DE112004000843B4

DE112004000843B4 - Festphasen-Extraktionsvorrichtung

Info

Publication number: DE112004000843B4
Application number: DE112004000843.3T
Authority: DE
Inventors: William Hudson; Wilford C. Downs
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2003-05-29
Filing date: 2004-05-28
Publication date: 2015-01-29
Anticipated expiration: 2024-05-29
Also published as: CA2523982C; US7595026B2; GB2418249A; GB0521759D0; GB2418249B8; WO2004106914A1; JP2007503595A; US20060216206A1; CA2523982A1; GB2418249B; DE112004000843T5; JP4880468B2

Abstract

Festphasen-Extraktionsvorrichtung für die Probenherstellung umfassend ein hohles, konisches Rohr mit einer engeren Öffnung und einer breiteren Öffnung, wobei die engere Öffnung des Rohres ein Festphasen-Extraktionsmaterial, das ein funktionalisiertes, monolithisches Sorptionsmittel umfasst, enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasen-Extraktionsvorrichtung durch eine Kombination von bezogen auf Atmosphärendruck reduziertem Druck, bezogen auf Atmosphärendruck erhöhtem Druck und mechanischer Verdichtung hergestellt ist, und wobei das funktionalisierte, monolithische Sorptionsmittel eine Glasfasermatrix, die eine Verbundphase aus einem Metall- oder Halbmetalloxid enthält, umfasst.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf Vorrichtungen zur Vorbereitung von Proben für die Analyse, und insbesondere für die Vorbereitung von Proben mit kleinem Volumen für die Analyse.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Vorbereitung von Proben für die Analyse kann eine erhebliche Menge an Probenmaterial verbrauchen, belanglose oder falsche Resultate in der Analyse bewirken und dann erhebliche Zeit in Anspruch nehmen, so dass die mit der Analyse verbundenen Kosten erhöht werden. Proben-Vorbereitungsverfahren umfassen im allgemeinen das Entfernen von Salzen und anderen unerwünschten Komponenten, die in der Probe vorhanden sind, das Entfernen von unerwünschten Lösungsmitteln oder Tausch von einem Lösungsmittel, in dem die beabsichtigten Analyte gelöst sind, gegen ein anderes Lösungsmittel, die Konzentration der Analyte auf eine vorgegebene Konzentration und dergleichen umfassen. Somit können unangemessene Proben-Vorbereitungsverfahren in einem Verlust der beabsichtigten Analyte und auch in einem Zeitverlust und erhöhten Kosten resultieren, was die Analyseprozeduren kostspielig, zeitintensiv, unzuverlässig, unreproduzierbar und unbefriedigend macht. Zahlreiche Verfahren zur Vorbereitung von Proben dienen zur Zeit zur Verfügung einschließlich der Festphasen-Extraktion („SPE” = Solid Phase Extraction), um Analyte von einer Flüssigphase auf eine Festphase zu konzentrieren, aus der sie dann in einer relativ reinen Form für die weitere Analyse entfernt werden können. Extraktionsverfahren aus der flüssigen Phase sind ebenfalls bekannt zusammen mit Flüssig-Flüssig-Phasenextraktions- und Flüssig-Flüssig-Flüssig-Phasenextraktionsverfahren.
Je nach der Art der durchzuführenden Analyse und dem verwendeten Detektionsverfahren kann das SPE darauf abgestimmt werden, spezifische Störungen zu entfernen. Die Analyse von biologischen Proben, beispielsweise Plasma und Urin, unter Verwendung von Hoch-Performance-Flüssigchromotographie (HPLC = High Performance Liquid Chromotography) oder Massenspektrometrie erfordert im allgemeinen SPE vor der Analyse sowohl, um lösliche Materie und lösliche Störsubstanzen zu entfernen, als auch um die Zielverbindungen vor zu konzentrieren zum Zwecke der verbesserten Meßempfindlichkeit. Viele biologische Proben enthalten Salze oder andere Ionen – unterdrückende Komponenten, die besonders problematisch sind, wenn eine Messung auf der Basis von einem Massenspektrometer verwendet wird. SPE kann auch verwendet werden, um eine einfache Fraktionierung einer Probe auf der Basis von Unterschieden in der Hydrophobizität oder von funktionalen Gruppen der Proben-Komponenten verwendet werden, um dadurch die Komplexität der analysierten Probe zu reduzieren.
Vorrichtungen, die für SPE ausgelegt sind, umfassen typischerweise ein chromatographisches Lösungsmittel, welches es dem Benutzer erlaubt, Proben-Komponenten bevorzugt zu erhalten. Sobald eine Probe in dem Lösungsmittel eingebracht ist, werden eine Reihe von Wasch- und -Elutions-Strömungsmittel durch die Vorrichtung geschickt, um die Verunreinigungen oder störenden Verbindungen von den beabsichtigten Probenanalyten zu trennen, und um dann die Ziel-Probenanalyten für die weitere Analyse zu sammeln. SPE-Vorrichtungen umfassen gewöhnlich ein die Probe enthaltendes Reservoir, Mittel zum Enthalten des Lösungsmittels und eine Strömungsmittelleitung oder einen Ausguß, um die Strömungsmittel, die die Vorrichtung verlassen, in geeignete Sammelbehälter abzuführen. Die SPE-Vorrichtung kann in einem Ein-Napf-Format, dass zur Vorbereitung einer kleinen Anzahl von Proben geeignet und kosteneffektiv ist, oder in einem Fehl-Napf-Format sein, dass zur parallelen Vorbereitung einer großen Anzahl von Proben gut geeignet ist. Viel-Napf-Formate werden gewöhnlich mit Roboter-Strömungsmittelabgabe-Systemen verwendet. Typische Viel-Napf-Formate umfassen 48, 96- und 384-Napf-Standardplattenformate. Die Strömungsmittel werden gewöhnlich durch die SPE Vorrichtung und in die Sammelbehälter entweder durch Anlegen eines Vakuums über der Vorrichtung mit einem speziell ausgelegten Vakuumverteiler oder durch Verwendung von Zentrifugalkräften oder der Schwerkraft getrübt. Die Zentrifugalkraft wird dadurch erzeugt, dass die SPE Vorrichtung zusammen mit einem geeigneten Sammeltablett in eine Zentrifuge eingelegt wird, die speziell für den beabsichtigten Zweck ausgelegt ist. Alle diese Formate erfordern jedoch eine relativ große Menge an Probenmaterial und Lösungsmitteln, und sie erfordern mehrere Schritte der Strömungsmittelübertragung.
Herkömmliche SPE-Vorrichtungsdesigns haben gepackte Betten aus Sorbtionsmittelteilchen verwendet, die zwischen porösen Filterscheiben enthalten sind, die in der SPE Vorrichtung enthalten sind. beispielsweise beschreibt das US Patent US 6 723 236 B2 von Fisk SPE Vorrichtungen, in denen Sorbtionsmittelteilchen zwischen zwei porösen Filterelementen enthalten sind. Die Retention der Verbindungen durch die resultierenden, gepackten Betten ist typischerweise recht gut, insbesondere dann, wenn die Eigenschaften des Sorbtionsmittels sorgfältig ausgewählt sind. Ein Nachteil mit herkömmlichen Vorrichtungen mit gepackten Betten ist es, dass das Hohlraumvolumen, das in den porösen Filtern und in den gepackten Betten vorhanden ist, es erfordert, dass verhältnismäßig große Elutionsvolumina verwendet werden, um die Zielverbindungen auszuwaschen. Typische Elutionsvolumina, die erforderlich sind, um die Zielverbindungen aus einer SPE Vorrichtung vom Typ mit gepacktem Bett voll auszuwaschen, fallen in den Bereich von 0,20–5 ml oder mehr, je nach der Größe des Sorbtionsmittelbetts.
Somit sind solche Vorrichtungen nicht für kleine Probenmengen oder kleine Volumina geeignet, und es gibt einen Bedarf im Stand der Technik für Vorrichtungen und Verfahren, um kleine Probengrößen und -Mengen zu handhaben. Um diesen Bedarf im Stand der Technik anzusprechen, beschreibt das US-Patent US 5 906 796 A von Blevins eine Festphasen-Extraktionsplatte, die eine Vielzahl von Festphasen-Extraktionsscheiben verwendet, die unter Press-Sitz zwischen den Seitenwänden der Kammern eingepaßt sind. Eine Vielzahl von Extraktionsmedien wurden als nützlich berichtet, insbesondere ein unpolares Extraktionsmedium, dass Siliciumdioxide enthält, dass mit hydrophoben Gruppen verbunden ist und von Varian, Inc. in Lake Forest, CA unter dem Warennamen SPEC^® erhältlich ist.
