DE60022025T2 - Anlage zum brechen von zellen - Google Patents

Anlage zum brechen von zellen

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DE60022025T2 DE2000622025 DE60022025T DE60022025T2 DE 60022025 T2 DE60022025 T2 DE 60022025T2 DE 2000622025 DE2000622025 DE 2000622025 DE 60022025 T DE60022025 T DE 60022025T DE 60022025 T2 DE60022025 T2 DE 60022025T2
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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum raschen Aufbrechen von Zellen oder Viren.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Extraktion von Nucleinsäure aus Zellen oder Viren ist für zahlreiche Anwendungen auf dem Gebiet der Molekularbiologie und biomedizinischen Diagnostik eine notwendige Aufgabe. Sobald die Nucleinsäure aus den Zellen freigesetzt ist, kann sie der genetischen Analyse zugeführt werden, z.B. Sequenzieren, Erreger-Identifikation und -Quantifizierung, Nucleinsäure-Mutationsanalyse, Genomanalyse, Gen-Expressionsstudien, pharmakologisches Monitoring, Aufbewahren von DNA-Bibliotheken für die Entdeckung von Arzneimitteln usw. Die genetische Analyse umfasst üblicherweise die Nulceinsäure-Amplifikation und -Detektion unter Anwendung bekannter Techniken; bekannte Polynucleotid-Amplifikationsreaktionen sind z.B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), QB-Replicase-Amplifikation (QBR), sich selbst unterhaltende („self-sustained") Sequenzreplikation (3SR), Strang-Verdrängungsamplifikation (SDA), „verzweigte" DNA-Amplifikation, Ligations-aktivierte Transkription (LAT), Nucleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA), Reparaturkettenreaktion (PCR) und zyklische Sondenreaktion (CPR).
  • Die Extraktion von Nucleinsäuren aus Zellen oder Viren erfolgt im Allgemeinen durch physikalische oder chemische Verfahren. Chemische Verfahren verwenden im Allgemeinen Lysiermittel (z.B. Detergenzien, Enzyme oder starke organische Substanzen), um die Zellen aufzubrechen und die Nucleinsäure freizusetzen, gefolgt von der Behandlung des Extrakts mit chaotropen Salzen, um allfällige kontaminierende oder möglicherweise störende Proteine zu denaturieren. Solche chemische Verfahren sind in US-Patent 5.652.141 (Henco) und US-Patent 5.856.174 (Lipshutz et al.) beschrieben. Ein Nachteil der Verwendung aggressiver Chemikalien zum Aufbrechen von Zellen besteht darin, dass die Chemikalien die anschließende Amplifikation der Nucleinsäure hemmen. Bei der Anwendung von Verfahren zum chemischen Aufbrechen ist es daher typischerweise notwendig, die aus den Zellen freigesetzte Nucleinsäure zu reinigen, bevor man die weitere Analyse fortsetzt. Solche Reinigungsschritte sind zeitaufwändig, kostspielig und verringern die für die Analyse gewonnene Menge an Nucleinsäure.
  • Physikalische Verfahren zum Aufbrechen von Zellen erfordern oft keine aggressiven Chemikalien, die auf die Nucleinsäure-Amplifikation eine hemmende Wirkung ausüben (z.B. PRC). Diese physikalischen Verfahren sind jedoch mit spezifischen Nachteilen verbunden. Beispielsweise umfasst ein physikalisches Verfahren zum Aufbrechen von Zellen das Einbringen der Zellen in eine Lösung und die Erwärmung der Zellen bis zum Siedepunkt, damit die Zellwände aufgebrochen werden können. Ungünstigerweise denaturiert die Wärme oft Proteine und bewirkt, dass diese an der freigesetzten Nucleinsäure ankleben. Die Proteine erschweren dann die nachfolgenden Versuche, die Nucleinsäure zu amplifizieren. Ein weiteres physikalisches Verfahren ist das Gefriertauen, bei dem die Zellen wiederholt gefroren und aufgetaut werden, bis die Zellwände aufgebrochen sind. Der Nachteil des Gefriertauens besteht darin, dass es oft nicht gelingt, zahlreiche Strukturen aufzubrechen, insbesondere bestimmte Sporen und Viren, die extrem zähe Außenschichten aufweisen.
  • Ein weiteres physikalisches Verfahren zum Aufbrechen von Zellen ist die Verwendung eines Druckinstruments. Dabei wird eine Lösung mykobakterieller Mikroorganismen unter hohem Druck durch ein Loch mit sehr kleinem Durchmesser geleitet. Während des Hindurchleitens durch das Loch werden die Mykobakterien durch die mechanischen Kräfte aufgebrochen und ihr Inhalt in die Lösung geschüttet. Ein solches System ist allerdings groß und teuer und erfordert ein Kühlsystem, damit nicht überschüssige Wärme entsteht, die den Inhalt der lysierten Zellen beschädigen könnte. Außerdem muss das Instrument zwischen den Läufen gereinigt und dekontaminiert werden, und es ist beim Umgang mit infektiösem Material ein großes Sicherheitssystem vonnöten. Ein weiterer mit diesem System verbundener Nachteil ist, dass die Lösung nur Teilchen mit im Wesentlichen der gleichen Größe enthalten muss, so dass sie nicht dazu verwendet werden kann, zahlreiche unbehandelte klinische oder biologische Proben zu verarbeiten.
  • Es ist außerdem bekannt, dass Zellen durch Ultraschallrühren lysiert werden können. Typischerweise werden die Zellen aufgebrochen, indem eine Ultraschallsonde direkt in ein die Zellen enthaltendes Flüssigkeitsvolumen eingebracht wird. Da die Sonde mit einer Probenflüssigkeit in direktem Kontakt steht, stellen die Querkontaminierung und Kavitations-induzierte Schäumung große Probleme dar.
  • Eine weitere Vorrichtung und Vorgangsweise zum Aufbrechen von Zellen unter Anwendung von Ultraschallenergie ist in GB 938.163 geoffenbart. Die Vorrichtung enthält ein Gefäß zum Halten des Zellmaterials und einer Vielzahl kleiner Körper (z.B. von Glasperlen oder Kugeln aus rostfreiem Stahl). Ein Ultraschallwandler ist so im Verhältnis zum Gefäß angeordnet, dass die kleinen Körper Ultraschallschwingung ausgesetzt sind. Der Wandler kann an der Gefäßbasis befestigt oder angeordnet sein, Ultraschallstrahlung durch ein Wasserbad auf das Gefäß zu übertragen. EP 337.690 offenbart eine weitere Ultraschallvorrichtung für die Zelllyse, in der ein Wandler an ein Gefäß gekoppelt ist, um das Aufbrechen von Zellen im Gefäß mittels des Phänomens der Kavitation durchzuführen.
  • Ein Problem beim direkten In-Kontakt-Bringen eines Behälters mit einem Ultraschallwandler, um Kavitation im Behälter hervorzurufen, besteht darin, dass die Behälterwand in Kontakt mit dem Wandler wahrscheinlich beschädigt wird, d.h. sie schmilzt oder weist Risse auf. EP 271.448 schlägt eine Lösung dieses Problems vor. Diese Veröffentlichung beschreibt einen speziellen Behälter zum Halten eines flüssigen Mediums. Eine Behälterwand ist ausgebildet, auf das flüssige Medium eine Welle an Ultraschallenergie mit einer Intensität zu übertragen, die ausreicht, um Kavitation zu bewirken. Diese Wand besteht aus einem Material mit einem Elastizitätsmodul von mehr als 25·104 N/cm2, und die Innenfläche der Wand besitzt im Bereich der Übertragung der Ultraschallschwingung eine in Wanddicke ausgebildete Nut. Die Breite der Nut auf der Innenfläche ist nicht größer als ihre Tiefe, so dass in der Nut lokaler Druck entsteht, der unter dem Dampfdruck der Flüssigkeit liegt.
  • Ein weiteres Verfahren zum Aufbrechen von Zellen ist in US-Patent 5.374.522 (Murphy et al.) geoffenbart. Gemäß dem Verfahren werden Zelllösungen oder -Suspensionen in einen Behälter mit kleinen Perlen gefüllt. Der Behälter wird dann in ein Ultraschallbad gelegt, bis die Zellen aufbrechen und ihre Zellkomponenten freisetzen. Dieses Verfahren ist mit zahlreichen Nachteilen verbunden. Erstens ist die Verteilung der Ultraschallenergie im Bad nicht einheitlich, so dass ein Techniker einen Bereich hoher Energie im Bad lokalisieren und den Behälter in diesen Bereich stellen muss. Die ungleichmäßige Verteilung der Ultraschallenergie erzeugt auch inkonsistente Ergebnisse. Zweitens konzentriert das Ultraschallbad die Energie nicht auf den Behälter, so dass das Aufbrechen der Zellen oft erst nach einigen Minuten abgeschlossen ist – dies ist eine relativ lange Zeit im Vergleich zum Verfahren der vorliegenden Erfindung. Drittens ist es unpraktisch, ein Ultraschallbad an Ort und Stelle für die Detektion biologischer Waffen, für forensische Analysen oder für das Vor-Ort-Testen von Umweltproben vorzusehen.
  • WO 99/33559 offenbart eine integrierte Fluidmanipulations-Kartusche zum Trennen eines erwünschten Analyten von einer Fluidprobe. Dieses Dokument fällt unter die Bestimmungen von Artikel 54(3) EPÜ. EP 0337690 offenbart ein Verfahren zum Freisetzen von Nucleinsäuren aus Zellen u.dgl., während EP 0271448 ein Verfahren zum Homogenisieren einer flüssigen Suspension offenbart. GB 938163 offenbart ein Verfahren zum Aufbrechen von Zellen, während US 5.652.141 eine Vorrichtung zum Isolieren von Nucleinsäuren aus Zellen offenbart.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Die vorliegende Erfindung löst die mit dem Stand der Technik verbundenen Probleme und stellt eine verbesserte Vorrichtung und ein weiter entwickeltes Verfahren zum Aufbrechen von Zellen oder Viren bereit. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Verfahren des Stands der Technik bietet die vorliegende Erfindung die Möglichkeit des raschen und wirkungsvollen Aufbrechens von Zellen oder Viren, z.B. harter Sporen, ohne den Einsatz aggressiver Chemikalien zu erfordern. Das Aufbrechen der Zellen oder Viren kann oft in 5 bis 10 Sekunden abgeschlossen werden. Außerdem sorgen die Vorrichtung und das Verfahren der gegenständlichen Erfindung für die äußerst gleichmäßige und reproduzierbare Lyse von Zellen oder Viren, so dass man über zahlreiche Einsätze der Vorrichtung konsistente Ergebnisse erzielen kann.
  • Gemäß einer ersten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung ein Behältnis mit einer Kammer zum Aufnehmen der Zellen oder Viren. Das Behältnis enthält zumindest eine die Kammer definierende biegsame Wand. Die Vorrichtung weist überdies einen Wandler wie z.B. ein Ultraschallhorn auf, um eine Außenfläche der biegsamen Wand zu erschüttern und so dynamische Druckimpulse oder Druckwellen in der Kammer zu erzeugen. Die Vorrichtung besitzt auch eine Druckquelle zur Steigerung des statischen Drucks in der Kammer. Die Druckbeaufschlagung der Kammer gewährleistet die wirkungsvolle Kopplung des Wandlers und der biegsamen Wand. Die Vorrichtung kann auch Perlen in der Kammer enthalten, um die Zellen oder Viren aufzubrechen. Im Betrieb werden die aufzubrechenden Zellen oder Viren in die Kammer des Behältnisses eingebracht. In der Kammer befindet sich auch eine Flüssigkeit. In einer Ausführungsform werden die Zellen oder Viren in die Kammer eingebracht, indem die Zellen oder Viren auf zumindest einem in der Kammer positionierten Filter eingefangen werden. In dieser Ausführungsform ist die in der Kammer befindliche Flüssigkeit üblicherweise ein Lysepuffer, der der Kammer nach dem Einfangen der Zellen oder Viren zugesetzt wird. In einer alternativen Ausführungsform enthält die in der Kammer befindliche Flüssigkeit die aufzubrechenden Zellen oder Viren (z.B. ist die Flüssigkeit eine die Zellen oder Viren enthaltende Probe), so dass die Flüssigkeit und die Zellen gleichzeitig in die Kammer eingebracht werden. In beiden Ausführungsformen ist der Wandler an der äußeren Oberfläche der biegsamen Wand angeordnet, und der statische Druck in der Kammer nimmt zu. Das Aufbrechen der Zellen erfolgt durch Erschüttern der biegsamen Wand mit dem Wandler, um dynamische Druckimpulse oder Druckwellen in der Kammer zu erzeugen. Auch Perlen können in der Kammer bewegt werden, um die Zellen oder Viren aufzubrechen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung eine Vorrichtung zum Aufbrechen von Zellen oder Viren, umfassend ein Behältnis mit einer Kammer zum Aufnehmen der Zellen oder Viren, worin das Behältnis zumindest eine die Kammer definierende Wand enthält und die Wand eine Oberfläche außerhalb der Kammer aufweist. Die Vorrichtung umfasst ferner einen Wandler zum In-Kontakt-Bringen der Außenfläche der Wand und zum In-Schwingung-Versetzen mit einer Frequenz, die ausreicht, um Druckpulse oder Druckwellen in der Kammer zu erzeugen. Die Eigenfrequenz der Wand ist höher als die Schwingungsfrequenz des Wandlers. In einer Ausführungsform ist die Wand in Bezug auf den Wandler kuppelförmig und konvex ausgebildet. In einer anderen Ausführungsform besitzt die Wand Versteifungsrippen, die sich radial von einem Mittelabschnitt der Wand erstrecken. Die Vorrichtung enthält gegebenenfalls Perlen in der Kammer, um die Zellen oder Viren aufzubrechen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung eine Vorrichtung zur Verwendung mit einem Wandler, um Zellen oder Viren aufzubrechen, welche Vorrichtung ein Behältnis mit einer Kammer zum Aufnehmen der Zellen oder Viren umfasst. Das Behältnis besitzt zumindest eine die Kammer definierende Wand, die Wand weist eine Oberfläche außerhalb der Kammer zum In-Kontakt-Bringen des Wandlers auf, und die Wand ist kuppelförmig und konvex ausgebildet. Die Vorrichtung kann gegebenenfalls Perlen in der Kammer enthalten, um die Zellen oder Viren aufzubrechen. Die Vorrichtung kann überdies zumindest einen Filter in der Kammer aufweisen, um die Zellen oder Viren einzufangen, wenn eine Fluidprobe durch die Kammer fließt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung eine Vorrichtung zur Verwendung mit einem Wandler, um Zellen oder Viren aufzubrechen, welche Vorrichtung ein Behältnis mit einer Kammer zum Aufnehmen der Zellen oder Viren umfasst. Das Behältnis besitzt zumindest eine die Kammer definierende Wand, die Wand weist eine Oberfläche außerhalb der Kammer zum In-Kontakt-Bringen des Wandlers auf, und die Wand enthält einen Mittelabschnitt sowie eine Vielzahl an sich radial vom Mittelabschnitt erstreckenden Versteifungsrippen. Die Vorrichtung kann außerdem Perlen in der Kammer zum Aufbrechen der Zellen oder Viren umfassen.
  • Außerdem kann die Vorrichtung zumindest einen Filter in der Kammer zum Einfangen der Zellen oder Viren aufweisen, wenn eine Fluidprobe durch die Kammer strömt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung eine Vorrichtung zur Verwendung mit einem Wandler, um Zellen oder Viren aufzubrechen, welche Vorrichtung einen eine Kammer definierenden Körper umfasst, worin die Kammer von zumindest einer Wand definiert ist, die eine Außenfläche zum In-Kontakt-Bringen des Wandlers aufweist. Ein Filterstapel befindet sich in der Kammer, um die Zellen oder Viren aus einer Fluidprobe einzufangen, während diese durch die Kammer strömt. Der Filterstapel umfasst zumindest zwei Filter mit unterschiedlicher durchschnittlicher Porengröße, wobei die Filter voneinander beabstandet angeordnet sind. Die Vorrichtung umfasst überdies Perlen, die zwischen den Filtern in der Kammer positioniert sind, um die Zellen oder Viren aufzubrechen.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun zum besseren Verständnis durch die folgende ausführliche Beschreibung und die beiliegenden Abbildungen näher beschrieben.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1 ist eine isometrische Ansicht einer Kartusche zum Analysieren einer Fluidprobe gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung.
  • 2 ist eine untere isometrische Ansicht der Kartusche von 1.
  • 3 ist eine Explosionsansicht der Kartusche von 1
  • 4 ist eine weitere Explosionsansicht der Kartusche von 1.
  • 5 ist eine teilweise abgeschnittene Ansicht eines Ultraschallhorns, das an eine Wand einer Lysekammer gekoppelt ist, die in der Kartusche von 1 ausgebildet ist.
  • 6 ist eine Explosionsansicht eines Filterstapels in der Lysekammer der Kartusche von 1.
  • 7 ist eine obere Draufsicht der Kartusche von 1
  • 8 ist eine untere Draufsicht der Kartusche von 1.
  • 9 ist ein schematisches Blockdiagramm der Kartusche von 1.
  • 10 ist eine isometrische Ansicht eines Instruments, in das die Kartusche von 1 zwecks Verarbeitung eingesetzt ist.
  • 11 ist eine isometrische Ansicht der Kartusche von 1 im Instrument von 10.
  • 12 ist eine teilweise abgeschnittene Ansicht der Kartusche von 1 im Instrument von 10.
  • 13 ist eine schematische Draufsicht optischer Sensoren, die positioniert sind, um Flüssigkeitspegel in der Kartusche von 1 zu detektieren.
  • 14 ist eine teilweise abgeschnittene schematische Seitenansicht eines geschlitzten optischen Sensors, der positioniert ist, um den Flüssigkeitspegel in einer Sensorkammer der Kartusche von 1 zu detektieren.
  • 15A ist eine Querschnittsansicht einer Abschnitts des Körpers der Kartusche von 1, aus der zwei unterschiedliche Ventiltypen in der Kartusche ersichtlich sind.
  • 15B ist eine Querschnittsansicht der Ventile von 15A in einer geschlossenen Position.
  • 16A ist eine weitere Querschnittsansicht eines der Ventile von 15A in einer geöffneten Position.
  • 16B ist eine Querschnittsansicht des Ventils von 16A in einer geschlossenen Position.
  • 1719 veranschaulichen ein Ventilbetätigungssystem zum Öffnen und Schließen der Ventile von 15A.
  • 20 ist eine Querschnittsansicht alternativer Ventilaktuatoren zum Öffnen und Schließen der Ventile in der Kartusche von 1. 20 zeigt außerdem eine Druckzufuhrdüse, die mit einer Drucköffnung (ausgebildet in der Kartusche von 1) versiegelt bzw. dichtend verbunden ist.
  • 21 ist eine teilweise in Explosionsansicht dargestellte isometrische Abbildung eines Reaktionsgefäßes der Kartusche von 1.
  • 22 ist eine Vorderansicht des Gefäßes von 21.
  • 23 ist eine Seitenansicht des zwischen zwei Heizplatten eingesetzten Gefäßes von 21.
  • 24 ist eine Vorderansicht einer der Heizplatten von 23.
  • 25 ist eine Vorderansicht eines alternativen Reaktionsgefäßes gemäß der gegenständlichen Erfindung.
  • 26 ist eine Vorderansicht eines weiteren Reaktionsgefäßes gemäß der Erfindung.
  • 27 ist eine weitere Vorderansicht des Gefäßes von 21.
  • 28 ist eine Vorderansicht des Gefäßes von 21, das in einen Wärmetauschermodul des Instruments von 10 eingesetzt ist.
  • 29 ist eine Explosionsansicht einer Trägerstruktur zum Halten der Platten von 23.
  • 3031 sind Ansichten der zusammengesetzten Trägerstruktur von 29.
  • 32 ist eine isometrische Ansicht des Äußeren einer der optischen Anordnungen im Wärmetauschermodul von 28.
  • 33 ist eine isometrische Ansicht der Platten von 23 in Kontakt mit der optischen Anordnung von 32.
  • 34 ist eine teilweise abgeschnittene isometrische Ansicht des Reaktionsgefäßes von 21, das zwischen die Platten von 23 eingesetzt ist. Nur der untere Abschnitt des Gefäßes ist in der Abbildung zu sehen.
  • 35 ist ein schematisches Blockdiagramm der Elektronik des Wärmetauschermoduls von 28.
  • 36 ist eine isometrische Ansicht einer Vorrichtung zum Aufbrechen von Zellen oder Viren gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.
  • 37 ist eine Querschnittsansicht der Vorrichtung von 36.
  • 38 ist eine Explosionsansicht eines in der Vorrichtung von 36 verwendeten Behältnisses.
  • 39 ist eine Querschnittsansicht des Behältnisses von 38.
  • 40 ist ein schematisches Blockdiagramm eines Fluidikystems, in dem die Vorrichtung von 36 enthalten ist.
  • 41 ist eine Querschnittsansicht eines weiteren Behältnisses zur Verwendung in der Vorrichtung von 36. Ein Ultraschallhorn steht mit einer Behälterwand in Kontakt, die nach außen zum Horn hin geschwungen ist.
  • 42 ist eine Querschnittsansicht der Wand von 41.
  • 43A43B sind isometrische Ansichten gegenüber liegender Seiten einer weiteren Wand, die sich für ein Behältnis zum Aufnehmen von aufzubrechenden Zellen oder Viren eignet.
  • 44 ist eine teilweise aufgeschnittene isometrische Ansicht eines Behältnisses, das die Wand der 43A43B aufweist.
  • 45 ist eine untere Draufsicht des Behältnisses von 44.
  • 46 ist eine teilweise in Explosionsansicht dargestellte, isometrische Abbildung eines Behältnisses zum Aufnehmen von aufzubrechenden Zellen oder Viren gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.
  • 47 ist eine Vorderansicht des Behältnisses von 46.
  • 48 ist eine weitere schematische Vorderansicht des Behältnisses von 46.
  • 49 ist eine Seitenansicht des Behältnisses von 46.
  • 50 ist eine Ansicht einer in das Behältnis von 46 eingeführten Pipette. Das Behältnis enthält Perlen zum Aufbrechen von Zellen oder Viren.
  • 51 ist eine isometrische Ansicht des Behältnisses von 46, das in eine Vorrichtung zum Aufbrechen von Zellen oder Viren eingesetzt ist.
  • 52 ist eine andere isometrische Ansicht des in die Vorrichtung von 51 eingesetzten Behältnisses von 46.
  • 53 ist eine teilweise aufgeschnittene isometrische Ansicht der Vorrichtung von 51.
  • 54 ist eine isometrische Ansicht einer Halterung zum Halten des Behältnisses von 46.
  • 55 ist eine weitere isometrische Ansicht der Vorrichtung von 51, in der mehrere Teile der Vorrichtung entfernt sind, um ein mit dem Behältnis von 46 in Kontakt stehendes Ultraschallhorn zu zeigen.
  • 56 ist eine schematische Seitenansicht des Behältnisses von 46, das in die Vorrichtung von 51 zum Aufbrechen der im Behältnis enthaltenden Zellen oder Viren eingesetzt ist.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Analysieren einer Fluidprobe. In einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Kartusche zum Trennen eines erwünschten Analyten von einer Fluidprobe und zum Halten des Analyten für eine chemische Reaktion bereit. Die Fluidprobe kann eine Lösung oder Suspension sein. In einer bestimmten Verwendung kann die Probe eine Körperflüssigkeit sein (z.B. Blut, Harn, Speichel, Sputum, Samenflüssigkeit, Schleim o.dgl.). Alternativ dazu kann die Probe ein Feststoff sein, der in einer Flüssigkeit gelöst oder suspendiert ist, oder die Probe kann eine Umweltprobe wie z.B. Grund- oder Abwasser, Bodenextrakte, Pestizidrückstände oder aerogene Sporen in einem Fluid sein. Außerdem kann die Probe mit einer/m oder mehreren Chemikalien, Reagenzien, Verdünnern oder Puffern vermischt sein. Die Probe kann vorbehandelt sein, z.B. mit Chemikalien vermischt, zentrifugiert, pelletiert usw., oder sie kann in unbehandelter Form vorliegen.
