WO2008106960A1 - Vorrichtung zur aufnahme, behandlung und aufbewahrung kleinvolumiger proben - Google Patents

Vorrichtung zur aufnahme, behandlung und aufbewahrung kleinvolumiger proben Download PDF

Info

Publication number
WO2008106960A1
WO2008106960A1 PCT/DE2008/000412 DE2008000412W WO2008106960A1 WO 2008106960 A1 WO2008106960 A1 WO 2008106960A1 DE 2008000412 W DE2008000412 W DE 2008000412W WO 2008106960 A1 WO2008106960 A1 WO 2008106960A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
capillary
sample
sample vessel
capillaries
vessel
Prior art date
Application number
PCT/DE2008/000412
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heidrun Rhode
Stefan Kreusch
Helga Endmann
Michael HÄNDEL
Günther SAMMLER
Edith Zimmermann
Original Assignee
Scienova Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scienova Gmbh filed Critical Scienova Gmbh
Priority to EP08715555A priority Critical patent/EP2129464A1/de
Priority to US12/450,044 priority patent/US8758706B2/en
Publication of WO2008106960A1 publication Critical patent/WO2008106960A1/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4005—Concentrating samples by transferring a selected component through a membrane
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/24—Dialysis ; Membrane extraction
    • B01D61/243—Dialysis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/24—Dialysis ; Membrane extraction
    • B01D61/28—Apparatus therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]

Definitions

  • the invention relates to a device for as universal as possible handling, that is to say for the reception, the most diverse treatments and for the storage of samples in ⁇ l volumes.
  • Essential constituents of biological samples, biomolecules, analytes and essential analytes are terms used interchangeably in the context of the invention, in particular for those constituents in samples to be examined which are in the focus of interest of the examiner or user and contain it together with dt r are. These are, for example, metabolites, nucleic acids, Pepticv proteins, particles, cells, viruses, microorganisms, spores, markers, enzyme substrates or products and others, both in their entirety or parts thereof and / or complexes thereof.
  • matrix means those constituents of a sample which are not in the focus of interest and which often interfere with analytical methods, in particular the solvent and other accompanying substances, such as, for example, salts, detergents, buffers, metal ions, antibiotics and others.
  • solvent and other accompanying substances such as, for example, salts, detergents, buffers, metal ions, antibiotics and others.
  • the essential constituents of a sample differ from the matrix constituents in their size or molecular size.
  • Biological samples must be treated in a variety of ways during preparative and analytical procedures. Such treatments include the addition of auxiliary reagents such as urea or guanidine for denaturation, mercaptoethanol or dithiothreitol for reduction, iodoacetamide for modification, enzymes and their cofactors for the selective elimination of modifications or the selective digestion of essential analytes, substrates for the detection of enzymatic activities , Inhibitors for the suppression of undesired enzymatic reactions, capture reagents for the binding of undesired substances and others.
  • auxiliary reagents such as urea or guanidine for denaturation, mercaptoethanol or dithiothreitol for reduction, iodoacetamide for modification, enzymes and their cofactors for the selective elimination of modifications or the selective digestion of essential analytes, substrates for the detection of enzymatic activities , Inhibitors for the suppression of undesired enzymatic reactions, capture reagent
  • the medium change which may also include desalting, is realized by three alternatively employable methods: gel chromatography, reverse phase chromatography and dialysis.
  • Gel chromatography is based on the chromatographic separation of matrix components according to the molecular weight size. It requires clean chromatography conditions and currently relatively large sample volumes. The sample components are always present after the medium change in larger volumes than the starting material and currently mostly in the ml range. For a parallelization in the sense that a plurality of similar samples is handled simultaneously, no solution is currently known to the experts.
  • the solid phase extraction is usually a special form of reverse phase chromatography and can also be used in highly miniaturized scale (EP 1 139087).
  • US 2006198765 a solution is described which offers a 96-fold parallelized solid-phase extraction or optionally also affinity chromatography for the smallest volumes.
  • parallelized affinity matrices used for sample pretreatment for mass spectrometry This principle is used in numerous other patents.
  • Reverse-phase chromatography, solid-phase extraction and affinity chromatography have the principle to purify the analyte (s) from the accompanying substances and possibly also to concentrate it. However, these methods always select specific analytes depending on the properties of the analytes and those of the solid phase.
  • the impurities and the solvent are removed without affecting the composition of the essential analytes of the sample.
  • Dialysis procedures and corresponding devices are currently available for any desired volume range from about 10 ⁇ l to several liters.
  • bags or cartridges are used.
  • the medium change takes place here via diffusion of the low-molecular-weight matrix constituents through a so-called semipermeable membrane with retention of essential sample contents.
  • Semi-permeable membranes in the sense of the invention are membranes which no longer allow the particles, cells or molecules beyond a certain size (cut-off) to pass through, d. H. permeiren. This happens due to the pores introduced in the membranes, wherein the pore sizes are usually realized in a narrow size range. These may be frits with pores of several 100 microns, filtration membranes with pores in the micron and sub-micron range and molecular sieve membranes in the molecular weight range of a few hundred Da to several 100 kDa.
  • Diffusion is a process that occurs due to Brown 's molecular motion in accordance with Fick 's law of diffusion (1).
  • de concentration difference
  • dl diffusion path
  • dt diffusion time
  • Membranes have additional factors that depend on the properties of the diffusing material as well as those of the membrane.
  • Concentration gradient the available surface directly and the diffusion path inversely proportional dependent and are usually for a diffusion distance of 1, 3 cm about 100 h, for 1, 3 mm for about 1 h and for 13 microns about 0.3 sec ( SM Rappoport, Medical Biochemistry, Verl. People and Health, 1983, p. 39/40).
  • suitable geometry large effective area, small diffusion paths
  • suitable membranes no interaction of the materials to be exchanged with the membrane
  • bundles of so-called Hollow-Fasem with defined pores, through which the sample liquid flows, are used for dialysis in the laboratory and preferably for hemodialysis.
  • cartridges with semipermeable membranes are used in the flow to change the medium in the laboratory.
  • Cartridges and hollow fibers have large dead volumes due to the connection to pumps and require high pressures, since the small cross-sections have large flow resistances and the relatively thick walls have long diffusion barriers. This makes it difficult to integrate both technical solutions into highly miniaturized or even parallelized systems.
  • the "drop-dialysis”, ie dialysis by means of comparatively coarsely porous floating on the dialysis liquid filtration membranes is indeed designed for rapid desalination of smallest volumes to a few ul, but not to parallelize and not quantified in terms of recovering sample amount and the essential components contained therein
  • special microdialysis units are for even smaller volumes, but not for medium change [0003] Instead, it has been developed for the diffusion-based production of low-molecular-weight solutes (WO 2004032735), whereby a maximum surface volume is formed in the small inner chamber, which is partially formed by a semipermeable membrane reached ratio, but transported in this a liquid that is to absorb from the outside living tissue sample diffusible substances and thus perform an analysis.
  • WO 2004032735 low-molecular-weight solute
  • No. 6,458,275 shows a possibility for parallelized equilibrium dialysis for the investigation of binding constants in the microplate grid, which realizes a separate outside liquid for each sample and can not be used for efficient medium change or for desalting because of the low volume ratio outside liquid / sample.
  • the parallelized implementation of dialysis is realized in different solutions. Up to 12 samples and a minimum volume of 20 ⁇ l (Pierce: Microdialyzer System) or up to 96 samples and a minimum volume of approximately 24 ⁇ l (advantageously in the microplate grid) are possible (eg US 2004195163, US Pat 2005019774, US 2005148066, Spectrum Labs: Spectra / PorMicrodialyzer). Due to the present unfavorable surface-to-volume ratios, the relatively small Diffusion surfaces and the resulting relatively large diffusion paths are required for a complete medium change with these methods many hours.
  • Sample plates for use in dialysis systems are known (DE 101 60 975 A1), with which a multiplicity of micro samples in the ⁇ l range can be dialyzed.
  • the sample vessels, whose upper ends are open and their lower ends, i. the end faces of the sample vessels were closed by a filtration membrane used for the "drop-dialysis" were arranged in suitable grid for the liquid handling technology for microplate technology, however, would be desirable a further reduction of the dialysis time and a reduction of the risk of damage, especially the semipermeable membrane
  • the dialysis time depends on the filling level (diffusion path dl in formula 1) and thus on the sample volume and on the pipetting precision.
  • Neutral salt, acid and organic solvent precipitations are efficient methods of increasing the concentration of many analytes, such as proteins.
  • these methods are not suitable for low molecular weight substances and peptides, are also not "unselective" for many other analytes, as analyte and matrix properties determine the case efficiency, and denature in addition usually a variety of proteins.
  • Fluthermore, precipitation reactions are difficult to miniaturize and The centrifugation and ultrafiltration are not possible in ⁇ l volumes, require flow aids such as centrifuges or vacuum, and are difficult to realize in parallel.
  • US 2005133425 proposes a kit containing individual elements for ultrafiltration for the purpose of molecular weight-selective concentration and thus selective enrichment of selected analytes.
  • the invention is based on the object to provide a device with which biomolecules in samples in the volume range of ⁇ 1 .mu.l to 500 .mu.s in the simplest possible, low expenditure and practicable way and without risk of damage to the device quickly, reproducibly and loss-free, comprehensively treated and can be stored.
  • the device should be usable without alterations, pipetting and conversions, etc., equally for medium changes, concentration steps and other sample treatments, including storage, in order to be able to handle the once introduced samples in a reproducible manner.
  • methods which can be used as widely as possible without preference or selection of specific analytes by means of any reactive surfaces should be usable.
  • the device is realized by at least one sample vessel for universal recording, treatment and storage of small-volume samples, which in size and shape as a form and position stable capillary open on both sides is formed, the longitudinal wall is formed completely or partially from a known semipermeable membrane.
  • capillary in the context of the invention are tube-shaped sample containers to understand with very small inner diameter.
  • This capillary can be called a straight tube. or be designed as a single or multiple curved tube.
  • a U-shaped curved capillary whose two-sided openings are accessible from the same side of the device is expedient.
  • the capillary with one or more supporting and thus shape and position stabilizing bodies for example made of stainless steel or of a non-metallic material, such as glass,
  • Ceramic or plastic in particular in the areas of their capillary ends or
  • sample vessel in size and shape directly as a capillary depression prepared for example by casting, pressing, deformation or machining, in an already shape and position-stable body, which may also consist of several partial bodies, is introduced.