Es wäre jedoch günstig, die Möglichkeiten der Festphasen-Extraktion in Mikrovolumen-Flüssigkeitshandhabungs- und Abgabe-Vorrichtungen selbst vorzusehen und damit Schritte in der Verarbeitung der Proben zu eliminieren. Zu diesem Zweck beschreibt das US Patent US 6 416 716 B1 von Shukla eine Vorrichtung für die Vorbereitung einer kleinen Probe unter Verwendung von Rohren und Säulen, beispielsweise Kapillaren oder Pipettenspitzen, in denen Teilchen eines Trennmediums direkt in das Festphasenmaterial eingebettet sind, das die Vorrichtung bildet. Shukla berichtet ferner, dass die Verwendung von Filtern, um die Trennmedien zu halten, problematisch ist, weil Filter die Rate, mit der das Muster durch die Säule fließt, verlangsamt und zu einem Verlust von Probenmaterial auf dem Filtermaterial führen. Shukla sagt, dass der Verlust an Probenmaterial besonders signifikant sein kann, wenn es um sehr kleine Probenvolumen geht. Shukla sagt ferner, dass filterfreie Säulen, die auf einer soliden Stützmatrix mit eingebettetem Trennmedium beruhen, vorhanden sind, dass jedoch der Probenfluß durch diese Säulen langsam ist.
Die US Patente US 6 048 457 A und US 6 200 474 B1 von Kopaciewicz beschreiben Verfahren zur Vorbereitung von an Ort und Stelle gegossenen Zusammensetzungen und/oder nicht gefüllten Strukturen, die als Sorbtions- oder Reaktions-Medien oder zum Zwecke von Trennung auf der Basis von Größe geeignet sind. die Vorrichtungen umfassen, wie berichtet wird, eine große Menge an adsorbtiven Teilchen, die in einem polymeren eingeschlossen sind, während sie dennoch die dreidimensionale Membranenstruktur beibehalten. In einem bevorzugten Aspekt wird berichtet, dass die Verfahren zur Vorbereitung von Teilchen geeignet sind, die in einem porösen, polymeren Substrat in einer Pipettenspitze eingeschlossen sind.
In der US 2002/0043499 A1 ist die Herstellung und Verwendung von Matrizenpartikeln mit festen Räumen, Zwischenräumen und Zwischenraumpolymernetzwerken beschrieben. Gemäß dieser Druckschrift können die Matrixpartikel in eine Säule gepackt werden, indem eine Kombination aus Überdruck und Vibrationen eingesetzt werden.
Aus der Veröffentlichung von Pedersen, D. S. und Rosenbohm, C., „Dry Column Vacuum Chromatography”, aus Synthesis 2001, No. 16, 2001, Seiten 2431–2434 ist ferner bekannt, dass man ein Sorbtionsmittel in eine Säule packen kann, indem an einem Ende des Rohres ein Unterdruck bzw. Vakuum angelegt wird.
Die EP 1 262 759 A1 betrifft eine Vorrichtung zum Bearbeiten von Proben, umfassend einen Körper mit einem Sammelraum, welcher mit einer auf diesen Sammelraum wirkenden Pumpe zum Aspirieren bzw. Dispensieren von Flüssigkeiten verbindbar ist; einen an den Sammelraum anschliessenden Trennraum zur Festphasenextraktion und Elution von aus diesen Proben abgetrennten organischen bzw anorganischen Teilchen; und eine Öffnung zum Abgeben dieser Teilchen. Die Vorrichtung betrifft auch Einzelpipettenspitzen und umfasst eine mit dem Sammelraum bzw. dem Körper verbundene Kapillare, welche eine Packung zur Festphasenextraktion von aus diesen Proben abgetrennten organischen bzw. anorganischen Teilchen aufweist und als Trennraum dient.
Diese Vorrichtungen und andere leiden jedoch unter den Einschränkungen in den Verfahren zur Vorbereitung, die in einer Nicht-Reproduzierbarkeit, einer schwachen Flußrate, einer geringen Fähigkeit der Absorbtion von Analyten, ungleichförmigen Flußraten, hohen Herstellungskosten und dergleichen resultieren. Folglich gibt es einen Bedarf im Stand der Technik, um SPE Vorrichtungen und -Verfahren zur Vorbereitung derselben zu verbessern, die die Einschränkungen der Vorrichtungen nach dem Stand der Technik überwinden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Folglich ist es eine primäre Aufgabe der Erfindung, den oben genannten Bedarf im Stand der Technik durch Bereitstellung neuartiger Vorrichtungen und Verfahren anzusprechen, die eine Fähigkeit der Festphasen-Extraktion in Verbindung mit der Fähigkeit einer Flüssigkeitsübertragung aufweist.
Es ist eine andere Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Vorbereitung solcher Festphasen-Extraktionsvorrichtungen bereit zu stellen, die eine reproduzierbare Arbeitsweise zeigen und die nicht in dem Verlust kostbaren Probenmaterials resultieren. Es ist eine weitere Aufgabe, Verfahren zur Vorbereitung von Festphasen-Extraktionsvorrichtungen bereit zu stellen, die eine größere und präzisere Rückgewinnung des Analyten von den Mustern liefern. Es ist noch eine weitere Aufgabe, Verfahren zur Vorbereitung von Festphasen-Extraktionsvorrichtungen bereit zu stellen, die eine zuverlässigere Arbeitsweise sowohl im Bezug auf Analyt-Rückgewinnung als auch auf die Einfachheit der Benutzung liefern.
Folglich werden Festphasen-Extraktionsvorrichtungen für die Probenvorbereitung bereit gestellt, die ein hohles, konisches Rohr aufweisen, dass eine engere Öffnung und eine breitere Öffnung hat, wobei die engere Öffnung des Rohres ein Festphasen-Extraktionsmaterial, das ein funktionalisiertes, monolithisches Sorbtionsmittel umfasst, enthält, worin die Festphasen-Extraktionsvorrichtung durch eine Kombination von bezogen auf Atmosphärendruck reduziertem Druck, bezogen auf Atmosphärendruck, erhöhtem Druck und mechanischer Verdichtung hergestellt ist, und wobei das funktionalisierte, monolithische Sorptionsmittel eine Glasfasermatrix, die eine Verbundphase aus einem Metall- oder Halbmetalloxid enthält, umfasst. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Festphasen-Extraktionsvorrichtung eine Pipette mit einer kleineren Öffnung und einer größeren Öffnung und einem funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittel, das in der kleineren Öffnung (oder Spitze) der Pipette angeordnet ist. Das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel wird in der kleineren Öffnung der Pipette durch eine Kombination aus reduziertem Druck, erhöhtem Druck und mechanischer Verdichtung angeordnet.
Das Festphasen-Extraktionsmaterial ist ein funktionalisiertes, monolitisches Sorbtionsmittel, das eine Glasfasermatrix aufweist, in der eine gebundene Phase eingebettet ist, die ein Metalloxid oder ein Halbmetalloxid umfasst, die reaktive Metalloxide haben, die mit Silan, beispielsweise Alkoxysilan, Aminosilan, Hydroxisilan oder Halosilan, reagieren können. Geeignete Metalloxide und Halbmetalloxide umfassen Siliciumdioxid, Aluminiumdioxid, Zeolit, Mullfit, Zirconoxide, Vanadiumoxid oder Titanoxide oder Mischungen oder Verbundstoffe davon. Entsprechend ist die Glasfasermatrix aus einem Metall- oder Halbmetalloxid zusammengesetzt. Nach der Reaktion des Festphasen-Extraktionsmaterials mit Silan ist das Silan mit dem anorganischen Substrat über eine Sauerstoffverbindung verbunden, und die Metall- oder Halbmetalloxide werden beispielsweise mit Hydrocarbyl, Amido, Carbamyl, Carbamato, Urethan, Carbamido, Isocyanato, Diol, Glycidoxy, Ethoxy, Propoxy, Carbonyl, Carboxy, Acetonyl, Thio, Dithio, Hydroxy, Ether, Sulfinyl, Sulfonyl, Sulfonsäure, Sulfat, Sulfonamido, Amino, Nitrilo, Isonitrilo, Epoxy, Guanidino, Nitro, Nitroso, und Phosphat funktionalisiert. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel enthält das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel gebundenes Siliciumdioxid. Das Siliciumdioxid kann durch ein im Stand der Technik bekanntes Verfahren behandelt (oder funktionalisiert) sein. In einem bevorzugtem Ausführungsbeispiel wird das Siliciumdioxid mit Alkylresten, typischerweise C_2-30-Alkylgruppen, gebunden, um das Silicumdioxid hydrophob zu machen.