  • Der erwünschte Analyt ist typischerweise intrazelluläres Material (z.B. Nucleinsäure, Proteine, Kohlehydrate, Lipide, Bakterien oder intrazelluläre Parasiten). In einer bevorzugten Verwendung ist der Analyt Nucleinsäure, die die Kartusche von der Fluidprobe trennt und für die Amplifikation (z.B. mittels PCR) und optische Detektion bereithält. Der Ausdruck „Nucleinsäure" bezieht sich hierin auf jede synthetische oder natürlich vorkommende Nucleinsäure wie etwa DNA oder RNA in jeder möglichen Konfiguraiton, d.h. in Form einer Doppelstrang-Nucleinsäure, Einzelstrang-Nucleinsäure oder jeder beliebigen Kombination davon.
  • 1 ist eine isometrische Ansicht einer Kartusche 20 gemäß der bevorzugten Ausführungsform. Die Kartusche 20 ist ausgebildet, um Nucleinsäure von einer Fluidprobe zu trennen und die Nucleinsäure für die Amplifikation und Detektion bereitzuhalten. Die Kartusche 20 besitzt einen Körper, der ein oberes Stück 22, ein mittleres Stück 24 und ein unteres Stück 26 umfasst. Eine Einlassöffnung zur Einleitung einer Fluidprobe in die Kartusche ist im oberen Stück 22 ausgebildet und durch eine Verschlusskappe 30 abgedichtet. Sechs Drucköffnungen 32 sind auch im oberen Stück 22 ausgebildet. Die Drucköffnungen 32 dienen zur Aufnahme von Düsen aus den Druckquellen, z.B. Pumpen oder Vakuum. Die Kartusche enthält auch Ausrichtungsschenkel 28, die sich vom unteren Stück 26 ausgehend erstrecken und der Positionierung der Kartusche 20 in einem Instrument dienen (weiter unten in Zusammenhang mit 10 beschrieben). Einbuchtungen bzw. Vertiefungen 38A, 38B und 38C sind im oberen und im mittleren Stück 22, 24 ausgebildet. Die Einbuchtungen dienen der Aufnahme optischer Sensoren, die den Fluidfluss in der Kartusche 20 detektieren. Die Kartusche 20 enthält außerdem die Entlüftungs-Austritte 34, 36. Jede Drucköffnung und jeder Entlüftungs-Austritt enthält vorzugsweise eine hydrophobe Membran, die das Hindurchströmen von Gas, aber nicht von Flüssigkeit in und aus den Entlüftungs-Austritten und Drucköffnungen ermöglicht. Modifizierte Acrylcopoly mermembranen sind im Handel erhältlich, z.B. bei Gelman Sciences (Ann Arbor, MI, USA); Polycarbonatmembranen mit geätzten Teilchenspuren sind im Handel bei Poretics, Inc. (Livermore, CA, USA) erhältlich.
  • 2 ist eine isometrische Ansicht der Unterseite der Kartusche 20. Neun Löcher 60 sind im unteren Stück 26 ausgebildet, um Ventilaktuatoren aufzunehmen, die Ventile in der Kartusche 20 öffnen und schließen. Ein Loch 62 ist auch im unteren Stück 26 ausgebildet, um einen Wandler (ausführlich weiter unten in Zusammenhang mit 5 beschrieben) aufzunehmen. Die Kartusche 20 enthält auch ein Reaktionsgefäß 40, das sich aus dem Kartuschenkörper nach außen erstreckt. Das Gefäß 40 besitzt eine Reaktionskammer 42 zum Aufnehmen eines Reaktionsgemisches (z.B. Nucleinsäure gemischt mit Amplifikationsreagenzien und fluoreszierenden Sonden) für chemische Reaktion und optische Detektion. Eine der Flusswege in der Kartusche trägt das Reaktionsgemisch zur Kammer 42, wo die chemische Reaktion und optische Detektion stattfindet. Das Gefäß 40 erstreckt sich vom Körper der Kartusche 20 nach außen, so dass das Gefäß 40 zwischen ein Paar gegenüber liegender Wärmeplatten (zum Erwärmen bzw. Abkühlen der Kammer 42) eingesetzt werden kann, ohne das Gefäß 40 vom Rest der Kartusche 20 abzukoppeln. Dies sorgt für eine deutliche Minderung des Kontaminations- und Austrittsrisikos. Das Gefäß 40 kann einstückig mit dem Kartuschenkörper ausgebildet sein (z.B. einstückig mit dem mittleren Stück 24 geformt). Es ist hierin jedoch vorzuziehen, das Gefäß 40 als getrenntes Element zu erzeugen, das während der Herstellung der Kartusche mit dem Körper verbunden wird.
  • 34 sind Explosionsansichten der Kartusche. Wie aus 3 ersichtlich, besitzt das mittlere Stück 24 mehrere darin ausgebildete Kammern. Insbesondere enthält das mittlere Stück 24 eine Probenkammer 65 zum Halten einer Fluidprobe, die durch die Einlassöffnung 64 eingeleitet wurde, eine Waschkammer 66 zum Aufnehmen einer Waschlösung, eine Reagenskammer 67 zum Aufnehmen eines Lysereagens, eine Abfallkammer 68 zur Aufnahme von aufgebrauchter Probe und Waschlösung, eine Neutralisierkammer 70 zum Halten eines Neutralisators und eine Stammmischungskammer 71 zum Halten einer Stammmischung (z.B. Amplifikations reagenzien und fluoreszierende Sonden) sowie zum Mischen der Reagenzien und Sonden mit von der Fluidprobe abgetrenntem Analyten. Die Probenkammer 65 enthält gegebenenfalls ein Seitenfach 155 mit etwas niedrigeren Wänden als die Probenkammer 65. Das Seitenfach 155 zeigt dem Benutzer visuell an, wenn ausreichend Probe der Probenkammer 65 zugesetzt wurde, d.h. wann der Flüssigkeitspegel in der Kammer 65 hoch genug ist, um sich in das Fach 155 zu ergießen.
  • Das obere Stück 22 enthält die Entlüftungs-Austritte 34, 36 und die sechs Drucköffnungen 32 (s.o.). Eine elastomere Membran oder Dichtung 61 ist zwischen die Stücke 22, 24 eingeschoben, um die verschiedenen Kanäle und Kammern in den Stücken abzudichten. Das mittlere Stück 24 enthält vorzugsweise mehrere Dichtungslippen, um sicherzustellen, dass die Dichtung 61 angemessen abdichtet. Insbesondere besitzt das mittlere Stück 24 die Dichtungslippen 73, die jede der Kammern 65, 66, 67, 68, 70 und 71 umgeben. Das mittlere Stück 24 enthält ferner die Stützwände 75 um den Umfang sowie die Zwischendichtungslippen 76. Die Dichtungslippen 73, 76 und die Stützwände 75 drücken die Dichtung 61 lokal zusammen und erzielen so die Dichtungswirkung.
  • Wie aus 4 ersichtlich, sind im mittleren Stück 24 an seiner Unterseite verschiedene Kanäle ausgebildet, von denen einer zu einer Lysekammer 86 führt. Die Kammer 86 ist mit dem Loch 62 im unteren Stück 26 ausgebildet, so dass ein Wandler (z.B. ein Ultraschallhorn) durch das Loch 62 eingesetzt werden kann, um dynamische Druckimpulse oder Druckwellen in der Lysekammer 86 zu erzeugen. Das mittlere Stück 24 besitzt auch neun Ventilsitze 84, die in seiner unteren Fläche ausgebildet sind. Die Ventilsitze 84 sind mit den neun Löchern 60 im unteren Stück 26 ausgerichtet, so dass Ventilaktuatoren durch die Löcher 60 in die Ventilsitze 84 eingesetzt werden können.
  • Eine elastomere Membran oder Dichtung 61 ist zwischen die Stücke 24, 26 eingeschoben, um die verschiedenen Kanäle, Ventilsitze und die Kammer im mittleren Stück 24 abzudichten. Das mittlere Stück 24 enthält vorzugsweise mehrere Dichtungslippen, um zu gewährleisten, dass die Dichtung 63 richtig abdichtet. Insbeson dere weist das mittlere Stück 24 vorzugsweise Dichtungslippen 73 auf, die die Lysekammer 86, die Ventilsitze 84 und verschiedene Kanäle umgeben. Das mittlere Stück 24 besitzt auch Stützwände 75 um seinen Umfang und Zwischendichtungslippen 76. Die Dichtungslippen 73, 76 und die Stützwände 75 drücken die Dichtung 63 lokal zusammen und erzielen so die Dichtungswirkung. Zusätzlich zur Abdichtung verschiedener Dichtungskanäle und Kammern agiert die Dichtung 63 auch als Ventilschaft, indem bei Betätigung durch eines der Löcher 60 hindurch das Zusammendrücken in einen korrespondierenden Ventilsitz 84 erfolgt, wodurch einer der Flusskanäle im mittleren Stück 24 geschlossen wird. Diese Ventilwirkung wird in Zusammenhang mit 1516 weiter unten näher erläutert.
  • Die Dichtung 63 bildet auch die untere Wand der Lysekammer 86, an der ein Wandler anliegt, um die Zellen oder Viren in der Kammer 86 aufzubrechen. Jede der Dichtungen 61, 63 besteht vorzugsweise aus einem Elastomer. Geeignete Dichtungsmaterialien sind Silikonkautschuk, Neopren, EPDM oder jedes andere biegsame Material. Jede der Dichtungen 61, 63 besitzt vorzugsweise eine Dicke im Bereich von 0,005 bis 0,125 Zoll (0,125 bis 3,175 mm), noch bevorzugter 0,01 bis 0,06 Zoll (0,25 bis 1,5 mm), wobei die hierin bevorzugte Dicke 0,031 Zoll (0,79 mm) beträgt. Die Dicke ist ausgewählt, um sicherzustellen, dass die Dichtung ausreichend biegsam ist, um die Kanäle und Kammern abzudichten, sich bei Druckausübung in die Ventilsitze 84 zusammenzudrücken, und sich unter Druck auszudehnen, um den Wandler zu kontaktieren.
  • Wie aus 3 ersichtlich, enthält das mittlere Stück 24 einen Schlitz 79, durch den das Reaktionsgefäß 40 während der Montage der Kartusche eingesetzt wird. Das Gefäß 40 ist mit zwei Fluidöffnungen 41, 43 zur Zuleitung und Entfernung von Fluid aus dem Gefäß versehen. Wenn das obere Stück 22 mittels der Dichtung 61 mit dem mittleren Stück 24 versiegelt ist, stehen die Öffnungen 41, 43 mit den Kanälen 80 bzw. 81, die im oberen Stück 22 ausgebildet sind (siehe 4), in Fluidkommunikation. Die Dichtung 61 dichtet die jeweiligen Fluidgrenzflächen zwischen den Öffnungen 41, 43 und den Kanälen 80, 81 ab. Das obere, das mittlere und das untere Stück 22, 24, 26 sind vorzugsweise spritzgussgeformte Teile aus polymerem Materi al wie etwa Polypropylen, Polycarbonat oder Acryl. Obwohl das Formen für die Massenproduktion geeignet ist, ist es auch möglich, das obere, das mittlere und das untere Stück 22, 24, 26 maschinell herzustellen. Die Stücke 22, 24, 26 können durch Schrauben oder Befestigungselemente miteinander befestigt sein. Alternativ dazu kann man bei der Montage der Kartusche auch das Ultraschallverbinden, Lösungsmittelverbinden oder Schnapppassverbinden („Snap-Fit") anwenden.
  • 4 zeigt auch einen Filterring 88. Dieser drückt einen Filterstapel in der Lysekammer 86 zusammen und hält ihn. 6 ist eine Explosionsansicht eines Filterstapels 87. Der Zweck des Filterstapels 87 besteht darin, Zellen oder Viren aus einer Fludiprobe einzufangen, wenn die Probe durch die Lysekammer 86 strömt. Die eingefangenen Zellen oder Viren werden dann in der Kammer 86 aufgebrochen (lysiert). Die Zellen können tierische oder pflanzliche Zellen, Sporen, Bakterien oder Mikroorganismen sein. Die Viren können jede Art von infektiösem Erreger mit einem Proteinmantel um einen RNA- oder DNA-Kern sein.
  • Der Filterstapel 87 umfasst eine Dichtung 93, einen ersten Filter 94, eine Dichtung 95, einen zweiten Filter 97 mit einer kleineren Porengröße als der erste Filter 94, eine Dichtung 98, einen dritten Filter 100 mit einer kleineren Porengröße als der zweite Filter 97, eine Dichtung 101, ein Gitternetz 102 und eine Dichtung 103. Der Filterstapel enthält vorzugsweise auch einen ersten Satz an Perlen 96 zwischen dem ersten und dem zweiten Filter 94 und 97 sowie einen zweiten Satz von Perlen 99 zwischen dem zweiten und dem dritten Filter 97 und 100. Der Filterring 88 drückt den Filterstapel 87 in die Lysekammer 86, so dass die Dichtung 93 gegen den Filter 94 gedrückt wird, der Filter 94 gegen die Dichtung 95 gedrückt wird, die Dichtung 95 gegen den Filter 97 gedrückt wird, der Filter 97 gegen die Dichtung 98 gedrückt wird, die Dichtung 98 gegen den Filter 100 gedrückt wird, der Filter 100 gegen die Dichtung 101 gedrückt wird, die Dichtung 101 gegen das Gitternetz 102 gedrückt wird, das Gitternetz 102 gegen die Dichtung 103 gedrückt wird und die Dichtung 103 gegen den Außenumfang der Bodenwand der Lysekammer 86 gedrückt wird. Die Dichtung 95 ist dicker als der durchschnittliche Durchmesser der Perlen 96, so dass sich die Perlen ungehindert im Raum zwischen den Filtern 94 und 97 bewegen können.
  • Ebenso ist die Dichtung 98 dicker als der durchschnittliche Durchmesser der Perlen 99, so dass sich die Perlen 99 ungehindert im Raum zwischen den Filtern 97 und 100 bewegen können. Eine durch den Kanal 106 in die Lysekammer 86 fließende Fluidprobe strömt zunächst durch den Filter 94, dann durch den Filter 97, als nächstes durch den Filter 100 und schließlich durch das Gitternetz 102. Nach dem Strömen durch den Filterstapel 87 fließt die Probe entlang der Flussrippen 91 im oberen Bereich der Lysekammer 86 durch einen Auslasskanal (in 6 nicht dargestellt).
  • Bezug nehmend auf 5 werden die im Filterstapel eingefangenen Zellen oder Viren (in 5 aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht dargestellt) durch Koppeln eines Wandlers 92 (z.B. eines Ultraschallhorns) direkt an die Wand der Lysekammer 86 lysiert. In dieser Ausführungsform ist die Wand der Lysekammer 86 durch die biegsame Dichtung 63 ausgebildet. Der Wandler 92 sollte direkt eine Außenfläche der Wand kontaktieren. Der Ausdruck „Außenfläche" bezieht sich hier auf eine Wandoberfläche, die außerhalb der Lysekammer 86 liegt. Der Wandler 92 ist eine Schwingungs- bzw. Oszillationsvorrichtung, die aktiviert wird, um dynamische Druckimpulse oder Druckwellen in der Kammer 86 zu erzeugen. Die Druckwellen schütteln die Perlen 96, 99 (6), und die Bewegung der Perlen bricht die eingefangenen Zellen oder Viren auf. Im Allgemeinen kann der die Wand der Lysekammer 86 kontaktierende Wandler ein Ultraschall-, piezoelektrischer, magnetostriktiver oder elektrostatischer Wandler sein. Der Wandler kann auch ein elektromagnetisches Gerät mit einer Wickelspule sein, z.B. ein Schwingspulenmotor oder eine Solenoidvorrichtung. Es ist hierin vorzuziehen, dass der Aktuator ein Ultraschallwandler wie z.B. ein Ultraschallhorn ist. Geeignete Horne sind im Handel bei Sonics & Materials, Inc. erhältlich (der Firmensitz befindet sich in 53 Church Hill, Newton, CN, 06470 – 1614 USA). Alternativ dazu kann der Ultraschallwandler eine piezoelektrische Scheibe oder eine andere Art von Ultraschallwandler enthalten, die bzw. der an das Behältnis gekoppelt ist. Es ist hierin vorzuziehen, ein Ultraschallhorn zu verwenden, da die Hornstruktur hoch resonant ist und für eine reproduzierbare und scharfe Erregungsfrequenz und große Bewegungen der Hornspitze sorgt.
  • Wie bereits in Bezug auf 6 beschrieben, enthält der Filterstapel an beiden seiner Enden eine Dichtung. Wie aus 5 zu sehen, besitzt das mittlere Kartuschenstück 24 eine Dichtungslippe 90, gegen die die Dichtung an einem Ende des Filterstapels gedrückt wird. Die Dichtung am anderen Ende des Filterstapels wird durch den Filterring 88 zusammengedrückt, um eine Dichtung zu bilden. Das Dichtungsmaterial kann sich in den Aussparungsbereich außerhalb der Dichtungslippe 90 ausdehnen. Die Breite der Dichtungslippe 90 ist klein (typischerweise 0,5 mm), so dass kein übermäßiger Kraftaufwand erforderlich ist, um eine ausreichende Dichtungswirkung zu erzielen.
  • Der Filterring 88 wird zwischen dem Filterstapel und der Kartuschendichtung 63 festgehalten. Die Kartuschendichtung 63 wird zwischen dem mittleren Stück 24 und dem unteren Stück 26 durch eine Dichtungslippe 406 festgehalten. Kraft wird daher vom unteren Stück 26 durch die Dichtung 63 auf den Filterring 88 und schließlich auf den Filterstapel übertragen. Der Filterring 88 enthält eine Kontaktlippe 404, die die Dichtung 63 berührt. Die Kontaktlippe 404 ist keine primäre Dichtungslippe (obwohl sie Dichtungswirkung entfaltet), sondern ein Kraftübertragungsmechanismus. Die Breite der Kontaktlippe 404 ist größer als die Breite der Dichtungslippe 90, um sicherzustellen, dass Verformung und Dichtung im Filterstapel stattfinden und nicht beim Zusammendrücken der Kartuschendichtung 63. Das mittlere Kartuschenstück 24 weist auch eine Dichtungslippe 406 auf, die den Filterring 88 umgibt. Dies ist ein aktiver Dichtungsbereich, der durch das Vorhandensein des Filterrings 88 nicht beeinträchtigt werden sollte. Aus diesem Grund besteht ein Zwischenraum 407 zwischen der Dichtungslippe 406 und der Kontaktlippe 404 auf dem Filterring 88. Der Zwischenraum 407 ist vorgesehen, um das Extrudieren der Dichtung 63 in den Zwischenraum 407 zu ermöglichen, wenn sie durch die Dichtungslippe 406 und die Kontaktlippe 404 zusammengedrückt wird. Wenn die Kontaktlippe 404 auf eine andere Höhe als die Dichtungslippe 406 gelangt, wird die Dichtung infolge des Zwischenraums 407 und des Abstands zwischen den Lippen 404 und 406 nicht beeinträchtigt.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 6 ist der Filterstapel 87 ausgebildet, Zellen oder Viren einzufangen, wenn eine Fluidprobe durch den Stapel 87 fließt, ohne irgendei nen der Filter 94, 97, 100 im Stapel zu verstopfen. Der erste Filter 94 (mit der größten Porengröße) filtert das grobe Material wie etwa Salzkristalle, Zellbruchstücke, Haare, Gewebe usw. heraus. Der zweite Filter 97 (mit der mittleren Porengröße) fängt Zellen oder Viren in der Fluidprobe ein. Der dritte Filter 100 (mit der kleinsten Porengröße) fängt kleinere Zellen oder Viren in der Probe ein. Der Filterstapel 87 ermöglicht demnach das gleichzeitige Einfangen unterschiedlich großer Probenkomponenten, ohne dass es zum Verstopfen der Filter kommt. Die durchschnittliche Porengröße des ersten Filters 94 ist ausgewählt, klein genug zu sein, um grobes Material aus der Fluidprobe zu filtern (z.B. Salzkristalle, Zellbruchstücke, Haare, Gewebe), aber auch groß genug zu sein, um das Hindurchströmen der Zielzellen oder Zielviren, die den erwünschten Analyten enthalten (z.B. Nucleinsäure oder Proteine), zu ermöglichen. Im Allgemeinen sollte die Porengröße des ersten Filters 94 im Bereich von etwa 2 bis 25 μm liegen, wobei eine hierin bevorzugte Porengröße etwa 5 μm beträgt.
  • Die durchschnittlichen Porengrößen des zweiten und des dritten Filters sind je nach durchschnittlicher Größe der den bzw. die erwünschten Analyten enthaltenden Zielzellen oder Zielviren ausgewählt. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform der Filterstapel 87 dazu verwendet, Gonorrhö- (GC-) und Chlamydia- (Ct-) Organismen einzufangen, um die Gegenwart von Krankheiten in der Fluidprobe zu bestimmen. Die GC- und Ct-Organismen besitzen unterschiedliche Durchschnittsdurchmesser – etwa 1 bis 2 μm für GC-Organismen und etwa 0,3 μm für Ct-Organismen. In dieser Ausführungsform weist der zweite Filter 97 eine durchschnittliche Porengröße von etwa 1,2 μm auf, während der dritte Filter 100 eine durchschnittliche Porengröße von etwa 0,22 μm besitzt, so dass die meisten GC-Organismen durch den zweiten Filter 97 eingefangen werden, während die meisten Ct-Organismen durch den dritten Filter 100 eingefangen werden. Der Filterstapel ermöglicht somit das gleichzeitige Einfangen unterschiedlich großer Zielorganismen, und dies erfolgt ohne Verstopfen der Filter. Die Porengrößen der Filter 97, 100 kann ausgewählt sein, erwünschte Zellen oder Viren beliebiger Größe einzufangen, wobei der Schutzumfang der Erfindung nicht auf das konkrete hierin gegebene Beispiel beschränkt ist.
  • Der Filterstapel 87 eignet sich auch zum Aufbrechen der eingefangenen Zellen oder Viren, um intrazelluläres Material (z.B. Nucleinsäure) daraus freizusetzen. Der erste und der zweite Satz an Perlen 96, 99 erfüllen in dieser Hinsicht zwei nützliche Aufgaben. Erstens werden die Perlen durch dynamische Druckimpulse oder Druckwellen, die vom Wandler erzeugt werden, geschüttelt. Die Bewegung der Perlen bricht die eingefangenen Zellen oder Viren auf. Zweitens können die Perlen die aus den lysierten Zellen oder Viren freigesetzte Nucleinsäure abschneiden, so dass die Nucleinsäurestränge ausreichend kurz sind, um durch die Filter und aus der Lysekammer 86 zu fließen. Geeignete Perlen zum Aufbrechen von Zellen oder Viren sind z.B. Borsilikatglas-, Kalkglas-, Silica- und Polystyrolperlen.
  • Die Perlen können porös oder nicht-porös sein und besitzen vorzugsweise einen durchschnittlichen Durchmesser von 1 bis 200 μm. Der durchschnittliche Durchmesser der Perlen 96, 99 ist je nach beabsichtigten Zielzellen oder Zielviren, die durch die Perlen aufzubrechen sind, ausgewählt. Der durchschnittliche Durchmesser der Perlen 96 im ersten Satz kann dem durchschnittlichen Durchmesser der Perlen 99 im zweiten Satz entsprechen. Wenn – alternativ dazu – der erste Satz der Perlen 96 zum Aufbrechen eines Typs von Zielzelle oder Zielvirus dient, der sich vom Zell- oder Virustyp unterscheidet, der vom zweiten Satz der Perlen 99 aufzubrechen ist, ist es vorteilhaft, den durchschnittlichen Durchmesser der Perlen solcherart auszuwählen, dass sich der durchschnittliche Durchmesser der Perlen 96 im ersten Satz vom durchschnittlichen Durchmesser der Perlen 99 im zweiten Satz unterscheidet. Wenn beispielsweise der Filterstapel zum Einfangen der oben angeführten GC- und Ct-Zellen dient, sind die Perlen 96 Borsilikatglasperlen mit einem Durchmesser von 20 μm für das Aufbrechen der GC-Organismen und die Perlen 99 Kalkglasperlen mit einem Durchmesser von 106 μm für das Aufbrechen der Ct-Organismen. Jede der Silikondichtungen 95, 98 sollte ausreichend dick sein, um Platz für die Perlen 96, 99 zu bieten, damit sie die Zellen oder Viren bewegen und aufbrechen können.