  • the semipermeable membrane can advantageously be permanently and sealingly connected to the shape and position-stabilizing bodies by methods known per se. Such methods are known, for example, as overmolding, IR welding, UV bonding or gluing. These methods have long been used for the non-detachable connection of a wide variety of polymeric materials.
  • the proposed capillaries can be arranged in a grid suitable for liquid handling technology for microplate technology (nx 8 ⁇ 12 or n ⁇ 8 or / and m ⁇ 12) and thus permit multiple sample treatment.
  • the proposed special sample container allows in particular in its aforementioned multiple arrangement in the grid simple and practical manageable, despite very small sample volumes extremely low-loss applications and universal use for recording, treatment and storage of samples, including for concentration and for the medium change. Due to the said universal uses, otherwise required changes, pipetting and retrofitting etc., which in practice involve special expenses in sample handling, especially in many thousands of samples in screening procedures and also the additional risk of sample losses and - confusions in itself.
  • the evaporation is minimized and not least a loss-free and easily parallelizable recovery of the dialyzed sample possible. In this way a drastic reduction of the required diffusion time is achieved and in addition a high precision of this sample treatment step is ensured.
  • further treatments such as the addition of modifying reagents whose residues can be removed by dialysis after reaction without further effort, or the digestion of protein analytes using specific proteases in the same sample vessel in which previously the medium change or concentration has taken place , followed by renewed concentration and desalting.
  • the semipermeable membrane is in contrast to the known solutions described above not arranged transversely to the feed direction, which from experience can not easily cause damage only with improper handling, but formed in the axial or longitudinal direction of the capillary as a complete or partial wall, causing the Risk of damage to the membrane, in particular by pipetting, is virtually eliminated.
  • the capillaries are advantageously realized in a ratio of their length to the inner diameter of greater than 4. The maximum extension of the cross section of the capillaries should not exceed 5 mm.
  • the capillary openings for example by means of lids, stoppers or adhesive films, can also be easily handled and reliably closed. Due to all these features, the risk of evaporation during a medium change by dialysis is reduced to a minimum, which also ensures a high reproducible accuracy of handling and analysis of the samples.
  • the evaporation of the solvent present in the sample solution through the large surface of the semipermeable membrane can be used for the purpose of concentrating essential analytes at high speed and advantageously without pipetting.
  • the device can be used universally, practicably, with minimal effort and with good precision and recovery of the essential analytes of a sample for a large number of parallelized methods.
  • Fig. 1 Top view of a capillary whose wall with a round cross-section consists entirely of a semipermeable membrane, wherein the independent capillary is arranged between two stabilizing bodies
  • Fig. 2 plan views of four capillaries with different cross-section, which are each formed by a recess in a stable body, wherein the recess is in each case completed by a semi-permeable membrane
  • Fig. 3 plan views of four capillaries with different cross-section, which are each formed as a breakthrough in a stable body, wherein the breakthrough is completed on both sides by a semi-permeable membrane
  • Fig. 4 Formation of eight U-shaped capillary sample vessels in microplates raster dimension in a stable basic body a: front view b: section XX corresponding to FIG. 4ac: section YY corresponding to FIG. 4a d: side view in a sectional representation of a stack of 12 rowed stable basic bodies according to FIG. 4 a with 8 U-shaped capillary sample vessels each (see individual illustration of FIG.
  • Fig. 5 Time course of the decrease of the p-nitrophenol concentration in six simultaneously dialyzed samples using U-shaped capillary sample vessels; shown are mean values (points) and standard deviations (error bars)
  • Fig. 6 Time course of the decrease of the NaCl concentration in eight simultaneously dialysed samples using U-shaped capillary sample vessels; the mean values (points) are shown
  • Fig. 7 Time course of the volume decrease of eight simultaneously stored in U-shaped capillary sample vessels in the convection current of a fan samples
  • FIG. 9 Lactate production in human erythrocytes according to exemplary embodiment 10.
  • FIG. 1 shows a cross section through a capillary sample vessel 1 with a circular cavity cross-sectional area 2.
  • the capillary is arranged to protect it between two shape and position stabilizing bodies 3 and 4.
  • the cylindrical surface (longitudinal wall) of the capillary sample vessel 1 consists entirely of a semipermeable membrane 5 (indicated in the sectional view of Fig. 1 as a circular dotted line).
  • Application Example 2
  • Fig. 2 shows representations of also cross-sections through four capillary sample vessels 6, 7, 8, 9 with different cavity cross-sectional areas 10, 1 1, 12, 13, in contrast to Fig. 1, in which the capillary independently, d. H. is realized independently of the adjacent shape and position-stabilizing bodies 3, 4 by the semipermeable membrane 5 as a cylindrical surface, the capillary sample vessels 6, 7, 8, 9 each as an example produced by casting, pressing, deformation or machining recess in one Form and position-stable base body 14, 15, 16, 17 formed. Covered in each case the depression in the shape and position stable base body 14, 15, 16, 17 with a z. B.
  • a capillary sample vessel 6 having a triangular cavity cross-sectional area 10 in the form and position-stable base body 15, a capillary sample vessel 7 with a semi-circular cavity cross-sectional area 1 1, in the shape and position stable base body 16th a capillary sample vessel 8 having a rectangular cavity cross-sectional area 12 and in the form and position-stable base body 17 a capillary sample vessel 9 having a trapezoidal cavity cross-sectional area 13.
  • Fig. 3 also shows four cross-sections through capillary sample vessels 19, 20, 21, 22 which are each realized in a form and position-stable base body 23, 24, 25, 26.
  • the capillaries are not formed by depressions, but in each case as a breakthrough by the shape and position-stable base body 23, 24, 25 and 26 respectively.
  • the breakthroughs are on both sides by semipermeable membranes 27, 28 (also shown here as dotted lines) covered.
  • the four capillary sample vessels 19, 20, 21, 22, whose shown in Fig. 3 cavity cross-sectional areas 29, 30, 31, 32 each have different shapes with the illustrated straight and / or curved polygons.
  • Application Example 4 is
  • Each sample vessel 33 consists of two vertical capillary tubes 35, 36, which are the cavity 3 and which have upwardly open tube ends 37 and communicate with said U-shaped sample vessel formation at the bottom via a horizontal capillary tube 38 in the form of sample cup 8 (see FIG. 2).
  • This capillary tube 38 preferably contains a stabilizing connecting web 43, which only partially constricts the lumen, between a material lip 44 and the remaining main body 34.
  • the tube ends 37 of the capillary tubes 35, 36 are in each sample vessel 33 via a connecting tube 39 with the opening 40 (capillary tube 35) for filling or removal of reasons not shown in the drawing for clarity or with the vent 41 (capillary tube 36) for the sample filling or -dnähme in connection.
  • Fig. 4b shows for clarity a section in the indicated in Fig. 4a plane XX through the capillary tube 35 of a sample vessel 33 with the opening 40 for said sample filling or -dnähme and a applied by bonding semipermeabie and thereby completing the U-shaped sample vessel 33 semipermeabie Membrane 42.
  • Fig. 4c shows for clarity a section in the plane indicated in Fig. 4a Y-Y through the capillary tube 38 of a sample vessel 33 with the stabilizing, the lumen only partially constricting, connecting web 43 and the material lip 44th
  • FIG. 4d shows a side view of a section through a stack of a total of twelve lined-up form and position-stable base bodies 34 according to FIG. 4a with (as shown in FIG. 4a) eight U-shaped capillary sample vessels 33.
  • the section shown in FIG. 4b XX corresponds to the left sample vessel 33 in FIG. 4d.
  • U-shaped capillary sample vessels 33 according to FIG. 4 a which are obtained by milling out a shape-and position-stable basic body 34 made of polymethyl methacrylate (PMMA) and from bonded semi-permeable membranes 42 (Spektra / Por® 1, RC, MWCO 6-8 kDa). Spectrum Labs), 200 .mu.l of a solution of 6 mM p-N ⁇ trophenol in 1 M diethanolamine / HCl, pH 9.8 (buffer A) are pipetted into two more capillary Probengefackede 33 a dye-free buffer A The module is at room temperature in After 30 minutes, the deionized water is exchanged for fresh.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • buffer A buffer A
  • 190 ⁇ l of a solution of 10 mM Tris / HCl, pH 7.4 (buffer B) with 150 mM NaCl are pipetted into all eight parallel U-shaped capillary sample vessels 33 (see FIG.
  • the module is placed at room temperature in a 150 ml buffer B (external liquid). After 30 minutes, the external fluid is replaced with fresh fluid. After various times, the entire contents of the capillaries are sucked out with a pipette.
  • the osmolarity of the solutions is measured with an osmometer (Knauer, Semi-Microosmometer) and compared with calibration solutions. Thereafter, the solutions are pipetted back and dialyzed further. It can be seen in the diagram in FIG. 6 that only about 8% or 4% of the initial NaCl concentration is present after 120 minutes or 180 minutes.
  • the method is well reproducible since the coefficients of variation of the respective 8-fold determinations are in the range of ⁇ 1%.
  • 190 ⁇ l of a bovine IgG solution (Serva No. 22550, 0.3 mg / ml, 2.0 ⁇ M, in 10 mM Tris / HCl , pH 7.4, sample 1) pipetted.
  • the module is fastened to a tripod and a fan (diffuser, Braun company) is switched on at a distance of approx. 30 cm at the lowest level and without additional heating.
  • the residual volumes are combined in a single U-shaped capillary sample vessels 33 and flushed the empty capillary sample vessels 33 sequentially with 100 ul 10 mM Tris / HCl, pH 7.4.
  • the rinsing liquid obtained is added to the same capillary sample vessel 33 with the said residual volumes. It is concentrated again with the fan (sample 2). Thereafter, without further pipetting in the same module for 2 h against 10 mM Tris / HCl, pH 7.4 with 100 mM NaCl dialyzed (sample 3).
  • the conventional method (method A) in tubes comprises the following working steps: successively pipetting of DTT and iodoacetamide solution, with respective incubation, reprecipitation in dialysis vessels, 2 h dialysis against 20 mM ammonium bicarbonate, pipetting into new tubes, addition of trypsin and incubation.
  • each 170 ul of a suspension of one part cell pellet and four parts of physiological saline (NaCl) are pipetted with freshly removed and previously washed three times with NaCl washed human erythrocytes.
  • the module is placed at room temperature in a 10.0 ml NaCI 10mM glucose (outside fluid). After approximately 60 minutes, the outside liquid is mixed and 100 ⁇ l removed, and the module is placed again in the outside liquid.
  • the lactate concentration is determined according to Bergmeyer, HU in: Methods of Enzymatic Analysis, 3rd Ed., Vol. VI, pp. 582-588.
  • Lactate in the external fluid can only be formed from glucose, which by means of diffusion reaches the capillaries, has formed through the anaerobic glycolysis of the erythrocytes, and has diffused back into the external fluid.
  • the lactate concentration in the outside liquid is plotted for a period of 5 hours. During this time, a linear increase in the concentration of this metabolite can be observed. Lactate production under these conditions is 0.0103 ⁇ Mole / (min x ml erythrocyte sediment) or about 0.7 ⁇ Mole / (min x 10 "cells).
  • the advantage of this method is that the packed cells can remain in the capillary without interference, supplied via diffusion, and can also be liberated from metabolic end products, such as lactate.
  • the membrane chosen represents a microbial barrier. Since the membrane can not be passed by cells or macromolecules, lactate determination is possible without costly deproteinization.