Es werden auch Verfahren bereit gestellt, um eine Vorrichtung für die Festphasen-Extraktion vorzubereiten. Die folgenden Schritte werden im allgemeinen verwendet: Einführen eines funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittels in ein hohles Rohr mit einer breiteren Offnung und einer engeren Offnung; Anlegen eines bezogen auf Atmosphärendruck reduzierten Drucks an die engere Öffnung des Rohres, um dass funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel in das Rohr einzuführen, Anlegen eines bezogen auf Atmosphärendruck erhöhten Drucks an die breitere Öffnung des Rohres, um das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel in die engere Öffnung des Rohres einzuführen; und Verdichten des funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittels, wobei das funktionalisierte, monolithische Sorptionsmittel eine Glasfasermatrix, die eine Verbundphase aus einem Metall- oder Halbmetalloxid enthält, umfasst.
In einem bevorzugtem Ausführungsbeispiel ist die Festphasen-Extraktionsvorrichtung eine Festphasenextraktionspipette, und das hohle Rohr mit einer breiteren Öffnung und einer engeren Öffnung ist eine Pipettenspitze. Im allgemeinen wird das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel in der kleineren Öffnung der Pipette durch die folgenden Schritte angeordnet: Einführen des funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittels in die größere Öffnung der Pipette; Anlegen eines reduzierten Drucks an die kleinere Öffnung der Pipette, um das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel einzuführen; Anlegen eines erhöhten Drucks an die größere Öffnung der Pipette, um das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel in die Pipettenspitze einzuführen; und Verdichten des funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittels. Typischerweise beträgt der reduzierte Druck etwa 25 Inch Quecksilbersäule, und der erhöhte Druck ist von etwa 95 psi bis etwa 110 psi, und typischerweise etwa 100 psi.
Es werden auch Verfahren zur Vorbereitung einer Probe für die Analyse bereit gestellt, die allgemein die folgenden Schritte aufweisen: Aktivieren einer Festphasen-Extraktions-Pipette gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9; Absorbieren von Komponenten eines Musters, das analysiert werden soll, in die Festphasen-Extraktions-Pipette; Waschen der Festphasen-Extraktionspipette mit einem Lösungsmittel, das die absorbieren Analyte nicht von dem Festphasen-Extraktions-Material entfernt; Waschen der Festphasen-Extraktions-Pipette mit einem Lösungsmittel, welches die absorbierten Analyte von dem Festphasen-Extraktionsmaterial entfernt; und Sammeln der Analyte.
Zusätzliche Aufgaben, Vorteile und neuartige Merkmale der Erfindung werden teilweise in der Beschreibung die folgt, angegeben und teilweise für den Durchschnittsfachmann bei Überprüfung des folgenden ersichtlich oder können durch Ausübung der Erfindung erlernt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer Festphasen-Extraktionsvorrichtung.
2 zeigt zusätzliche Ausführungsbeispiele einer Festphasen-Extraktions-Pipette unter Verwendung verschiedener Mengen an Sorbtionsmittel.
3 zeigt die Rückgewinnung von Peptiden von einer Probe unter den Bedingungen von keiner Behandlung, Behandlung unter Verwendung einer Festphasen-Extraktionspipette, die wie hier beschrieben vorbereitet wurde, und einer Festphasen-Extraktionspipette, die durch einen alternativen Hersteller vorbereitet wurde,
4 zeigt ein HPLC-Chromatogramm, das die Anwesenheit von Drogen zeigt, von einem Plasma, das unter Verwendung einer Festphasen-Extraktionspipette gewonnen wurde, die in der hier beschriebenen Weise vorbereitet war.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. Definitionen und Übersicht
Bevor die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben wird, ist zu verstehen, dass die Erfindung nicht auf eine spezielle Pipettenspitzenform, – Größe oder dergleichen eingeschränkt ist, da diese sich ändern können, es sei denn, dass es anders beschrieben ist. Es ist auch zu verstehen, dass die hier verwendete Terminologie nur zum Zwecke der Beschreibung spezieller Ausführungsbeispiele ist und den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken soll.
Es ist zu beachten, dass der in Singular-Formen „ein”, ”und„ und „der, die, das” auch die Plural-Formen umfassen außer, wenn der Zusammenhang klar etwas anderes vorschreibt. So umfasst beispielsweise die Bezugnahme auf „ein Lösungsmittel” zwei oder mehrere Lösungsmittel, die Bezugnahme auf „ein Analyt” zwei oder mehrere Analyte usw.
Wo ein Bereich von Werten angegeben ist, ist zu verstehen, dass jeder Zwischenwert bis auf ein Zehntel der Einheit der unteren Grenze außer, wenn der Zusammenhang klar etwas anderes vorschreibt, zwischen der oberen Grenze und der unteren Grenze des Bereichs und jeden anderen Angegebenen oder dazwischenliegenden Wert in dem angegebenen Bereich in der Erfindung mit einbezogen ist. Die oberen und unteren Grenzen dieser kleineren Bereiche können unabhängig voneinander in den kleineren Bereichen enthalten sein, und sie sind ebenfalls in der Erfindung umfasst, außer bei einem speziell ausgeschlossenen Grenzwert in einem angegebenen Bereich. Wo der angegebene Bereich eine oder beide der Grenzwerte umfasst, sind Bereiche, die einen oder beide dieser Grenzwerte ausschließen ebenfalls in der Erfindung umfasst.
Wie er hier benutzt wird, bezieht sich der Begriff „Pipette” auf den mit dem Strömungsmittel in Kontakt tretenden Teil einer Pipette, im allgemeinen eine einmal-Pipettenspitze, die im Zusammenhang mit einer Pipette verwendet wird, die zur Abgabe von kleinen Mengen eines Strömungsmittels verwendet wird.
Wie er hier benutzt wird, wird der Begriff „Stück” verwendet, um eine Masse an Festphasen-Extraktionsmaterial zu bezeichnen.
Wie er hier benutzt wird, bezieht sich der Begriff „funktionalisiertes, monolithisches Sorbtionsmittel” auf eine Glasfasermatrix, die Metalloxide in gebundener Phase, vorzugsweise Siliciumdioxid, enthält.