  • Das Gitternetz 102 erfüllt auch zwei nützliche Aufgaben. Erstens bietet es dem Filterstapel 87 eine Stützmöglichkeit. Zweitens bricht es Luftblasen auf, so dass diese durch die Flussrippen 91 und aus der Lysekammer hinaus 86 geleitet werden kön nen. Um die Größe der Luftblasen wirkungsvoll zu verringern bzw. diese aufzubrechen, besitzt das Gitternetz 102 vorzugsweise eine kleine Porengröße. Vorzugsweise handelt es sich um Polypropylen-Flechtgewebe mit einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 25 μm. Um zu gewährleisten, dass die Luftblasen aus der Lysekammer 86 entweichen können, ist es wünschenswert, die Kartuschen in einer Ausrichtung zu verwenden, in der Flüssigkeit (relativ zur Schwerkraft) durch den Filterstapel 87 und die Lysekammer 86 nach oben strömt. Das Aufwärtsfließen durch die Kammer 86 unterstützt das Strömen von Luftblasen aus der Kammer 86. Somit sollte die Einlassöffnung für Fluids in die Kammer 86 im Allgemeinen am niedrigsten Punkt der Kammer positioniert sein, während die Auslassöffnung am höchsten Punkt angeordnet sein sollte.
  • Es sind zahlreiche unterschiedliche Ausführungsformen des Filterstapels möglich. Beispielsweise besitzt in einer alternativen Ausführungsform der Filterstapel nur zwei Filter und einen zwischen den Filtern angeordneten Perlensatz. Der erste Filter besitzt die größte Porengröße (z.B. 5 μm) und filtert grobes Material wie z.B. Salzkristalle, Zellbruchstücke, Haare, Gewebe usw. Der zweite Filter weist eine kleinere Porengröße als der erste Filter und eine etwas kleinere Porengröße als die einzufangenden Zielzellen oder Zielviren auf. Ein solcher Filterstapel ist weiter unten in Bezug auf 38 beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform der Kartusche ist der Filter mit der größten Portengröße (zum Filtern des groben Materials) in einer nicht dargestellten Filterkammer positioniert, die sich stromauf von der Lysekammer 86 befindet. Ein Kanal verbindet die Filterkammer mit der Lysekammer 86. In dieser Ausführungsform fließt eine Fluidprobe zunächst durch den groben Filter in der Filterkammer und dann durch einen zweiten Filter in der Lysekammer, um die Zielzellen oder Zielviren in der Lysekammer einzufangen.
  • Außerdem können die Perlen im Filterstapel eine Bindungsaffinität für Zielzellen oder Zielviren in der Fluidprobe aufweisen, um das Einfangen der Zielzellen oder Zielviren zu erleichtern. Beispielsweise können Antikörper oder bestimmte Rezeptoren auf die Perlenoberfläche aufgetragen sein, um Zielzellen in der Probe zu binden. Darüber hinaus kann die Lysekammer 86 zwei unterschiedliche Arten von Perlen enthalten, um mit Zielzellen oder Zielviren in Wechselwirkung zu treten. Beispielsweise kann die Lysekammer einen ersten Satz Perlen, die mit Antikörpern oder Rezeptoren zur Bindung von Zielzellen oder Zielviren beschichtet sind, und einen zweiten Satz Perlen (gemischt mit dem ersten Satz) zum Aufbrechen der eingefangenen Zellen oder Viren enthalten. Die Perlen in der Lysekammer 86 können auch Bindungsaffinität für das intrazelluläre Material (z.B. Nucleinsäure) besitzen, das aus den eingefangenen Zellen oder Viren freigesetzt wird. Solche Perlen eignen sich zum Isolieren von Zielnucleinsäure für die anschließende Elution und Analyse. Beispielsweise kann die Lysekammer Silicaperlen enthalten, um DNA oder Celluloseperlen mit Oligo-dT zu isolieren, um Messenger-RNA für Raumtemperatur-PCR zu isolieren. Die Lysekammer 86 kann auch Perlen zur Entfernung von unerwünschtem Material (z.B. von Proteinen oder Peptiden) oder Chemikalien (z.B. von Salzen, Metallionen oder Detergenzien) aus der Probe enthalten, die PCR hemmen könnten. Beispielsweise kann die Kammer 86 Ionenaustauschperlen enthalten, um Proteine zu entfernen. Alternativ dazu entfernen Perlen mit Metallion-Chelatbildnern wie z.B. Iminodiessigsäure Metallionen aus biologischen Proben.
  • 2122 veranschaulichen das Reaktionsgefäß 40 im Detail. 21 ist eine teilweise in Explosionsansicht dargestellte Abbildung des Gefäßes 40, und 22 ist eine Vorderansicht des Gefäßes 40. Das Gefäß 40 enthält die Reaktionskammer 42 (in dieser Ausführungsform rautenförmig) zum Halten eines Reaktionsgemisches. Das Gefäß 40 ist ausgebildet, um für optimale Wärmeübertragung auf und vom Reaktionsgemisch sowie für wirkungsvolle optische Sicht auf das Gemisch zu sorgen. Die dünne Form des Gefäßes trägt zur optimalen thermischen Kinetik bei, indem große Oberflächen für die Wärmeleitung und die Kontaktmöglichkeit mit Wärmeplatten vorgesehen sind. Außerdem bieten die Gefäßwände optische Fenster in die Kammer 42, so dass das gesamte Reaktionsgemisch optisch kontrolliert werden kann. Wie im Detail aus 2122 ersichtlich, enthält das Reaktionsgefäß 40 einen steifen Rahmen 46, der die Seitenwände 57A, 57B, 59A, 59B der Reaktionskammer 42 definiert. Der Rahmen 46 definiert auch eine Einlassöffnung 41 und einen Kanal 50, der die Öffnung 41 mit der Kammer 42 verbindet. Der Rahmen 46 definiert überdies eine Auslassöffnung 43 und einen Kanal 52, der die Öffnung 43 mit der Kammer 42 verbindet. Die Einlassöffnung 41 und der Kanal 50 dienen dazu, Fluid der Kammer 42 zuzuleiten; der Kanal 52 und die Auslassöffnung 43 dienen dazu, Fluid aus der Kammer 42 auszuleiten. Ausrichtungszinken 44A, 44B dienen dazu, das Gefäß 40 während der Montage der Kartusche richtig zu positionieren.
  • Wie aus 21 ersichtlich, enthält das Gefäß 40 auch dünne, flexible Lagen, die an gegenüber liegenden Seiten des steifen Rahmens 46 befestigt sind, um gegenüber liegende Hauptwände 48 der Kammer zu bilden. (Die Hauptwände 48 treten in 1 aus Gründen der Übersichtlichkeit wie in einer Explosionsansicht aus dem steifen Rahmen 46 heraus.) Die Reaktionskammer 42 ist somit durch die steifen Seitenwände 57A, 57B, 59A, 59B des Rahmens 46 und durch die gegenüber liegenden Hauptwände 48 definiert. Die gegenüber liegenden Hauptwände 48 sind mit gegenüber liegenden Seiten des Rahmens 46 versiegelt, so dass die Seitenwände 57A, 57B, 59A, 59B die Hauptwände 48 miteinander verbinden. Die Wände 48 ermöglichen optimale Wärmeleitung zum in der Kammer 42 enthaltenen Reaktionsgemisch. Jede der Wände 48 ist ausreichend biegsam, um eine jeweilige Wärmefläche zu kontaktieren und sich an sie anzupassen, wodurch für optimalen thermischen Kontakt und optimale Wärmeübertragung zwischen der Wärmefläche und dem in der Kammer 42 befindlichen Reaktionsgemisch gesorgt wird. Außerdem passen sich die biegsamen Wände 48 weiterhin an die Wärmeoberflächen an, wenn sich die Form der Oberflächen infolge von Wärmeausdehnung oder Wärmeschrumpfung während des Wärmetauschbetriebs verändert.
  • Wie aus 23 ersichtlich, bestehen die Wärmeoberflächen zum Kontaktieren der biegsamen Wände 48 vorzugsweise aus einem Paar gegenüber liegender Platten 190A, 190B, die positioniert sind, um die Kammer 42 zwischen ihnen aufzunehmen, Wenn die Kammer 42 des Gefäßes 40 zwischen die Platten 190A, 190B eingesetzt ist, kontaktieren die Innenflächen der Platten die Wände 48, und die biegsamen Wände passen sich an die Plattenoberflächen an. Die Platten sind vorzugsweise in einem Abstand voneinander angeordnet, der der Dicke des Rahmens 46 entspricht. In dieser Position bestehen minimale oder überhaupt keine Zwischenräume zwischen den Plattenoberflächen und den Wänden 48. Die Platten können durch ver schiedene thermische Elemente erwärmt oder gekühlt werden, um Temperaturveränderungen innerhalb der Kammer 42 hervorzurufen, wie dies weiter unten ausführlich beschrieben ist.
  • Die Wände 48 sind vorzugsweise flexible Filme aus polymerem Material wie etwa Polypropylen, Polyethylen, Polyester oder andere Polymere. Die Filme können entweder in Schichten ausgebildet sein, z.B. Laminate, oder sie können homogen sein. In Schichten ausgebildete Filme sind vorzuziehen, da sie im Allgemeinen höhere Festigkeit und strukturelle Integrität aufweisen als homogene Filme. Insbesondere sind hierin geschichtete Polypropylenfilme vorzuziehen, da Polypropylen PCR nicht hemmt. Alternativ dazu können die Wände 48 aus jedem anderen beliebigen Material bestehen, das zu einer dünnen, biegsamen Lage geformt ist und rasche Wärmeübertragung ermöglicht. Um zufrieden stellende Wärmeleitung zu erreichen, liegt die Dicke jeder Wand 48 vorzugsweise zwischen etwa 0,003 und 0,5 mm, noch bevorzugter zwischen 0,0 und 0,15 mm, am bevorzugtesten zwischen 0,025 und 0,08 mm.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 22 enthält das Gefäß 40 vorzugsweise auch optische Fenster für optische in situ-Abfragen des Reaktionsgemisches in der Kammer 42. In der bevorzugten Ausführungsform sind die optischen Fenster die Seitenwände 57A, 57B des steifen Rahmens 46. Die Seitenwände 57A, 57B sind optisch durchlässig, um die Anregung des Reaktionsgemisches in der Kammer 42 durch die Seitenwand 57A hindurch und die Detektion von aus der Kammer 42 durch die Seitenwand 57B strahlendem Licht zu ermöglichen. Die Pfeile A stellen die in die Kammer 42 durch die Seitenwand 57A eintretenden Beleuchtungsstrahlen dar, und Pfeile B stellen das ausgestrahlte Licht dar (z.B. Fluoreszenzemission aus markierten Analyten im Reaktionsgemisch), das aus der Kammer 42 durch die Seitenwand 57B austritt.
  • Die Seitenwände 57A, 57B sind vorzugsweise im Winkel voneinander versetzt. Es ist üblicherweise vorzuziehen, dass die Wände 57A, 57B in einem Winkel von etwa 90° voneinander versetzt sind. Ein Winkel von 90° zwischen Anregungs- und Detektionswegen gewährleistet, dass eine Mindestmenge an durch die Wand 57A eintre tender Anregungsstrahlung aus der Wand 57B austritt. Darüber hinaus ermöglicht der Winkel von 90°, dass eine maximale Menge an ausgestrahltem Licht (z.B. Fluoreszenz) durch die Wand 57B hindurch gesammelt wird. Die Wände 57A, 57B sind vorzugsweise miteinander verbunden, um eine „V"-förmige Kreuzungsstelle im Boden der Kammer 42 zu bilden. Alternativ dazu müssen die im Winkel voneinander versetzten Wände 57A, 57B nicht direkt miteinander verbunden sein, sondern können durch einen Zwischenabschnitt voneinander getrennt sein, z.B. durch eine andere Wand oder diverse mechanische oder Fluideinrichtungen, die die thermische und optische Leistungsfähigkeit des Gefäßes nicht beeinträchtigen. Beispielsweise können einander die Wände 57A, 57B an einer Öffnung treffen, die zu einem weiteren Verarbeitungsbereich in Kommunikation mit der Kammer 42 führt, z.B. einem integrierten Kapillarelektrophorese-Bereich. In der hierin bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich eine Positionierungszunge 58 vom Rahmen 46 ausgehend unterhalb des Kreuzungspunkts der Wände 57A, 57B. Die Zunge 58 dient dazu, das Gefäß 40 in einem Wärmetauschmodul (unten in Zusammenhang mit 28 erklärt) richtig zu positionieren.
  • Optimale optische Sensitivität kann erreicht werden, indem die optische Weglänge des Lichts, das den markierten Analyten im Reaktionsgemisch erregt, und des ausgestrahlten detektierten Lichts maximiert wird; dies wird durch die folgende Gleichung dargestellt: Io/Ii = C·L·Aworin Io die Ausgangsbeleuchtung des emittierten Lichts in V, Photonen o.dgl. ist, C die Konzentration des zu detektierenden Analyten ist, Ii die Eingangsbeleuchtung ist, L die Weglänge ist und A das intrinsische Absorptionsvermögen des zum Markieren des Analyten verwendeten Farbstoffs ist.
  • Das dünne, flache Reaktionsgefäß 40 der Erfindung optimiert die Detektionssensitivität, indem für maximale optische Weglänge pro Einheit des Analytenvolumens gesorgt wird. Bezug nehmend auf 23 und 27 ist das Gefäß 40 vorzugsweise solcherart aufgebaut, dass jede der Seitenwände 57A, 57B, 59A, 59B der Kammer 42 eine Länge L im Bereich von 1 bis 15 mm aufweist, die Kammer eine Breite W im Bereich von 1,4 bis 20 mm aufweist, die Kammer eine Dicke T im Bereich von 0,5 bis 5 mm aufweist und das Verhältnis der Breite W der Kammer zur Dicke T der Kammer zumindest 2:1 beträgt. Diese Parameter sind hierin vorzuziehen, um ein Gefäß mit relativ großer durchschnittlicher optischer Weglänge durch die Kammer (d.h. 1 bis 15 mm durchschnittlich) vorzusehen, während trotzdem die Kammer ausreichend dünn ist, damit extrem rasche Erwärmung und Kühlung des darin befindlichen Reaktionsgemisches erfolgen können. Die durchschnittliche optische Weglänge der Kammer 42 ist der Abstand vom Mittelpunkt der Seitenwand 57A zum Mittelpunkt der Kammer 42 plus der Abstand vom Mittelpunkt der Kammer 42 zum Mittelpunkt der Seitenwand 57B.
  • Noch bevorzugter ist das Gefäß 40 solcherart aufgebaut, dass jede der Seitenwände 57A, 57B, 59A, 59B der Kammer 42 eine Länge L im Bereich von 5 bis 12 mm aufweist, die Kammer eine Breite W im Bereich von 7 bis 17 mm aufweist, die Kammer eine Dicke T im Bereich von 0,5 bis 2 mm aufweist und das Verhältnis der Breite W der Kammer zur Dicke T der Kammer zumindest 4:1 beträgt. Diese Bereiche sind bevorzugter, da sie zu einem Gefäß mit größerer durchschnittlicher optischer Weglänge (d.h. 5 bis 12 mm) und einem Fassungsvermögen im Bereich von 12 bis 100 μl führen, während die Kammer trotzdem ausreichend dünn ist, um extrem rasche Erwärmung und Abkühlung des Reaktionsgemisches zu ermöglichen. Das relativ große Fassungsvermögen sorgt für höhere Sensitivität beim Detektieren von Analyten in niedrigen Konzentrationen wie z.B. Nulcleinsäuren.
  • In der bevorzugten Ausführungsform besitzt das Reaktionsgefäß 40 eine rautenförmige Kammer 42, die durch die Seitenwände 57A, 57B, 59A, 59B definiert ist; jede der Seitenwände besitzt eine Länge von etwa 10 mm, die Kammer weist eine Breite W von etwa 14 mm, eine Dicke T von 1 mm (definiert durch die Dicke des Rahmens 46) und ein Fassungsvermögen von etwa 100 μl auf. Dieses Reaktionsgefäß bietet eine relativ lange durchschnittliche optische Weglänge von 10 mm durch die Kammer 42. Außerdem ermöglicht die dünne Kammer extrem rasche Erwärmung und/oder Abkühlung des darin befindlichen Reaktionsgemisches. Die Rautenform der Kammer 42 trägt dazu bei, dass sich keine Luftblasen in der Kammer bilden, wenn sie mit dem Reaktionsgemisch gefüllt wird, und unterstützt ferner die optische Abfrage bzw. Untersuchung des Gemisches.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 22 besteht der Rahmen 46 vorzugsweise aus einem optisch durchlässigen Material wie z.B. einem Polycarbonat oder geklärtem Polypropylen, so dass die Seitenwände 57A, 57B optisch durchlässig sind. Der Ausdruck „optisch durchlässig" bedeutet hierin, dass eine oder mehrere Lichtwellenlängen durch die Wände übertragen werden können. In der bevorzugten Ausführungsform sind die optisch durchlässigen Wände 57A, 57B im Wesentlichen transparent. Außerdem kann bzw. können ein oder mehrere optische Elemente auf den optisch durchlässigen Seitenwänden 57A, 57B vorhanden sein. Die optischen Elemente können z.B. ausgebildet sein, um das gesamte Lösungsvolumen, das durch eine Lichtquelle beleuchtet wird, zu maximieren, um Anregungslicht auf einen bestimmten Bereich der Kammer 42 zu fokussieren oder um möglichst viel Fluoreszenzsignal aus einer möglichst großen Fraktion des Kammervolumens erfassen bzw. zu sammeln. In alternativen Ausführungsformen können die optischen Elemente Gitter zur Auswahl spezifischer Wellenlängen, Filter, die nur bestimmte Wellenlängen passieren lassen, oder gefärbte Linsen, die Filterfunktionen erfüllen, umfassen. Die Wandflächen können beschichtet sein oder Materialien wie z.B. Flüssigkristall umfassen, um die Absorption bestimmter Wellenlängen zu erhöhen. In der hierin bevorzugten Ausführungsform sind die optisch durchlässigen Wände 57A, 57B im Wesentlichen klare, flache Fenster mit einer Dicke von etwa 1 mm.
  • Die Seitenwände 59A, 59B enthalten vorzugsweise Reflexionsflächen 56, die intern Licht reflektieren, das durch die Seitenwände 59A, 59B aus der Kammer 42 auszutreten versucht. Die Reflexionsflächen 56 sind solcherart angeordnet, dass angrenzende Flächen in einem Winkel von etwa 90° voneinander versetzt sind. Außerdem definiert der Rahmen 46 offene Räume zwischen den Seitenwänden 59A, 59B und den Stützrippen 53. Die offenen Räume sind durch Umgebungsluft ausgefüllt, die einen anderen Brechungsindex aufweist als das den Rahmen bildende Material (z.B. Kunststoff). Infolge der Differenz im Brechungsindex eignen sich die Reflexionsflächen 56 zur internen Reflexion des Lichts, das aus der Kammer durch die Wände 59A, 59B auszutreten versucht, und ermöglichen bessere Detektion optischer Signale durch die Wände 57A, 57B. Vorzugsweise definieren die optisch durchlässigen Seitenwände 57A, 57B den Bodenabschnitt der rautenförmigen Kammer 42, und die rückstrahlenden Seitenwände 59A, 59B definieren den Spitzenabschnitt der Kammer.
  • Es wird nun ein bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung des Reaktionsgefäßes 40 in Bezugnahme auf 2122 beschrieben. Das Reaktionsgefäß 40 kann durch Formen des steifen Rahmens 46 unter Anwendung bekannter Spritzgussformtechniken hergestellt werden. Der Rahmen 46 wird vorzugsweise einstückig als Polymermaterial, z.B. geklärtes Polypropylen, geformt. Nach der Erzeugung des Rahmens 46 werden dünne, biegsame Lagen zugeschnitten und mit gegenüber liegenden Seiten des Rahmens 46 versiegelt, um die Hauptwände 48 der Kammer 42 zu bilden. Die Hauptwände 48 sind vorzugsweise gegossene oder extrudierte Filme aus polymerem Material, z.B. Polypropylenfilme, die unter Anwendung der folgenden Vorgangsweise zugeschnitten und am Rahmen 46 befestigt werden. Ein erstes Stück des Films wird auf eine Seite des Rahmens 46 gelegt. Der Rahmen 46 enthält vorzugsweise einen Befestigungsstab 47, um die oberen Filmkante auszurichten. Der Film wird über den unteren Abschnitt des Rahmens 46 gelegt, so dass die obere Filmkante mit dem Befestigungsstab 47 ausgerichtet ist und der Film den unteren Abschnitt des Rahmens 46 unterhalb des Befestigungsstabs 47 vollständig abdeckt. Der Film sollte größer als der untere Abschnitt des Rahmens 46 sein, so dass er leicht gehalten und flach über den Rahmen gezogen werden kann. Der Film wird dann zugeschnitten, um mit der Kontur des Rahmens übereinzustimmen, indem am Rahmen jener Abschnitt des Films festgeklemmt wird, der den Rahmen bedeckt, und die Filmabschnitte abgeschnitten werden, die über den Umfang des Rahmens hinausragen, z.B. unter Verwendung von Laser oder einer Düse. Dann wird der Film klebend am Rahmen angeschweißt, wobei dies vorzugsweise mittels Laser erfolgt.
  • Der Film wird anschließend dichtend mit dem Rahmen 46 verbunden, vorzugsweise mittels Heißversiegeln. Das Heißversiegeln ist hierin vorzuziehen, da es eine starke Dichtung erzeugt, ohne dass potenzielle Schmutzstoffe in das Gefäß eindringen, wie dies bei der Anwendung von Klebe- oder Lösungsmittelklebeverfahren geschehen könnte. Das Heißversiegeln ist überdies einfach und kostengünstig. Es kann z.B. unter Verwendung einer Heizplatte durchgeführt werden. Eine identische Vorgangsweise kann gewählt werden, um eine zweite Lage zu schneiden und mit der gegenüber liegenden Seite des Rahmens 46 zu versiegeln, damit die Herstellung der Kammer 42 abgeschlossen werden kann. Es sind zahlreiche Variationsmöglichkeiten dieses Herstellungsverfahrens möglich. Beispielsweise wird in einer alternativen Ausführungsform der Film über den Bodenabschnitt des Rahmens 46 gespannt und dann mit den Rahmen versiegelt, bevor das Zurechtschneiden des Films erfolgt. Nach dem Versiegeln des Films mit dem Rahmen schneidet man die über den Umfang des Rahmens ragenden Filmabschnitte z.B. mittels Laser oder einer Düse weg.
  • Obwohl es hierin vorzuziehen ist, den Rahmen 46 einstückig zu formen, ist es auch möglich, den Rahmen aus mehreren Stücken zu fertigen. Beispielsweise können die Seitenwände 57A, 57B, die die im Winkel voneinander versetzten optischen Fenster bilden, aus Polycarbonat geformt sein, das zufrieden stellende optische Transparenz aufweist, während der Rest des Rahmens aus Polypropylen besteht, das kostengünstig ist und PCR nicht beeinträchtigt. Die getrennten Stücke können in einem zweiten Schritt aneinander gefügt werden. Beispielsweise können die Seitenwände 57A, 57B pressgepasst und/oder mit dem verbleibenden Abschnitt des Rahmens 46 verklebt werden. Die biegsamen Wände 48 können dann an gegenüber liegenden Seiten des Rahmens 46 befestigt werden, wie dies oben beschrieben ist.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 3 ist es hierin vorzuziehen, eine Dichtung 61 zum Versiegeln der Öffnungen 41, 43 des Gefäßes 40 mit den korrespondierenden Kanälen 80, 81 (4) im Kartuschenkörper zu verwenden. Alternativ dazu können Fluiddichtungen mittels Luer-Verbindungen, Pressarmatur oder Rohrverschraubung erfolgen. In einer weiteren Ausführungsform sind der Kartuschenkörper und der Rahmen des Gefäßes 40 einstückig geformt, und die biegsamen Hauptwände des Gefäßes sind mit gegenüber liegenden Seiten des Rahmens heißversiegelt.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 22 wird die Kammer 42 gefüllt, indem Flüssigkeit (z.B. ein Reaktionsgemisch) durch die Öffnung 41 und den Kanal 50 in die Kammer 42 geleitet wird. Die Flüssigkeit kann unter Anlegen von Differenzialdruck in die Kammer 42 gelenkt werden (d.h. entweder indem die Flüssigkeit durch die Einlassöffnung 41 gedrängt oder durch Anlegen eines Vakuums an die Auslassöffnung 43 angesaugt wird). Während die Flüssigkeit die Kammer 42 füllt, verdrängt sie die dort befindliche Luft. Die verdrängte Luft tritt durch den Kanal 52 und die Öffnung 43 aus der Kammer 42 aus. Zwecks optimaler Detektion von Analyt in der Kammer 42 sollte darauf geachtet werden, dass die Kammer keine Luftblasen enthält. Um zu verhindern, dass Luftblasen in der Kammer 42 eingeschlossen werden, sollte die Verbindung zwischen der Kammer 42 und dem Auslasskanal 52 am höchsten Punkt (bezogen auf die Schwerkraft) in der Kammer 42 positioniert sein. Dies ermöglicht das Entweichen von Luftblasen aus der Kammer 42, und sie werden dadurch nicht eingeschlossen. Somit ist das Gefäß 40 ausgebildet, in vertikaler Ausrichtung verwendet zu werden, wie dies aus 22 ersichtlich ist.