Abstract

Aufgabe war es, eine Vorrichtung zu schaffen, mit welcher Biomoleküle in Proben im Volumenbereich von <1 µl bis 500 µl auf möglichst einfache, aufwandgeringe und praktikable Art und ohne Beschädigungsrisiko für die Vorrichtung schnell, reproduzierbar und verlustfrei aufgenommen, behandelt und aufbewahrt werden können. Es werden Probengefäße (33) vorgeschlagen, welche in Größe und Gestalt als Formund Lagestabile beidseitig offene Kapillaren ausgebildet sind, deren Längswandungen vollständig oder teilweise aus einer semipermeablen Membran bestehen. Die Erfindung dient dem universellen und exakten Handling kleinvolumiger Proben.

Description

Vorrichtung zur Aufnahme, Behandlung und Aufbewahrung kleinvolumiger Proben
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum möglichst universellen Handling, das heißt für die Aufnahme, die unterschiedlichsten Behandlungen und zur Aufbewahrung von Proben in μl-Volumina.
Wesentliche Bestandteile biologischer Proben, Biomoleküle, Analyte, sowie wesentliche Analyte sind im Sinne der Erfindung synonym verwendete Begriffe, insbesondere für diejenigen Bestandteile in zu untersuchenden Proben, die im Fokus des Interesses des Untersuchers bzw. Anwenders stehen und zusammen mit dtr sog. Matrix enthalten sind. Dies sind beispielsweise Metabolite, Nukleinsäuren, Pepticv Proteine, Partikel, Zellen, Viren, Mikroorganismen, Sporen, Markierungsstoffe, Enzyn 'ώstrate oder - Produkte und weitere, sowohl in ihrer Ganzheit, bzw. Teile davon und/c 'er Komplexe daraus.
Unter Matrix im Sinne der Erfindung werden diejenigen Bestandteile einer Probe verstanden, die nicht im Fokus des Interesses stehen und die oftmals Analyseverfahren stören, wie insbesondere das Lösungsmittel und weitere Begleitstoffe, wie beispielsweise Salze, Detergenzien, Puffer, Metallionen, Antibiotika und weitere. Meistens unterscheiden sich die wesentlichen Bestandteile einer Probe von den Matrixbestandteilen durch ihre Größe bzw. Molekülgröße.
Biologische Proben müssen im Verlauf von präparativen und analytischen Verfahren bezüglich ihrer wesentlichen Bestandteile vielfältig behandelt werden. Solche Behandlungen sind der Zusatz von Hilfsreagenzien, wie beispielsweise Harnstoff oder Guanidin zum Denaturieren, Mercaptoethanol oder Dithiotreitol zum Reduzieren, Jodacetamid zum Modifizieren, Enzyme und deren Cofaktoren für die selektive Elimination von Modifikationen oder den selektiven Verdau von wesentlichen Analyten, Substrate zum Nachweis von enzymatischen Aktivitäten, Inhibitoren zur Unterdrückung unerwünschter enzymatischer Reaktionen, Capture-Reagenzien zum Binden unerwünschter Stoffe und andere mehr.
Häufig ist es erforderlich, die wesentlichen Bestandteile biologischer Proben in ein anderes Medium, eine andere Matrix (s. o.), zu bringen, um die Kompatibilität zu nachfolgenden Reinigungsschritten bzw. zu Analyseverfahren herzustellen. Da oftmals nur geringe Mengen von mitunter sehr kostbaren Proben zur Verfügung stehen sowie meist mehrere Analyseverfahren für eine Probe zur Anwendung kommen, empfiehlt es sich, möglichst nur sehr geringe Teilmengen der Probe in das entsprechende zur jeweiligen Analyse kompatible Medium zu transferieren. Für massenspektrometrische Untersuchungen ist darüber hinaus eine sog. Entsalzung, d. h. eine sehr drastische Verminderung der Salz- und Detergenz-Konzentration der Matrix bei Erhalt oft niedermolekularer wesentlicher Bestandteile im Bereich von 1000 bis zu 3000 Da erforderlich.
Massenspektrometrische Verfahren kommen zwar mit sehr geringen Volumina (1 -5 μl) aus, benötigen jedoch relativ hohe Analytkonzentrationen. Um den Sensitivitätsbereich zu erreichen, ist es häufig erforderlich, die wesentlichen Bestandteile der Proben präanalytisch stark aufzukonzentrieren. Dabei dürfen jedoch die Konzentrationen störender Begleitstoffe nicht gleichermaßen wachsen.
Bei analytischen Screening-Verfahren und bei Proteomics-basierten Technologien fallen häufig sehr große Zahlen von gleichartigen Proben an, die jeweils einer Behandlung oder mehreren gleichartigen Behandlungen, beispielsweise Medienwechseln, Entsalzungen bzw. Konzentrierungsprozeduren unterzogen werden müssen.
Üblicherweise wird der Mediumwechsel, der auch die Entsalzung einschließen kann, durch drei alternativ einsetzbare Verfahren realisiert: Gelchromatographie, Reverse- Phase-Chromatographie und Dialyse. Der Gelchromatographie liegt die chromatographische Abtrennung von Matrixbestandteilen nach der Molekulargewichts-Größe zu Grunde. Sie erfordert saubere Chromatographiebedingungen und gegenwärtig relativ große Probenvolumina. Die Probenbestandteile liegen nach dem Mediumwechsel stets in größeren Volumina als das Ausgangsmaterial und gegenwärtig meist im ml-Bereich vor. Für eine Parallelisierung in dem Sinn, dass eine Pluralität gleichartiger Proben gleichzeitig hantiert wird, ist der Fachwelt derzeit keine Lösung bekannt.
Eine Miniaturisierung wäre denkbar, erfordert jedoch Probenvolumen-abhängige Mindest-Trennlängen der Säulchen und damit auch nicht zu unterschreitende Minimal- Volumina der entsalzten Proben. In WO 9502182 wird beispielsweise ein solches Verfahren in miniaturisertem Maßstab zur Präfraktionierung für Capillarelektrophorese- Verfahren beschrieben.
Demgegenüber sind analytische chromatographische Trennungen parallelisiert bis in den nano-fluidic-Maßstab möglich (z. B. WO 2004101 151 ). Für eine präparative Anwendung im Rahmen der Probenvorbehandlung ist dies jedoch nicht verwendbar, da die Probenmengen den Sensitivitätsbereich z. B. massenspektrometrischer Verfahren unterschreiten und die Probenbestandteile nach der Chromatographie stets in größeren Volumina, also zusätzlich verdünnt im Vergleich zur Ausgangsprobe, vorliegen.
Durch Reverse-Phase-Chromatographie werden vorzugsweise hydrophobe
Probenbestandteile an einer festen hydrophoben Phase gebunden. Diese Träger werden danach mit dem potentiellen Verlust von wesentlichen, insbesondere hydrophilen Analyten gewaschen und nachfolgend im gewünschten salzfreien Medium eluiert. Hierbei sind durch die geschickte Wahl der Adsorptions- und Elutionsvolumina auch Aufkonzentrierungsschritte möglich. Es wurden Mikroverfahren für Proben- und Elutionsvolumina im μl-Bereich in sog. Zip-Tips der Fa. Millipore (WO 9837949) bzw. Perfect Pure (Fa. Eppendorf) entwickelt. Eine Parallelisierung dieser Mikroverfahren ist auf Grund des durch den Untersucher zu kontrollierenden Laufverhaltens der in Pipettenspitzen untergebrachten Mikrosäulchen, Membranen bzw. monolithischer Strukturen nicht oder nur erschwert möglich.
Es gibt parallelisierbare spin-down Vorrichtungen, die in Arrays hydrophober Membranen angeordnet sind. Diese Verfahren kommen, wenngleich unter Einbeziehung einer Zentrifuge, einem praktikablen parallelisierten Hantieren nahe (US 6,998,047). Hierfür werden jedoch deutlich größere Volumina benötigt, als mit Zip- Tips.
Die Festphasenextraktion ist meist eine Sonderform der Reverse-Phase- Chromatographie und kann ebenfalls in stark miniaturisiertem Maßstab zur Anwendung kommen (EP 1 139087). In US 2006198765 ist eine Lösung beschrieben, die für kleinste Volumina eine 96-fach parallelisierte Festphasenextraktion oder wahlweise auch Affinitätschromatographie anbietet. Auch in WO 02082051 werden parallelisierte Affinitätsmatrices zur Probenvorbehandlung für die Massenspektrometrie eingesetzt. Dieses Prinzip wird in zahlreichen weiteren Patentschriften angewendet. Reverse-Phase-Chromatorgraphie, Festphasenextraktion und Affinitätschromatographie haben zum Prinzip, den/die Analyten aus den Begleitstoffen herauszureinigen und gegebenenfalls dadurch auch aufzukonzentrieren. Diese Verfahren selektieren jedoch dadurch stets spezielle Analyte in Abhängigkeit von den Eigenschaften der Analyte und denen der festen Phase.
In dem nachfolgend beschriebenen Dialyseverfahren werden die Begleitstoffe und das Lösungsmittel entfernt, ohne dabei die Zusammensetzung der wesentlichen Analyte der Probe zu beeinflussen.
Dialyseverfahren und entsprechende Vorrichtungen gibt es gegenwärtig für jeden gewünschten Volumenbereich von ca. 10 μl bis zu mehreren Litern. Üblicherweise werden im Labor Dialyseschläuche, -säckchen oder Kartuschen verwendet. Der Mediumwechsel erfolgt hier via Diffusion der niedermolekularen Matrix-Bestandteile durch eine sog. semipermeable Membran bei Zurückhaltung von wesentlichen Probenbestanteilen.
Semipermeable Membranen im Sinne der Erfindung sind Membranen die Partikel, Zellen oder Moleküle ab einer bestimmten Größe (cut-off) nicht mehr hindurch lassen, d. h. permeiren. Dies geschieht aufgrund der in den Membranen eingebrachten Poren, wobei die Porengrößen meist in einem engen Größen-Bereich realisiert sind. Dies können Fritten mit Poren von mehreren 100 μm, Filtrationsmembranen mit Poren im μm- und sub-μm-Bereich und Molekularsiebmembranen im Molekulargewichtsbereich von wenigen hundert Da bis mehreren 100 kDa sein.
Die Diffusion ist ein Vorgang der auf Grund der Brown'schen Molekularbewegung entsprechend dem Fick'schen Diffusionsgesetz (1 ) zustande kommt.
q x de x dt
wobei: dm = Menge des diffundierenden Stoffes,
D = Diffusionskoeffizient q = Diffusionsquerschnitt oder -Fläche, de = Konzentrationsunterschied und dl = Diffusionsweg dt = Diffusionszeit bedeuten.
An Membranen wirken zusätzliche Faktoren, die von den Eigenschaften des diffundierenden Stoffes als auch von denen der Membran abhängen.
Für niedermolekulare Matrixbestandteile sind dabei die reinen Diffusionszeiten vom
Konzentrationsgradienten, der zur Verfügung stehenden Fläche direkt und vom Diffusionsweg umgekehrt proportional abhängig und betragen üblicherweise für einen Diffusionsweg von 1 ,3 cm ca. 100 h, für 1 ,3 mm ca. 1 h und für 13 μm ca. 0,3 sec (S. M. Rappoport, Medizinische Biochemie, Verl. Volk und Gesundheit, 1983, S. 39/40). Durch eine geeignete Geometrie (große wirksame Fläche, kleine Diffusionswege) und durch geeignete Membranen (keine Interaktion der zu tauschenden Stoffe mit der Membran) ist daher die Diffusion für den effizienten Mediumwechsel insbesondere für kleine Volumina nutzbar. Durch die Erzeugung von Turbulenzen in Probe und/oder Dialyseaußenflüssigkeit durch geeignete mechanische Vorrichtungen, können zusätzlich die Konzentrationsunterschiede (de in Formel 1 ) groß gehalten und dadurch die Diffusion durch die Membran beschleunigt werden. Auch Bündel von sog. Hollow-Fasem mit definierten Poren, durch welche die Probenflüssigkeit hindurchfließt, kommen für die Dialyse im Labor und bevorzugt für die Hämodialyse zur Anwendung. Dabei strömt die gleiche, meist großvolumige Probe durch eine gebündelte hohe Zahl von Hollow-Fasern, wodurch die wirksame Oberfläche stark vergrößert ist. Auch Kartuschen mit semipermeablen Membranen werden im Durchfluss zum Mediumwechsel im Labor eingesetzt. Kartuschen und Hollow-Fasern haben durch die Anbindung an Pumpen große Totvolumina und erfordern hohe Drücke, da durch die kleinen Querschnitte große Flusswiderstände und die relativ dicken Wände lange Diffusionsbarrieren vorhanden sind. Dadurch lassen sich beide technische Lösungen nur schwer in stark miniaturisierte oder gar parallelisierte Systeme integrieren.