Glasfaserfilter sind im Stand der Technik als nützlich im Zusammenhang mit der Filtration bekannt, man glaubt jedoch, dass dieses Material einen zu kleinen Oberflächenbereich hat, um für die Festphasen-Extraktion geeignet zu sein, und tatsächlich hat man Glasfasern im allgemeinen als inert und nicht-adsorptive gegenüber chromatographischen oder analytischen Verfahren betrachtet. So wurden Glasfasern bei SPE hauptsächlich als Rückhaltemittel für das Sorbtionsmittel und nicht als SPE-Absorbtionsmaterial selbst benutzt ungeachtet der Berichte, dass der Filter selbst zu einem Verlust an Probenmaterial führen kann, wie durch die US Patentschrift US 6 416 716 B1 suggeriert wird. Die vorliegenden Erfinder haben die überraschende Entdeckung gemacht, dass Glasfasermatrizen, die in dem Verbundphasen-Siliciumdioxid eingebettet sind, zu einem funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittel in einer Festphasenextraktionspipette ausgebildet werden kann, da es eine hohe Absorbtionsfähigkeit für Analyte hat, während gute Strömungseigenschaften und eine Reproduzierbarkeit in dem Betrieb und in der Herstellung beibehalten wird. Herkömmliche Mittel, um Glasfasermatrizen, die mit Verbundphasen-Siliciumdioxid eingebettet sind, um Festphasen-Extraktionsvorrichtungen für die Extraktion von mikromolaren oder kleinen Mengen an Analyten zu bilden, haben sich als unpraktisch aufgrund einer Beschädigung der empfindlichen Glasfasermatrix herausgestellt. Die vorliegenden Erfinder haben jedoch die überraschende Entdeckung gemacht, dass eine Festphasen-Extraktionspipette, die ein funktionalisiertes, monolithisches Sorbtionsmittel enthält, da es aus Glasfasermatrizen mit Verbundphasen-Siliciumdioxid aufweist, unter Verwendung einer Kombination von reduziertem Druck, erhöhtem Druck und mechanischer Verdichtung hergestellt werden können, was in einer in hohen Maßen reproduzierbaren Herstellung des Festphasen-Extraktions-Sorbtionsmittels in einer Pipettenspitze resultiert, die gute Strömungseigenschaften und sowohl eine außerordentlich gute Retention und eine Rückgewinnung von Analyten hat.
Folglich werden Festphasen-Extraktionsvorrichtungen für die Vorbereitung von Proben bereit gestellt, die ein hohles, konisches Rohr aufweist, das eine engere Öffnung und eine breitere Öffnung hat, wobei die engere Öffnung des Rohres ein Festphasen-Extraktionsmaterial enthält, das ein funktionalisiertes, monolithisches Sorbtionsmittel umfasst, wobei die Festphasen-Extraktionsvorrichtung durch eine Kombination aus einem reduziertem Druck, einem erhöhten Druck und mechanischer Verdichtung vorbereitet wird. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Festphasen-Extraktionsvorrichtung eine Pipette mit einer kleineren Öffnung und einer größeren Öffnung und einem funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittel, das in der kleineren Öffnung (oder der Spitze) der Pipette angeordnet ist. Das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel wird in der kleineren Öffnung der Pipette durch eine Kombination aus reduziertem Druck, erhöhtem Druck und mechanischer Verdichtung angeordnet.
Diese Vorrichtungen und Verfahren zur Vorbereitung und zur Verwendung der Vorrichtung werden in größerem Detail unten beschrieben.
II. Festphasen-Extraktionsvorrichtungen
A. Spezifikationen der Vorrichtung
Die Festphasen-Extraktionsvorrichtung umfasst ein hohles, konisches Rohr, das eine Vielzahl von Formen, Formgebungen und Dimensionen annehmen kann. Typischerweise hat das Rohr einen kreisförmigen Querschnitt, prinzipiell kann das Rohr jedoch oval, quadratisch, rechteckig oder unregelmäßig und dergleichen sein, solange dass Festphasenmaterial in dem Rohr angeordnet werden kann, um hohe Strömungscharakteristiken zu verwirklichen. Das hohle Rohr kann aus einem beliebigen Material aufgebaut sein, das zum Aufbewahren und Abgeben von Flüssigkeiten geeignet ist, und es wird im allgemeinen aus einem polymeren Material, beispielsweise aus Polyolefin, fluorierten Polymeren, Polysulfon, Polyethersulfon, Celluloseacetat, Polystyrol, Polystyrol/Acrylonitril-Kopolymeren, PVDF und dergleichen sein. Polyolefin-Materialien sind bevorzugt, beispielsweise Polypropylen, Polyethylen, Polytetrafluorethylen oder Kopolymere davon. Für nicht wäßrige Flüssigkeiten kann das Rohr aus einem Material aufgebaut sein, das keine Verunreinigungen in die nicht wäßrige Flüssigkeit durch Auflösen oder Auslecken abgibt. Vorzugsweise sind die Vorrichtungen aus ultra-reinen Polymeren, vorzugsweise Polypropylen, aufgebaut.
In einem bevorzugten Beispiel ist die Festphasen-Extraktionsvorrichtung in Form einer Pipettenspitze ausgebildet, die mit einem beliebigen, herkömmlichen, von Hand betriebenen oder automatisierten Pipettenvorrichtung verwendet werden kann. Die Pipettenspitze ist nicht auf eine spezielle Größe oder Form oder ein Konstruktionsmerkmal eingeschränkt. Das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel kann eine variable Menge des Volumens der Pipettenspitze einnehmen, beispielsweise wenigstens bis zu etwa 10% des Nutzvolumens der Pipettenspitze. Repräsentative Ausführungsbeispiele sind in den 1 und 2 gezeigt.
B. Festphasen-Extraktionsmaterialien
Das Festphasen-Extraktionsmaterial ist ein funktionalisiertes, monolithisches Sorbtionsmittel, das eine Glasfasermatrix eingebettet mit einer Verbundphase umfasst, die ein Metalloxid oder ein Halbmetalloxid aufweist, die reaktive Metalloxide haben, die in der Lage sind, mit Silanmaterialien, beispielsweise Alkoxysilan-, Aminosilan-, Hydroxysilan- oder Halosilan-Materialien, zu reagieren. Geeignete Metalloxide und Halbmetalloxide umfassen Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Zeolit, Mulit, Zirkoniumoxid, Vanadiumoxid oder Titanoxid oder Mischungen und Zusammensetzungen davon. Entsprechend ist die Glasfasermatrix aus einem Metall- oder Halbmetall-Oxid zusammengesetzt. Nach der Reaktion des Festphasen-Extraktionsmaterials mit einem Silan ist das Silan kovalent mit dem anorganischen Substrat über eine Sauerstoffverbindung verbunden, und die Metall- oder Halbmetall-Oxide werden beispielsweise mit Hydrocarbyl, Amido, Carbamyl, Carbamato, Urethan, Carbamido, Isocyanato, Diol, Glycidoxy, Ethoxy, Propoxy, Carbonyl, Carboxy, Acetonyl, Thio, Dithio, Hydroxy, Ether, Sulfinyl, Sulfonyl, Sulfonsäure, Sulfat, Sulfonamido, Amino, Nitrilo, Isonitrilo, Epoxy, Guanidino, Nitro, Nitroso, und Phosphat funktionalisiert.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel enthält das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel gebundenes Siliciumdioxid. Das Siliciumdioxid kann durch ein beliebiges im Stand der Technik bekanntes Verfahren chemisch behandelt (oder funktionalisiert) werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird das Siliciumdioxid mit Alkoxyresten, typischerweise C_2-30 Alkylgruppen, gebunden, um das Siliciumdioxid hydrophobisch zu machen. Jede Verbundphase, die verwendet werden kann, um das Siliciumdioxid zu modifizieren, ist möglich, beispielsweise Amino, Cyano, Glycidyl und dergleichen, und auch Anionen- oder Kationen-Austauschgruppen, wie sie oben diskutiert wurden.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel aus Glasmikrofasern, die mit einem modifizierten Siliciumdioxid imprägniert sind, die vorzugsweise unter Verwendung von Organosilanverbindungen vorbereitet sind, die von Varian, Inc., Lake Forest, Calif., erhältlich sind und die dem SPEC^®-Produkt ähnlich sind. Dieses monolithische, gebundene Siliciumdioxid gestattet eine in hohem Maße verbesserte Strömung. Das monolithische Design in der gesamten Membran hat eine in hohem Maße effektive Massenübertragung im Vergleich zu der von SPE-Säulen mit gepacktem Bett zur Folge. Mit dem monolithischen Design gibt es viel weniger totes Volumen, und weniger Lösungsmittel wie bei der Verarbeitung der Probe verwendet. Die Bindungkapazität des funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittels ist im allgemeinen im Bereich von etwa 1 Microgramm analyt pro 0,5 mg Sorbtionsmittel.