  • 25 zeigt ein weiteres Gefäß 206, das sich zum Einsatz in horizontaler Ausrichtung eignet. Das Gefäß 206 besitzt eine Einlassöffnung 41 und einen Einlasskanal 50, der die Einlassöffnung 41 mit dem unteren Abschnitt der Kammer 42 verbindet. Das Gefäß besitzt auch eine Auslassöffnung 43 und einen Auslasskanal 50, der die Auslassöffnung 43 mit dem oberen Abschnitt der Kammer 42 verbindet. Somit können allfällige in der Kammer 42 befindliche Luftblasen durch den Auslasskanal 52 entweichen, ohne eingeschlossen zu werden. 26 zeigt ein weiteres Gefäß 207 mit zwei Einlassöffnungen 41, 45 und einer Auslassöffnung 43. Die Einlasskanäle 50, 54 verbinden die jeweiligen Einlassöffnungen 41, 45 mit der Kammer 42, und der Auslasskanal 52 verbindet die Kammer 42 mit der Auslassöffnung 43. Zahlreiche andere Ausführungsformen des Gefäßes sind ebenfalls möglich. In jeder Ausführungsform ist es wünschenswert, die Kammer 42 vom (bezogen auf die Schwerkraft) höchsten Punkt aus zu evakuieren und Flüssigkeit von einem unteren Punkt aus in die Kammer einzuleiten.
  • 15A15B veranschaulichen zwei Arten von in der Kartusche verwendeten Ventilen. Wie aus 15A ersichtlich, gibt es zwei grundsätzliche Möglichkeiten des Ventileinsatzes, weshalb auch zwei Ventiltypen vorliegen. Das erste Ventil weist einen konisch geformten Ventilsitz 160, der im mittleren Kartuschenstück 24 ausgebildet ist. Der Ventilsitz 160 ist eine Vertiefung, eine Ausnehmung oder ein Hohlraum, der bzw. die im mittleren Stück 24 geformt oder maschinell ausgebildet ist. Der Ventilsitz 160 steht mit der Kammer 167 durch eine Öffnung bzw. einen Kanal 157, der bzw. die den Mittelpunkt des konischen Ventilsitzes 160 schneidet, in Fluidkommunikation. Wie aus 15B ersichtlich, wird ein Ventilaktuator 164 mit kugelförmiger Oberfläche gegen die elastische Membran 63 und in den Ventilsitz 160 gedrückt, wodurch ein kreisförmiger Ring entsteht, der Kontakt zwischen der Membran 63 und dem Ventilsitz 160 herstellt. Das kinematische Prinzip ist jenes einer in einem Konus befindlichen Kugel. Die zwischen der Membran 63 und dem Ventilsitz 160 gebildete Runddichtung verhindert das Fließen zwischen dem Kanal 157 (und somit der Kammer 167) und einem sich aus einer Seite des Ventilsitzes 160 erstreckenden Seitenkanal. Der Seitenkanal 158 ist durch die Membran 63 und das mittlere Kartuschenstück 24 definiert.
  • Wie aus 15A ersichtlich, steuert die andere Ventilart den quer verlaufenden Fluss zwischen dem Kanal 158 und dem anderen Seitenkanal 159, der zwischen der Membran 63 und dem mittleren Kartuschenstück 24 ausgebildet ist. In diesem Fall wäre ein kreisrunder Kontaktring nicht wirkungsvoll. Stattdessen umfasst das zweite Ventil eine Ausnehmung, eine Vertiefung bzw. einen Hohlraum 161 im mittleren Kartuschenstück 24. Der Hohlraum 161 trennt die Kanäle 158, 159 voneinander. Ein Ende des Kanals 158 befindet sich auf einer Seite des Hohlraums 161, und das andere Ende des Kanals 159 befindet sich auf der gegenüber liegenden Seite des Hohlraums 161. Der Hohlraum 161 ist durch eine erste gekrümmte Oberfläche 162A angrenzend an das Ende des Kanals 158 definiert, eine zweite gekrümmte Oberfläche 162B grenzt an das Ende des Kanals 159 an, und eine dritte Oberfläche 163 ist zwischen der ersten und der dritten gekrümmten Oberfläche 162A, 162B positioniert. Wie aus 15B ersichtlich, bieten die gekrümmten Oberflächen zwei Ventilsitze, die den Hauptkontaktbereich für die Membran 63 darstellen, um den Fluss zwischen den Kanälen 158 und 159 abzudichten. Das kinematische Prinzip ist jenes einer Kugel oder eines kugelförmigen Endes auf einem Ventilaktuator, gehalten von drei Kontaktpunkten, der nach oben gerichteten Kraft auf dem Aktuator und den zwei Ventilsitzen 162A, 162B.
  • Wie aus 16A ersichtlich, sind die erste und die zweite gekrümmte Oberfläche 162A, 162B vorzugsweise konzentrische kugelförmige Oberflächen. Der Ventilaktuator 164 besitzt auch eine kugelförmige Oberfläche, um die Membran eng an die Oberflächen 162A, 162B anzupressen. Darüber hinaus weist jede der Oberflächen 162A, 162B vorzugsweise einen kugelförmigen Krümmungsradius R1 auf, der dem kombinierten Krümmungsradius R2 des Ventilaktuators 164 plus der Dicke T der Membran 63 entspricht. Wenn z.B. der Krümmungsradius R2 der Oberfläche des Ventilaktuators 164 0,094 Zoll beträgt und die Membran 63 eine Dicke T von 0,031 Zoll aufweist, dann ist der Krümmungsradius R1 jeder der Oberflächen 162A, 162B 0,125 Zoll. Im Allgemeinen hängen die Größe und der Krümmungsradius der Ventilsitze von der Größe der Kanäle in der Kartusche ab. Die Ventile sind vorzugsweise gerade groß genug, um die Kanäle wirkungsvoll abzudichten, aber nicht größer, so dass totes bzw. ungenutztes Volumen in der Kartusche minimiert wird.
  • Wie dies aus 16B erkennbar ist, ist die dritte Oberfläche 163 gegenüber der ersten und der zweiten Oberfläche 162A, 162B vertieft, um einen Zwischenraum 166 zwischen der Membran 63 und der dritten Oberfläche 163 zu schaffen, wenn die Membran 63 gegen die erste und die zweite Oberfläche 162A, 162B gedrückt wird. Anders ausgedrückt sind die Oberflächen 162A, 162B gegenüber der Oberfläche 163 erhöht bzw. erhaben. Der Zwischenraum 166 stellt sicher, dass die Membran 63 vor allem die Ventilsitze 162A, 162B berührt und nicht die gesamte Oberfläche des Hohlraums 161, so dass durch die Membran 63 maximaler Druck an die Ventilsitze 162A, 162B angelegt wird. Dies erzeugt eine sehr starke Dichtung mit minimalem Aktuator-Kraftaufwand.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 15B definiert in beiden Ventiltypen das jeweilige kinematische Prinzip die Position der zusammenpassenden Teile. Sowohl beim Kugel-im-Konus-Konzept als auch beim Kugel-gegen-zwei-kugelförmige-Oberflächen-Konzept kann die Kugel bzw. der kugelförmige Ventilaktuator seine eigene Position finden, wenn er bzw. sie gegen den bzw. die Ventilsitze) gedrängt wird. Es ist absichtlich ein Freiraum (z.B. 0,01 bis 0,03 Zoll) zwischen dem Ventilaktuator und dem Loch im unteren Kartuschenstück 26 vorgesehen, in dem sich der Aktuator 164 fortbewegt, so dass nur die Wirkung und Funktion des Ventilsitzes die Position der zusammenpassenden Stücke definiert.
  • Die Ventilaktuatoren können mittels unterschiedlicher Mechanismen gesteuert werden. 1719 zeigen einen derartigen Mechanismus. Wie aus 17 ersichtlich, besitzt ein Ventilaktuator 172 eine kugelförmige Oberfläche, um die Dichtung 63 in einen Ventilsitz hineinzudrücken. Der Aktuator 172 weist auch in seinem unteren Abschnitt einen Flansch 177 auf. Die Kartusche besitzt einen elastischen Körper, z.B. eine Feder 174, die gegen eine Leiste im unteren Kartuschenstück 26 drückt, um den Ventilaktuator gegen die Dichtung 63 vorzuspannen. Die Feder 174 ist ausreichend stark, um das Ventil zu schließen – es sei denn es wird absichtlich Kraft aufgewendet, um den Aktuator 172 hinunterzuziehen. Die Ventile in der Kartusche können auf diese Weise zwecks Transport und Lagerung vor der Verwendung der Kartusche geschlossen werden. Somit kann die Kartusche während der Herstellung mit den notwendigen Reagenzien und Waschlösungen vorbeladen werden, um eine Fluidprobe analysieren zu können, ohne dass die Fluids während des Transports und der Lagerung aus der Kartusche austreten.
  • Der Mechanismus zum Hinunterziehen des Aktuators befindet sich üblicherweise in einem Instrument, in das die Kartusche zwecks Probenanalyse eingesetzt wird (ein derartiges Instrument ist ausführlich weiter unten in Zusammenhang mit 10 beschrieben). Der Mechanismus umfasst eine Gleitführung 175, die ein mit Scharniergelenk versehenes Hinunterziehelement 180 dreht, das eine Backe 181 zur Aufnahme des Flansches 177 des Aktuators 172 aufweist. Wie aus 18 ersichtlich, dreht die Gleitführung 175 das mit Scharniergelenk versehene Hinunterziehelement 180, bis sich der Flansch 177 innerhalb der Backe 181 befindet. Wie man in 19 erkennt, zieht ein Solenoid 146 das Element 180 und demnach den Ventilaktuator 172 hinunter, so dass die Dichtung 63 aus dem Ventilsitz befreit wird; dadurch öffnet sich das Ventil, und Fluidfluss zwischen den Kanälen 170 und 171 wird ermöglicht.
  • 20 veranschaulicht die Art, in der Fluidfluss in und aus der Probenkammer, Waschkammer, Neutralisatorkammer und Reagenskammer in der Kartusche gesteuert wird. Jede dieser Kammern – wie dies anhand der Kammer 414 in 20 erkennbar ist – ist von einer hydrophoben Membran 410 überzogen, die das Hindurchströmen von Gas, aber nicht von Flüssigkeit ermöglicht. Die hydrophobe Membran 410 befindet sich zwischen der Kammer 414 und einer Drucköffnung 32. Die Drucköffnung 32 ist im oberen Kartuschenstück 22 ausgebildet und befindet sich oberhalb der Kammer 414. Die Membran 410 hält während des Transports und der Lagerung der Kartusche Flüssigkeiten in der Kammer 414, selbst wenn die Kartusche umgedreht wird. Die Drucköffnung 32 ist dimensioniert, eine Druckdüse 182 aufzunehmen, die mit einer Druckquelle (z.B. einer Vakuum- oder pneumatischen Pumpe) verbunden ist, die sich üblicherweise im externen Instrument befindet. Die Düse 182 beinhaltet einen O-Ring 184 und einen Flansch 415. Eine Feder 185 drückt gegen den Flansch 415, um die Düse 182 in die Drucköffnung 32 zu zwängen, so dass der O-Ring 184 eine Dichtung um die Öffnung 32 bildet. Während des Betriebs wird positiver Luftdruck oder ein Vakuum an die Kammer 414 durch die Drucköffnung 32 angelegt, damit Flüssigkeiten aus oder in die Kammer 414 gelenkt werden.
  • Ein konischer Ventilsitz 160 (weiter oben in Zusammenhang mit 15A15B beschrieben) ist im mittleren Kartuschenstück 24 unterhalb der Kammer 414 ausgebildet, um den Flüssigkeitsstrom zwischen der Kammer 414 und einem Verbindungskanal 411 zu steuern. Das Ventil wird durch einen Ventilaktuator 188 mit einem Flansch 187 und einer Feder 188 geöffnet und geschlossen, die gegen den Flansch drückt, um das Ventil geschlossen zu halten, bis eine nach unten gerichtete Kraft an den Aktuator 186 angelegt wird. Die nach unten gerichtete Kraft stammt vorzugsweise aus einem Solenoid, das den Aktuator 186 zwecks Öffnen des Ventils nach unten zieht. Der Ventilaktuator 186 und das Solenoid befinden sich vorzugsweise im Instrument.
  • 78 sind eine obere bzw. untere Draufsicht der Kartusche. 9 ist ein schematisches Blockdiagramm der Kartusche. Wie aus 79 ersichtlich, enthält die Kartusche eine Probenkammer 65 mit einer Öffnung, um der Kartusche eine Fluidprobe zuzusetzen, und einen Probenflussweg, der sich von der Probenkammer 65 ausgehend erstreckt. Der Probenflussweg erstreckt sich von der Probenkammer 65 durch ein Ventil 107 in einen Kanal 106. Der Kanal 106 enthält eine Sensorregion 136, in der der Kanal 106 einen flachen Boden aufweist, wodurch die problemlose optische Detektion der Gegenwart von Flüssigkeit im Kanal ermöglicht wird. Der Probenflussweg setzt sich vom Kanal 106 in die Lysekammer 86 und durch den Filterstapel 87 fort. Der Probenflussweg enthält auch einen Kanal 109 für den Entlüftungs-Austritt von Fluid aus der Lysekammer 86, einen Kanal 110 mit einer mit flachem Boden versehenen Detektionsregion 137, ein Ventil 111 und einen Kanal 112, der durch ein Ventil 114 zur entlüfteten Abfallkammer 68 führt.
  • Die Kartusche besitzt auch eine Waschkammer 66 zum Aufnehmen von Waschlösung und die Reagenskammer 67 zum Aufnehmen von Lysereagens. Die Waschkammer 66 ist mit der Lysekammer 86 durch ein Ventil 115, einen Kanal 117 und einen Kanal 106 verbunden. Die Reagenskammer 67 ist mit der Lysekammer 86 durch ein Ventil 119, den Kanal 117 und den Kanal 106 verbunden. Probenkomponenten (z.B. Zellen oder Viren in der Probe) werden im Filterstapel 87 eingefangen und in der Kammer 86 lysiert, um Zielanalyt (z.B. Nucleinsäure) aus den Probenkomponenten freizusetzen. Die Kartusche enthält ferner einen Analytenflussweg, der sich von der Lysekammer 86 erstreckt, um den von der Fluidprobe abgetrennten Analyten zwecks chemischer Reaktion und optischer Detektion zum Reaktionsgefäß 40 zu befördern. Der Analyenflussweg verläuft von der Kammer 86 durch den Kanal 109, den Kanal 110 und das Ventil 111. Nach dem Passieren durch das Ventil 111 zweigt der Analytenflussweg vom Probenflussweg ab. Während sich der Probenflussweg durch den Kanal 112 in die Abfallkammer 68 erstreckt, zweigt der Analytenflussweg in den U-förmigen Kanal 122 ab. Der Analytenflussweg erstreckt sich dann durch ein Ventil 124 in und aus der Neutralisatorkammer 70. Der Analytenflussweg führt auch durch ein Ventil 126 in und aus der Stammmischungskammer 71. Von der Stammmischungskammer 71 erstreckt sich der Analytenflussweg entlang des Kanals 122 durch ein Ventil 127, durch den Kanal 80 und durch die Öffnung 41 hindurch in das Reaktionsgefäß 40.
  • Das Reaktionsgefäß 40 enthält die Öffnung 41 für die Zuleitung von Reaktionsgemisch in das Gefäß sowie die Öffnung 43 für das Ausleiten von Fluiden (z.B. Luft oder überschüssiges Reaktionsgemisch) aus dem Gefäß. Die Kartusche besitzt ferner den Kanal 81, der in Fluidkommunikation mit der Öffnung 43 steht. Der Kanal 81 enthält eine mit flachem Boden versehene Detektionsregion 130 zum Detektieren der Gegenwart von Flüssigkeit im Kanal. Der Kanal 81 ist mit einen Kanal 131 verbunden (Kanal 131 verläuft in der oberen Draufsicht von 7 senkrecht nach unten). Kanal 131 ist mit einem Kanal 132 verbunden, der seinerseits durch ein Ventil 133 mit einem Kanal 134 verbunden ist (Kanal 134 verläuft in der oberen Draufsicht von 7 senkrecht nach oben). Der Kanal 134 führt zum Entlüftungs-Austritt 36, der eine hydrophobe Membran aufweist, damit Gas, aber nicht Flüssigkeit aus der Kartusche entweichen kann. Die Kanäle, der Entlüftungs-Austritt und das Ventil, die stromab vom Reaktionsgefäß 40 angeordnet sind, dienen der Druckbeaufschlagung der Kammer 42 des Gefäßes, wie dies weiter unten in Zusammenhang mit dem Betrieb der Vorrichtung beschrieben ist.
  • Die Kartusche weist überdies eine erste Drucköffnung 105 oberhalb der Probenkammer 65, eine zweite Drucköffnung 116 oberhalb der Waschkammer 66, eine dritte Drucköffnung 118 oberhalb der Reagenskammer 67, eine vierte Drucköffnung 123 oberhalb der Neutralisatorkammer 70, eine fünfte Drucköffnung 125 oberhalb der Stammmischungskammer 71 und eine sechste Drucköffnung 128 am Ende des U-förmigen Kanals 122 auf. Die Kartusche enthält außerdem Sensorkammern 120 und 121, die in Fluidkommunikation mit der Abfallkammer 68 stehen. Die Sensorkammern 120 und 121 zeigen an, wann vorbestimmte Flüssigkeitsvolumen in der Abfallkammer 68 aufgenommen sind, wie dies ausführlich weiter unten erläutert wird.
  • Bezug nehmend auf 10 wird die Kartusche vorzugsweise in Kombination mit einem Instrument 140 verwendet, das ausgebildet ist, eine oder mehrere Kartuschen aufzunehmen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit nimmt das in 10 gezeigte Instrument nur eine Kartusche auf. Es ist allerdings zu beachten, dass das Instrument ausgebildet sein kann, mehrere Kartuschen gleichzeitig zu verarbeiten. Das Instrument 140 besitzt ein Kartuschennest 141, in das die Kartusche zwecks Verarbeitung eingesetzt wird. Das Instrument 140 enthält ferner den Wandler 92 (z.B. ein Ultraschallhorn), um dynamische Druckimpulse oder Druckwellen in der Lysekammer der Kartusche zu erzeugen, neun Ventilaktuatoren 142 zur Betätigung der neun Ventile in der Kartusche, neun korrespondierende Solenoide 146 für das Hinunterziehen der Ventilaktuatoren und sechs Druckdüsen 145, um Grenzflächen mit sechs korrespondierenden Drucköffnungen in der Kartusche zu bilden. Darüber hinaus umfasst das Instrument eine oder mehrere gesteuerte Druckquellen zur Druckbeaufschlagung der Kartusche durch die Druckdüsen 145 bzw. ist mit diesen Druckquellen verbunden. Geeignete Druckquellen sind Spritzenpumpen, Druckluftquellen, pneumatische Pumpen oder Verbindungen zu externen Druckquellen. Das Instrument besitzt außerdem drei geschlitzte optische Sensoren 143 und drei optische Reflexionssensoren 144.
  • 13 zeigt die geschlitzten optischen Sensoren 143, die positioniert sind, um Flüssigkeit in den Sensorkammern 120, 121 und in der Reagenskammer zu detektieren. Jeder Sensor 143 enthält eine eingebaute LED und Photodiode, die sich auf gegenüber liegenden Seiten des Sensors befinden. Die LED emittiert einen Strahl, der von der Photodiode detektiert wird, wenn der Strahl nicht wesentlich gebrochen wird. Derartige geschlitzte optische Sensoren sind bei einigen Firmen im Handel erhältlich. Die Kartusche ist solcherart geformt, dass die geschlitzten optischen Sensoren um die Kammern 67, 120 und 121 passen. Der Betrieb jedes einzelnen Sensors ist wie folgt: Wenn keine Flüssigkeit in der vom Sensor umgebenen Kammer vorhanden ist, wird der Strahl aus der LED durch die Luft in der Kammer und deren gekrümmte Innenwand deutlich gebrochen, und es wird, wenn überhaupt, nur ein schwaches Signal von der Photodiode detektiert, da Luft einen Brechungsindex besitzt, der nicht an jenen der KunststoffKartusche herankommt. Wenn jedoch Flüssigkeit in der Kammer vorhanden ist, wird der Strahl aus der LED nicht oder nur gering gebrochen, wodurch ein viel stärkeres von der Photodiode detektiertes Signal erzeugt wird, da die Flüssigkeit einen Brechungsindex besitzt, der jenem der KunststoffKartusche nahe kommt. Die optischen Sensoren 143 eignen sich demnach dazu, die Gegenwart oder Abwesenheit von Flüssigkeit in den Kammern 67, 120 und 121 zu ermitteln.
  • 14 ist eine abgeschnittene schematische Seitenansicht der Sensorkammer 120, die in Fluidkommunikation mit der Abfallkammer 68 steht und vom geschlitzten optischen Sensor 143 umgeben ist. Die Sensorkammer 120 und der Sensor 143 dienen dazu, anzuzeigen, wann ein vorbestimmtes Flüssigkeitsvolumen in der Abfallkammer 68 vorhanden ist. Die Sensorkammer 120 ist durch eine Wand 151 mit einem Überlaufrand 152 teilweise von der Abfallkammer 68 getrennt. Die Wandhöhe ist solcherart ausgewählt, dass sich im Fall der Aufnahme des vorbestimmten Flüssigkeitsvolumens in der Abfallkammer 68 die Flüssigkeit über den Überlaufrand 152 in die Sensorkammer 120 ergießt. Die Flüssigkeit in der Sensorkammer 120 wird dann durch den Sensor 143 detektiert.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 13 kann die Kartusche auch eine zweite Sensorkammer enthalten, die in Fluidkommunikation mit der Abfallkammer 68 steht. Die zweite Sensorkammer 121 ist ebenfalls durch eine Wand 153 mit einem Überlaufrand von der Abfallkammer 68 getrennt. Die Wand 153 ist höher als die Wand 152, so dass Flüssigkeit erst dann über die Wand 153 tritt, wenn ein zweites vorbestimmtes Fluidvolumen zusätzlich zum ersten vorbestimmten Fluidvolumen in der Abfallkammer 68 aufgenommen wurde. Die Sensorkammern 120, 121 und die optischen Sensoren 143 eignen sich zur Steuerung des Kartuschenbetriebs. Die Höhe der Wand 152 ist vorzugsweise solcherart ausgewählt, dass sich – sobald ein vorbestimmtes Volumen an Fluidprobe aus der Probenkammer 65 durch den Probenflussweg in die Abfallkammer 68 geströmt ist – die Probenflüssigkeit in die Sensorkammer 120 ergießt und detektiert wird. Die Detektion in der Kammer 120 löst die Freisetzung von Waschlösung aus der Waschkammer 66 aus, die durch den Probenflussweg in die Abfallkammer 68 fließt. Wenn ein inkrementales Volumen der Waschlösung in der Kammer 68 aufgenommen ist, läuft Flüssigkeit über die Wand 153 in die Sensorkammer 121 und wird detektiert. Die Detektion von Flüssigkeit in der Kammer 121 löst dann die Freisetzung von Lysereagens aus der Kammer 67 aus. Der die Kammer 67 umgebende Sensor 143 kann dann zur Anzeige herangezogen werden, wann die Kammer 67 leer ist, wobei dies den Beginn der Ultraschalllyse auslöst. In einer alternativen Ausführungsform kann die Kartusche zwei Abfallkammern aufweisen – eine für die Probe und eine für Waschlösung -, wobei jede Abfallkammer eine jeweils damit verbundene Sensorkammer aufweist.
