedeckt war, das Gewebe dazu, zu verhindern, daß die Membran während des Zusammensetzens zer teilt oder während der Hochgeschwindigkeitszentrifugierung verzogen wird. Bei der Probe, wo beide Hauptoberflächen der Membran bedeckt waren, diente das Gewebe, das die zur Basis weisende Oberfläche der Membran bedeckte, dazu, die Bindungs wirksamkeit zu vergrößern.

Fig. 7 zeigt klar, daß Vorrichtungen, die mit Gewebe auf beiden Hauptoberflächen der Membran vorbereitet wurden, in der Lage waren, über 250 µgs Cytochrom c zu binden, was mit weniger als 170 µgs zu vergleichen ist, wenn nur eine Haupt oberfläche mit Gewebe bedeckt war.

BEISPIEL 2

Cytochrom c wurde mit Trypsin digeriert, um Mehrfachpeptide freizugeben, die hinsichtlich der Ladung und Größe variieren. Ungefähr 150 µgs (in 400 µl) des digerierten Materials wurden dem Gerät gemäß Fig. 1 zugeführt, zentrifugiert und zur folgenden Quantifizierung durch Umkehrphasen-HPLC desorbiert. Die Integrationswerte von abgelösten Maxima wurden dann mit der äquivalenten Probenmenge verglichen, die direkt der HPLC- Säule zugeführt wurde (Kontrolle). Um eine optimale Bindung sicherzustellen, wurde der pH-Wert auf 3 eingestellt. Dem Probenzusatz folgend wurde das Gerät für 15 Sekunden zentri fugiert. Als ein Waschschritt wurden 400 µl dH₂O durchzentri fugiert, um Salze, Detergentien und andere nichtadsorbierte gelöste Substanzen zu entfernen. Gebundene Komponenten wurden dann mit zwei 50 µl-Aliquoten eines alkoholischen Lösungs mittels mit hohem pH-Wert desorbiert. Der Ablösevorgang erforderte nur ungefähr 1 Minute zur Ausführung. Die freige gebenen Peptide wurde nachfolgend mit Säure neutralisiert, in eine Säule injiziert und unter Verwendung eines Acetonitril gradienten chromatographiert. In den Fig. 8a und 8b sind Ergebnisse gezeigt, die Peptide, die bei dieser Prozedur erhalten wurden, in Bezug auf die Kontrollprobe vergleichen. Die Chromatogramme in den Fig. 8 und 8b sind virtuell identisch, womit eine wirksame Bindung und Ablösung demonstriert wird. Die Maximaintegrationsergebnisse zeigten, daß die Rückgewinnungen von 75% bis 95% reichen.

BEISPIEL 3

Die Prozedur gemäß Beispiel 2 wurde unter Verwendung eines Endo-lys-c-(Enzym)-Auszugs von α-Lactoglobulin wiederholt, das einen vollständig anderen Peptidsatz als den gemäß Fig. 2 erzeugt. Die Peptide wurden erneut gebunden, gewaschen, abgelöst und analysiert. Die Fig. 9a und 9b zeigen die Chroma togramme, die wiederum virtuell identisch sind, wodurch die Wirksamkeit der Vorrichtung gezeigt wird, selektiv zu adsorbieren und zu desorbieren.

BEISPIEL 4

Ungefähr 20 Picomol von PCR-Primer-Polythymidinsäure, die aus 6 Oligomeren mit einer von 19 bis 24 reichenden Oligomergröße wurden für die Vorrichtung gemäß Fig. 1 durch Lösen einer Probe in einem Puffer (100 mM Ammoniumacetat mit pH 7,0) zubereitet. Dem Zusatz von 10 µl wasserfreier Essigsäure zu 400 µl der Probe (pH = 3,5) folgend wurden die Primere auf dem Gerät zentrifugiert, mit 400 µl deionisiertem Wasser gewaschen, um ungebundene gelöste Substanzen zu entfernen, und schließlich durch Zusatz von 50 µl von 1N-Ammoniumhydroxid in 50% Methanol unter Verwendung einer 30 s-Hochgeschwindigkeits zentrifugierung abgelöst. Die Proben wurden schnell mit HCl neutralisiert und einer C18-Umkehrphasen-Säule in 100 mM- Triethylaminacetat zugeführt und mit einem flachen Gradienten von Acetonitril (0,5%/min) chromatographiert. Der Vergleich des Probenchromatogramms mit dem der abgelösten Substanz zeigt einen hohen Grad der Rückgewinnung. Diese Daten demonstrieren klar, daß die Vorrichtung Oligonukleotide bindet und löst. Daher können solche Moleküle erfindungsgemäß konzentriert und gereinigt werden.

Claims

1. Zentrifugal-Adsorptivprobenpräparationsvorrichtung, umfassend:
ein erstes Mittel zur Aufnahme einer Probe;
ein zweites Mittel zum Verteilen der Probe; und
eine polymergebundene, teilchenbeladene, semipermeable Adsorptivmembran, die zum selektiven Adsorbieren von Biomolekülen wirksam ist, welche ein Molekulargewicht unter halb ungefähr 10 000 aufweisen, und zwischen den ersten und zweiten Mitteln eingeschlossen ist.

2. Zentrifugal-Adsorptivprobenpräparationsgerät gemäß Anspruch 1, worin die semipermeable Adsorptivmembran eine erste Oberfläche, die zu dem ersten Mittel weist, und eine zweite Oberfläche besitzt, die zu dem zweiten Mittel weist, welche semipermeable Adsorptivmembran eine Schicht aus einem Polyester- oder Polyolefin-Gewebe mindestens auf einer von den ersten und zweiten Oberflächen aufweist.