Die Glasfasermatrix bildet ein poröses Labyrinth, was hohe Strömungscharakteristiken gestattet, während eine hohe Retention des Analyten sichergestellt wird. Das Glasfaser-Matrixmaterial ist typischerweise aus unregelmäßig verteilten Fasern aufgebaut, die einen gebundenen Weg mit einer normaldimensionierten Größe erzeugen. In bestimmten Ausführungsbeispielen hat die Glasfasermatrix eine Dicke von etwa 0,1 bis etwa 2 Millimeter (mm), und typischerweise eine Dicke von etwa 1 mm.
Die Strömungseigenschaften der Festphasen-Extraktionspipette können bequem dadurch festgestellt werden, dass die Strömung von Umgebungsluft durch die Pipettenspitze von der größeren Öffnung zu der Spitze hin gemessen wird, wenn die Spitze der Pipette mit einer Vakuumquelle verbunden ist. Festphasen-Extraktionspipetten, die durch die hier beschriebenen Verfahren hergestellt sind, entwickeln ein Vakuum über dem funktionalisiertem, monolithischem Sorbtionsmittel bei einer Rate von etwa 1 Inch Quecksilbersäule in etwa 2–3 Sekunden, wenn die Pipettenspitze mit einer Vakuumquelle verbunden wird, währen der Aufbau eines Vakuums an dem Ende mit einer größeren Öffnung gemessen wird. Diese Strömungsraten liefern einen guten Wirkungsgrad, selbst bei viskosen Probenlösungen.
Es ist wichtig, dass die Verfahren zur Vorbereitung der Festphasen-Extraktionspipetten reproduzierbare Ergebnisse liefern, da wertvolle Proben durch die Verwendung von Pipettenspitzen verloren gehen können, die keine adäquaten Strömungscharakteristiken zeigen. Durch Verwendung der hier beschriebenen Verfahren werden Festphasen-Extraktionspipetten bereitgestellt, die eine gleichförmige Strömung durch das monolithische Sorbtionsmittel haben, was auch zu einer größeren Reproduzierbarkeit und zu überlegener Performance führt.
III. Verfahren zur Vorbereitung der Festphasen-Extraktionsvorrichtung
Verfahren werden auch bereitgestellt, um eine Vorrichtung für die Festphasen-Extraktion vorzubereiten. Die folgenden Schritte werden im allgemeinen verwendet: Einführen eines funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittels in ein hohles Rohr mit einer breiteren Öffnung und einer engeren Öffnung; Anlegen eines reduzierten Drucks an die engere Öffnung des Rohres, um das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel in das Rohr einzuführen; Anlegen eines erhöhten Drucks an die breitere Öffnung des Rohres, um das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel in die enge Öffnung des Rohres einzuführen; und Verdichten des funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittels.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Festphasen-Extraktionsvorrichtung eine Festphasen-Extraktionspipette, und das hohle Rohr mit einer breiteren Öffnung und einer engeren Öffnung ist eine Pipettenspitze. Im allgemeinen wird das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel in der kleineren Öffnung der Pipette durch die folgenden Schritte angeordnet: Einführen des funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittels in die größere Öffnung der Pipette; Anlegen eines reduzierten Drucks an die kleinere Öffnung der Pipette, um das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel einzuführen; Anlegen eines erhöhten Drucks an die größere Öffnung der Pipette, um das funktionalisierte, monolithische Sorbtionsmittel in die Pipettenspitze einzuführen; und Verdichten des funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittels. Typischerweise beträgt der reduzierte Druck etwa 25 Inch Quecksilbersäule (625 torr oder 12 psi), und der erhöhte Druck liegt zwischen etwa 95 psi (4,913 torr) bis etwa 110 psi (5,689 torr), und mehr typisch bei etwa 100 psi (5,171 torr).
Das verallgemeinerte Verfahren zur Vorbereitung von Festphasen-Extraktionspipettenspitzen wird wie folgt beschrieben. Ein chemisch behandeltes Glasfaser-Filtermaterial wird als Festphasen-Extraktionsmatrix verwendet. Ein bevorzugtes Glasfaser-Filtermaterial ist ein alkylfunktionalisiertes, momolithisches Sorbtionsmittel, dass von Varian, Inc., Lake Forest, CA hergestellt wird (ähnlich zu dem unter dem Warennamen SPEC^®-C18 verkauftem Material), ein Glasfasermaterial, das Verbundphasen-Siliciumdioxid enthält. Der Glasfaserfilter wird in Stücke geeigneter Größe je nach der Größe der Pipettenspitze oder der anderen Vorrichtung und je nach der gewünschten Menge des Festphasen-Extraktionsmaterials geschnitten. Die Menge des Festphasenmaterials wird im allgemeinen so gewählt, dass sie wenigstens etwa 10% des Nutzvolumens der Pipettenspitze einnimmt, obwohl die Menge nicht kritisch ist und kleinere oder größere Mengen, wenn erwünscht, verwendet werden können. Für eine 10 μL Pipettenspitze wird das Glasfasermaterial typischerweise in schmale Streifen (beispielsweise etwa 2–7 mm) geschnitten, und jeder Streifen wird dann erneut in kleinere Portionen (beispielsweise 0,43–0,50 mm oder nach Wunsch) zum Einführen in eine Pipettenspitze geschnitten. Das Glasfasermaterial kann mit jedem gewünschtem Verfahren geschnitten werden, beispielsweise von Hand oder unter Verwendung eines mechanischen Schneidgeräts (beispielsweise Biodot, Inc., Irvine, CA). Eine einzige Pipettenspitze wird mit einem einzigen Stück des Festphasen-Extraktionsmediums beladen. Die Glasfasermatrix wird anfänglich durch Anlegen eines Vakuums (beispielsweise unter Verwendung einer Vakuumpumpe) im Bereich von etwa 25 Inch Quecksilbersäule an ein Ende der Spitze eingeführt.
Sodann wird die Glasfasermatrix weiter durch die Verwendung trockener Luft unter hohem Druck (beispielsweise unter Verwendung eines Luftkompressors) weiter verdichtet. Die Hochdruckluft liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 95 bis 110 psi, typischerweise bei 100 psi. Schließlich können die Medien an Ort und Stelle dadurch eingesetzt werden, dass das hintere Ende des Medienstücks unter Verwendung einer Nadel aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser verdichtet werden, der zu dem Innendurchmesser der Pipettenspitze an der Oberseite des Glasfaserbetts entspricht. Die Verwendung einer Nadel mit einem Durchmesser, der zu dem Innendurchmesser der Pipette passt, liefert eine sanfte, nicht zerstörende Verdichtung und sichert weiterhin die Glasfasermatrix an ihrer Stelle in der Pipettenspitze. Die Auswahl der Nadelgröße kann auch ausgewählt werden, um den Betrag der aufgewendeten Verdichtungskraft zu steuern.
Die Festphasen-Extraktionspipettenspitze, die unter Verwendung des obigen Verfahrens vorbereitet wurde besitzt eine umgekehrte Phasenabsorbtionsfähigkeit, die zum Absorbieren von Drogen oder anderen hydrophoben Verbindungen aus wäßrigen Proben zu verwenden ist. Die Pipettenspitzen wurden getestet, wie in den Beispielen 3 und 4 unten beschrieben wird, und sie haben eine außerordentlich gute Rückgewinnung von Verbindungen aus der Lösung und reine, analytische Resultate geliefert, wie sowohl durch HPLC als auch durch MALDI-TOF demonstriert wird. Diese Resultate sind in den 3 und 4 dargestellt.