Im Labor ist die Dialyse in Säckchen oder Containern mit einfachen Pipettiersch ritten durchzuführen. Es kommt üblicherweise nur zu unwesentlichen Volumenänderungen der Probe. Bei geschickter Wahl des Membrantyps und der Porengröße (Molekulargewichts-cut-off) gehen keine wesentlichen Bestandteile biologischer Proben verloren. Für die gleichzeitige Dialyse einer großen Zahl von zwar gleichartigen, in der Zusammensetzung von wesentlichen Analyten und Matrixbestandteilen jedoch verschiedenen kleinvolumigen Proben gibt es jedoch bisher keine befriedigende Lösung. Die „drop-dialysis", d. h. Dialyse mittels vergleichsweise grobporigen auf der Dialyseflüssigkeit schwimmenden Filtrationsmembranen ist zwar zur schnellen Entsalzung kleinster Volumina bis wenige μl konzipiert, jedoch nicht zu parallelisieren und hinsichtlich der zurück zu gewinnenden Probenmenge sowie der darin enthaltenen wesentlichen Bestandteile nicht quantitativ. Es gibt singuläre Dialysevorrichtungen bis zu einem minimalen Volumen von gegenwärtig 10 μl (z. B. US 5,503,741 ) wobei das Oberflächen-Volumen-Verhäitnis keinesfalls optimal und eine Parallelisierung nicht vorgesehen ist. Daneben sind spezielle Mikrodialyseeinheiten für noch kleinere Volumina, jedoch nicht für den Mediumwechsel von wesentlichen Probenbestandteilen entwickelt worden, sondern zur Diffusions- basierten //?-ι//Vα-Gewinnung von niedermolekularen Soluten (WO 2004032735). Hierbei wird in der kleinen mit einer semipermeablen Membran teilweise gebildeten Innenkammer ein maximales Oberflächen-Volumenverhältnis erreicht, jedoch in dieser eine Flüssigkeit transportiert, die aus der außen befindlichen lebenden Gewebsprobe diffusible Stoffe aufnehmen und so einer Analyse zuführen soll. Hier . ist eine Parallelisierung ausgeschlossen.
Mit US 6,458,275 wird eine Möglichkeit zur parallelisierten Gleichgewichtsdialyse zur Untersuchung von Bindungskonstanten im Mikroplattenraster aufgezeigt, die für jede Probe eine eigene Außenflüssigkeit realisiert und wegen des geringen Volumenverhältnisses Außenflüssigkeit/Probe prinzipiell nicht zum effizienten Mediumwechsel bzw. zum Entsalzen einsetzbar ist.
Die parallelisierte Durchführung von Dialysen ist in verschiedenen Lösungen realisiert. Bis zu 12 Proben und einem Volumen von minimal 20 μl (Pierce: Microdialyzer System) bzw. von bis zu 96 Proben und einem minimalen Volumen von ca. 24 μl (vorteilhafter Weise im Mikroplattenraster) sind möglich (z. B. US 2004195163, US 2005019774, US 2005148066, SpectrumLabs: Spectra/PorMicrodialyzer). Auf Grund der dabei vorliegenden ungünstigen Oberflächen-Volumen-Verhältnisse, der relativ kleinen Diffusionsflächen und der daraus resultierenden relativ großen Diffusionswege sind für einen vollständigen Mediumwechsel mit diesen Verfahren viele Stunden erforderlich. In dieser Zeit kommt es sogar bei Deckelung der Probengefäße zu Verdunstungsverlusten durch die Verdunstungsfähigkeit an der großen Oberfläche in die eingeschlossene Luftkammer hinein, und es können sich wesentliche Bestandteile der Proben verändern, beispielsweise Proteine denaturieren. Zudem sind die Proben aus den Mikroplatten- well-förmigen Probengefäßen mit fragilen Membranen nur schwer parallelisiert und verlustarm rückgewinnbar. Eine Standardisierung der Dialysebedingungen für alle Proben ist durch die Zufälligkeit der Ausbildung des effektiven Diffusionsweges durch Volumentoleranzen, Meniskusbildung sowie durch schwer zu kontrollierende Luftblaseneinschlüsse und Luftpoister-Bildung nicht gegeben.
Es sind Probenplatten zur Verwendung in Dialysesystemen bekannt (DE 101 60 975 AI ), womit eine Vielzahl von Mikroproben im μl-Bereich dialysiert werden können. Die Probengefäße, deren obere Enden offen und deren untere Enden, d.h. die Stirnflächen der Probengefäße durch eine für die „drop-dialysis" verwendete Filtrationsmembran verschlossen sind, wurden im zur Anwendung der Liquidhandlingtechnik für die Mikroplattentechnologie passenden Raster angeordnet. Wünschenswert wären allerdings eine weitere Verkürzung der Dialysezeit und eine Verringerung der Beschädigungsgefahr, insbesondere der semipermeablen Membran bei Beschickung (Pipettierbewegung). Darüber hinaus ist die Dialysezeit abhängig von der Füllstandshöhe (Diffusionsweg dl in Formel 1 ) und damit vom Probenvolumen sowie von der Pipettierpräzision.
Zusammengefasst gibt es noch immer kein vollständig zufrieden stellendes praktikables, schnelles, reproduzierbares Verfahren, mit dem unselektiv für wesentliche Bestandteile von Proben im Volumenbereich von < 1 μl bis 500 μl ein Mediumwechsel in kurzer Zeit verlustfrei durchgeführt werden kann. Dialyseverfahren, die in den unteren des genannten Volumenbereiches gelangen, sind nicht quantitativ und nicht parallelisierbar, diejenigen die parallelisiert werden können, benötigen größere Volumina und haben wesentliche Nachteile bezüglich des Handlings, der zu erwartenden Präzision und der benötigten Dialysezeiten. Aufkonzentrierungen sind prinzipiell mittels Fällungsreaktionen, Ultrazentrifugation, Ultrafiltration, Lyophyllisation, incl. der Sonderform mittels SpeedVac, und Adsorptionsverfahren möglich.
Fällungen mittels Neutralsalzen, Säuren und organischen Lösungsmitteln sind effiziente Verfahren der Konzentrationserhöhung für viele Analyte, wie beispielsweise Proteine. Diese Verfahren eignen sich jedoch nicht für niedermolekulare Stoffe und Peptide, sind ebenfalls nicht „unselektiv" für viele weitere Analyte, da Analyt- und Matrixeigenschaften die Fälleffizienz bestimmen, und denaturieren darüber hinaus meist eine Vielzahl von Proteinen. Zudem sind Fällungsrektionen nur schwer miniaturisier- und parallelisierbar, und die zur Fällung eingesetzten Mittel müssen vor der eigentlichen Analyse in der Regel wieder aus der Probe entfernt werden. Ultrazentrifugation und Ultrafiltration sind nicht in μl-Volumina möglich, erfordern Flusshilfen, wie Zentrifugen oder Vakuum, und sind nur schwer parallelisiert zu realisieren. In US 2005133425 wird ein Kit vorgeschlagen, der Einzelelemente zur Ultrafiltration zum Zweck der Molekulargewichtsselektiven Konzentrierung und damit selektiven Anreicherung von ausgewählten Analyten enthält.
Mit dem Verfahren der Lyphyllisation, auch mittels SpeedVac, steht zwar ein gut parallelisierbares und miniaturisierbares Verfahren zur Verfügung, jedoch mit dem Nachteil, dass dabei mit dem genutzten physikalischen Prinzip des Verdunstens des Lösungsmittels auch alle störenden Begleitstoffe mit aufkonzentriert werden. Wird das Verfahren bis zum vollständigen Lösungsmittelentzug, d. h. zur sog. Trockne geführt, besteht die Gefahr, dass die wesentlichen Analyte, insbesondere Proteine oder spezielle Peptide oftmals nicht/oder nur partiell wieder lösbar sind.
Adsorptionen mittels spezifischer Capture-Verbindungen sind elegante Methoden,
Analyte auf Oberflächen hoch anzureichern, implizieren jedoch ebenfalls eine Vorauswahl gebundener Analyte. Dies sind Verfahren, die leicht parallelisierbar sind. Solche Verfahren sind beispielsweise für zahlreiche SELDI-Träger in unterschiedlicher Ausgestaltung, in WO 2005103718 für Glycoproteine, in US 2003027216 für immunoreaktive Analyte, in WO 2005070141 für verschiedene auszuwählende Analyte beschrieben, wobei hier zudem eine Parallelisierung bis zu 96-fach vorgesehen ist. Aber auch unspezifischere Adsorptionsverfahren, wie die oben beschriebene Reversed- Phase-Chromatographie in Zip-Tips selektieren spezielle, hier insbesondere hydrophobe, Analyte. Miniaturisierte chromatographische adsorptive Verfahren (US 2003027216, WO 2005070141) erfordern meist eine Flusshilfe, wie Zentrifugalbeschleunigung oder Unterdruck.
Zusammengefasst gibt es außer den nur bedingt in Betracht kommenden und oben beschriebenen adsorptiven Vorrichtungen, wie z. B. Zip-Tips mit den bekannten Nachteilen, keine Vorrichtung und kein praktikables Verfahren, mit denen auch Mediumwechsel in Kombination mit einer deutlichen Aufkonzentrierung von einer Vielzahl paralleler Proben im μl-Bereich und ohne Selektion eines Teils der Probenbestandteile ermöglicht werden können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine Vorrichtung zu schaffen, mit welcher Biomoleküle in Proben im Volumenbereich von < 1 μl bis 500 μl auf möglichst einfache, aufwandgeringe und praktikable Art und ohne Beschädigungsgefahr für die Vorrichtung schnell, reproduzierbar und verlustfrei aufgenommen, umfassend behandelt sowie aufbewahrt werden können.
Die Aufnahme und Behandlung der Proben soll mit den Vorzügen der an sich bekannten Liquidhandlingtechnik, wie sie unter anderem für Mikroplatten bekannt ist, erfolgen können.
Die Vorrichtung soll möglichst ohne Änderungen, Umpipettierung und Umrüstungen etc. gleichermaßen für Mediumwechsel, Aufkonzentrierungsschritte und andere Probenbehandlungen, incl. Aufbewahrung, verwendbar sein, um die einmal eingebrachten Proben reproduzierbar hantieren zu können. Dazu sollen möglichst allgemein einsetzbare Verfahren ohne Bevorzugung bzw. Selektion spezieller Analyte durch eventuelle reaktive Oberflächen einsetzbar sein.
Erfindungsgemäß wird die Vorrichtung durch mindestens ein Probengefäß für universelle Aufnahme, Behandlung und Aufbewahrung kleinvolumiger Proben realisiert, welches in Größe und Gestalt als Form- und Lagestabile beidseitig offene Kapillare ausgebildet ist, deren Längswandung vollständig oder teilweise aus einer an sich bekannten semipermeablen Membran ausgebildet ist.
Als Kapillare im Sinne der Erfindung sind röhrchenförmige Probengefäße mit sehr kleinem Innendurchmesser zu verstehen. Diese Kapillare kann als gerade Röhre. oder auch als ein- oder mehrfach gekrümmte Röhre ausgebildet sein. Zweckmäßig ist beispielsweise eine U-förmig gekrümmte Kapillare, deren beidseitige Öffnungen von derselben Seite der Vorrichtung zugänglich sind.
Zur ihrer Form- und Lagestabilität kann es zweckmäßig sein, wenn die Kapillare mit einem oder mehreren stützenden und somit Form- und Lagestabilisierenden Körpern beispielsweise aus Edelstahl oder aus einem nichtmetallischen Werkstoff, wie Glas,
Keramik oder Kunststoff, insbesondere in den Bereichen ihrer Kapillarenden bzw.
Stirnflächen, formschlüssig in Verbindung steht. Andererseits ist es auch möglich, dass das Probengefäß in Größe und Gestalt unmittelbar als kapillarförmige Vertiefung, hergestellt beispielsweise durch Gießen, Pressen, Verformen oder Zerspanen, in einem bereits Form- und Lagestabilen Körper, der auch aus mehreren Teilkörpern bestehen kann, eingebracht ist.
Die semipermeable Membran kann vorteilhafterweise mit an sich bekannten Verfahren unlösbar und dichtend mit den Form- und Lagestabilisierenden Körpern verbunden werden. Solche Verfahren sind beispielsweise als Overmolding, IR-Schweißen, UV- Bonden bzw. Kleben bekannt. Diese Verfahren werden seit langem zum unlösbaren Verbinden verschiedenster polymerer Werkstoffe genutzt.
In den Unteransprüchen sind vorteilhafte Ausgestaltungen der kapillaren Probengefäße aufgeführt.