3. Zentrifugal-Adsorptivprobenpräparationsgerät gemäß Anspruch 2, bei dem auf beiden der ersten und zweiten Ober fläche der semipermeablen Membran eine Schicht aus Poly ester- oder Polyolefin-Gewebe vorgesehen ist.

4. Zentrifugal-Adsorptivprobenpräparationsgerät gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Adsorptivmembran Polystyren- Divinylbenzen-Kugel umfaßt.

5. Zentrifugal-Adsorptivprobenpräparationsgerät gemäß Anspruch 4, bei dem die Polystyren-Divinylbenzen-Kugel mit einer schwefligen Säure funktionalisiert sind.

6. Schleuder-Adsorptivprobenpräparationsgerät gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Adsorptivmembran Silika, PVDF- Bindemittel und einen Träger umfaßt.

7. Schleuder-Adsorptivprobenpräparationsgerät gemäß Anspruch 1, bei dem die Adsorptivmembran biomolekulare Kationen adsorbiert.

8. Verfahren zum Einschließen einer Adsorptivmembran in einem Probenpräparationsvorrichtung, die ein erstes Mittel zur Aufnahme einer Probe und ein zweites Mittel zum Verteilen der Probe aufweist, wobei eines der ersten und zweiten Mittel einen Membranträger umfaßt, umfassend:
Bereitstellung einer Schicht umfassend ein Polyester- oder Polyolefingewebe auf einer Hauptoberfläche der Adsorptiv membran;
Anordnung der Adsorptivmembran auf dem Membranträger; und Verbindung des ersten und zweiten Mittels gemeinsam mit der Membran, die zwischen diesen angeordnet ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem die Adsorptivmembran Polystyren-Divinylbenzen-Kugel umfaßt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem die Adsorptivmembran Silika, PVDF-Bindemittel und einen Träger umfaßt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem ferner eine Schicht umfassend ein Polyester- oder Polyolefin-Gewebe auf einer zweiten Hauptoberfläche der Adsorptivmembran bereitgestellt wird.

12. Verfahren gemäß Anspruch 8, bei der das erste Mittel ein Probenreservoir umfaßt.

13. Polymergebundene, teilchenbeladene Adsorptivmembran, die zum selektiven Adsorbieren einer analytischen Substanz wirksam ist, welche Membran eine erste Oberfläche umfaßt, die dazu vorgesehen ist, der analytischen Substanz ausgesetzt zu sein, wobei auf der ersten Oberfläche eine Schicht aus Gewebe auf Polyester- oder Polyolefin-Basis vorgesehen ist.

14. Adsorptivmembran gemäß Anspruch 13, bei der die Membran ferner eine zweite Oberfläche gegenüber zu der ersten Ober fläche umfaßt, wobei auf der zweiten Oberfläche eine Schicht aus Gewebe auf Polyester- oder Polyolefin-Basis vorgesehen ist.

15. Adsorptivmembran gemäß Anspruch 13 oder 14, ferner umfassend Polystyren-Divinylbenzen-Kugel.

16. Adsorptivmembran gemäß Anspruch 13 oder 14, ferner umfassend Silika, PVDF-Bindemittel und einen Träger.

17. Zentrifugalfiltrationsvorrichtung, umfassend:
ein Probenreservoir,
eine Basis, die unterhalb des Probenreservoirs angeordnet ist,
ein Adsorptivfiltermittel, das das Probenreservoir von der Basis trennen, wobei das Adsorptivfiltermittel eine semi permeable, polymergebundene, mit Teilchen beladene Adsorptiv membran umfassen,
einen Träger für das Adsorptivfiltermittel,
eine oder mehrere Filtratleitungen in der Basis, um den Durchtritt von Filtrat von dem Filtermittel in die Basis zu ermöglichen, und
Mittel zur Bereitstellung eines flüssigkeitsdichten Verschlusses zwischen dem Rand des Probenreservoirs, der Membran und dem Membranträger.

18. Filtrationsvorrichtung gemäß Anspruch 17, bei der das Adsorptivfiltermittel eine erste Oberfläche aufweist, die zum Probenreservoir weist, wobei auf der ersten Oberfläche eine Schicht aus Gewebe auf Polyester- oder Polyolefin-Basis vor gesehen ist.

19. Filtrationsvorrichtung gemäß Anspruch 18, bei der das Adsorptivfiltermittel eine zweite Oberfläche gegenüber zu der ersten Oberfläche aufweist, wobei auf der zweiten Oberfläche eine Schicht aus Gewebe auf Polyester- oder Polyolefin-Basis vorgesehen ist.

20. Verfahren zum selektiven Adsorbieren von Biomolekülen, die ein Molekulargewicht unterhalb von ungefähr 10 000 aufweisen, aus einer Probe, umfassend:
Kontaktieren der Probe mit einer semipermeablen, polymer gebundenen, teilchenbeladenen Adsorptivmembran, um so die Biomoleküle zu veranlassen, an der Membran adsorbiert zu werden, und
Unterziehen der Membran einer Zentrifugierung, um so die Probe, die nicht durch die Membran adsorbiert wird, zu veran lassen, durch die Membran hindurchzutreten.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, bei dem ferner die Biomole küle mit einem Mittel, das zum Ablösen der Biomoleküle wirksam ist, von der Membran abgelöst werden.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, bei dem das Volumen der Probe größer als das Volumen des ablösenden Mittels ist, wodurch eine Konzentration der Biomoleküle resultiert.

23. Verfahren gemäß Anspruch 20, bei dem die Probe, die nicht adsorbiert wird, Verunreinigungen umfaßt, wodurch eine Reinigung der Biomoleküle bei Ablösung resultiert.