Ein Durchschnittsfachmann wird selbstverständlich erkennen, dass diese Verfahren auf Glasfasermatrizen, die ein beliebiges, gebundenes Siliciumdioxid enthalten, wie es im Stand der Technik bekannt ist oder in Zukunft gefunden wird. Einige nicht-einschränkende Beispiele der Verbundphasen, die vorbereitet werden können, umfassen solche, die die folgenden Funktionalisierungsmittel enthalten: (z. B. C_2-30 Alkyl, Alkenyl, Alkynyl), -NHC(O)-(Amido), -C(O)NH-(Carbamyl), -OC(O)NH-(Carbamato), -NHC(O)O-(Urethan), -(NHC(O)NH-(Carbamido oder Harnstoff), -NCO(Isocyanato), -CHOHCHOH-(Diol), CH₂OCHCH₂O-(Glycidoxy), -(CH₂CH₂O)_n-(Ethoxy), -(CH₂CH₂CH₂O)_n-(Propoxy), -C(O)-(Carbonyl), -C(O)O-(Carboxy), CH₃C(O)CH₂-(Acetonyl), -S-(Thio), -SS-(Dithio), -CHOH-(Hydroxy), -O-(Ether), -SO-(Sulfinyl), -SO₂ (sulfonyl), -SO₃-(Sulfonsäure), -OSO₃-(Sulfate), -SO₂NH-, -SO₂NMe-(Sulfonamido), -NH-, -NMe-, -NMe₂ ⁺-, -N[(CH₂)_n]₂ ⁺-(Amino), -CN (Nitrilo), -NC (Isonitrilo), -CHOCH-(Epoxy), -NHC(NH)NH-(Guanidino), -NO₂ (Nitro), -NO (Nitroso), und -OPO₃-(Phosphate), wobei Me sich auf Methylen oder Methyl bezieht und n eine ganze Zahl bis zu 30, im allgemeinen weniger als 10 ist. Viele andere Beispiele sind ebenfalls bekannt und können leicht an die Vorrichtungen und hier beschriebenen Verfahren angepasst werden.
Unter Verwendung dieser allgemeinen Verfahren können Vorrichtungen anderer Konfigurationen hergestellt werden. SPE-Vorrichtungen, die Pipettenspitzen verwenden, sind ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel, ein Durchschnittsfachmann kann jedoch sich leicht zusätzliche Anwendungsfälle und Größen und Konfigurationen von Vorrichtungen vorstellen, die an die hier beschriebenen Verfahren angepasst werden können. Pipettenspitzen verschiedener Größen und Formen können hergestellt werden, und auch Säulen, Kapillaren und Röhren können unter Verwendung dieser Verfahren hergestellt werden. Die Verfahren sind besonders gut geeignet zur Herstellung von SPE-Vorrichtungen unter Verwendung von Rohren und Kapillaren, die verengende Dimensionen haben, beispielsweise konische Formen, die eine Herausforderung beim Einführen empfindlicher Sorbtionsmaterialien in die kleinen Räume darstellen, was erforderlich ist, um Mikroextraktionsvorrichtungen herzustellen.
IV. Verfahren zur Verwendung der Festphasen-Extraktionsvorrichtungen bei der Vorbereitung von Proben für die Analyse.
Festphasen-Extraktionsvorrichtungen können in einer Vielzahl von Art und Weisen verwendet werden, um Muster für die weitere Analyse vorzubereiten. In einem Ausführungsbeispiel kann die Festphasen-Extraktionsvorrichtung verwendet werden, um unerwünschte Komponenten aus einer Mischung von Analyten zu entfernen, beispielsweise Verunreinigungen, Salze und andere Verbindungen, die in einer zu analysierenden Probe vorhanden sind. Das Festphasen-Extraktionsmaterial enthält Analyte mit den gewünschten, adsorbtiven Charakteristiken zurück, während unerwünschte Komponenten nicht adsorbiert werden und aus der Pipettenspitze abgegeben werden, und sie können gespeichert, weiteranalysiert oder verworfen werden, wie erwünscht.
In einem anderen Ausführungsbeispiel kann die Festphasen-Extraktionsvorrichtung verwendet werden, um eine spezielle Komponente von einer Probenlösung zu adsorbieren und anzureichern, während andere Komponenten, die unterschiedliche chemische Charakteristiken haben, nicht adsorbiert werden. Beispielsweise kann ein monolithisches Alkylverbundphasen-Sorbtionsmittel verwendet werden, um hydrophobe Verbindungen aus einer Probe selektiv zu adsorbieren, während mehrpolare Verbindungen nicht adsorbiert werden. Polare Verbindungen können selektiv unter Verwendung von einer Verbundphase, die Anionen- oder Kationen-Austauschmittel enthält, wahlweise adsorbiert werden, während mehrhydrophobe Verbindungen in einer Probe nicht adsorbiert werden. Kombinationen der beiden sind ebenfalls möglich, wodurch die Adsorbtion von allen interessierenden Verbindungen aus einer Probe und das Auswaschen unter Verwendung unterschiedlicher Waschmittel ermöglicht wird, um entweder die über einen hydrophoben Mechanismus adsorbierten Verbindungen oder die über einen Ionenaustauschmechanismus adsorbierten Verbindungen auszuwaschen.
Verfahren zur Vorbereitung einer Probe für die Analyse umfassen im allgemeinen die folgenden Schritte: Aktivieren einer Festphasen-Extraktionspipette; Adsorbieren von Komponenten einer zu analysierenden Probe auf der Festphasen-Extraktionspipette; Waschen der Festphasen-Extraktionspipette mit einem Lösungsmittel, das adsorbierte (oder zurückgehaltene) Analyte aus dem Festphasen-Extraktionsmaterial nicht entfernt; Waschen der Festphasen-Extraktionspipette mit einem Lösungsmittel, das adsorbierte (oder zurückgehaltene) Analyte aus dem Festphasen-Extraktionsmaterial auswäscht; und Sammeln der Analyte. Ein typisches Verfahren der Verwendung einer SPE Vorrichtung umfasst (1) Aktivieren oder Konditionieren der SPE Vorrichtung mit einem organischem Lösungsmittel, beispielsweise Methanol oder Acetonitril oder Mischungen aus organischen Lösungsmitteln mit Wasser, die optional Puffer oder Ionenpaarungsreagenzien, beispielsweise Trifluoressigsäure oder Ameisensäure enthalten; (2) Ausgleichen der SPE Vorrichtung mit einer wäßrigen Lösung, die wiederum optional Puffer oder Ionenpaarungsreagenzien enthält; (3) Zugeben von einer Probe, die Analyte enthält (die störende Komponenten enthalten können oder nicht) in die SPE Vorrichtung; (4) Waschen der SPE-Vorrichtung mit einer wäßrigen Lösung, um unerwünschte oder nicht-adsorbierte Komponenten zu entfernen; und (5) Eluiren der adsorbierten Analyte mit einem geeigneten Elusions-Lösungsmittel, typischerweise einer Mischung aus organischen und wäßrigen Lösungsmitteln. In einigen Fällen beispielsweise bei einem monolithischen Sorbtionsmittel, das funktionalisiert ist, um Ionenaustauschende Fähigkeiten zu besitzen, kann der anfängliche Aktivierungsschritt optional sein. Typische Protokolle sind in den Beispielen beschrieben.
Die hier beschriebenen SPE-Vorrichtungen sind geeignet zur Verwendung bei der Vorbereitung von kleinen Probenvolumina für die Analyse. Das anfängliche Volumen ist jedoch nicht speziell auf kleine Volumina eingeschränkt, und eine verhältnismäßig große Menge an Lösungsmittel kann an dem funktionalisierten, monolithischen Sorbtionsmittel adsorbiert werden und dann auf Wunsch in ein kleineres Volumen eluiert werden. Typischerweise ist die Vorrichtung geeignet für die Vorbereitung von kleinen Volumina einer Probe, beispielsweise für Probenvolumina im Bereich von etwa mehreren Mikroliter oder weniger oder bis zu 1 ml, prinzipiell kann sie jedoch mit Probenvolumina bis zu etwa 10³ ml benutzt werden.
Es ist zu verstehen, dass, während die Erfindung im Zusammenhang mit den bevorzugten, speziellen Ausführungsbeispielen davon beschrieben worden ist, die vorstehende Beschreibung und auch die Beispiele, die folgen, nur zur Erläuterung und nicht zur Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung gedacht sind. Die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung verwendet herkömmliche Techniken der organischen Chemie, der Polymerchemie, der Biochemie und dergleichen, die im Können des Durchschnittsfachmanns liegen, außer, wenn dies anders angegeben ist. Andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen im Rahmen der Erfindung sind für den Durchschnittsfachmann ersichtlich, an den sich die Erfindung wendet. Solche Techniken sind in der Literatur voll erläutert.
In den folgenden Beispielen wurden Anstrengungen unternommen, um die Genauigkeit im Bezug auf die verwendeten Zahlen (beispielsweise Beträge, Temperaturen usw.) sicherzustellen, jedoch ist ein gewisser, experimenteller Fehler und eine Abweichung zu berücksichtigen. Außer, wenn dies anders angegeben ist, ist die Temperatur in Grad Celsius und der Druck ist bei oder nahe bei dem Atmosphärendruck. Alle Lösungsmittel wurden als HPLC-geeignet erworben.
Abkürzungen:

SPEC-C18

VerbundphasenSiliciumdioxid funktionalisiert unter Verwendung von einer Alkylkette aus 18 Kohlenstoffatomen in der Länge (von Varian, Inc., Lake Forest, CA)

MALDI-TOF

Matrix – unterstützte Laserdesorptions-Ionisations-Flugzeit-Massenspektroskopie (Matrix – assisted laser desorption ionization – time of flight mass spectrometry)

HPLC

Hochperformance-Flüssigkeitschromatograpie (high performance liquid chromatography)

TFA

Trifluoressigsäure

Beispiel 1
Ein allgemeines Verfahren zur Vorbereitung von Festphasen-Extraktionspipettenspitzen wird beschrieben. Ein chemisch behandeltes (C-18 modifiziertes Siliciumdioxid) bleibt aus Glasfaserfiltermaterial (Varian, Inc., Lake Forest, CA) wurde in schmale Streifen geschnitten (etwas 2–7 mm). Jede der Streifen wurde dann wiederum in Medienstücke (0,43–0,50 mm) zum Einführen in eine Pipettenspitze geschnitten. Eine einzige Pipettenspitze wurde mit einem einzigen Stück der Festphasen-Extraktionsmedien beladen. Die Medien wurden anfänglich durch Anlegen eines Vakuums, (etwa 25 Inch Quecksilbersäule) an ein Ende der Spitze eingeführt, wie es geschnitten war. Sodann wurden die Medien weiter durch die Verwendung einer Hochdruckluft unter trockenen Bedingungen unter Verwendung eines Luftkompressors (etwa 100 psi) weiter verdichtet. Schließlich wurden die Medien an Ort und Stelle angebracht, in dem das hintere Ende des Medienstücks unter Verwendung einer Nadel aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser, der zu dem Innendurchmesser der Pipettenspitze an der Oberseite des Glasfaserbettes paßt, sanft verdichtet.
Die Festphasen-Extraktionspipettenspitze, die unter Verwendung des obigen Verfahrens hergestellt wurde, besaß eine Umkehrphasen-Adsorbtionsfähigkeit, die zum Adsorbieren von Drogen oder anderen hydrophoben Verbindungen aus wäßrigen Lösungen nutzbar war. Die Pipettenspitzen wurden getestet, wie in den Beispielen 3 und 4 unten beschrieben ist.
Beispiel 2
Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde ausgeführt unter Verwendung eines Glasfaser-Filtermaterials, das chemisch modifiziert war, um Aminreste zu besitzen (Varian, Inc., Lake Forest, CA), um eine Festphasen-Extraktionspipette mit einer modifizierten Adsorbtionsfähigkeit vorzubereiten.
Beispiel 3
Eine Festphasen-Extraktionspipettenspitze, die unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens vorbereitet wurde, wurde verwendet, um eine Mischung aus Peptiden für die massenspektroskopische Analyse vorzubereiten, die durch die proteolytische Verdauung von Serumalbumin des Rins erzeugt wurden.
Die Festphasen-Extraktionspipettenspitze wurde in das Pipettengerät eingebaut und durch zweimaliges Pipettieren von 10 μl von 50 prozentigem Acetonitril gefolgt von zweimaligem Pipettieren von 10 μl 0,1 prozentiger Trifluoressigssäure (TFA) aktiviert. In einem Testrohr wurden 5 μl einer Mischung aus Peptin (0,5 pmoles) und 5 μl 1 prozentiger TFA zugegeben und kurz gevortext. Die vorbehandelte Probe, die die Mischung der Peptide enthält, wurde in eine Festphasen-Extraktionspipette geladen, in dem 10 μl der Probe pipettiert wurde und die Probe langsam aus der Pipettenspitze ausgestoßen wurde. Die Pipettenspitze wurde durch Pipettieren von 10 μL von 0,1 prozentiger TFA und ausgestoßen der Lösung gewaschen. Schließlich wurden die adsorbierten Verbindungen durch Pipettieren mit 2 μl 50 prozentigem Acetonitril/0,1 prozentiger TFA eluiert, was ohne weitere Behandlung durch MALDI-TOF analysiert wurde.
Zum Vergleich wurde eine unbehandelte Probe aus Peptiden (0,5 pmoles) und eine Probe aus Peptiden (0,5 pmoles), die unter Verwendung einer Pipettenspitze hergestellt von einem Konkurrenten Z bereitet wurde, ebenfalls durch MALDI-TOF analysiert. Die Resultate, die in 3 gezeigt sind, zeigen die Interferenz, die durch Ionenunterdrückung in den unbehandelten Proben verursacht wurden, und die hervorragende Rückgewinnung der Peptide, wenn die Festphasen-Extraktionspipettenspitze verwendet wurde, die gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren vorbereitet wurde. Die Rückgewinnung von Peptiden war wenigstens 2–3 mal größer, wenn die Festphasen-Extraktionspipette verwendet wurde, die durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren vorbereitet wurde, im Vergleich zu der Pipettenspitze, die von dem Konkurrenten Z hergestellt wurde. Noch größere Ausbeute war im Vergleich zu der unbehandeltem Probe zu sehen.
Beispiel 4
Ein Verfahren wurde entwickelt, um Plasmakonzentrationen von Vardenafil und Quetiapine unter Verwendung eines Rinder-Models zu analysieren. Kurz gesagt wurde eine Blindprobe aus Rinderplasma mit geeigneten Mengen an Vardenafil und Quetiapine-Lösungen geimpft. Standardkurven wurden unter Verwendung bekannter Konzentrationen von Vardenafil und Quetiapine wie folgt erzeugt: 1,0 und 10,0 ng/ml Standardlösungen wurden in 50:50Me0H:10 mM wäßriger HCOOH vorbereitet. Geeignete Mengen wurden in Teströhren verdünnt, um bekannte Konzentrationen in jeder Droge vorzubereiten. Aliquots wurden der Analyse entfernt, die eine bekannte Menge jeder Droge hatten, und das gemessene Signal wurde verwendet, um eine Standardkurve herzustellen.
In einem Testrohr wurden 50 μl Rinderplasma und 10 μl interner Standard (100 ng/ml Norfluorxetine in 25% wäßrigem Methanol) zugegeben und kurz gevortext. Vierzig μl Ammoniumacetat (pH ~ 9) wurden zugegeben und kurz gevortext. Eine Festphasen-Extraktionspipettenspitze, die eine C-18 Extraktionsphase mit umgekehrter Phase enthielt, wurde durch zweimaliges Pipettieren von 100 μl von 100% Methanol gefolgt von zweimaligem Pipettieren von 100 μl 5 mM Ammoniumacetat (pH ~ 9) vorbereitet. Das Muster wurde in eine Festphasen-Extraktionspipette geladen, in dem 100 μl vorbehandelte Probe pipettiert und die Probe aus der Pipettenspitze langsam ausgestoßen wurde. Die Pipettenspitze wurde durch Pipettieren mit 100 μl von 5% wäßrigem Menthol und Ausstoßen der Lösung gewaschen. Die feste Phase wurde getrocknet, in dem Luft durch die Spitze 2–4 mal schnell pipettiert wurde. Schließlich wurden die adsorbierten Verbindungen eluiert, in dem zweimal 25 μl 95:5 MeOH:10 mM wäßrige HCOOH pipettiert wurde, um ein Gesamtelutionsvolumen von 50 μl zu erzeugen, was direkt durch HPLC analysiert wurde. Die Resultate sind in 4 gezeigt.
Beispiel 5
Ein Vergleich von Festphasen-Extraktionspipetten, die unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren vorbereitet wurden, mit Pipetten, die von dem Konkurrenten Z hergestellt wurden, wurde durchgeführt. Die Pipettenspitzen wurden willkürlich von 3 Gestellen genommen, die Pipettenspitzen von einem Konkurrenten und Pipettenspitzen enthielten, die mit den hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, und sie wurden auf ihre Fähigkeit getestet, Analyte zu extrahieren. Neunzehn Fehlversuche (0% Ausbeute) wurden bei Pipettenspitzen, die von dem Konkurrenten Z hergestellt wurden, festgestellt (18% Fehlversuche unter den getesteten Spitzen), während keine Fehlmessungen unter den Pipettenspitzen festgestellt wurden, die nach den hier beschriebenen Verfahren hergestellt waren (0% Fehlmessungen unter den getesteten Spitzen).
Zusätzlich wurden die Prozentausbeuter und relative Standardabweichung der Ausbeute der Analyte bei Pipettenspitzen, die nach den hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, mit Pipettenspitzen, die von dem Konkurrenten Z hergestellt wurden, verglichen. Die Prozentausbeute und die relative Standardabweichung für drei unterschiedliche Peptide TFQAYPLREA, RTKRSGSVYEPLKI und LWMRF wurden bei zwei unterschiedlichen Pipettenspitzen gemessen. Die Verwendung von Pipettenspitzen, die nach den hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, ergab bis zu 38% verbesserte Ausbeuten und bis zu dreifach verbesserten, relativen Standardabweichungen (verbesserte Präzision) im Vergleich zu Pipettenspitzen, die von dem Konkurrenten Z hergestellt wurden.
Dieser Vergleich zeigt die überlegene Reproduzierbarkeit des Verfahrens der Vorbereitung der Festphasen-Extraktionspipetten und auch die überlegenen Strömungs- und Adsorbtionseigenschaften, die von dem verwendeten, überlegenen Festphasen-Extraktionsmaterial geliefert werden.