Von Vorteil ist, dass die vorgeschlagenen Kapillaren in einem zur Liquidhandlingtechnik für die Mikroplattentechnologie passenden Raster (n x 8 x 12 oder n x 8 oder/und m x 12) angeordnet werden können und damit eine multiple Probenbehandlung ermöglichen. Damit ist auch die Anwendung und die Kompatibilität an sich bekannter und in der Praxis etablierter Verfahren der Liquidhandlingtechnik ohne komplizierte Anpassungen und Umrüstungen oder gesonderte Methoden des Probenhandlings gegeben. Das vorgeschlagene spezielle Probengefäß gestattet insbesondere bei seiner vorgenannten multiplen Anordnung im Rastermaß einfach und praktikabel handhabbare, trotz sehr geringer Probenvolumina äußerst verlustarme Anwendungen sowie den universellen Einsatz für Aufnahme, Behandlung und Aufbewahrung von Proben, unter anderem auch zur Aufkonzentrierung und für den Mediumwechsel. Durch die besagten universellen Verwendungsmöglichkeiten entfallen ansonsten erforderliche Änderungen, Umpipettierung und Umrüstungen etc., die in der Praxis besondere Aufwendungen im Probenhandling, insbesondere bei vielen Tausend Proben in Screeningver-fahren und auch die zusätzliche Gefahr von Probenverlusten und - Verwechslungen in sich bergen.
Für das parallelisierte Dialysieren von Mikrovolumina wurde eine Geometrie der Probengefäße gefunden, welche nicht nur äußerst kurze und damit effektive Diffusionswege unabhängig vom Probenvolumen im Bereich von unter einem Millimeter ermöglicht, sondern mit der Membrananordnung auch eine sehr effiziente im Vergleich zum Volumen große wirksame Diffusionsfläche realisiert.
Darüber hinaus wird die Verdunstung minimiert und nicht zuletzt eine verlustfreie und leicht parallelisierbare Rückgewinnung der dialysierten Probe ermöglicht. Auf diese Weise werden eine drastische Verkürzung der benötigten Diffusionszeit erreicht und zusätzlich eine hohe Präzision dieses Probenbehandlungsschrittes gewährleistet. Daneben können ggf. weitere Behandlungen, wie beispielsweise der Zusatz von modifizierenden Reagenzien, deren Reste nach Reaktion ohne weiteren Aufwand durch Dialyse entfernt werden können, oder der Verdau von Proteinanalyten mittels spezifischer Proteasen im selben Probengefäß, in dem zuvor der Mediumwechsel oder eine Konzentrierung stattgefunden hat, mit anschließender erneuter Konzentrierung und Entsalzung, durchgeführt werden.
Die semipermeable Membran ist im Unterschied zu den eingangs beschriebenen bekannten Lösungen nicht quer zur Beschickungsrichtung angeordnet, was aus Erfahrung nicht nur bei unsachgemäßer Behandlung leicht zu Beschädigungen führen kann, sondern in Achs- bzw. Längsrichtung der Kapillare als vollständige oder teilweise Wandung ausgebildet, wodurch das Beschädigungsrisiko der Membran, insbesondere durch Pipettierbewegung, quasi ausgeschlossen ist. Die Kapillaren werden vorteilhaft in einem Verhältnis ihrer Länge zum Innendurchmesser von größer 4 realisiert. Die größte Ausdehnung des Querschnittes der Kapillaren sollte 5 mm nicht übersteigen. Außerdem können die Kapillaröffnungen, zum Beispiel durch Deckel, Stopfen oder Klebefolien ebenfalls gut handhabbar und zuverlässig verschlossen werden. Durch all diese Merkmale ist auch die Verdunstungsgefahr während eines Mediumwechsels mittels Dialyse auf ein Minimum reduziert, was ebenfalls eine hohe reproduzierbare Genauigkeit des Umgangs und der Analyse der Proben gewährleistet.
Die vorgeschlagene kapillare Geometrie mit den empfohlenen Abmessungen und dem vergleichsweise großen Anteil der semipermeablen Membran gestattet gut parallelisierbare Verfahrens-kombinierte Anwendungen.
Zum Beispiel, ist im Fall des Eintauchens der Vorrichtung in eine Außenflüssigkeit bei verlustfreiem Erhalt der wesentlichen Analyten in kleinvolumigen Probenvolumina a: die Entfernung primär in der Probe enthaltener und die Analyse störender
Matrixbestandteile, b: der Zusatz von Hilfsreagenzien und c: die Entfernung von Beiprodukten nach Hilfsreaktionen relativ problemlos mittels Dialyse über die Außenflüssigkeit möglich. Durch die vergleichsweise kleinen Oberflächen an den offenen Kapillarenden, die zudem auch verschlossen werden können, ist dabei die Verdunstung minimiert bzw. ausgeschlossen. Bei Aufbewahrung in verdunstungsgeschützter Umgebung ohne kontaktierende Außenflüssigkeit sind die Vorrichtungen als parallelisierte Reaktionsgefäße für analytische Hilfsreaktionen oder zur Lagerung und Transport von Proben verwendbar, wie beispielsweise Mikroplatten oder Tubes.
Im Fall der Aufbewahrung in trockener Umgebung ggf. mit kontrollierter Konvektion oder Vakuum kann die Verdunstung des in der Probenlösung vorhandenen Lösungsmittels durch die große Oberfläche der semipermeablen Membran zum Zwecke der Aufkonzentrierung wesentlicher Analyten mit hoher Geschwindigkeit und vorteilhafter Weise ohne Umpipettierung genutzt werden.
Es ist auch eine beliebige sequenzielle Kombination der aufgeführten Anwendungen und auch bei unterschiedlichen Temperaturen möglich. Die Kapillarität der Probengefäße und die daraus realisierten Kohäsionskräfte der Flüssigkeitssäule sowie die Nicht-Selektivität der semipermeablen Membran bezüglich des hydrophoben bzw. hydrophilen Charakters der wesentlichen Probenbestandteile ermöglichen zudem deren quasi komplette Rückgewinnung.
Durch die genannten Möglichkeiten und Merkmale ist die Vorrichtung für eine Vielzahl parallelisierter Verfahren universell, praktikabel, aufwandgering sowie mit guter Präzision und Wiederfindung der wesentlichen Analyte einer Probe einsetzbar.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Es zeigen:
Fig. 1 : Draufsicht auf eine Kapillare, deren Wandung mit rundem Querschnitt vollständig aus einer semipermeablen Membran besteht, wobei die eigenständige Kapillare zwischen zwei stabilisierenden Körpern angeordnet ist
Fig. 2: Draufsichten auf vier Kapillaren mit unterschiedlichem Querschnitt, welche jeweils durch eine Vertiefung in einem stabilen Körper gebildet werden, wobei die Vertiefung jeweils durch eine semipermeable Membran abgeschlossen wird
Fig. 3: Draufsichten auf vier Kapillaren mit unterschiedlichem Querschnitt, welche jeweils als Durchbruch in einem stabilen Körper ausgebildet sind, wobei der Durchbruch jeweils auf beiden Seiten durch eine semipermeable Membran abgeschlossen wird Fig. 4: Ausbildung von acht U-förmigen kapillaren Probengefäßen im Mikroplatten- rastermaß in einem stabilen Grundkörper a: Vorderansicht b: Schnitt X-X entsprechend Fig. 4a c: Schnitt Y-Y entsprechend Fig. 4a d: Seitenansicht in Schnittdarstellung eines Stapels von 12 aneinander gereihten stabilen Grundkörpern gemäß Fig. 4a mit je 8 U-förmigen kapillaren Probengefäßen (vgl. Einzeldarstellung von Fig. 4b)
Fig. 5: Zeitverlauf der Abnahme der p-Nitrophenol-Konzentration in sechs gleichzei- tig dialysierten Proben unter Verwendung von U-förmigen kapillaren Probengefäßen; dargestellt sind Mittelwerte (Punkte) und Standardabweichungen (Fehlerbalken)
Fig. 6: Zeitverlauf der Abnahme der NaCI-Konzentration in acht gleichzeitig dialysierten Proben unter Verwendung von U-förmigen kapillaren Probengefäßen; dargestellt sind die Mittelwerte (Punkte)
Fig. 7: Zeitverlauf der Volumen-Abnahme von acht gleichzeitig in U-förmigen kapillaren Probengefäßen im Konvektionsstrom eines Ventilators aufbewahrten Proben
Fig. 8: Massenspektren der drei Proben nach Ausführungsbeispiel 8 a: Massenspektrum von Probe 1 , 2 pM Protein, 10 mM Tris/HCI, pH 7.4 mit
15O mM NaCI. b: Massenspektrum von Probe 2, 9,4 pM Protein, ca. 53 mM Tris/HCI, pH 7.4 mit 70O mM NaCI. c: Massenspektrum von Probe 3, 19 pM Protein, 10 mM Tris/HCI, pH 7.4 mit 10O mM NaCI
Fig. 9 Lactatproduktion in humanen Erythrozyten nach Ausführungsbeispiel 10
Anwendunqsbeispiel 1 : In Fig. 1 ist ein Querschnitt durch ein kapillares Probengefäß 1 mit einer kreisförmigen Hohlraum-Querschnittsfläche 2 dargestellt. Die Kapillare ist zu ihrem Schutz zwischen zwei Form- und Lagestabilisierenden Körpern 3 und 4 angeordnet. Die zylindrische Mantelfläche (Längswandung) des kapillaren Probengefäßes 1 besteht vollständig aus einer semipermeablen Membran 5 (angedeutet in der Schnittdarstellung von Fig. 1 als kreisförmige punktierte Linie). Anwendunqsbeispiel 2:
Fig. 2 zeigt Darstellungen von ebenfalls Querschnitten durch vier kapillare Probengefäße 6, 7, 8, 9 mit unterschiedlichen Hohlraum-Querschnittsflächen 10, 1 1 , 12, 13. im Unterschied zu Fig. 1 , bei welcher die Kapillare eigenständig, d. h. unabhängig von den benachbarten Form- und Lagestabilisierenden Körpern 3, 4 durch die semipermeable Membran 5 als zylindrische Mantelfläche realisiert ist, werden die kapillaren Probengefäße 6, 7, 8, 9 jeweils als eine beispielsweise durch Gießen, Pressen, Verformen oder Zerspanen hergestellte Vertiefung in einem Form- und Lagestabilen Grundkörper 14, 15, 16, 17 gebildet. Abgedeckt wird jeweils die Vertiefung im Form- und Lagestabilen Grundkörper 14, 15, 16, 17 mit einer z. B. aufgeklebten oder gebondeten semipermeablen Membran 18 (wiederum als punktierte Linie dargestellt), wodurch jeweils der Hohlraum der kapillaren Probengefäße 6, 7, 8, 9 seitlich abgeschlossen wird. Auf diese Weise entstehen im Form- und Lagestabilen Grundkörper 14 ein kapillares Probengefäß 6 mit einer dreieckigen Hohlraum- Querschnittsfläche 10, im Form- und Lagestabilen Grundkörper 15 ein kapillares Probengefäß 7 mit einer halbrunden Hohlraum-Querschnittsfläche 1 1 , im Form- und Lagestabilen Grundkörper 16 ein kapillares Probengefäß 8 mit einer rechteckigen Hohlraum-Querschnittsfläche 12 und im Form- und Lagestabilen Grundkörper 17 ein kapillares Probengefäß 9 mit einer trapezförmigen Hohlraum-Querschnittsfläche 13.
Anwendunqsbeispiel 3:
In ähnlicher Weise wie in Fig. 2 zeigt Fig. 3 ebenfalls vier Querschnitte durch kapillare Probengefäße 19, 20, 21 , 22 welche jeweils in einem Form- und Lagestabilen Grundkörper 23, 24, 25, 26 realisiert sind. Im Gegensatz zu Fig. 2 werden in diesem Ausführungsbeispiel die Kapillaren nicht durch Vertiefungen, sondern jeweils als Durchbruch durch den Form- und Lagestabilen Grundkörper 23, 24, 25 bzw. 26 ausgebildet. Die Durchbrüche sind beidseitig durch semipermeable Membranen 27, 28 (auch hier als punktierte Linien dargestellt) abgedeckt. Auf diese Weise entstehen die vier kapillaren Probengefäße 19, 20, 21 , 22, deren in Fig. 3 gezeigte Hohlraum- Querschnittflächen 29, 30, 31 , 32 jeweils unterschiedliche Formen mit den dargestellten geraden und/oder gekrümmten Polygonzügen aufweisen. Anwendungsbeispiel 4:
Fig. 4 zeigt eine spezielle Ausbildung von acht U-förmigen kapillaren Probengefäßen 33 im Mikroplattenrastermaß n x 8, mit n = 1 in einem Form- und Lagestabilen Grundkör- per 34. Jedes Probengefäß 33 besteht aus zwei vertikalen Kapillarröhrchen 35, 36, die der Hohlraum-Querschnittsform von Probengefäß 22 in Fig. 3 entsprechen und welche nach oben offene Röhrchenenden 37 aufweisen sowie zur besagten U-förmigen Probengefäßausbildung unten über ein horizontales Kapillarröhrchen 38 in der Form von Probengefäß 8 (siehe Fig. 2) in Verbindung stehen. Dieses Kapillarröhrchen 38 enthält vorzugsweise einen stabilisierenden, das Lumen nur teilweise einengenden, Verbindungssteg 43 zwischen einer Materiallippe 44 und dem restlichen Grundkörper 34.