  • Optische Inline-Reflexionssensoren 144 dienen dazu, die Gegenwart oder Abwesenheit von Flüssigkeit in den mit flachem Boden versehenen Detektionsregionen 130, 136, 137 der Kanäle 81, 106 bzw. 110 zu bestimmen (7). Jeder Sensor 144 besitzt einen eingebauten Emitter und Detektor, der über der mit flachem Boden versehenen Detektionsregion angeordnet ist. Der Emitter sendet einen Strahl aus, der von der Kartusche reflektiert und durch den Detektor detektiert wird. Der Sensor detektiert eine Änderung im Signal, wenn eine Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche durch die Detektionsregion gelangt. Gegebenenfalls können optische Dualemitter-Reflexionssensoren verwendet werden, damit die Zuverlässigkeit des Detektionsvorgangs erhöht wird. Beide Arten optischer Reflexionssensoren sind auf dem Gebiet allgemein bekannt und im Handel erhältlich.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 10 enthält das Instrument 140 auch ein Wärmetauschermodul 147 mit einem Schlitz 148 zur Aufnahme des Reaktionsgefäßes der Kartusche. Der Modul 147 ist weiter unten in Zusammenhang mit 28 ausführlich beschrieben. Das Instrument 140 besitzt überdies einen Einschnappmechanismus 149, um einen Deckel 150 über einer Kartusche einschnappen zu lassen. Das Kartuschennest 141 weist Ausrichtungslöcher 401 zur Aufnahme der Kartuschenfüße auf. Die Ausrichtungslöcher 401 stellen die richtige Positionierung der Kartusche im Nest 141 sicher, so dass die Druckdüsen 145, der Wandler 92 und die Ventilaktuatoren 142 in die korrespondierenden Öffnungen in der Kartusche passen und das Reaktionsgefäß in den Schlitz 148 passt. Der Wandler 92 sollte im Instrument 140 solcherart angeordnet sein, dass beim Positionieren der Kartusche im Nest 141 der Wandler die Bodenwand der Lysekammer 86 berührt, wie dies aus der ausgeschnit tenen Ansicht aus 5 erkennbar ist. Außerdem kann das Instrument eine Feder oder einen ähnlichen Mechanismus aufweisen, um den Wandler 92 gegen die Wand der Lysekammer 86 vorzuspannen.
  • Das Instrument 140 enthält auch verschiedene herkömmliche und in 10 nicht dargestellte Elemente, z.B. eine Hauptlogikschaltplatte mit einem Mikrocontroller zur Steuerung der Solenoide 146, des Wandlers 92, des Wärmetauschermoduls 147 und der optischen Sensoren 143, 144. Das Instrument umfasst überdies eine Stromversorgung bzw. ist an diese angeschlossen, um das Instrument mit elektrischer Energie zu versorgen, und eine pneumatische Pumpe, um durch die Düsen 145 Druck zuzuführen. Das Instrument 140 ist vorzugsweise computergesteuert, wobei dies z.B. mittels eines Mikrocontrollers erfolgt, der so programmiert ist, dass er die weiter unten in Zusammenhang mit dem Betrieb beschriebenen Funktionen erfüllt. Alternativ dazu kann das Instrument durch einen getrennten Computer oder eine Kombination eines getrennten Computers und eines auf der Schaltplatte befindlichen Mikrocontrollers betrieben werden.
  • 11 ist eine isometrische Ansicht der Kartusche 20, die sich zwecks Verarbeitung im Instrument 140 befindet. 11 ist eine teilweise abgeschnittene Ansicht des Instruments 140 mit geschlossenem Deckel 150. Ein Speicher- oder Mikroprozessorchip kann gegebenenfalls als Teil der Kartusche 20 vorgesehen sein. Dieser Chip enthält vorzugsweise Informationen wie z.B. Kartuschentyp, Programminformationen wie z.B. spezifische Arbeitsvorschriften zur Verarbeitung der Kartusche, Toleranzwerte für Annahme bzw. Ablehnung, Seriennummern und Chargencodes für die Qualitätskontrolle sowie die Möglichkeit, die Verarbeitungsergebnisse zu speichern. Ein integrierter elektronische Speicher auf der Kartusche 20 ermöglicht das rasche, problemlose und fehlerfreie Aufsetzen der Instrumente 140 für unterschiedliche Fluidik-Verarbeitungs-Arbeitsvorschriften. Wenn die Kartusche 20 in das Instrument 140 eingesetzt ist, kann das Instrument elektronisch auf den Kartuschenspeicher zugreifen und dadurch autoamtisch die jeweiligen Befehle empfangen, um die Zeitabfolge der bei eingesetzter Kartusche durchzuführenden Fluidikvorgänge zu steuern. Das Instrument 140 kann einfach sequenziell jeden Schritt im Kartuschenspeicher aufru fen und ausführen oder den Speicherinhalt herunterladen, so dass der Benutzer die Abfolge z.B. unter Verwendung des Controllercomputers abändern kann.
  • Wenn auf der Kartusche ein geeigneter Speicher vorgesehen ist, z.B. ein beschreibbarer Speicher (z.B. ein löschbarer programmierbarer Nur-Lese-Speicher (EPROM), ein elektrisch löschbarer programmierbarer Nur-Lese-Speicher (EEPROM) usw., können Zwischen- und Endergebnisse, die auf der in die Kartusche eingeführten Probe basieren, durch das Instrument in den Kartuschenspeicher geschrieben werden, damit dort nach der Verarbeitung die Speicherung gemeinsam mit der physischen Probe erfolgt. Dies ist besonders in Anwendungen von Vorteil, wo die Archivierung von Proben und Ergebnissen notwendig ist, z.B. im Bereich der forensischen Medizin. Außerdem können andere Informationen im Kartuschenspeicher in unveränderlicher oder veränderlicher Form gespeichert werden. Beispielsweise können die Kartuschen-Seriennummer, Chargenproduktions-Information und ähnliche Informationen vorprogrammiert und unveränderlich sein. Benutzerdaten, Techniker-Identifikationsnummer, Testdatum, Teststandort und Instrument-Seriennummer könnten unveränderlich in den Kartuschenspeicher geschrieben sein. Dies ermöglicht problemlose Identifikation und eine lückenlose „Beweiskette" während des Umfangs mit einer Probe. Techniker, die auch Fachleute auf dem Gebiet der Datenspeicherung sind, wissen, dass andere Speichermittel als elektronische ebenfalls in Frage kommen, z.B. optisch adressierte Druckregionen (z.B. Tintenstrahl oder Thermo), Magnetstreifen usw.
  • 28 zeigt den Wärmetauschermodul 147 des Instruments, in das das Reaktionsgefäß 40 zwecks thermischer Verarbeitung und optischer Detektion des bzw. der Zielanalyten im Reaktionsgemisch eingesetzt ist. Der Modul 147 enthält vorzugsweise ein Gehäuse 208, in dem die verschiedenen Modulkomponenten aufbewahrt sind. Der Modul 147 enthält ferner die oben beschriebenen Wärmeplatten 190. Das Gehäuse 208 enthält einen in 28 nicht zu sehenden Schlitz oberhalb der Platten 190, so dass die Reaktionskammer des Gefäßes 40 durch den Schlitz zwischen die Platten eingesetzt werden kann. Der Wärmetauschermodul 147 enthält vorzugsweise auch ein Kühlsystem wie z.B. ein Gebläse 212. Dieses ist so positioniert, dass Kühlluft an den Oberflächen der Platten 190 vorbei geblasen wird, um diese und somit auch das Reaktionsgemisch im Gefäß zu kühlen. Das Gehäuse 208 definiert vorzugsweise Kanäle, die die Kühlluft an den Platten 190 vorbei aus dem Modul 147 lenken.
  • Der Wärmetauschermodul 147 enthält außerdem eine optische Anregungsanordnung 216 und eine optische Detektionsanordnung 218 zur optischen Abfrage des im Gefäß 40 befindlichen Reaktionsgemisches. Die Anregungsanordnung 216 enthält eine erste Leiterplatte 220 zur Aufnahme ihrer elektronischen Komponenten, und die Detektionsanordnung 216 enthält eine zweite Leiterplatte 222 zur Aufbewahrung ihrer elektronischen Komponenten. Die Anregungsanordnung 216 enthält eine oder mehrere Lichtquellen (z.B. LED, Laser oder Glühlampe) zur Anregung fluoreszierend markierter Analyten im Gefäß 40. Die Anregungsanordnung 216 enthält ferner eine oder mehrere Linsen für das Kollimieren des Lichts aus den Lichtquellen sowie Filter zur Auswahl der Anregungswellenlängenbereiche von Interesse. Die Detektionsanordnung 218 enthält einen oder mehrere Detektoren (z.B. eine Photodiode, eine Photovervielfacherröhre oder CCD) für das Detektieren des aus dem Gefäß 40 emittierten Lichts. Die Detektionsvorrichtung 218 enthält auch eine oder mehrere Linsen für das Fokussieren und Kollimieren des emittierten Lichts sowie Filter für die Auswahl der Emissionswellenlängen von Interesse. Geeignete optische Anregungs- und Detektionsanordnungen zur Verwendung im Wärmetauschermodul 147 sind in WO 99/60380 (PCT/US99/11182), veröffentlicht am 25. November 1999, beschrieben.
  • Die optischen Anordnungen 216, 218 sind im Gehäuse 208 solcherart positioniert, dass beim Einsetzen der Kammer des Gefäßes 40 zwischen die Platten 190 die Anregungsanordnung 216 durch die optisch durchlässige Seitenwand 57A (siehe 22) in optischer Kommunikation mit der Kammer 42 steht und die Detektionsanordnung 218 durch die optisch durchlässige Seitenwand 57B (siehe 22) in optischer Kommunikation mit der Kammer steht. In der bevorzugten Ausführungsform werden die Optikanordnungen 216, 218 in optische Kommunikation mit den optisch durchlässigen Seitenwänden gebracht, indem einfach die Optikanordnungen 216, 218 neben den Unterkanten der Platten 190 positioniert werden, so dass beim Einsetzen der Kammer des Gefäßes zwischen die Platten die Optikanordnungen 216, 218 direkt die Seitenwände berühren oder in unmittelbarer Nähe von ihnen positioniert sind.
  • 34 ist eine teilweise aufgeschnittene isometrische Ansicht der Kammer des Gefäßes (zwischen die Platten 190A, 190B eingesetzt), wobei der obere Abschnitt des Gefäßes abgeschnitten ist. Das Gefäß besitzt vorzugsweise einen winkelförmigen Bodenabschnitt (z.B. dreieckig), der durch die optisch durchlässigen Seitenwände 57A, 57B gebildet ist. Jede der Platten 190A, 190B besitzt einen korrespondierend geformten Bodenabschnitt. Der Bodenabschnitt der ersten Platte 190A weist eine erste Unterkante 250A und eine zweite Unterkante 2190B auf. Ebenso besitzt der Bodenabschnitt der zweiten Platte 190B eine erste Unterkante 252A und eine zweite Unterkante 252B. Die erste und die zweite Unterkante jeder Platte sind vorzugsweise im gleichen Winkel wie die Seitenwände 57A, 57B voneinander versetzt (z.B. 90°). Außerdem sind die Platten 190A, 190B vorzugsweise so positioniert, dass sie die Gefäßkammer dazwischen aufnehmen, so dass die erste Seitenwand 57A im Wesentlichen angrenzend an und parallel zu jeder der ersten Unterkanten 250A, 252A positioniert ist und die zweite Seitenwand 57B im Wesentlichen angrenzend an und parallel zu jeder der zweiten Unterkanten 2190B, 252B positioniert ist. Diese Anordnung sorgt für leichten optischen Zugriff auf die optisch durchlässigen Seitenwände 57A, 57B und somit auf die Gefäßkammer. Ein Gel oder Fluid kann gegebenenfalls dazu dienen, optische Kommunikation zwischen jeder optischen Anordnung und den Seitenwänden 57A, 57B herzustellen oder zu verbessern. Das Gel oder Fluid sollte einen Brechungsindex aufweisen, der jenen der dadurch verbundenen Elemente nahe kommt.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 28 sind die Optikanordnungen 216, 218 vorzugsweise positioniert, um einen Winkel von 90° zwischen Anregungs- und Detektionswegen zu bilden. Der Winkel von 90° zwischen Anregungs- und Detektionswegen stellt sicher, dass eine Mindestmenge an Anregungsstrahlung, die durch die erst Seitenwand der Kammer eintritt, durch die zweite Seitenwand austritt. Außerdem ermöglicht der Winkel von 90°, dass eine maximale Menge emittierter Strahlung durch die zweite Seitenwand hindurch gesammelt wird. In der bevorzugten die zweite Seitenwand hindurch gesammelt wird. In der bevorzugten Ausführungsform enthält das Gefäß 40 eine Positionierungszunge 58 (siehe 22), die in einen Schlitz zwischen den Optikanordnungen 216, 218 eingepasst ist, um die richtige Positionierung des Gefäßes 40 für die optische Detektion zu gewährleisten. Zwecks Verbesserung der Detektion enthält der Modul 147 vorzugsweise auch einen lichtdichten Deckel (nicht dargestellt), der auf dem Gefäß 40 aufliegt und lichtdicht mit dem Gehäuse 208 verbunden wird, nachdem das Gefäß zwischen die Platten 190 eingesetzt wurde.
  • Obwohl es hierin vorzuziehen ist, die Optikanordnungen 216, 218 neben den Unterkanten der Platten 190 vorzusehen, sind viele andere Anordnungen möglich. Beispielsweise kann mit Lichtleitern, Wellenleitern, Lichtwellenleitern oder ähnlichen Vorrichtungen optische Kommunikation zwischen den Optikanordnungen 216, 218 und den Wänden des Gefäßes 40 hergestellt werden. Ein Vorteil dieser Vorrichtungen besteht darin, dass es durch sie nicht mehr nötig ist, die Optikanordnungen 216, 218 angrenzend an die Platten 190 vorzusehen. Dadurch entsteht mehr Raum um die Platten, in dem Kühlluft oder Kühlmittel zirkulieren kann, so dass auf diese Weise die Kühlung verbessert wird.
  • Der Wärmetauschermodul 147 enthält auch eine PC-Karte 226 zum Tragen der elektronischen Komponenten des Moduls und einen Kantenverbinder 224 zur Verbindung des Moduls 147 mit dem Instrument 140 (10). Die Heizelemente und Temperatursensoren auf den Platten 190 sowie die optischen Schaltplatten 220, 222 sind mit der PC-Karte 226 mittels Kabellitzen (in 28 aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht dargestellt) verbunden. Der Modul 147 kann auch eine Erdungsbahn 228 zur Abschirmung der optischen Detektionsschaltung enthalten. Der Modul 147 kann gegebenenfalls einen Indikator wie z.B. eine LED 214 besitzen, um einem Benutzer den aktuellen Zustand des Moduls wie z.B. „Erwärmen", „Abkühlen", „Ende" oder „Fehler" anzuzeigen.
  • Das Gehäuse 208 kann aus einem steifen, hochleistungsfähigen Kunststoff oder einem anderen herkömmlichen Material bestehen. Die Hauptfunktion des Gehäuses 208 besteht darin, einen Rahmen zum Halten der Platten 190, der Optikanordnungen 216, 218, des Gebläses 212 und der PC-Karte 226 bereitzustellen. Das Gehäuse 208 bietet vorzugsweise auch Flusskanäle und Öffnungen für das Lenken von Kühlluft vom Gebläse 212 über die Oberflächen der Platten 190 und aus dem Gehäuse. In der bevorzugten Ausführungsform umfasst das Gehäuse 208 komplementäre Stücke (in der schematischen Seitenansicht von 28 ist nur ein Stück zu sehen), die zusammenpassen, um die Komponenten des Moduls 147 dazwischen zu umschließen.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 23 können die Platten 190A, 190B aus verschiedenen Wärme leitenden Materialien wie z.B. Keramik oder Metall bestehen. Geeignete Keramikmaterialien sind Aluminiumnitrid, Aluminiumoxid, Berylliumoxid und Siliciumnitrid. Andere für die Platten in Frage kommende Materialien sind z.B. Galliumarsenid, Silicium, Siliciumitrid, Siliciumdioxid, Quarz, Glas, Diamant, Polyacryle, Polyamide, Polcarbonate, Polyester, Polyimide, Vinylpolymere und halogenierte Vinylpolymere wie etwa Polytetrafluorethylene. Andere mögliche Plattenmaterialien sind Chrom/Aluminium-Superlegierungen, Zircaloy, Aluminium, Stahl, Gold, Silber, Kupfer, Wolfram, Molybdän, Tantal, Messing, Saphir oder jedes andere auf dem Gebiet der Erfindung erhältlicher geeigneter Keramik-, Metall- oder Poylmermaterialien.
  • Keramikplatten sind hierin vorzuziehen, da ihre Innenflächen sehr glatt maschinell bearbeitet werden können, um dadurch für hohe Abriebbeständigkeit, hohe chemische Beständigkeit und guten Wärmekontakt mit den biegsamen Wänden des Reaktionsgefäßes zu sorgen. Keramikplatten können auch sehr dünn gefertigt sein, vorzugsweise zwischen 0,6 und 1,3 mm, damit die thermisch wirksame Masse niedrig und extrem rasche Temperaturwechsel möglich sind. Eine Keramikplatte ist auch ein guter Wärmeleiter und elektrischer Isolator, so dass die Temperatur der Platte mittels eines an die Platte gekoppelten Widerstandsheizelements gut gesteuert werden kann.
  • Es können verschiedene thermische Elemente verwendet werden, um die Platten 190A, 190B zu erwärmen und/oder abzukühlen und dadurch die Temperatur des Reaktionsgemisches in der Kammer 42 zu steuern. Im Allgemeinen sind geeignete Heizelemente zum Erwärmen der Platte leitende Heizelemente, Konvektionsheizgeräte oder Strahlungsheizgeräte. Beispiele für leitende Heizelemente sind Widerstands- oder Induktionsheizelemente, die an Platten gekoppelt sind, z.B. Widerstände oder thermoelektrische Geräte. Geeignete Konvektionsheizgeräte sind Umluftheizgeräte oder Fluidwärmetauscher zum Strömen von Fluiden an den Platten vorbei. Geeignete Strahlungsheizgeräte sind Infrarot- oder Mikrowellenheizgeräte. Ebenso können zahlreiche Kühlelemente zum Kühlen der Platten verwendet werden. Beispiele für in Frage kommende Konvektionskühlelemente sind Gebläse, Peltier-Kühlelemente, Kühlapparate oder Strahldüsen zum Strömen von Kühlfluiden an den Plattenoberflächen vorbei. Alternativ dazu eignen sich verschiedene leitende Kühlelemente wie z.B. Kühlkörper wie etwa Kühlmetallblöcke in direktem Kontakt mit den Platten.
  • Bezug nehmend auf 24 besitzt jede Platte 190 auf ihrer Außenfläche vorzugsweise ein Widerstandsheizelement 206. Das Widerstandsheizelement 206 ist vorzugsweise ein dicker oder dünner Film und kann direkt auf jede Platte 190 mittels Siebdruck aufgebracht sein, insbesondere Platten mit einem Keramikmaterial wie etwa Aluminiumnitrid oder Aluminiumoxid. Siebdrucken sorgt für hohe Zuverlässigkeit und niedrigen Querschnitt, wodurch wirkungsvolle Wärmeübertragung in die Reaktionskammer gegeben ist. Dick- oder Dünnfilmwiderstände verschiedener geometrischer Muster können auf den Außenflächen der Platten abgelagert sein, um einheitlichere Erwärmung zu bewirken, z.B. indem man dichtere Widerstände an den Enden und dünnere Widerstände in der Mitte vorsieht. Obwohl es hierin vorzuziehen ist, ein Heizelement auf der Außenfläche jeder Platte abzulagern, kann ein Heizelement alternativ dazu innerhalb jeder Platte eingebrannt sein, insbesondere wenn die Platten aus Keramik bestehen. Das Heizelement 206 kann Metalle, Wolfram, Polysilicium oder andere Materialien umfassen, die sich erhitzen, wenn eine Spannungsdifferenz an das Material angelegt wird. Das Heizelement 206 besitzt zwei Enden, die mit jeweiligen Kontakten 204 verbunden sind, die ihrerseits mit einer in 24 nicht dargestellten Spannungsquelle verbunden sind, damit Strom durch das Heizelement fließt. Jede Platte 190 enthält vorzugsweise auch einen Temperatursensor 192 wie z.B. ein Thermoelement, einen Thermistor oder RTD, der mittels zweier Bahnen 202 mit den jeweiligen Kontakten 204 verbunden ist. Der Temperatursensor 192 dient zur Überwachung der Temperatur der Platte 190 in einer gesteuerten Rückkopplungsschleife.
  • Die Platten besitzen eine niedrige thermisch wirksame Masse, damit die Platten rasch erwärmt und abgekühlt werden können. Insbesondere ist es hierin vorzuziehen, dass jede der Platten eine thermisch wirksame Masse von weniger als etwa 5 J/°C, noch bevorzugter von weniger als 3 J/°C, am bevorzugtesten von weniger als 1 J/°C, besitzt. Der Ausdruck „thermisch wirksame Masse" einer Platte ist hierin als spezifische Wärme der Platte, multipliziert mit der Masse der Platte, definiert. Außerdem sollte jede Platte groß genug sein, um eine jeweilige Hauptwand der Reaktionskammer abzudecken. In der hierin bevorzugten Ausführungsform besitzt z.B. jede der Platten eine Breite X im Bereich von 2 bis 22 mm, eine Länge Y im Bereich von 2 bis 22 mm und eine Dicke im Bereich von 0,5 bis 5 mm. Die Breite X und die Länge Y jeder Platte sind ausgewählt, um etwas größer als die Breite und Länge der Reaktionskammer zu sein. Außerdem besitzt jede Platte vorzugsweise einen winkelförmigen unteren Abschnitt, der an die Geometrie des unteren Abschnitts der Reaktionskammer angepasst ist, wie zuvor in Zusammenhang mit 34 beschrieben worden ist. In der bevorzugten Ausführungsform besteht jede der Platten aus Aluminiumnitrid mit einer spezifischen Wärme von etwa 0,75 J/g°C. Die Masse jeder Platte liegt vorzugsweise im Bereich von 0,005 bis 5,0 g, so dass jede Platte eine thermisch wirksame Masse im Bereich von 0,00375 bis 3,75 J/°C aufweist.
  • Die gegenüber liegenden Platten 190 sind positioniert, um die Kammer des Gefäßes 40 dazwischen solcherart aufzunehmen, dass die biegsamen Hauptwände der Kammer die Innenflächen der Platten berühren und sich an sie anpassen. Es ist hierin vorzuziehen, dass die Platten 190 in einer gegenüber liegenden Beziehung zueinander z.B. mittels Armen, Stützen oder Rückhaltevorrichtungen gehalten werden. Alternativ dazu können die Platten 190 mittels Feder zueinander vorgespannt sein, wie dies in WO 98/38487 beschrieben ist. In einer anderen Ausführungsform ist eine der Platten an einer fixen Position gehalten und die zweite Platte in Richtung der ersten Platte mittels Feder vorgespannt. Wenn eine oder mehrere Federn zum Vorspannen der Platten in Richtung zueinander dienen, sollten die Federn ausreichend steif sein, um sicherzustellen, dass die Platten gegen die biegsamen Wände des Gefäßes mit ausreichender Kraft gedrückt werden, so dass sich die Wände an die Innenflächen der Platten anpassen.