Claims

Festphasen-Extraktionsvorrichtung für die Probenherstellung umfassend ein hohles, konisches Rohr mit einer engeren Öffnung und einer breiteren Öffnung, wobei die engere Öffnung des Rohres ein Festphasen-Extraktionsmaterial, das ein funktionalisiertes, monolithisches Sorptionsmittel umfasst, enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasen-Extraktionsvorrichtung durch eine Kombination von bezogen auf Atmosphärendruck reduziertem Druck, bezogen auf Atmosphärendruck erhöhtem Druck und mechanischer Verdichtung hergestellt ist, und wobei das funktionalisierte, monolithische Sorptionsmittel eine Glasfasermatrix, die eine Verbundphase aus einem Metall- oder Halbmetalloxid enthält, umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Metall- oder Halbmetalloxid Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Zeolit, Mullit, Zirconiumoxid, Vanadiumoxid oder Titanoxid oder Mischungen oder Zusammensetzungen davon ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Metall- oder Halbmetall-Oxid reaktive Metalloxide hat, die in der Lage sind, mit Alkoxysilan, Aminosilan, Hydroxysilan oder Halosilan zu reagieren.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das monolithische Sorptionsmittel funktionalisiert ist mit Hydrocarbyl, Amido, Carbamyl, Carbamato, Urethan, Carbamido, Isocyanato, Diol, Glycidoxy, Ethoxy, Propoxy, Carbonyl, Carboxy, Acetonyl, Thio, Dithio, Hydroxy, Ether, Sulfinyl, Sulfonyl, Sulfonsäure, Sulfat, Sulfonamido, Amino, Nitrilo, Isonitrilo, Epoxy, Guanidino, Nitro, Nitroso, und Phosphat.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zur Vorbereitung von kleinen Volumina von mehreren Mikroliter bis 1 ml einer Probe geeignet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Probenvolumen von 10^–3 ml bis 10³ ml beträgt.
Festphasen-Extraktionsvorrichtung nach einem der Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktionsvorrichtung eine Festphasen-Extraktionspipette ist.
Festphasen-Extraktionspipette nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der reduzierte Druck 12 psi (8,27 × 10⁴ Pa) beträgt.
Festphasen-Extraktionspipette nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der erhöhte Druck 95 psi (6,55 × 10⁵ Pa) bis 110 psi (7,58 × 10⁵ Pa) beträgt.
Verfahren zur Vorbereitung einer Vorrichtung zur Festphasen-Extraktion umfassend die Schritte: a) Einführen eines funktionalisierten, monolithischen Sorptionsmittels in ein hohles Rohr mit einer breiteren Öffnung und einer engeren Öffnung; b) Anlegen eines bezogen auf Atmosphärendruck reduzierten Druckes an die engere Öffnung des Rohres, um das funktionalisierte, monolithische Sorptionsmittel in das Rohr einzuführen; c) Anlegen eines bezogen auf Atmosphärendruck erhöhten Drucks an die breitere Öffnung des Rohres, um das funktionalisierte, monolithische Sorptionsmittel in die engere Öffnung des Rohres einzuführen; und d) Verdichten des funktionalisierten, monolithischen Sorptionsmittels, wobei das funktionalisierte, monolithische Sorptionsmittel eine Glasfasermatrix, die eine Verbundphase aus einem Metall- oder Halbmetalloxid enthält, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasen-Extraktionsvorrichtung eine Festphasen-Extraktionspipette ist.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der reduzierte Druck 12 psi (8,27 × 10⁴ Pa) beträgt.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der erhöhte Druck 95 psi (6,55 × 10⁵ Pa) bis 110 psi (7,58 × 10⁵ Pa) beträgt.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Metall- oder Halbmetall-Oxid Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Zeolit, Mullit, Zirconiumoxid, Vanadiumoxid oder Titanoxid oder Mischungen oder Zusammensetzungen davon ist.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Metall- oder Halbmetalloxid reaktive Metalloxide hat, die in der Lage sind, mit Alkoxysilan, Aminosilan, Hydroxysilan oder Halosilan zu reagieren.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das monolithische Sorptionsmittel funktionalisiert ist mit Hydrocarbyl, Amido, Carbamyl, Carbamato, Urethan, Carbamido, Isocyanato, Diol, Glycidoxy, Ethoxy, Propoxy, Carbonyl, Carboxy, Acetonyl, Thio, Dithio, Hydroxy, Ether, Sulfinyl, Sulfonyl, Sulfonsäure, Sulfat, Sulfonamido, Amino, Nitrilo, Isonitrilo, Epoxy, Guanidino, Nitro, Nitroso, und Phosphat.
Verfahren zur Vorbereitung einer Probe zur Analyse umfassend die Schritte: a) Aktivieren einer Festphasen-Extraktionspipette gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9; b) Adsorbieren von Komponenten einer zu analysierenden Probe in die Festphasen-Extraktionspipette; c) Waschen der Festphasen-Extraktionspipette mit einem Lösungsmittel, das adsorbierte Analyte von dem Festphasen-Extraktionsmaterial nicht entfernt; d) Waschen der Festphasen-Extraktionspipette mit einem Lösungsmittel, das die adsorbierten Analyte von dem Festphasen-Extraktionsmaterial entfernt; e) Sammeln der Analyte.