Die Röhrchenenden 37 der Kapillarröhrchen 35, 36 stehen bei jedem Probengefäß 33 jeweils über ein Verbindungsröhrchen 39 mit der Öffnung 40 (Kapillarröhrchen 35) zur Befüllung bzw. Entnahme von aus Übersichtsgründen nicht in der Zeichnung dargestellter Proben oder mit der Belüftungsöffnung 41 (Kapillarröhrchen 36) für die Probenbefüllung bzw. -entnähme in Verbindung.
Fig. 4b zeigt zur Verdeutlichung einen Schnitt in der bei Fig. 4a angezeigte Ebene X-X durch das Kapillarröhrchen 35 eines Probengefäßes 33 mit der Öffnung 40 zur besagten Probenbefüllung bzw. -entnähme sowie eine durch Bonden aufgebrachte und dadurch das U-förmige Probengefäß 33 vervollständigende semipermeabie Membran 42.
Fig. 4c zeigt zur Verdeutlichung einen Schnitt in der bei Fig. 4a angezeigte Ebene Y-Y durch das Kapillarröhrchen 38 eines Probengefäßes 33 mit dem stabilisierenden, das Lumen nur teilweise einengenden, Verbindungssteg 43 und der Materiallippe 44.
Fig. 4d zeigt in Seitendarstellung einen Schnitt durch einen Stapel von insgesamt zwölf aneinandergereihten Form- und Lagestabiler Grundkörpern 34 gemäß Fig. 4a mit jeweils (wie in Fig. 4a abgebildet) acht U-förmigen kapillaren Probengefäßen 33. Der in Fig. 4b dargestellte Schnitt X-X entspricht bei Fig. 4d dem linken Probengefäß 33. In Fig. 4d rechts daneben sind weitere elf Form- und Lagestabile Grundkörper 34 angereiht (realisierbar auch durch einen einzigen Form- und Lagestabilen Grundkorper für den gesamten Block der insgesamt 96 vorhandenen Probengefaße 33) Dadurch werden die U-formιgen kapillaren Probengefaße 33 in mehreren Ebenen in einem Rastermaß von hier n x 8 x 12 mit n = 1 entsprechend dem an sich bekannten Mikroplattenrastermaß angeordnet Zwischen den zwölf aneinandergereihten Formund Lagestabilen Grundkorpem 34 befinden sich jeweils vergleichsweise großlumige Kanäle 45, in denen sich eine nicht dargestellte Dialyseaußenflussigkeit befinden bzw hindurchgeleitet werden kann
Im Nachfolgenden werden weitere Anwendungsbeispiele aufgeführt, welche die Verwendung der erfindungsgemaßen Vorrichtung verdeutlichen sollen
Anwendungsbeispiel 5
Mediumwechsel am Beispiel der Entfernung von p-Nιtrophenollosung aus einer Losung im Kapillarmodul
In sechs der acht U-formιgen kapillaren Probengefaße 33 entsprechend Fig 4a, die durch Ausfrasung eines Form- und Lagestabilen Grundkorpers 34 aus Polymethylmethacrylat (PMMA) sowie aus aufgeklebten semipermeablen Membranen 42 (Spektra/Por® 1 , RC, MWCO 6-8 kDa, SpectrumLabs) entstanden sind, werden je 200 μl einer Losung aus 6 mM p-Nιtrophenol in 1 M Diethanolamin/HCI, pH 9,8 (Puffer A) pipettiert, in zwei weitere kapillare Probengefaße 33 ein Farbstofffreier Puffer A Das Modul wird bei Raumtemperatur in ein Gefäß mit 1 50 ml deionisiertem Wasser (Außenflussigkeit) gestellt Nach 30 min wird das deionisierte Wasser gegen frisches ausgetauscht Nach jeweils unterschiedlichen Zeiten werden der gesamte Inhalt aller Kapillaren mit einer Pipette herausgesaugt, Aliquots davon 1 zu 10 bis 1 zu 100 in Puffer A in Mikroplatten-Wells verdünnt und die Absorbanz bei 405 nm in einem Reader (Spectramax Plus384) gemessen Der Rest wird zurück pipettiert und weiter dialysiert Aus dem Diagramm in Fig 5 ist ersichtlich, dass nach ca 2 h nur noch 1 2 %, nach ca 3 h nur noch ca 7 % der ursprünglichen Farbkonzentration vorhanden ist Anhand der geringen Streuung der Einzelwerte ist die hohe Reproduzierbarkeit der Methode erkennbar Die geringe Farbkonzentration in denjenigen Kapillaren mit Puffer A vor Wechsel der Außenflüssigkeit ist auf die retrograde Diffusion in die Kapillaren hinein zurückzuführen.
Nach dem Wechsel (nach 30 min) ist in den mit Puffer A gefüllten Kammern keine Absorbanz mehr nachweisbar, d. h. die durch Kleben der semipermeablen Membran vervollständigten kapillaren Probengefäße 33 sind dicht, es gibt keine Kreuzkontamination.
Anwendunqsbeispiel 6: Entfernung von NaCI mittels Kapillarmodul
In alle acht parallele U-förmige kapillare Probengefäße 33 (vgl. Fig. 4a) werden je 190 μl einer Lösung aus 10 mM Tris/HCI, pH 7,4 (Puffer B) mit 150 mM NaCI pipettiert. Das Modul wird bei Raumtemperatur in ein Gefäß mit 150 ml Puffer B (Außenflüssigkeit) gestellt. Nach 30 min wird die Außenflüssigkeit gegen frische ausgetauscht. Nach verschiedenen Zeiten wird der gesamte Inhalt der Kapillaren mit einer Pipette herausgesaugt. Es wird mit einem Osmometer (Knauer, Semi-Microosmometer) die Osmolarität der Lösungen gemessen und mit Eichlösungen verglichen. Danach werden die Lösungen zurück pipettiert und weiter dialysiert. Im Diagramm in Fig. 6 ist zu erkennen, dass nach 120 min bzw. 180 min nur noch ca. 8 % bzw. 4 % der Ausgangs-NaCI-Konzentration vorhanden sind. Die Methode ist gut reproduzierbar, da die Variationskoeffizienten der jeweiligen 8- fach-Bestimmungen im Bereich von < 1 % liegen.
Anwendunqsbeispiel 7:
Verdunstung von Wasser im Kapillarmodul
In alle acht der U-förmigen kapillaren Probengefäße 33 (vgl. Fig. 4a) werden 200 μl deionisiertes Wasser hinein pipettiert. Das Modul wird bei üblicher Raumtemperatur an einem Stativ befestigt und ein im Luftstrom darauf gerichteter Ventilator (Diffusor, Fa. Braun) in ca. 30 cm Abstand auf der geringsten Stufe und ohne Zusatzheizung eingeschaltet. Nach verschiedenen Zeiten wird jeweils das Modul gewogen. Aus dem Diagramm in Fig. 7 ist zu sehen, dass nach ca. 2 h etwa noch 5 % und nach 3 h nur noch 0,6 % der Ausgangsflüssigkeitsmenge vorhanden ist, was bei Anwesenheit von nichtflüchtigen Analyten einem Konzentrierungsfaktor von mehr als 20 bzw. ca. 160 entsprechen würde.
Anwendunqsbeispiel 8:
Kombinierte Probenbehandlung: Konzentrierung und Dialyse
In alle acht der U-förmigen kapillaren Probengefäße 33 (vgl. Fig. 4a) werden 190 μl einer Lösung mit Rinder-IgG (Serva No. 22550, 0,3 mg/ml, 2,0 μM, in 10 mM Tris/HCI, pH 7,4, Probe 1 ) pipettiert. Das Modul wird wie in Anwendungsbeispiel 7 an einem Stativ befestigt und ein Ventilator (Diffusor, Fa. Braun) in ca. 30 cm Abstand auf der geringsten Stufe und ohne Zusatzheizung eingeschaltet. Nach Verdunstung des überwiegenden Teils von Flüssigkeit werden die Restvolumina in einem einzigen der U- förmigen kapillaren Probengefäße 33 vereinigt und die entleerten kapillaren Probengefäße 33 sequenziell mit 100 μl 10 mM Tris/HCI, pH 7,4 gespült. Die erhaltene Spülflüssigkeit wird in dasselbe kapillare Probengefäß 33 mit den besagten Restvolumina dazu gegeben. Es wird erneut mit dem Ventilator konzentriert (Probe 2). Danach wird ohne weites Umpipettieren im gleichen Modul 2 h gegen 10 mM Tris/HCI, pH 7.4 mit 100 mM NaCI dialysiert (Probe 3).
Von den Proben 1 -3 werden Massespektren mittels MALDI-MS aufgezeichnet (siehe A. Hörn et al.: Proteomics, 6, 2006, 559). Fig. 8 a bis Fig. 8c zeigen die Massenspektren der Proben 1 bis 3. In nachstehender Tabelle sind für die drei Proben jeweils Probenvolumen, Konzentrierungsfaktor und MALDI-Resultat gegenübergestellt:
Figure imgf000021_0001
* unter den in Fig. 8a-c angegebenen Bedingungen. Verwertbare Massespektren sind solche, die ein hohes, zur exakten Bestimmung der Mittleren Masse ausreichendes Signal/Rausch-Verhältnis aufweisen.
Anwendunqsbeispiel 9:
Proteinmodifikation, Dialyse und Verdau
16 Proben von Human-Serumalbumin (Sigma, 3 μM, je 60 μl in 2O mM Ammonium- Hydrogencarbonat) werden nach Zusatz von 20 μl 8 M Guanidin-HCL und Denaturierung in Polycarbonatgefäßen 20 min bei 90 °C auf zwei Sätze zu je 8 Proben aufgeteilt. Je einer dieser Probensätze wird parallel herkömmlich in acht Tubes (Methode A) bzw. vorschlagsgemäß als Methode B in den besagten acht U-förmigen kapillaren Probengefäßen 33 (siehe wiederum Fig. 4a), modifiziert und verdaut. Das herkömmliche Verfahren (Methode A) in Tubes umfasst folgende Arbeitssch ritte: Nacheinander Zupipettieren von DTT- und Jodacetamid-Lösung, mit jeweiliger Inkubation, Umpipettieren in Dialysegefäße, 2 h Dialyse gegen 20 mM Ammonium- Hydrogencarbonat, Umpipettieren in neue Tubes, Zusatz von Trypsin und Inkubation. In den U-förmigen kapillaren Probengefäßen 33 (Methode B) erfolgen prinzipiell die gleichen Reaktionen, jedoch entfällt das zweimalige Umpipettieren vor bzw. nach Dialyse: Die nach dieser Behandlung jeweils in den acht Probengefäßen (Tubes bzw. U- förmige kapillare Probengefäße 33) erhaltenen Peptidgemische wurden mittels MALDI- MS jeweils als Vierfachbestimmung pro Reaktionsgefäß analysiert (Bublitz et al.: Proteomics 2006, 6, 3909). Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefasst. Es ist zu erkennen, dass sowohl die Anzahl der gefundenen Peptide, die erreichten normierten Höhensummen, welche ein verlässliches quantitatives massenspektromethsches Maß darstellen und die Zusammensetzung der gefundenen Peptidgemische mit beiden Methoden vergleichbar sind.
Figure imgf000023_0001
vgl. Bublitz et al.: Proteomics 2006, 6, 3909, SD: Standardabweichung
Anwendungsbeispiel 10
Untersuchung von Metaboliten lebender Zellen
In alle acht parallele U-förmige kapillare Probengefäße 33 (vgl. Fig. 4a) werden je 170 μl einer Suspension aus einem Teil Zellsediment und vier Teilen physiologischer Kochsalzlösung (NaCI) mit frisch abgenommenen und zuvor dreimal mit NaCI gewaschenen humanen Erythrozyten pipettiert. Das Modul wird bei Raumtemperatur in ein Gefäß mit 10,0 ml NaCI mit 10 mM Glukose (Außenflüssigkeit) gestellt. Nach jeweils etwa 60 min wird die Außenflüssigkeit gemischt 100 μl davon entnommen und das Modul erneut in der Außenflüssigkeit platziert. In den entnommenen Proben wird die Lactatkonzentration nach Bergmeyer, H. U. in: Methods of Enzymatic Analysis, 3. Ed., Vol. VI, S. 582-588 bestimmt. Lactat in der Außenflüssigkeit kann nur aus Glukose gebildet sein, die mittels Diffusion in die Kapillaren gelangt, über die anaerobe Glycolyse der Erythrozyten entstanden und in die Außenflüssigkeit zurück diffundiert sein. Im Diagramm in Fig. 9 ist die Lactatkonzentration in der Außenflüssigkeit für einen Zeitraum von 5 h aufgetragen. In dieser Zeit ist eine lineare Konzentrationszunahme dieses Metaboliten zu beobachten. Die Lactatproduktion beträgt unter diesen Bedingungen 0.0103 μMole/(min x ml Erythrozytensediment) oder ca. 0.7 μMole/(min x 10" Zellen).
Der Vorteil dieser Methode ist, dass die gepackten Zellen in der Kapillare ohne Störung verbleiben können, via Diffusion versorgt und ebenso von Stoffwechselendprodukten, wie Lactat, befreit werden können. Außerdem stellt die gewählte Membran eine mikrobielle Barriere dar. Da die Membran nicht von Zellen oder Makromolekülen passiert werden kann, ist die Lactatbestimmung ohne aufwendige Entproteinisierung möglich.
Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen
1 6 7 8 9 1 9,20,21,22,33 kapillares Probengefäß
2, 10, 11, 12 / 13,29,30,31,32 - Hohlraum-Querschnittsfläche des kapillaren
Probengefäßes
3, 4 - Form- und Lagestabilisierender Körper
5, 18, 27,28 / 42 semipermeable Membran
14 , 15 , 16, 1 7 , 23, 24, 25, 26, 34 - Form- und Lagestabiler Grundkörper
35 ,36 ,38 Kapillarröhrchen
37 - Röhrchenende
39 - Verbindungsröhrchen
40 - Öffnung zur Befüllung bzw. Entnahme
41 - Belüftungsöffnung
43 - Verbindungssteg
44 - Materiallippe des Grundkörpers
45 - Kanal für eine Dialyseaußenflüssigkeit