  • 2930 veranschaulichen eine bevorzugte Stützstruktur 209 zum Halten der Platten 190A, 190B in einer zueinander gegenüber liegenden Beziehung. 29 ist eine Explosionsansicht der Struktur, und 30 zeigt die montierte Struktur. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind die Stützstruktur 209 und die Platten 190A, 190B relativ zu ihrer normalen Ausrichtung im Wärmetauschermodul von 28 auf den Kopf gestellt. Bezug nehmend auf 29 enthält die Stützstruktur 209 eine Montageplatte 210 mit dem darin ausgebildeten Schlitz 148. Der Schlitz 148 ist ausreichend groß, damit die Kammer des Gefäßes darin eingesetzt werden kann. Die Abstandpfosten 230A, 230B erstrecken sich von der Montageplatte 210 auf gegenüber liegenden Seiten des Schlitzes 148. Der Abstandhalterpfosten 230A besitzt Vertiefungen 232, die auf gegenüberliegenden Seiten davon ausgebildet sind (nur eine Seite ist in der isometrischen Ansicht von 29 sichtbar), und der Abstandhalterpfosten 230B besitzt Vertiefungen 234, die auf gegenüber liegenden Seiten davon ausgebildet sind (nur eine Seite ist in der isometrischen Ansicht von 29 sichtbar). Die Vertiefungen 232, 234 in den Abstandhalterpfosten dienen zur Aufnahme der Kanten 190A, 190B. Um die Struktur zusammenzusetzen, werden die Platten 190A, 190B an gegenüber liegende Seiten der Abstandhalterpfosten 230A, 230B gestellt, so dass sich die Kanten der Platten in den Vertiefungen 232, 234 befinden. Die Plattenkanten werden dann unter Verwendung eines geeigneten Rückhaltemittels in den Vertiefungen festgehalten. In der bevorzugten Ausführungsform werden die Platten durch die Rückhalteschellen 236A, 236B festgehalten. Alternativ dazu können die Platten 190A, 190B durch Klebeverbindung, Schrauben, Bolzen, Klemmen oder andere geeignete Mittel festgehalten werden.
  • Die Montageplatte 210 und die Abstandhalterpfosten 230A, 230B sind vorzugsweise einstückig als einzelnes geformtes Kunststoffstück geformt. Der Kunststoff sollte ein Hochtemperaturkunststoff wie z.B. Polytherimid sein, der sich nicht verformt oder schmilzt, wenn die Platten 190A, 190B erwärmt werden. Die Rückhalteschellen 230A, 230B sind vorzugsweise aus rostfreiem Stahl. Die Montageplatte 210 kann gegebenenfalls Vertiefungen 240A, 240B zur Aufnahme von Kabellitzen 238A, 238B aufweisen, die die Heizelemente und Temperatursensoren auf den Platten 190A, 190B mit der PC-Karte 226 des Wärmetauschermoduls 147 verbinden (28). Der an die Platte 190A angrenzende Abschnitt der Kabellitzen 238A wird durch ein Stück Band 242A in der Vertiefung 240A gehalten, und der an die Platte 190B angrenzende Abschnitt der Kabellitzen 238B wird durch ein Stück Band 242A in der Vertiefung 240B gehalten.
  • 31 ist eine isometrische Ansicht der montierten Stützstruktur 209. Die Montageplatte 210 enthält vorzugsweise Laschen 246, die sich aus gegenüber liegenden Seiten davon erstrecken, um die Struktur 209 am Gehäuse des Wärmetauschermoduls zu befestigen. Wiederum Bezug nehmend auf 28 enthält das Gehäuse 208 vorzugsweise Schlitze für die Aufnahme von Laschen, um die Montageplatte 210 zu befestigen. Alternativ dazu kann die Montageplatte 210 mittels Klebeverbindung, Schrauben, Bolzen, Klemmen oder jede andere geeignete Fixiermöglichkeit am Gehäuse 208 befestigt sein.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 29 hält die Stützstruktur 209 die Platten 190A, 190B bevorzugt solcherart fest, dass ihre Innenflächen sehr geringfügig zueinander im Winkel stehen. In der bevorzugten Ausführungsform besitzt jeder der Abstandhalterpfosten 230A, 230B eine Wand 244, die sich leicht verjüngt, so dass beim Drücken der Platten 190A, 190B gegen gegenüber liegende Seiten der Wand die Innenflächen der Platten zueinander geringfügig im Winkel stehen. Wie man dies am besten in 23 erkennt, sind die Innenflächen der Platten 190A, 190B zueinander im Winkel angeordnet, um einen leicht V-förmigen Schlitz zu bilden, in den die Kammer 42 eingesetzt wird. Das Ausmaß, in dem die Innenflächen zueinander im Winkel angeordnet sind, ist sehr gering, vorzugsweise etwa 1° von der Parallelen. Die Oberflä chen sind solcherart zueinander im Winkel positioniert, dass vor dem Einsetzen der Kammer 42 zwischen die Platten 190A, 190B die unteren Teile der Platten etwas näher aneinander liegen als die oberen Teile. Diese leichte Winkelanordnung der Innenflächen vereinfacht das Einsetzen der Kammer 42 des Gefäßes zwischen die Platten und das Herausnehmen der Platten. Alternativ dazu könnten die Innenflächen der Platten 190A, 190B zueinander parallel gehalten werden, doch das Einsetzen und die Entnahme des Gefäßes 40 wäre so schwieriger.
  • Darüber hinaus sind die Innenflächen der Platten 190A, 190B vorzugsweise in einem Abstand voneinander entfernt, der der Dicke des Rahmens 46 entspricht. In Ausführungsformen, in denen die Innenflächen im Winkel, zueinander positioniert sind, sind die Mittelpunkte der Innenflächen vorzugsweise in einem Abstand voneinander entfernt, der der Dicke des Rahmens 46 entspricht, und die unteren Teile der Platten am Anfang in einem Abstand voneinander entfernt, der etwas weniger als die Dicke des Rahmens 46 ist. Wenn die Kammer 42 zwischen die Platten 190A, 190B eingesetzt wird, drückt der starre Rahmen 46 die unteren Plattenabschnitte auseinander, so dass die Kammer 42 fest zwischen den Platten eingesetzt ist. Der Abstand, in dem die Platten 190A, 190B durch den Rahmen auseinander gedrückt werden, ist üblicherweise sehr klein, z.B. etwa 0,035 mm, wenn die Rahmendicke 1 mm beträgt und die Innenflächen in einem Winkel von 1° zueinander angeordnet sind.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 30 sollten die Rückhalteschellen 236A, 236B ausreichend biegsam sein, um diese leichte Bewegung der Platten 190A, 190B nach außen aufzunehmen, doch ausreichend steif sein, um die Platten während des Einsetzens und der Entnahme des Gefäßes in den Ausnehmungen in den Abstandhalterpfosten 230A, 230B zu halten. Die Verkeilung des Gefäßes zwischen den Platten 190A, 190B bietet eine anfängliche Vorlast gegen die Kammer und stellt sicher, dass die biegsamen Hauptwände der Kammer unter Druckbeaufschlagung guten thermischen Kontakt mit den Innenflächen der Platten herstellen.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 28 können Anschläge in den Gehäusen der Optikanordnungen 216, 218 ausgeformt sein, um das Ausmaß zu begrenzen, in dem die Platten 190 infolge der Druckbeaufschlagung des Gefäßes 40 auseinander gedrückt werden können. Wie aus 32 ersichtlich, enthält das Gehäuse 249 der Optikanordnung 218 klauenartige Anschläge 247A, 247B, die sich aus dem Gehäuse erstrecken. Wie aus 33 ersichtlich, ist das Gehäuse 249 solcherart positioniert, dass die Unterkanten der Platten 190A, 190B zwischen den Anschlägen 247A, 247B eingesetzt sind. Die Anschläge 247A, 247B verhindern somit, dass die Platten 190A, 190B über einen vorbestimmten maximalen Abstand hinaus auseinander gedrückt werden. Obwohl dies in 33 aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht dargestellt ist, besitzt die Optikanordnung 216 (siehe 28) ein Gehäuse mit korrespondierenden Anschlägen, um die anderen Hälften der Platten daran zu hindern, über den vorbestimmten maximalen Abstand hinaus auseinander gedrückt zu werden. Wiederum Bezug nehmend auf 23 sollte der von den Anschlägen festgelegte maximale Abstand zwischen den Innenflächen der Platten 190A, 190B etwa der Dicke des Rahmens 46 entsprechen. Vorzugsweise ist der maximale Abstand der Innenflächen der Platten 190A, 190B etwas größer als die Dicke des Rahmens 46, um Toleranzvariationen im Gefäß 40 und in den Platten 190A, 190B aufzunehmen. Beispielsweise ist der maximale Abstand vorzugsweise etwa 0,1 bis 0,3 mm größer als die Dicke des Rahmens 46.
  • 35 ist ein schematisches Blockdiagramm der elektrischen Komponenten des Wärmetauschermoduls 147. Der Modul enthält einen Verbinder 224 oder eine Kabellitze zur Verbindung mit der Hauptlogikleiterplatte des Instruments. Der Modul enthält ferner Heizplatten 190A, 190B mit jeweils einem Widerstandheizelement (s.o.). Die Platten 190A, 190B sind parallel verdrahtet, um den Leistungseingang 253 aus dem Instrument aufzunehmen. Die Platten 190A, 190B enthalten ferner Temperatursensoren 192A, 192B, die analoge Temperatursignale an einen Analog-Digital-Wandler 264 aussenden. Der Wandler 264 wandelt die analogen Signale in digitale Signale um und leitet sie durch den Verbinder 224 an den Mikrocontroller im Instrument weiter.
  • Der Wärmetauschermodul enthält auch ein Kühlsystem wie z.B. ein Gebläse 212, um die Platten 190A, 190B und das im Gefäß zwischen den Platten enthaltene Re aktionsgemisch zu kühlen. Das Gebläse 212 wird durch Einschalten eines Netzschalters 272 aktiviert, der seinerseits durch einen Steuerlogikblock 270 geregelt wird, der Steuersignale aus dem Mikrocontroller empfängt. Der Modul enthält außerdem vier Lichtquellen wie z.B. LED 200 zur Anregung der markierten Analyten im Reaktionsgemisch und vier Detektoren 198, vorzugsweise Photodioden, um Fluoreszenzemissionen aus dem Reaktionsgemisch zu detektieren. Der Modul umfasst außerdem eine einstellbare Spannungsquelle 255, um eine variable Strommenge (z.B. im Bereich von 0 bis 30 mA) jeder LED zuzuführen und dadurch die Helligkeit der LED zu variieren. Ein digitaler Digital-Analog-Wandler 260 ist zwischen der einstellbaren Spannungsquelle 255 und dem Mikrocontroller angeordnet, damit dieser die Spannungsquelle digital einstellen kann.
  • Die einstellbare Spannungsquelle 255 dient vorzugsweise dazu, sicherzustellen, dass jede LED im aktivierten Zustand etwa die gleiche Helligkeit aufweist. Infolge von Produktionsvarianzen besitzen zahlreiche LED unterschiedliche Helligkeiten, wenn sie mit der gleichen Strommenge versorgt werden. Daher ist es hierin vorzuziehen, die Helligkeit jeder LED während der Herstellung des Wärmetauschermoduls zu überprüfen und Kalibrierungsdaten in einem Speicher 268 des Moduls zu speichern. Die Kalibrierungsdaten zeigen die jeder LED zuzuführende korrekte Strommenge an. Der Mikrocontroller liest die Kalibrierungsdaten aus dem Speicher 268 und reguliert dementsprechend die Spannungsquelle 255.
  • Der Modul enthält zusätzlich einen Signalkonditionierungs/Verstärkungsauswahl/Offset-Einstellblock 262, der Verstärker, Schalter, elektronische Filter und einen Digital-Analog-Wandler umfasst. Der Block 262 stellt die Signale aus den Detektoren 198 ein, um Verstärkung und Offset zu erhöhen und das Rauschen zu vermindern. Der Mikrocontroller reguliert den Block 262 durch ein digitales Ausgangsregister 266. Das Ausgangsregister 266 empfängt Daten aus dem Mikrocontroller und gibt Steuerspannungen an den Block 262 aus. Der Block 262 sendet die eingestellten Detektorsignale durch den Analog-Digital-Wandler 264 und den Verbinder 224 an den Mikrocontroller aus. Der Modul enthält auch den Speicher 268, vorzugsweise einen seriellen EEPROM, um für den Modul spezifische Daten zu speichern, z.B. Kalibrie rungsdaten für die LED 200, Wärmeplatten 190A, 190B und Temperatursensoren 192A, 192B.
  • Es folgt eine Beschreibung des Betriebs der Kartusche und des Instruments. Wie aus 3 ersichtlich, wird eine zu analysierende Fluidprobe der Probenkammer 65 durch die Probenöffnung 64 zugesetzt und die Verschlusskappe 30 in die Öffnung 64 geschraubt, um diese abzudichten. Bezug nehmend auf 10 wird die Kartusche 20 dann zwecks Verarbeitung in das Kartuschenest 141 des Instruments 140 gesetzt. Alle Ventile in der Kartusche 20 sind anfänglich geschlossen, wenn die Kartusche in das Instrument 140 eingesetzt wird. Wenn die Kartusche in das Instrument eingesetzt wird, kontaktiert der Wandler 92 eine Außenfläche der biegsamen Dichtung 63, die die untere Wand der Lysekammer 86 bildet (siehe 5).
  • Wiederum Bezug nehmend auf 10 ist das Instrument vorzugsweise computergesteuert, um die im folgenden Abschnitt beschriebenen Funktionen zu erfüllen, z.B. das Öffnen und Schließen von Ventilen in der Kartusche mittels der Ventilaktuatoren 142, das Anlegen von Druck an die Kartusche durch die Düsen 145, das Aktivieren des Wandlers 92, das Abfühlen der Gegenwart von Flüssigkeit oder von Flüssigkeitspegeln unter Verwendung optischer Sensoren 143 und 144 und die Steuerung des Wärmetauscher- und optischen Detektionsmoduls 147. Ein auf dem Gebiet der Erfindung geschulter Programmierer kann auf der Grundlage der folgenden Beschreibung einen Mikrocontroller und/oder Computer so programmieren, dass er diese Funktionen erfüllt.
  • Bezug nehmend auf 9 werden Flüssigkeiten vorzugsweise unter Anwendung von Differenzialdruck durch die Kartusche gedrängt. Obwohl hierin positiver Druck angewendet wird, kann auch negativer Druck (Vakuum) zur Regulierung von Fluidfluss in der Kartusche dienen. Das maximale Ausmaß des anzulegenden positiven Drucks wird üblicherweise durch die hydrophoben Membranen begrenzt, die einen Flüssigkeits-Durchbruchdruck von über 30 Pfund pro Quadratzoll (psi) (207 kPa) erreichen können. Die untere Druckgrenze ist durch die Notwendigkeit gegeben, Probe und andere Fluide ausreichend rasch durch die Kartusche zu bewegen, um die Testziele zu erreichen. Unter 1 psi (6,9 kPa) beispielsweise kann die Probe nicht wirkungsvoll durch den Filterstapel 87 fließen. Druck im Bereich von 6 bis 20 psi (41 bis 138 kPa) ist im Allgemeinen angemessen. Die Probenflussrate durch die Kartusche liegt vorzugsweise im Bereich von 10 bis 30 ml/min. Die Waschflussrate kann niedriger sein, z.B. 6 bis 18 ml/min, so dass die Waschlösung wirkungsvoll die Lysekammer 86 auswäscht.
  • Es folgt die Beschreibung einer konkreten Arbeitsvorschrift in Bezug auf 9, um den Betrieb der Kartusche zu veranschaulichen. Es ist zu beachten, dass es sich hierbei lediglich um ein Beispiel einer möglichen Arbeitsvorschrift handelt und dass der Schutzumfang der Erfindung keinesfalls darauf beschränkt ist. Zunächst wird die Kartusche vorzugsweise mit Waschlösung aus der Waschkammer 66 gefüllt, bevor die Fluidprobe aus der Probenkammer 65 gedrückt wird. Um die Kartusche zu füllen, werden die Ventile 111 und 115 geöffnet und ein Druck von 10 psi (69 kPa) an die Kammer 66 durch die Drucköffnung 116 etwa 2 s lang angelegt. Ein kleiner Teil der Waschlösung fließt durch die Kanäle 117 und 106, durch die Lysekammer 86, durch die Kanäle 109 und 110, in den U-förmigen Kanal 122 und bis in die hydrophobe Membran unterhalb der Drucköffnung 128.
  • Nach dem Füllen werden das Ventil 115 und die Drucköffnung 116 geschlossen und die Ventile 107 und 114 geöffnet. Gleichzeitig wird ein Druck von 20 psi (138 kPa) an die Probenkammer 65 durch die Drucköffnung 105 etwa 15 s lang angelegt, um die Probe durch den Kanal 106, durch den Filterstapel 87 in der Kammer 86, durch die Kanäle 110, 111, 112 und in die entleerte Abfallkammer 68 zu lenken. Wenn die Probe den Detektionsbereich 136 im Kanal 106 passiert, kann der optische Reflexionssensor 144 (13) dazu dienen, zu ermitteln, wann die Probenkammer 65 entleert wurde. Während die Probenflüssigkeit durch den Filterstapel 87 fließt, werden Zielzellen oder Zielviren in der Probe eingefangen. Wenn ein vorbestimmtes Probenvolumen die Abfallkammer 68 erreicht, ergießt sich etwas Flüssigkeit in die Sensorkammer 120, wodurch der nächste Schritt in der Arbeitsvorschrift ausgelöst wird. Alternativ dazu können statt der Rückkopplung aus den optischen Sensoren (dies löst die oben beschriebenen Ereignisse aus) die Schritte in einer vorbestimmten Arbeits vorschrift auch einfach zeitlich festgelegt werden; beispielsweise können vorbestimmte Drücke über eine vorbestimmte Zeitdauer angelegt werden, um bekannte Fluidvolumen mit bekannten Flussraten zu bewegen.
  • Das Durchflussmuster der Lysekammer 86 ermöglicht es Zielzellen oder Zielviren, zwecks Amplifikation und Detektion aus einem relativ großen Probenvolumen in ein viel kleineres Volumen eingeengt zu werden. Dies ist für die Detektion niedriger Analytenkonzentrationen (z.B. Nucleinsäure) von Bedeutung. Insbesondere beträgt das Verhältnis des Volumens der durch die Lysekammer 86 gelenkten Probe zum Fassungsvermögen der Kammer 86 vorzugsweise zumindest 2:1, noch bevorzugter zumindest 5:1. Das Volumen der durch die Kammer 86 gelenkten Probe beträgt vorzugsweise zumindest 100 μl, noch bevorzugter zumindest 1 ml. In der hierin bevorzugten Ausführungsform wird ein Probenvolumen von 5 ml durch die Lysekammer 86 gelenkt, wobei die Kammer 86 ein Fassungsvermögen von etwa 0,5 ml aufweist, so dass das Verhältnis 10:1 beträgt. Außerdem kann die Lysekammer 86 ultraschallbehandelt werden (z.B. unter Einsatz eines an eine Kammerwand gekoppelten Ultraschallhorns), während die Probe durch die Kammer gelenkt wird. Die Ultraschallbehandlung der Kammer 86 trägt dazu bei, die Verstopfung des Filterstapels 87 zu vermeiden und einen einheitlicheren Fluss durch die Kammer 86 zu bewirken. Insbesondere tragen die Schallwellen dazu bei, Teilchen oder Perlen im Filterstapel an der Verstopfung eines oder mehrerer Filter zu hindern.
  • Im nächsten Schritt werden die Ventile 111, 114, 115 geöffnet und ein Druck von 20 psi (138 kPa) an die Waschkammer 66 etwa 7 s lang angelegt, um auf diese Weise Waschlösung durch die Kanäle 117 und 106 in die Lysekammer 86 zu lenken. Die Waschlösung wäscht PCR-Inhibitoren und Schmutzstoffe aus der Lysekammer 86 und trägt sie durch die Kanäle 109, 110 und 112 in die Abfallkammer 68. Es können viele unterschiedliche geeignete und auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Waschlösungen mit variierenden pH-Werten, Lösungsmittelzusammensetzungen und Ionenstärken zu diesem Zweck verwendet werden. Beispielsweise ist ein zweckmäßiges Waschreagens eine Lösung von 80 mM Kaliumacetat, 8,3 mM Tris-HCl, pH 7,5, 40 μM EDTA und 55 % Ethanol. Die Lysekammer 86 kann ultraschall behandelt werden (z.B. mittels eines an eine Kammerwand gekoppelten Ultraschallhorns), während die Waschlösung durch die Kammer gelenkt wird. Die Ultraschallbehandlung der Kammer 86 trägt zur Vermeidung des Verstopfung des Filterstapels 87 bei und sorgt für einheitlicheren Fluss durch die Kammer 86 (s.o.). Außerdem können die Schallwellen dazu beitragen, das wegzuwaschende Material aufzulockern. Wenn das inkrementale Volumen der Waschlösung die Abfallkammer 68 erreicht, ergießt sich ein Teil der Flüssigkeit in die Sensorkammer 121, was den nächsten Schritt in der Arbeitsvorschrift auslöst.
  • Im nächsten Schritt wird das Ventil 115 geschlossen und das Ventil 119 geöffnet, während ein Druck von 15 psi (103 kPa) an die Reagenskammer 67 durch die Drucköffnung 118 etwa 3 s lang angelegt wird. Der Druck lenkt Lysereagens aus der Kammer 67 durch die Kanäle 117, 106 in die Lysekammer 86 sowie in den Kanal 110. Die Kammer 86 ist somit mit Flüssigkeit gefüllt. Geeignete Lysereagezien sind z.B. Lösungen mit einem chaotropen Salz, z.B. Guanidin-HCl, Guanidinthiocyanat, Guanidinisothiocyanat, Natriumiodid, Harnstoff, Natriumperchlorat und Kaliumbromid. In der hierin bevorzugten Ausführungsform wird ein PCR nicht hemmendes Lysereagens verwendet. Das Lysereagens umfasst 10 mM Tris, 5 % Tween-20, 1 mM Tris(2-carboxyethylphosphinhydrochlorid), 0,1 mM Ethylenglycol-bis(b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure. Nach dem Füllen der Lysekammer 86 mit Lysereagens werden die Ventile 111, 114 geschlossen. Das Ventil 119 bleibt offen, und es wird ein Druck von 20 psi (138 kPa) an die Drucköffnung 118 angelegt. Der statische Druck in der Lysekammer 86 wird daher auf 20 psi (138 kPa) erhöht; dies geschieht als Vorbereitung auf die Lyse der im Filterstapel 87 eingeschlossenen Zellen oder Viren.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 5 ist die Druckbeaufschlagung der Lysekammer 86 von Bedeutung, da sie die wirksame Kopplung zwischen dem Wandler 92 und der biegsamen Wand 63 der Lysekammer 86 sicherstellt. Um die Zellen oder Viren in der Kammer 86 aufzubrechen, wird der Wandler 92 aktiviert (d.h. in Schwingungsbewegung versetzt). Die biegsame Wand 63 der Lysekammer 86 überträgt die Schwingungsbewegung des Wandlers 92 auf die Flüssigkeit in der Kammer 86; leichte Durchbiegungen sind gestattet, nicht aber hohe Belastungen der Wand. Die Wand 63 kann aus elastomerer Membran bestehen, wie dies oben beschrieben ist. Alternativ dazu kann die Wand aus einem Film oder einer Lage polymeren Materials (z.B. eines Polypropylenfilms) bestehen, das vorzugsweise eine Dicke im Bereich von 0,025 bis 0,1 mm aufweist. Der Wandler 92 ist vorzugsweise ein Ultraschallhorn zur Ultraschallbehandlung der Kammer 86. Die Kammer 86 wird vorzugsweise 10 bis 40 s lang bei einer Frequenz im Bereich von 20 bis 60 kHz ultraschallbehandelt. In diesem Beispiel einer Arbeitsvorschrift wird die Kammer 15 s lang mit einer Frequenz von 47 kHz ultraschallbehandelt. Die Amplitude der Hornspitze liegt vorzugsweise im Bereich von 20 bis 25 μm (Spitze-Spitze-Messung).
  • Durch das Schwingen der Spitze des Wandlers 92 wird die biegsame Wand 63 mehrfach erschüttert. Der Vorwärtsimpuls (in 6 nach oben) der Spitze des Wandlers 92 drückt die Wand 63 und erzeugt einen Druckimpuls oder eine Druckwelle in der Kammer 86. Der Rückwärtsimpuls (in 5 nach unten) der Spitze des Wandlers 92 trennt diese üblicherweise von der biegsamen Wand 63, da diese sich nicht mehr mit der gleichen Frequenz wie der Wandler bewegen kann. Beim nächsten Vorwärtsimpuls erschüttert die Spitze des Wandlers 92 wieder die Wand 63 durch frontalen Aufprall, während die Spitze und die Wand rasch aufeinander zusteuern. Da sich der Wandler 92 und die Wand 63 bei schwingendem Wandler 92 trennen, ist der effektive Vorwärtsimpuls des Wandlers geringer als seine Spitze-Spitze-Amplitude. Der effektive Vorwärtsimpuls bestimmt das Ausmaß der Ultraschallbehandlung in der Kammer 86. Es ist daher wichtig, den statischen Druck in der Lysekammer 86 zu erhöhen, so dass beim Zurückziehen der Spitze des Wandlers 92 die biegsame Wand 63 nach außen gedrückt wird, um beim Rückwärtsimpuls auf die Spitze zu treffen. Der statische Druck in der Kammer 86 sollte ausreichen, um sicherzustellen, dass der effektive Vorwärtsimpuls des Wandlers 92 Druckimpulse oder Druckwellen in der Kammer 86 erzeugt. Es ist hierin vorzuziehen, den statischen Druck in der Kammer 86 auf zumindest 5 psi (34 kPa) über dem Umgebungsdruck außerhalb der Kartusche zu erhöhen; noch bevorzugter wird er auf einen Druck im Bereich von 15 bis 25 psi (103 bis 172 kPa) über Umgebungsdruck erhöht.
  • Bei jedem Vorwärtsimpuls verleiht der Wandler 92 der Flüssigkeit in der Kammer 86 Geschwindigkeit, wodurch ein Druckimpuls erzeugt wird, der rasch die Kammer 86 erfasst. Die Perlen im Filterstapel 87 (6) werden durch die Druckimpulse in der Kammer 86 geschüttelt. Die Druckimpulse schleudern die Perlen in der Kammer 86 in heftige Bewegung, wobei die Perlen mechanisch die Zellen oder Viren aufbrechen, um daraus das Material (z.B. Nucleinsäure) freizusetzen. Es ist zu beachten, dass einige Arten von Zellen wie z.B. Blutzellen relativ schwach sind und nur durch Druckimpulse – ohne Verwendung von Perlen – aufgebrochen werden können. Andere Arten von Zellen (insbesondere Sporen) besitzen hochresistente Zellwände, und Perlen sind im Allgemeinen für eine wirksame Lyse erforderlich.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 9 werden nach dem Aufbrechen der Zellen oder Viren die Ventile 111, 124 geöffnet und ein Druck von 12 psi (83 kPa) etwa 4 s lang an die Reagenskammer 67 durch die Drucköffnung 118 angelegt. Der Druck zwingt das Lysereagens dazu, die Nucleinsäure aus dem Filterstapel 87 zu eluieren und mit der Nucleinsäure in die Neutralisationskammer 70 zu strömen. Die Lysekammer 86 kann z.B. mittels eines an eine Kammerwand gekoppelten Ultraschallhorns ultraschallbehandelt werden, während die Elution der Nucleinsäure stattfindet. Die Ultraschallbehandlung der Kammer 86 kann dazu beitragen, die Verstopfung des Filterstapels 87 – wie oben beschrieben – zu vermeiden. Die Kammer 420 ist teilweise (z.B. zur Hälfte) mit Neutralisator wie z.B. Detergens gefüllt, um das Lyseragens zu neutralisieren. Wenn ein PCR nicht hemmendes Lysereagens verwendet wird, ist der Neutralisator optional.
  • Im nächsten Schritt wird das Ventil 124 geschlossen, um das Lysereagens, den Analyten und den Neutralisator in der Kammer 70 zu halten. Das Ventil 114 wird geöffnet und ein Druck von 15 psi (103 kPa) etwa 3 s lang durch die Drucköffnung 128 angelegt, um Flüssigkeit im U-förmigen Kanal 122 in die Abfallkammer 68 zu lenken. Als nächstes werden die Ventile 124 und 126 geöffnet und ein Druck von 15 psi (103 kPa) etwa 5 s lang durch die Drucköffnung 123 an der Spitze der Neutralisatorkammer 70 angelegt. Der Druck zwingt das neutralisierte Lysereagens und die Nucleinsäure in der Kammer 70 dazu, in den Kanal 122 und in die Stammmischungskam mer 71 zu fließen. Das Ventil 126 zur Stammmischungskammer 71 wird dann geschlossen. Die Stammmischungskammer enthält PCR-Reagenzien und Fluoreszenzsonden, die sich mit dem neutralisierten Lysereagens und der Nucleinsäure vermischen, um ein Reaktionsgemisch zu bilden.
  • Im nächsten Schritt wird der Kanal 122 durch Öffnen des Ventils 114 zur Abfallkammer 68 und Anlegen eines Drucks von 15 psi (103 kPa) etwa 1 s lang durch die Drucköffnung 128 entleert. Im nächsten Schritt wird das in der Stammmischungskammer 71 gebildete Reaktionsgemisch wie folgt in das Reaktionsgefäß 40 befördert. Die Ventile 126, 127 und 133 werden geöffnet und ein Druck von 15 psi (103 kPa) etwa 6 s lang an die Drucköffnung 125 im oberen Bereich der Stammmischungskammer 71 angelegt, damit das Reaktionsgemisch durch den Kanal 122, das Ventil 127 und den Kanal 80 durch die Öffnung 41 in das Reaktionsgefäß 40 gelenkt wird. Das Reaktionsgemisch füllt die Kammer 42 des Gefäßes und verdrängt Luft in der Kammer, die durch den Auslasskanal 52 austritt. Die durch den Auslasskanal 52 entweichende Luft bewegt sich im Kanal 81 an der Sensorregion 130 vorbei in den Kanal 131. Aus dem Kanal 131 strömt die Luft in den Kanal 132, durch das Ventil 133 und den Kanal 134 und entweicht durch den Entlüftungs-Austritt 36 aus der Kartusche. Wenn ein Volumen des Reaktionsgemisches, das zum Füllen der Kammer 42 ausreicht, in das Gefäß geflossen ist, tritt überschüssiges Reaktionsgemisch durch den Auslasskanal 52 aus dem Gefäß aus. Das überschüssige Reaktionsgemisch fließt in den Kanal 81 und wird in der Sensorregion optisch detektiert. Wenn das Reaktionsgemisch detektiert wird, wird das Ventil 133 geschlossen, während Druck aus der Drucköffnung 125 zur Druckbeaufschlagung der Reaktionskammer 42 angelegt wird.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 23, dehnt die Druckbeaufschlagung der Kammer 42 die biegsamen Haupt-Wände 48 des Gefäßes aus. Insbesondere zwingt der Druck die Hauptwände 48 dazu, die Innenflächen der Platten 190A, 190B zu berühren und sich an sie anzupassen. Dies gewährleistet optimale Wärmeleitung zwischen den Platten 190A, 190B und dem Reaktionsgemisch in der Kammer 42. Es ist hierin vorzuziehen, die Kammer 42 einem Druck im Bereich von 2 bis 30 psi (14 bis 207 kPa) über Umgebungsdruck auszusetzen. Dieser Bereich ist hierin vorzuziehen, da 2 psi (14 kPa) im Allgemeinen ausreicht, um Übereinstimmung zwischen den Wänden 48 und den Oberflächen der Platten 190A, 190B sicherzustellen, während Drücke über 30 psi (207 kPa) das Aufplatzen der Wände 48, die Verformung des Rahmens 46 oder der Platten 190A, 190B oder das Aufbrechen der hydrophoben Membranen in der Kartusche bewirken können. Noch bevorzugter wird die Kammer 42 einem Druck im Bereich von 8 bis 15 psi (55 bis 103 kPa) über Umgebungsdruck ausgesetzt. Dieser Bereich ist bevorzugter, da er zuverlässig innerhalb der oben beschriebenen praktikablen Grenzwerte liegt. Wenn die Kammer 42 unter Druck gesetzt wird, wird das Reaktionsgemisch im Gefäß 40 thermisch verarbeitet und optisch kontrolliert, um die Abwesenheit oder Gegenwart eines Zielanalyten im Gemisch festzustellen.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 35 wird das Reaktionsgemisch zwischen den Platten 190A, 190B unter Einsatz von proportional-integral-derivativer (PID) Steuerung mittels Zieltemperaturen und Rückkopplungssignalen aus den Temperatursensoren 192A, 192B thermisch verarbeitet. Die Proportionierung kann entweder durch Variieren des Verhältnisses zwischen „Ein"- und „Aus"-Zeit oder vorzugsweise mit proportionalen analogen Ausgängen erfolgen, die zu einer Senkung der Durchschnittsleistung führen, die entweder den Heizelementen auf den Platten 190A, 190B oder dem Gebläse 212 zugeführt wird, wenn die Ist-Temperatur der Platten 190A, 190B an die erwünschte Soll-Temperatur herankommt. Die PID-Steuerung kombiniert den proportionalen Modus mit einer automatischen Rückstellfunktion (das Abweichungssignal wird in Bezug auf die Zeit integriert) und Geschwindigkeitswirkung (Summenbildung des integralen und Abweichungssignals zur Verlagerung des proportionalen Bands). Die Standard-PIC-Steuerung ist auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und muss hierin nicht weiter beschrieben werden. Alternativ dazu kann das Reaktionsgemisch mittels einer modifizierten Version der PID-Steuerung thermisch verarbeitet werden; siehe WO 99/48608 (Anmeldungsnummer PCT/US99/06628).
  • Wenn das Reaktionsgemisch zwischen den Heizplatten 190A, 190B thermisch zykliert wird, um eine oder mehrere Ziel-Nucleinsäuresequenzen im Gemisch zu amplifizieren, wird das Gemisch optisch kontrolliert, wobei dies vorzugsweise am niedrigsten Temperaturpunkt in jedem Zyklus erfolgt. Die optische Abfrage umfasst die sequenzielle Aktivierung jeder LED 200, um unterschiedliche fluoreszierend markierte Analyten im Gemisch anzuregen, und das Detektieren des aus der Kammer 42 emittierten Lichts (Fluoreszenzausgang) mittels der Detektoren 198. Wiederum Bezug nehmend auf 22 werden die Anregungsstrahlen durch die optisch durchlässige Seitenwand 57A vorzugsweise in die Kammer 42 übertragen, während die fluoreszierende Emission durch die Seitenwand 57B hindurch detektiert wird.
  • Ein Vorteil der Kartusche der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie die Trennung von intrazellulärem Material aus einem relativ großen Fluidprobenvolumen, z.B. von mehreren ml oder mehr, von der Probe sowie die Einengung in ein viel kleineres Reaktionsfluidvolumen von z.B. 100 μl oder weniger ermöglicht. Die Kartusche ermöglicht außerordentliche Konzentrationsfaktoren durch wirkungsvolles Extrahieren von Material aus ml-Mengen an Fluidprobe. Insbesondere besitzt die Probenkammer 65 ein Fassungsvermögen im Bereich von 100 μl bis 12 ml. Noch bevorzugter weist die Probenkammer 65 ein Fassungsvermögen von zumindest 1 ml auf. Die Untergrenze von 1 ml ist vorzuziehen, da zumindest 1 ml Probe analysiert werden sollte, um in niedriger Konzentration vorliegende Analyten wie z.B. Nucleinsäure zu analysieren. Die Obergrenze von 12 ml ist vorzuziehen, da ein Probenvolumen von mehr als 12 ml eine viel größere Kartusche erfordern und wahrscheinlich den Filterstapel verstopfen würde. In der hierin bevorzugten Ausführungsform besitzt die Probenkammer ein Fassungsvermögen von 5,5 ml, um 5 ml Probe zu halten.
  • Die Waschkammer 66 besitzt ein Fassungsvermögen, das proportional zum Volumen der Lysekammer 86 ist. Insbesondere hält die Waschkammer 66 vorzugsweise ein Waschlösungsvolumen, das zumindest das Ein- bis Zweifache des Volumens der Lysekammer 86 ist, um zu gewährleisten, das genug Waschlösung vorliegt, um PCR-Inhibitoren und Bruchstücke aus der Kammer 86 zu waschen. In der hierin bevorzugten Ausführungsform beträgt das Volumen der Lysekammer 86 etwa 0,5 ml und das Volumen der Waschkammer 66 2,5 ml, um 2 ml Waschlösung zu halten. Das Lysekammervolumen von 0,5 ml ist ein Kompromiss zwischen einer Größe, die groß genug ist, um die Verstopfung des Filterstapels 87 zu verhindern, und einer Größe, die klein genug ist, um Analyt zwecks verbesserter Amplifikation und Detektion in ein kleines Volumen einzuengen.
  • Die Reagenskammer 67 hält vorzugsweise ein Volumen an Lysereagens, das zumindest das Ein- bis Zweifache des Volumens der Lysekammer 86 ist, so dass ausreichend Lysereagens vorliegt, um die Kammer unter Druck zu setzen und Nucleinsäure aus der Kammer zu eluieren. In der hierin bevorzugten Ausführungsform besitzt die Kammer 67 ein Fassungsvermögen von 1,5 ml, um etwa 1 bis 1,5 ml Lysereagens zu halten. Die Abfallkammer 68 besitzt ein Fassungsvermögen, das ausreicht, um die Probe, die Waschlösung und unverbrauchtes Lysereagens zu halten. Die Abfallkammer 68 ist in der bevorzugten Ausführungsform mit einem Fassungsvermögen von 9,5 ml dimensioniert.
  • Die Größe der Neutralisationskammer 70 hängt vom Volumen der Lysekammer 86 ab, da der Neutralisator in der Kammer 70 das Volumen des die Lysekammer 86 füllenden Lysereagens neutralisiert. Es ist hierin vorzuziehen, dass die Lysekammer ein Volumen von 0,5 ml besitzt, so dass die Kammer 70 ein Fassungsvermögen von 1,0 ml aufweist, um etwa 0,5 ml Neutralisator zu halten, der mit 0,5 ml Lysereagens und eluiertem Analyt vermischt ist. Das Fassungsvermögen der Stammmischungskammer 71 sollte ausreichend sein, um ein Reaktionsgemisch zu erzeugen, das das Gefäß 40 und die zum Gefäß führenden Kanäle 122, 127 füllt. In der hierin bevorzugten Ausführungsform besitzt die Stammmischungskammer ein Fassungsvermögen von 200 μl zum Halten einer Anfangslast von 100 μl Stammmischung, der 100 μl neutralisierter Lysereagens und eluierter Analyt zugesetzt werden, um das Reaktionsgemisch zu bilden.
  • Die Flusskanäle in der Kartusche sind im Allgemeinen D-förmig im Querschnitt (wobei die Dichtung 63 die flache Seite des Kanals bildet) und besitzen vorzugsweise eine Breite bzw. einen Durchmesser im Bereich von 1/64 bis 1/8 Zoll (0,4–3,2 mm), noch bevorzugter im Bereich von 1/32 bis 1/16 Zoll (0,8–1,6 mm). Diese Bereiche sind hierin vorzuziehen, um zu enge Kanäle (die den Fluss einschränken) und zu breite Kanäle (die ungenutzte Flüssigkeitsvolumen im Flussweg bewirken) zu vermeiden.
  • Es sind in alternativen Ausführungsformen zahlreiche Modifikationen der Struktur und Funktionsweise der Kartusche und des Instruments denkbar. Beispielsweise können – obwohl Amplifikation durch PCR hierin vorzuziehen ist – die Kartusche und das Instrument dazu dienen, Nucleinsäuresequenzen unter Anwendung jedes beliebigen Amplifikationsverfahrens zu amplifizieren; Beispiele dafür sind thermische Zyklier-Amplifikationsverfahren und isothermische Amplifikatinverfahren. Geeignete thermische Zyklierverfahren sind u.a. Polymerase-Kettenreaktion (PCR; US-Patente 4. 683.202, 4.683.195 und 4.965.188); Revertase-PCR (RT-PCR); DNA-Ligase-Kettenreaktion (LCR; WO 89/09835); und Transkriptions-basierte Amplifikation (D.Y. Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173–1177). Geeignete isothermische Amplifikationsverfahren, die sich zur Durchführung der vorliegenden Erfindung eignen, sind u.a. „Rolling-Circle-Amplifikation", die Strangverlagerungs-Amplifikation (SDA; Walker et al., 1992, Prob. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392–396); Q-β-Replicase (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6, 1197–1202); Nucleinsäurebasierte Sequenzamplifikation (NASBA; R. Sooknanan und L. Malek, 1995, Bio/Technology 13, 563–565); und die sich selbst unterhaltende („self-sustained") Sequenzreplikation (3SR; Gutatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874–1878).
  • Außerdem können die Kartusche und das Instrument dazu dienen, andere chemische Reaktionen als die Nucleinsäure-Amplifikation durchzuführen. Obwohl Fluoreszenzanregung und Emissionsdetektion vorzuziehen sind, können optische Detektionsverfahren, wie sie z.B. in direkter Absorption und/oder Übertragung mit axialen Geometrien zum Tragen kommen, dazu dienen, Analyt in der Kartusche zu detektieren. Ein weiteres mögliches Detektionsverfahren ist die Zeitverfalls-Fluoreszenz. Außerdem ist die Kartusche nicht auf Detektion auf der Grundlage fluoreszierender Marker beschränkt. Beispielsweise kann die Detektion auf phosphorisierenden Mar kern, chemilumineszierenden Markern oder elektrochemilumineszierenden Markern basiert sein.
  • Eine Fluidprobe kann auf unterschiedliche Weise – manuell oder automatisch – in die Kartusche eingebracht werden. Im Fall der manuellen Zugabe kann ein gemessenes Materialvolumen durch eine Einlassöffnung in einen Aufnahmebereich der Kartusche eingebracht und eine Verschlusskappe dann über die Öffnung gesetzt werden. Alternativ dazu kann eine größere Menge an Probenmaterial als für die Analyse erforderlich der Kartusche zugesetzt werden, wobei Mechanismen innerhalb der Kartusche die genaue Messung und Dosierung der für die jeweilige Arbeitsvorschrift notwendigen Probe durchführen können. Es kann wünschenswert sein, bestimmte Proben wie z.B. Gewebebiopsie-Material, Boden, Fäzes, Exudate und andere komplexe Materialien in eine andere bzw. zusätzliche Vorrichtung zu füllen, die dann in die Kartusche eingesetzt wird. Beispielsweise kann ein Gewebestück in das Lumen eines zusätzlichen Geräts gelegt werden, das als Verschlusskappe für die Einlassöffnung der Kartusche fungiert. Wenn die Verschlusskappe in die Öffnung gedrückt wird, wird das Gewebe durch ein Gitternetz gezwängt, das es schneidet oder in anderer Weise teilt.
  • Für die automatische Probenzufuhr kommen zusätzliche Konstruktionsmerkmale der Kartusche zum Tragen, die in vielen Fällen das direkte Einbringen der Probe in die Kartusche vorsehen. Bei bestimmten Proben, die z.B. für die Bedienperson oder die Umgebung eine Gefahr darstellen, z.B. Human-Retrovirus-Erreger, kann die Übertragung der Probe in die Kartusche mit Risken verbunden sein. Somit kann in einer Ausführungsform eine Spritze in der Vorrichtung vorhanden sein, um ein Mittel für die Beförderung externer Fluidproben direkt in die Kartusche vorzusehen. Alternativ dazu kann eine Venenpunktionsnadel und ein evakuiertes Blutröhrchen an der Kartusche befestigt sein, um eine Anordnung zu bilden, die zum Ziehen einer Blutprobe dient. Nach dem Ziehen der Probe werden das Röhrchen und die Nadel entfernt und verworfen und die Kartusche zwecks Verarbeitung in die Kartusche eingesetzt. Der Vorteil dieser Vorgangsweise besteht darin, dass die Bedienperson oder die Umgebung nicht in Kontakt mit Erregern kommt.
  • Die Einlassöffnung kann unter Berücksichtigung entsprechender Humanfaktoren in Abhängigkeit von der Art der jeweils beabsichtigten Probe ausgebildet sein. Beispielsweise können Atmungsproben aus den unteren Atemwegen in Form von durch Husten ausgeworfenem Schleim oder in Form von Abstrich-, Tupfer- oder Bürstenproben aus dem hinteren Rachen- oder Nasenlochbereich gezogen werden. Im ersteren Fall kann die Einlassöffnung ausgebildet sein, um dem Patienten das direkte Husten in die Kartusche zu ermöglichen oder das Spucken der Schleimprobe in die Kartusche zu erleichtern. Im Fall von Abstrich-, Tupfer- oder Bürstenproben wird die Probe in die Einlassöffnung eingebracht, wo Konstruktionsmerkmale der Öffnung und des Verschlusses das Abbrechen und Zurückhalten des Endes des Tupfers oder der Bürste im Kartuschenaufnahmebereich erleichtern.
  • In einer anderen Ausführungsform enthält die Kartusche Einlass- und Auslassröhrchen, die in einem Probenpool von sehr großem Volumen angeordnet sein können, z.B. in einem fließenden Wasserstrom, so dass das Probenmaterial durch die Kartusche fließt. Alternativ dazu kann ein hydrophiles Dochtmaterial als interaktive Region dienen, so dass die gesamte Kartusche direkt in die Probe eingetaucht werden kann und eine ausreichende Probenmenge in das Dochtmaterial absorbiert wird. Die Kartusche wird dann entfernt und kann in das Labor befördert oder direkt mithilfe eines tragbaren Instruments analysiert werden. In einer anderen Ausführungsform können Schläuche so verwendet werden, dass ein Ende des Schlauches in direkter Kommunikation mit der Kartusche steht, um eine Fluidgrenzfläche mit zumindest einem interaktiven Bereich zu bilden, und das andere Ende gegenüber der Umgebung geöffnet ist, um die Probe aufnehmen zu können. Der Schlauch kann dann in eine Probe eingetaucht werden und als Ansaugvorrichtung dienen. Die Kartusche selbst kann auch als Vorrichtung zum Ziehen der Probe verwendet werden, wodurch der Aufwand reduziert und die Praktikabilität gesteigert wird. Im Fall von Proben, die Gegenstand von Rechtstreitigkeiten oder kriminalpolizeilichen Untersuchungen sind, ist die direkte Aufnahme des Testmaterials in der FluidKartusche von Vorteil, da so die Lückenlosigkeit der gesamten Beweiskette gegeben ist.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 9 können Reagenzien vor der Verwendung exogen in die Kartusche eingebracht werden, z.B. durch dichtbare Öffnungen in der Reagenskammer 67, Neutralisatorkammer 70 und Stammmischungskammer 71. Alternativ dazu können die Reagenzien während der Herstellung in die Kartusche eingebracht werden, z.B. als wässrige Lösungen oder getrocknete Reagenzien, die Rekonstitution erfordern. Das jeweilige Format wird in Abhängigkeit von einer Vielzahl an Parametern ausgewählt, z.B. ob die Wechselwirkung Lösungs-Phase oder Feststoff-Phase ist; weitere Parameter sind die inhärente thermische Stabilität des Reagens, die Geschwindigkeit der Rekonstitution und die Reaktionskinetik. Reagenzien, die Verbindungen enthalten, die in Lösung thermisch instabil sind, können durch Trocknen stabilisiert werden, wobei hier Techniken wie etwa Lyophilisierung zum Einsatz kommen. Additive wie z.B. einfache Alkoholzucker, Methylcellulose und Füllproteine können dem Reagens vor dem Trocknen zugesetzt werden, um die Stabilität oder Rekonstituierbarkeit zu erhöhen.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 21 erfordert das Reaktionsgefäß 40 keine zwei biegsamen Lagen, die gegenüber liegende Hauptwände 48 der Reaktionskammer 42 bilden. Beispielsweise besitzt in einer alternativen Ausführungsform das Gefäß 40 nur eine flexible Lage, die eine Hauptwand der Kammer bildet. Der starre Rahmen 46 definiert die andere Hauptwand der Kammer sowie die Seitenwände der Kammer. In dieser Ausführungsform sollte die durch den Rahmen 46 gebildete Hauptwand eine Mindestdicke von etwa 0,05 Zoll (1,25 mm) aufweisen, die typischerweise die in der Praxis vorgesehene Mindestdicke für das Spritzgussformen ist, während die biegsame Lage auch nur 0,0005 Zoll (0,0125 mm) dick sein kann. Der Vorteil dieser Ausführungsform liegt darin, dass die Fertigung des Reaktionsgefäßes 40 vereinfacht wird und daher weniger kostspielig ist, da nur eine flexible Lage am Rahmen 46 zu befestigen ist. Der Nachteil besteht darin, dass die Heiz- und Kühlraten des Reaktionsgemisches wahrscheinlich niedriger sind, da die durch den Rahmen 46 gebildete Hauptwand vermutlich keine so hohe Wärmeübertragungsrate ermöglicht wie die dünne, biegsame Lage.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 28 erfordert der Wärmetauschermodul 147 nur eine Wärmefläche für die Kontaktaufnahme mit einer biegsamen Wand des Reaktionsgefäßes 40 und nur ein thermisches Element für das Erwärmen und/oder Abkühlen der Wärmefläche. Der Vorteil der Verwendung einer Wärmefläche und eines thermischen Elements liegt darin, dass die Vorrichtung kostengünstiger erzeugt werden kann. Der Nachteil besteht darin, dass die Heiz- und Kühlraten wahrscheinlich etwa zweimal so langsam sind. Obwohl es hierin nicht vorzuziehen ist, dass die Wärmeflächen durch wärmeleitende Platten 190 gebildet sind, kann jede Wärmefläche aus jeder beliebigen steifen Struktur mit einer Kontaktfläche für den Kontakt mit einer Wand des Gefäßes 40 bestehen. Die Wärmefläche umfasst vorzugsweise ein Material mit hoher Wärmeleitfähigkeit wie z.B. Keramik oder Metall. Außerdem kann die Wärmefläche die Oberfläche des thermischen Elements selbst umfassen. Beispielsweise kann die Wärmefläche die Oberfläche eines thermoelektrischen Geräts sein, das die Wand zwecks Erwärmen und/oder Abkühlen der Kammer kontaktiert.