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur Aufnahme, Behandlung und Aufbewahrung kleinvolumiger Proben, bestehend aus mindestens einem Probengefäß (1 , 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21 , 22, 33), welches in Größe und Gestalt als
Form- und Lagestabile beidseitig offene Kapillare ausgebildet ist, deren Längswandung vollständig oder teilweise aus einer semipermeablen Membran (5, 18, 27, 28, 42) besteht.
2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Teil der Längswandung des Probengefäßes (6, 7, 8, 9, 19, 20, 21 , 22, 33) der nicht aus einer semipermeablen Membran gebildet wird, aus einem metallischen Werkstoff, beispielsweise Edelstahl, besteht.
3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Teil der Längswandung des Probengefäßes (6, 7, 8, 9, 19, 20, 21 , 22, 33), der nicht aus einer semipermeablen Membran gebildet wird, aus einem nichtmetallischen Werkstoff, beispielsweise Glas, Keramik oder Kunststoff, besteht.
4. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die semipermeable Membran (5, 18, 27, 28, 42) aus einer Dialysemembran, beispielsweise einer sogenannten Regenerierten Zellulose, Zelluloseester oder Polyvinylidendifluorid, aus einer Filtrationsmembran, beispielsweise aus gemischten Zelluloseestern, Polyethersulfonen, aus Fritten, Glasfasern oder Filterpapiern oder aus anderen Membranmaterialien, wie Nitrocellulose, Nylon oder Polytetrafluoroethylen, porösen Polyethylen, Polypropylen bzw. Fluorokarbon bzw. Kompositen daraus, besteht.
5. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (1 , 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21 , 22) als gerade Röhre ausgebildet ist.
6. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (1 , 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21 , 22, 33) als ein- oder mehrfach gekrümmte bzw. abgewinkelte Röhre (35, 36, 38) ausgebildet ist.
7. Vorrichtung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (33) einen im Wesentlichen um 360° gekrümmten Abschnitt (35, 36, 38) aufweist, wobei sich beide Röhrchenenden (37) der Kapillare auf ein und derselben Seite der Vorrichtung befinden.
8. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass alle Seitenwände der Längswandung die Kapillare des
Probengefäßes (1 , 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21 , 22, 33) parallel umschließen.
9. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Längswandung der Kapillare Seitenwände oder Teile davon enthält, die nicht parallel zueinander ausgerichtet sind.
10. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (1 ) einen runden Querschnitt (2) aufweist.
1 1. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (6 bis 9, 19 bis 22, 33) einen polygonen Querschnitt (10, 12, 13, 29, 30, 31 , 32) mit zumindest drei Ecken aufweist.
12. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (7, 19, 20) einen Querschnitt mit einer oder mehreren gekrümmten Linien, beispielsweise zur Ausbildung eines konvex- oder konkavartig gestalteten Querschnitts, aufweist.
13. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare in einem Verhältnis ihrer Länge zum Innendurchmesser von größer 4, vorzugsweise von größer 10, ausgebildet ist.
14. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die größte Ausdehnung des Querschnittes der Kapillaren 5 mm nicht übersteigt.
15. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare im Fassungsvermögen für Mikrolitervolumina ausgeführt ist, welches vorzugsweise
500 μl nicht übersteigt.
16. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Pluralität der Kapillaren in einem zur Liquidhandlingtechnik für die Mikroplattentechnologie passenden Raster (n x 8 x 12 oder n x 8 oder/und m x 12) angeordnet ist.
17. Vorrichtung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass alle im Raster angeordneten Kapillaren jeweils gleiche Fassungsvermögen aufweisen.
18. Vorrichtung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die im Raster angeordneten Kapillaren unterschiedliche Fassungsvermögen aufweisen.
19. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (6 bis 9, 19 bis 22, 33) in oder an einem oder mehreren Form- und Lagestabilen Grundkörpern (14 bis 17, 23 bis 26, 34) angeordnet ist.
20. Vorrichtung gemäß Ansprüchen 16 und 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine Pluralität von 2 bis 1536 Kapillaren als Probengefäße (1 , 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21 , 22, 33) in oder an einem oder mehreren Form- und Lagestabilen Grundkörpern (14 bis 17, 23 bis 26, 34) angeordnet ist.
21. Vorrichtung gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (6 bis 9, 19 bis 22, 33) in oder an einem oder mehreren Form- und Lagestabilen Grundkörpern (14 bis 17, 23 bis 26, 34) zumindest im Bereich einer ihrer Stirnflächen fest verankert ist.
22. Anordnung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (1 ) zum Zweck ihrer Form- und Lagestabilisierung mit einem oder mehreren stützenden Körpern (3, 4) formschlüssig in Verbindung steht.
23. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (6 bis 9) als Vertiefung in einem Form- und Lagestabilen Grundkörper (14 bis 17) ausgebildet ist.
24. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (19 bis 22) als Durchbruch im Form- und Lagestabilen
Grundkörper (23 bis 26) ausgebildet ist.
25. Vorrichtung gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass eine Pluralität von 2 bis 1536 Kapillaren als Probengefäße (1 ) zum Zweck ihrer Form- und Lagestabilisierung mit einem oder mehreren stützenden Körpern (3, 4) formschlüssig in Verbindung steht.
26. Vorrichtung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Grundplatte, auf welcher die Kapillaren Form- und Lagestabil angeordnet sind, in bezug auf Form und Größe die äußeren Abmessungen für die Liquidhandlingtechnik von
Mikroplatten aufweist.
27. Vorrichtung gemäß Ansprüchen 20 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass alle im Raster der Liquidhandlingtechnik angeordnete Kapillaren der Probengefäße (1 , 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21 , 22, 33) jeweils in derselben Ebene des oder der Körper (3, 4, 14 bis 17, 23 bis 26, 34) ausgebildet sind.
28. Vorrichtung gemäß Ansprüchen 16, 20 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die im Raster der Liquidhandlingtechnik angeordnete Kapillaren der Probengefäße (1 , 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21 , 22, 33) jeweils gruppenweise im Raster n x 8 x 12, n x δ und m x 12 bzw. n x 8 oder m x 12 in unterschiedlichen Ebenen des oder der Körper (3, 4, 14 bis 17, 23 bis 26, 34) ausgebildet sind.
29. Vorrichtung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 19 bis 25 und 27, 28 dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Körper (3, 4, 14 bis 17, 23 bis 26, 34) im Wesentlichen aus Metall, Keramik, Kunststoff oder Glas bestehen.
30. Vorrichtung gemäß nach einem oder mehreren der Ansprüche 19 bis 25 und 27, 28 dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Körper (3, 4, 14 bis 17, 23 bis 26, 34) durch Gießen, Pressen, Verformen oder Zerspanen hergestellt sind.
31. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Längswandung der Kapillare des Probengefäßes (6 bis 9, 19 bis 22, 33) teilweise aus der semipermeablen Membran (18, 27, 28, 42) besteht und dass die semipermeable Membran (18, 27, 28, 42) mit der übrigen Wandung der Kapillare des Probengefäßes (6 bis 9, 19 bis 22, 33) unlösbar verbunden ist.
32. Vorrichtung gemäß Ansprüchen 11 und 31 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (6 bis 9) einen polygonen Querschnitt (10 bis 13) aufweist, wobei die semipermeable Membran (18) eine dieser Polygonlinien entsprechenden Fläche der Längswandung der Kapillare des Probengefäßes (6 bis 9) bildet.
33. Vorrichtung gemäß Ansprüchen 11 und 31 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare des Probengefäßes (19 bis 22, 33) einen polygonen Querschnitt (29 bis 32) aufweist, wobei die semipermeable Membran (27, 28, 42) zumindest zwei dieser Polygonlinien entsprechenden Flächen der Längswandung der Kapillare des Probengefäßes (19 bis 22, 33) bildet.
34. Vorrichtung gemäß Ansprüchen 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, dass der für die Probenbehandlung wirksame Teil der Längswandung der Kapillare des Probengefäßes (1 , 6 bis 9, 19 bis 22, 33) durch die semipermeable Membran
(18, 27, 28, 42) gebildet wird.
35. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Klebefolie als lösbarer Verschluss für die jeweils stirnseitigen Öffnungen (40, 41) der Kapillaren des Probengefäßes (33) zur Probenbeschickung, Probenentnahme und Belüftung vorgesehen ist.
36. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Deckel als lösbare Verschlüsse für die jeweils stimseitigen Öffnungen (40, 41) der Kapillaren des Probengefäßes (33) zur Probenbeschickung, Probenentnahme und Belüftung vorgesehen sind.
37. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Stopfen als lösbare Verschlüsse für die jeweils stirnseitigen Öffnungen (40, 41) der Kapillaren des Probengefäßes (33) zur Probenbeschickung. Probenentnahme und Belüftung vorgesehen sind.
38. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 1 als Reaktionsgefäße.
39. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 1 als Dialysegefäße.
40. Verwendung der Vorrichtung gemäß Ansprüchen 1 und 39 zum Mediumwechsel und zur Entsalzung.
41. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 1 zur Aufbewahrung von Proben.
42. Verwendung der Vorrichtung gemäß Ansprüchen 39 und 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Probengefäße (1 , 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21 , 22, 33) zur Dialyse, zum Mediumwechsel und/oder zur Entsalzung mit einer ruhenden oder bewegten Außenflüssigkeit direkten Kontakt haben, deren Flüssigkeitsvolumen mindestens dem 30-fachen des Gesamtvolumens aus allen Probenvolumina der Vorrichtung beträgt.
43. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 1 als Gefäße zum Aufkonzentrieren.
44. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass die Probengefäße (1 , 6, I1 8, 9, 19, 20, 21 , 22, 33) in ruhender oder bewegter nicht dampfgesättigter Umgebung gelagert werden.
45. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass die Probengefäße (1 , 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21 , 22, 33) in nicht dampfgesättigter Umgebung mit Unterdruck gelagert werden.
46. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 38 und 41 , dadurch gekennzeichnet, dass die Probengefäße (1 , 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21 , 22, 33) in dampfgesättigter Umgebung gelagert werden.
PCT/DE2008/000412 2007-03-08 2008-03-07 Vorrichtung zur aufnahme, behandlung und aufbewahrung kleinvolumiger proben WO2008106960A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08715555A EP2129464A1 (de) 2007-03-08 2008-03-07 Vorrichtung zur aufnahme, behandlung und aufbewahrung kleinvolumiger proben
US12/450,044 US8758706B2 (en) 2007-03-08 2008-03-07 Device for receiving, treating, and storing small volume samples

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102007011866.1 2007-03-08
DE102007011866A DE102007011866A1 (de) 2007-03-08 2007-03-08 Vorrichtung zur Aufnahme, Behandlung und Aufbewahrung kleinvolumiger Proben

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008106960A1 true WO2008106960A1 (de) 2008-09-12

Family

ID=39472015

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2008/000412 WO2008106960A1 (de) 2007-03-08 2008-03-07 Vorrichtung zur aufnahme, behandlung und aufbewahrung kleinvolumiger proben

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8758706B2 (de)
EP (1) EP2129464A1 (de)
DE (1) DE102007011866A1 (de)
WO (1) WO2008106960A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014004851B4 (de) 2014-03-31 2018-09-20 Scienova Gmbh Vertikales funktionelles Reaktionsgefäß

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008017083A1 (de) * 2008-04-01 2009-10-08 Scienova Gmbh Vorrichtung zur Gleichgewichtsdialyse von Flüssigkeiten
DE102009048039A1 (de) 2009-10-02 2011-06-22 scienova GmbH, 07745 Vorrichtung zur Probenbehandlung kleiner Volumina für Mikrotiterplatten und Einzelproben in Mikrozentrifugenröhrchen
US20190201846A1 (en) * 2017-12-30 2019-07-04 University Of Kansas Apparatus, systems, and methods for isotope exchange and/or dialysis
DE102018102383B4 (de) 2018-02-02 2019-08-29 Scienova Gmbh System zur Durchführung biologischer oder chemischer Verfahren

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6187190B1 (en) * 1997-05-09 2001-02-13 Battelle Memorial Institute Apparatus for molecular weight separation
WO2002016652A2 (en) * 2000-08-25 2002-02-28 Genome Therapeutics Corporation Device for rapid dna sample processing with integrated liquid handling, thermocycling, and purification
WO2002088672A1 (en) * 2001-04-26 2002-11-07 Varian, Inc. Hollow fiber membrane sample preparation devices
US20050186118A1 (en) * 2004-02-25 2005-08-25 Bishop David J. Micro-channel chemical concentrator
WO2006055756A2 (en) * 2004-11-18 2006-05-26 Linden Technologies, Inc. Dialysis device

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1245322B (de) * 1964-12-28 1967-07-27 Paul Scheibner Kommanditgesell Dialysiergeraet mit parallelgeschalteten und durch eine Wand getrennten Kanaelen fuer die zu dialysierende Fluessigkeit und die Spuelloesung
AU1460170A (en) 1970-02-13 1971-11-11 Abcor Inc Membrane method forthe fractionation of whey solutions
DK123074B (da) * 1970-07-13 1972-05-15 Inst Produktudvikling Understøtningsplade for membranerne i en dialysator, navnlig til hæmodialyse.
BE788759A (fr) * 1971-09-14 1973-01-02 Atomic Energy Commission Dialyseur compact pour la dialyse du sang et autres applications
US4244820A (en) * 1978-05-16 1981-01-13 Gelman Instrument Company Fluid purification system
US4491011A (en) * 1982-06-11 1985-01-01 Brigham Young University Dialyzing injection system for instrumental detection
US4931160A (en) * 1987-05-11 1990-06-05 Millipore Corporation Electrodeionization method and apparatus
US5922615A (en) 1990-03-12 1999-07-13 Biosite Diagnostics Incorporated Assay devices comprising a porous capture membrane in fluid-withdrawing contact with a nonabsorbent capillary network
DE4137532A1 (de) * 1991-11-14 1993-05-19 Max Planck Gesellschaft Durchfluss-membran-osmometer
US5492834A (en) 1993-07-09 1996-02-20 Beckman Instruments, Inc. Method of sample preparation for urine protein analysis with capillary electrophoresis
EP0720508B1 (de) 1993-09-22 2000-04-05 Pierce Chemical Company Vorrichtung zum dialysieren von proben
US20030027216A1 (en) 2001-07-02 2003-02-06 Kiernan Urban A. Analysis of proteins from biological fluids using mass spectrometric immunoassay
US6048457A (en) 1997-02-26 2000-04-11 Millipore Corporation Cast membrane structures for sample preparation
US6998047B1 (en) 1997-02-26 2006-02-14 Millipore Corporation Cast membrane structures for sample preparation
US6030358A (en) 1997-08-08 2000-02-29 Odland; Rick Matthew Microcatheter and method for site specific therapy
US6494614B1 (en) * 1998-07-27 2002-12-17 Battelle Memorial Institute Laminated microchannel devices, mixing units and method of making same
US20020151040A1 (en) 2000-02-18 2002-10-17 Matthew O' Keefe Apparatus and methods for parallel processing of microvolume liquid reactions
JP2001281117A (ja) 2000-03-24 2001-10-10 Millipore Corp 試料調製装置及び試料調製装置形成方法
US6458275B1 (en) 2000-06-05 2002-10-01 Harvard Apparatus, Inc. Multi-well equilibrium dialysis system
US20020110904A1 (en) 2001-01-18 2002-08-15 Nelson Randall W. Integrated system for analysis of biomolecules
EP1381840A1 (de) * 2001-04-26 2004-01-21 Esytech AB Trenneinheit, verfahren und vorrichtung zur montage der trenneinheit in einer trennvorrichtung
US20020158016A1 (en) * 2001-04-26 2002-10-31 Jan Norberg Separation unit, a method for separation, and a device for mounting a separation unit in a separation apparatus
DE10160975A1 (de) 2001-12-10 2003-06-18 Univ Schiller Jena Probenplatte zur Verwendung in Dialysesystemen
WO2003083044A2 (en) 2002-03-25 2003-10-09 Condros, Inc. Tissue analogs for in vitro testing and method of use therefor
AU2003239152A1 (en) 2002-04-23 2003-11-10 Millipore Corporation Sample preparation of biological fluids for proteomic applications
DE10247023B4 (de) 2002-10-09 2006-07-20 Disetronic Licensing Ag Mikrodialysesonde und Verfahren zu deren Herstellung
US7264723B2 (en) * 2002-11-01 2007-09-04 Sandia Corporation Dialysis on microchips using thin porous polymer membranes
US7166458B2 (en) * 2003-01-07 2007-01-23 Bio Tex, Inc. Assay and method for analyte sensing by detecting efficiency of radiation conversion
DE20305570U1 (de) 2003-04-07 2004-05-13 Roche Diagnostics Gmbh Mehrkammer-Mikrodialysevorrichtung
WO2004101151A1 (en) 2003-05-08 2004-11-25 Nanostream, Inc. Sample preparation for parallel chromatography
US20050142067A1 (en) * 2003-08-29 2005-06-30 Christopher Frederickson Zintrodes, multitrodes and uses thereof
WO2005070141A2 (en) 2004-01-08 2005-08-04 Phynexus, Inc. Method and device for sample preparation
SE0401033D0 (sv) 2004-04-20 2004-04-20 Amersham Biosciences Ab Device and method for protein analysis
WO2006042079A1 (en) * 2004-10-06 2006-04-20 State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Mecs dialyzer
US20060198765A1 (en) 2005-03-03 2006-09-07 Gjerde Douglas T Method and device for sample preparation
EP1937134B1 (de) * 2005-08-24 2016-09-21 Flowsion A/S Sonde umfassend ein Mikrofluidik-system und ein Verfahren zur Befestigung einer Membran an einer Röhre
US7820024B2 (en) * 2006-06-23 2010-10-26 Siemens Water Technologies Corp. Electrically-driven separation apparatus
US7887703B2 (en) * 2007-02-16 2011-02-15 Tangenx Technology Corporation Dialysis apparatus and a method for assembling a dialysis apparatus

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6187190B1 (en) * 1997-05-09 2001-02-13 Battelle Memorial Institute Apparatus for molecular weight separation
WO2002016652A2 (en) * 2000-08-25 2002-02-28 Genome Therapeutics Corporation Device for rapid dna sample processing with integrated liquid handling, thermocycling, and purification
WO2002088672A1 (en) * 2001-04-26 2002-11-07 Varian, Inc. Hollow fiber membrane sample preparation devices
US20050186118A1 (en) * 2004-02-25 2005-08-25 Bishop David J. Micro-channel chemical concentrator
WO2006055756A2 (en) * 2004-11-18 2006-05-26 Linden Technologies, Inc. Dialysis device

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014004851B4 (de) 2014-03-31 2018-09-20 Scienova Gmbh Vertikales funktionelles Reaktionsgefäß
US10272433B2 (en) 2014-03-31 2019-04-30 Scienova Gmbh Vertical functional reaction vessel

Also Published As

Publication number Publication date
US20100136596A1 (en) 2010-06-03
US8758706B2 (en) 2014-06-24
EP2129464A1 (de) 2009-12-09
DE102007011866A1 (de) 2008-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6416716B1 (en) Sample preparation device with embedded separation media
DE60022025T2 (de) Anlage zum brechen von zellen
DE19933458B4 (de) Einrichtungen und Systeme zum Handhaben von Flüssigkeitsproben
Kataoka Sample preparation for liquid chromatography
US7276158B1 (en) Incision-based filtration/separation pipette tip
WO1988009201A1 (en) Process and device for separating and cleaning molecules
DE4139664A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsaeuren
WO2000048716A2 (de) Vorrichtung zum konzentrieren und/oder reinigen von makromolekülen in einer lösung und verfahren zum herstellen einer derartigen vorrichtung
JP4997487B2 (ja) 液−液抽出あるいは固−液抽出のための装置およびそれを用いた抽出方法
EP1315553B1 (de) Vorrichtung und verfahren zur separation von ungelösten bestandteilen aus biologischen flüssigkeiten
WO2008106960A1 (de) Vorrichtung zur aufnahme, behandlung und aufbewahrung kleinvolumiger proben
WO2011113508A1 (de) Mehrfachlochplatte mit filtermedium und ihre verwendung
DE10160975A1 (de) Probenplatte zur Verwendung in Dialysesystemen
EP3230730B1 (de) Spritzengehäuse zum pipettieren eines biologischen materials mit integrierten membranen
EP1609800B1 (de) Verfahren zur Extraktion von biologischem Material
WO1993019368A1 (de) Einwegreaktionsgefäss für die festphasenimmunanalytik und verfahren zur messung von über immunreaktionen bestimmbaren komponenten
EP0734768A1 (de) Verfahren zur Bindung eines biologischen Materials
EP1262759B1 (de) Mikroplatte zum Bearbeiten von Proben
WO2013026808A1 (de) Neues poc-testsystem und verfahren
DE10018788B4 (de) Prozessieren von Proteinen aus Gelen für massenspektrometrische Analysen
EP3063525B1 (de) Verbesserte vorrichtung und verfahren für reaktionen zwischen einer festen und einer flüssigen phase
DE202007009226U1 (de) Vorrichtung zur Aufnahme, Behandlung und Aufbewahrung kleinvolumiger Proben
EP1455943B1 (de) Einrichtungen und verfahren zur verarbeitung biologischer oder chemischer substanzen oder deren substanzgemische
EP2774677A2 (de) Vorrichtung zur Durchführung von chemischen und/oder biochemischen Prozessen
EP3408025B1 (de) Röhre mit einer mikrofluidischen struktur und dazugehöriges verfahren

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08715555

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008715555

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12450044

Country of ref document: US