  • Es ist hierin vorzuziehen, den Wandler in das Instrument 140 einzubauen. In einer anderen Ausführungsform jedoch kann der Wandler in die Kartusche eingebaut sein. Beispielsweise kann eine piezoelektrische Scheibe in die Kartusche eingebaut sein, um die Lysekammer einer Ultraschallbehandlung zu unterziehen. Alternativ dazu kann ein Lautsprecher oder eine elektromagnetische Spulenvorrichtung in die Kartusche eingebaut sein. In diesen Ausführungsformen enthält die Kartusche zweckmäßige elektrische Verbinder zur Verbindung des Wandlers mit einer Stromversorgung. In Ausführungsformen, in denen der Wandler in die Kartusche eingebaut ist, sollte der Wandler daran gehindert werden, die Fluidprobe direkt zu kontaktiert; z.B. sollte der Wandler laminiert oder von der Probe mittels einer Kammerwand getrennt sein. Die Lyse der Zellen oder Viren kann mittels eines Heizelements anstelle von oder in Kombination mit einem Wandler erfolgen. Das Heizelement kann ein Widerstandheizelement sein, das Teil der Kartusche ist, oder es kann in das die Kartusche aufnehmende Instrument eingebaut sein. In dieser Ausführungsform werden die Zellen oder Viren durch Heizen der Lysekammer auf eine hohe Temperatur (z.B. 95°C) zwecks Aufbrechen der Zellwände aufgebrochen.
  • 3646 zeigen eine weitere Vorrichtung 350 zum Aufbrechen von Zellen oder Viren gemäß der vorliegenden Erfindung. 36 ist eine isometrische Ansicht der Vorrichtung 350, und 37 ist eine Querschnittsansicht der Vorrichtung 350. Wie aus 3637 ersichtlich, enthält die Vorrichtung 350 eine Kartusche bzw. ein Behältnis 358 mit einer Kammer 367 zu Halten der Zellen oder Viren. Das Behältnis besitzt eine biegsame Wand 440, die die Kammer 367 definiert. In dieser Ausführungsform ist die biegsame Wand 440 die untere Wand der Kammer 367. Die biegsame Wand 440 ist vorzugsweise eine Lage oder ein Film aus polymerem Material (z.B. ein Polypropylenfilm), und die Wand 440 weist vorzugsweise eine Dicke im Bereich von 0,025 bis 0,1 mm auf. Die Vorrichtung 350 enthält auch einen Wandler 314, z.B. ein Ultraschallhorn, um eine Außenfläche der biegsamen Wand 440 zu kontaktieren (d.h. eine Oberfläche der Wand 440, die außerhalb der Kammer 367 liegt). Der Wandler 314 sollte zu Schwingungsbewegung fähig sein, die ausreicht, um Druckimpulse in der Kammer 367 zu erzeugen. Geeignete Wandler sind Ultraschall-, piezoelektrische, magnetostriktive oder elektrostatische Wandler. Der Wandler kann auch eine elektromagnetische Vorrichtung mit einer Wickelspule sein, z.B. ein Schwingspulenmotor oder ein Solenoidgerät.
  • Die Vorrichtung 350 enthält überdies eine Stützstruktur 352 zum Halten des Behältnisses 358 und des Wandlers 314 gegen einander, so dass der Wandler 314 die Wand 440 der Kammer 367 berührt, und zum Anlegen einer im Wesentlichen konstanten Kraft an das Behältnis 358 oder an den Wandler 314, um den Wandler 314 und die Wand 440 der Kammer aneinander zu drücken. Die Stützstruktur 352 enthält eine Basisstruktur 354 mit einem Ständer 356. Der Wandler 314 ist mittels einer Führung 364 gleitend an der Basisstruktur 354 montiert. Die Führung 364 ist entweder einstückig mit der Basisstruktur 354 ausgebildet oder fix an der Basisstruktur befestigt. Die Stützstruktur 352 enthält auch eine Halterung 360, die an der Basisstruktur 354 befestigt ist und zum Befestigen des Behältnisses 358 dient. Die Halterung 360 verfügt über einen U-förmigen unteren Abschnitt, der Zugriff auf die biegsame Wand 440 der Kammer 367 gewährt. Die Führung 364 und die Halterung 360 sind angeordnet, um den Wandler 314 bzw. das Behältnis 358 solcherart zu befestigen, dass die Außenfläche der Wand 440 den Wandler 314 berührt. Die Stützstruktur 352 enthält auch eine obere Festhaltevorrichtung 362 für das Behältnis 358. Die Festhaltevorrichtung 362 ist U-förmig ausgestaltet, um Zugriff auf eine Austrittsöffnung 444 im Behältnis 358 zu ermöglichen.
  • Die Stützstruktur 352 besitzt außerdem einen elastischen Körper, z.B. eine Feder 366, um eine Kraft an den Wandler 314 anzulegen und ihn gegen die Wand 440 zu drücken. Wenn der Wandler 314 mit der Wand 440 in Kontakt steht, ist die durch die Feder 366 angelegte Kraft konstant und sorgt für dauerhafte Kopplung des Wandlers 314 an der Wand 440. Die Feder 366 ist zwischen einer Federführung 372 und der Basis eines Kupplungselements 368 positioniert, das den unteren Teil des Wandlers 314 stützt. Wie dies aus 36 zu sehen ist, besitzt das Kupplungselement 370 vorzugsweise ein Fenster 370, durch das das nicht gezeigte Stromkabel des Wandlers 314 geführt werden kann. Bolzen oder Schrauben 376 halten die Federführung 372 in Justiernuten 374, die in der Basisstruktur 354 ausgebildet sind. Die Größenordnung der durch die Feder 366 angelegten Kraft kann durch Änderung der Vorlast der Feder eingestellt werden. Um die Vorlast auf der Feder 366 einzustellen, werden die die Federführung 372 haltenden Bolzen 376 gelockert, die Führung 372 wird auf eine neue Position bewegt, und die Bolzen 376 werden neu angezogen, um die Führung 372 an der neuen Position zu halten. Sobald die Vorlast auf der Feder 366 justiert ist, um für zweckmäßige Kopplungskraft zwischen dem Wandler 314 und der Wand 440 zu sorgen, ist es wünschenswert, die Vorlast von einer Nutzung der Vorrichtung 350 bis zur nächsten konstant zu halten, so dass schlüssige Vergleiche zwischen unterschiedlichen durch die Vorrichtung aufgebrochenen Proben gezogen werden können.
  • Die Größenordnung der durch die Feder 366 angelegten Kraft, um den Wandler 314 und die Wand 440 aneinander zu drücken, ist wichtig, um einen gleichmäßigen und konstanten Energietransfer zwischen dem Wandler 314 und der Kammer 367 zu erreichen. Wenn die Kraft zu gering ist, wird der Wandler 314 nur schwach gegen die Wand 440 gehalten, was zu schlechter Übersetzung der Schwingungsbewegung vom Wandler 314 auf die Wand 440 sorgt. Wenn die Kraft zu groß ist, kann es während der Schallbehandlung zur Beschädigung des Behältnisses 358 oder der Wand 440 kommen. Eine dazwischen liegende Kraft bewirkt eine überaus konsistente und reproduzierbare Übertragung der Schwingungsbewegung vom Wandler 314 auf die Wand 440. Es ist hierin vorzuziehen, dass die Feder 366 eine Kraft im Bereich von 2 bis 5 Pfund (9 bis 22 N) anlegt.
  • 38 ist eine Explosionsansicht des Behältnisses 358, und 39 zeigt das montierte Behältnis 358. Wie aus 3839 ersichtlich, besitzt das Behältnis 358 einen Körper, der aus einem oberen Stück 448, einem mittleren Stück 450 und einem unteren Stück 452 besteht. Das mittlere Stück 450 definiert eine in die Kammer 367 führende Einlassöffnung 442, und das obere Stück 448 definiert eine Auslassöffnung 444 zur Kammer. Die Öffnungen 442, 444 sind positioniert, um kontinuierlichen Fluss einer Fluidprobe durch die Kammer 367 zu bewirken. Die biegsame Wand 440 wird mittels der Dichtungen 453, 454 zwischen dem mittleren und dem unteren Stück 450, 452 gehalten. Alternativ dazu kann die biegsame Wand 440 einfach mit dem mittleren Stück 450 heißversiegelt sein, so dass das untere Stück 452 und die Dichtungen 453, 454 entfallen.
  • Das Behältnis 358 weist überdies einen Filterstapel 446 in der Kammer 367 auf, um Probenkomponenten (z.B. Zielzellen oder Zielviren) einzufangen, wenn die Probe durch die Kammer 367 fließt. Der Filterstapel umfasst (von unten nach oben in 3839) eine Dichtung 456, einen ersten Filter 458, eine Dichtung 460, einen zweiten Filter 464 mit kleinerer durchschnittlicher Porengröße als der erste Filter 458 und eine Dichtung 466. Der Filterstapel wird zwischen dem oberen und dem mittleren Stück 448, 450 des Behältnisses 358 festgehalten. Der Filterstapel enthält überdies Perlen 462, die sich zwischen dem ersten und dem zweiten Filter 458, 464 befinden. Die Dichtung 460 beabstandet den ersten Filter 458 vom zweiten Filter 464. Die Dichtung 460 sollte dick genug sein, damit sich die Perlen ungehindert im Raum zwischen den Filtern 458, 464 bewegen können. Eine durch die Kammer 367 strömende Fluidprobe fließt zunächst durch den Filter 458 und dann durch den Filter 466. Nach dem Fließen durch den Filterstapel strömt die Probe entlang der Flussrippen 468 (38) im Abschnitt des oberen Stücks 448, das den oberen Teil der Kammer definiert, und durch die Auslassöffnung 444 (39).
  • Der Filterstapel kann Zellen oder Viren einfangen, während eine Fluidprobe durch die Kammer 367 fließt, ohne dass es dabei zu Verstopfungen kommt. Der erste Filter 458 (mit der größten Porengröße) filtert grobes Material wie z.B. Salzkristalle, Zellbruchstücke, Haare, Gewebe usw. Der zweite Filter 464 (mit kleinerer Porengröße) fängt Zielzellen oder Zielviren in der Fluidprobe ein. Die durchschnittliche Porengröße des ersten Filters 458 ist ausgewählt, um klein genug zu sein, damit er grobes Material (z.B. Salzkristalle, Zellbruchstücke, Haare, Gewebe) aus der Fluidprobe filtern kann, aber auch um groß genug zu sein, damit das Passieren der Zielzellen oder Zielviren ermöglicht wird. Im Allgemeinen sollte die durchschnittliche Porengröße des ersten Filters 458 im Bereich von etwa 2 bis 25 μm liegen, wobei die hierin bevorzugte Porengröße etwa 5 μm beträgt. Die durchschnittliche Porengröße des zweiten Filters 464 ist ausgewählt, um etwas kleiner als die durchschnittliche Größe der einzufangenden Zielzellen oder Zielviren zu sein; sie liegt typischerweise im Bereich von 0,2 bis 5 μm.
  • Die Perlen 462 eignen sich zum Aufbrechen der eingefangenen Zellen oder Viren, um das intrazelluläre Material (z.B. Nucleinsäure) daraus freizusetzen. Die Bewegung der Perlen 462 bricht die auf dem Filter 464 eingefangenen Zellen oder Viren auf. Zweckmäßige Perlen für das Aufbrechen von Zellen oder Viren sind Borsilicatglas-, Kalkglas-, Silica- und Polystyrolperlen. Die Perlen können porös oder nicht-porös sein und besitzen vorzugsweise einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 1 bis 200 μm. In der hierin bevorzugten Ausführungsform sind die Perlen 462 Polystyrolperlen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 100 μm.
  • Die Perlen 462 können Bindungsaffinität für Zielzellen oder Zielviren in der Fluidprobe aufweisen, um das Einfangen der Zielzellen oder Zielviren zu erleichtern. Beispielsweise können Antikörper oder bestimmte Rezeptoren auf die Oberfläche der Perlen 462 aufgetragen sein, um Zielzellen in der Probe zu binden. Außerdem kann die Kammer 367 zwei unterschiedliche Arten von Perlen aufweisen, um mit Zielzellen oder Zielviren in Wechselwirkung zu treten. Beispielsweise kann die Kammer einen ersten Satz an Perlen, die zwecks Bindung von Zielzellen oder Zielviren mit Antikörpern oder Rezeptoren beschichtet sind, und einen zweiten Satz an Perlen (gemischt mit dem ersten Satz) zum Aufbrechen der eingefangenen Zellen oder Viren enthalten. Die Perlen in der Kammer können auch Bindungsaffinität für das intrazelluläre Material (z.B. Nucleinsäure) aufweisen, das aus den aufgebrochenen Zellen oder Viren freigesetzt wird. Solche Perlen kommen für das Isolieren von Zielnucleinsäure für die anschließende Elution und Analyse in Frage. Beispielsweise kann die Kammer 367 Silicaperlen enthalten, um DNA oder Celluloseperlen mit Oligo-dT zu isolieren, um Messenger-RNA für Raumtemperatur-PCR zu isolieren. Die Kammer 367 kann auch Perlen zur Entfernung von PCR möglicherweise hemmendem unerwünschtem Material (z.B. von Proteinen oder Peptiden) oder Chemikalien (z.B. von Salzen, Metallionen oder Detergenzien) aus der Probe enthalten.
  • Um sicherzustellen, dass die Luftblasen aus der Kammer 367 entweichen können, ist es wünschenswert, das Behältnis 358 in einer Ausrichtung zu verwenden, in der Flüssigkeit (relativ zur Schwerkraft) durch die Filter 458, 464 und die Kammer 367 nach oben strömt. Das Aufwärtsströmen durch die Kammer 367 unterstützt den Fluss von Luftblasen aus der Kammer. Somit sollte die Einlassöffnung 442 für das Eintreten von Fluiden in die Kammer 367 im Allgemeinen niedriger angeordnet sein als die Auslassöffnung 444. Das Fassungsvermögen der Kammer 367 liegt üblicherweise im Bereich von 50–500 μl. Das Fassungsvermögen der Kammer 367 ist ausgewählt, um für die Einengung bzw. Konzentration von aus einer Fluidprobe abgetrenntem Analyten zu sorgen, ohne dass die Kammer so klein wäre, dass sich die Filter 458, 464 verstopfen.
  • Die den Körper des Behältnisses 358 bildenden Stücke 448, 450, 452 sind vorzugsweise geformte Polymerteile (z.B. Polypropylen, Polycarbonat, Acryle usw.). Obwohl das Formen für die Massenproduktion vorzuziehen ist, ist es auch möglich, das obere, das mittlere und das untere Stück 448, 450, 452 maschinell herzustellen. Die Stücke 448, 450, 452 können durch Schrauben oder Befestigungselemente miteinander befestigt sein. Alternativ dazu kann man mittels Ultraschallverbinden, Lösungsmittelverbinden oder Schnapppassverbinden das Behältnis 358 zusammensetzen. Ein weiteres Verfahren zur Herstellung des Behältnisses 358 ist das einstü ckige Formen des Körpers und das Heißversiegeln der biegsamen Wand 440 und der Filter 458, 464 mit dem Körper.
  • 40 zeigt ein Fluidiksystem zur Verwendung mit der hierin geoffenbarten Vorrichtung. Das System enthält eine Flasche 470 zur Aufbewahrung von Lysepuffer, eine Flasche 472 zur Aufbewahrung von Waschlösung und ein Probenbehältnis 474 zur Aufbewahrung einer Fluidprobe. Die Flaschen 470, 472 und das Probenbehältnis 474 sind mittels Schläuchen mit den Ventilöffnungen einer Spritzenpumpe 476 verbunden. Die Einlassöffnung des Behältnisses 358 ist auch mit der Spritzenpumpe 476 verbunden. Die Auslassöffnung des Behältnisses 358 ist mit der gemeinsamen Öffnung eines Verteilventils 478 verbunden. Das System enthält ferner einen Sammelschlauch 480 zur Aufnahme von aus der Probe entferntem intrazellulärem Material, ein Abfallbehältnis 482 zur Aufnahme von Abfall und eine Druckquelle wie z.B. eine Pumpe 484. Der Sammelschlauch 480, das Abfallbehältnis 482 und die Pumpe 484 sind mit jeweiligen peripheren Öffnungen des Verteilventils 478 verbunden. Ein Druckregler 486 reguliert den von der Pumpe 484 zugeführten Druck.
  • Es folgt die Beschreibung einer konkreten Arbeitsanleitung unter Bezugnahme auf 3940, um den Betrieb und die Funktionsweise des Behältnisses 358 zu erläutern. Es ist zu beachten, dass es sich hier lediglich um ein Beispiel für eine mögliche Arbeitsvorschrift handelt und dass der Schutzumfang der Erfindung keinesfalls darauf beschränkt ist. Die Spritzenpumpe 476 pumpt eine Fluidprobe aus dem Probenbehältnis 476 durch das Behältnis 358 in das Abfallbehältnis 482. Während die Fluidprobe durch die Filter in der Kammer 367 gelenkt wird, wird grobes Material durch den Filter 458 gefiltert, und Zielzellen oder Zielviren in der Probe werden durch den Filter 464 eingefangen. Die Kammer 367 kann ultraschallbehandelt werden, wenn die Probe durch die Kammer gelenkt wird, um die Verstopfung der Filter zu vermeiden. Als nächstes pumpt die Spritzenpumpe 476 Waschlösung aus der Flasche 472 durch das Behältnis 358 und in das Abfallbehältnis 482. Die Waschlösung wäscht PCR-Inhibitoren und Schmutzstoffe aus der Kammer 367.
  • Im nächsten Schritt pumpt die Spritzenpumpe 476 Lysepuffer aus der Flasche 470 in das Behältnis 358, so dass die Kammer 367 mit Flüssigkeit gefüllt ist. Der Lysepuffer sollte ein Medium sein, durch das dynamische Druckimpulse oder Druckwellen übertragen werden können. Beispielsweise kann der Lysepuffer entionisiertes Wasser zum Halten der Zellen oder Viren in Suspension oder Lösung umfassen. Alternativ dazu kann der Lysepuffer ein oder mehrere Lysemittel enthalten, um das Aufbrechen der Zellen oder Viren zu unterstützen. Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung ist jedoch, dass aggressive Lysemittel für das erfolgreiche Aufbrechen der Zellen oder Viren nicht erforderlich sind. Als nächstes wird das Verteilventil der Spritzenpumpe 476 stromauf vom Behältnis 358 geschlossen und das Verteilventil 478 geöffnet. Die Pumpe 484 setzt dann die Kammer 367 durch die Auslassöffnung 444 unter Druck – vorzugsweise mit etwa 20 psi (138 kPa) über Umgebungsdruck. Das Verteilventil 478 stromab vom Behältnis 358 wird anschließend geschlossen. Der statische Druck in der Kammer 367 wird daher auf etwa 20 psi (138 kPa) erhöht, wobei dies als Vorbereitung auf das Aufbrechen der auf dem Filter 464 eingeschlossenen Zellen oder Viren erfolgt.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 37 ist die Druckbeaufschlagung der Kammer 367 wichtig, da sie die wirksame Kopplung des Wandlers 314 an der biegsamen Wand 440 gewährleistet. Um die Zellen oder Viren in der Kammer 367 aufzubrechen, wird der Wandler 314 aktiviert (d.h. in Schwingungsbewegung versetzt). Die biegsame Wand 440 überträgt die Schwingungsbewegung des Wandlers 314 auf die Flüssigkeit in der Kammer 367, indem leichte Verbiegungen ermöglicht werden, ohne dass die Wand großen Belastungen ausgesetzt ist. Der Wandler 314 ist vorzugsweise ein Ultraschallhorn zur Ultraschallbehandlung der Kammer 367. Die Kammer 367 wird vorzugsweise 10 bis 40 s lang mit einer Frequenz im Bereich von 20 bis 60 kHz ultraschallbehandelt. Im hierein angeführten Beispiel einer Arbeitsanleitung wird die Kammer mit einer Frequenz von 40 kHz 15 s lang ultraschallbehandelt. Die Amplitude der Hornspitze liegt vorzugsweise im Bereich von 20 bis 25 μm (Spitze-Spitze-Messung).
  • Durch das Schwingen der Spitze des Wandlers 314 wird die biegsame Wand 440 mehrfach erschüttert. Der Vorwärtsimpuls (in 37 nach oben) der Spitze des Wandlers 314 drückt die Wand 440 und erzeugt einen Druckimpuls oder eine Druckwelle in der Kammer 367. Der Rückwärtsimpuls (in 37 nach unten) der Spitze des Wandlers 314 trennt diese üblicherweise von der biegsamen Wand 440, da diese sich nicht mehr mit der gleichen Frequenz wie der Wandler bewegen kann. Beim nächsten Vorwärtsimpuls erschüttert die Spitze des Wandlers 314 wieder die Wand 440 durch frontalen Aufprall, während die Spitze und die Wand rasch aufeinander zusteuern. Da sich der Wandler 314 und die Wand 440 bei schwingendem Wandler 314 trennen, ist der effektive Vorwärtsimpuls des Wandlers geringer als seine Spitze-Spitze-Amplitude. Der effektive Vorwärtsimpuls bestimmt das Ausmaß der Ultraschallbehandlung in der Kammer 367. Es ist daher wichtig, den statischen Druck in der Kammer 367 zu erhöhen, so dass beim Zurückziehen der Spitze des Wandlers 314 die biegsame Wand 440 nach außen gedrückt wird, um beim Rückwärtsimpuls auf die Spitze zu treffen. Der statische Druck in der Kammer 367 sollte ausreichen, um sicherzustellen, dass der effektive Vorwärtsimpuls des Wandlers 314 die notwendigen Druckimpulse oder Druckwellen in der Kammer erzeugt, um die Zellen aufzubrechen. Es ist hierin vorzuziehen, den statischen Druck in der Kammer 367 auf zumindest 5 psi (34 kPa) über dem Umgebungsdruck zu erhöhen; noch bevorzugter wird er auf einen Druck im Bereich von 15 bis 25 psi (103 bis 172 kPa) über Umgebungsdruck erhöht.
  • Bei jedem Vorwärtsimpuls verleiht der Wandler 314 der Flüssigkeit in der Kammer 367 Geschwindigkeit, wodurch ein Druckimpuls oder eine Druckwelle erzeugt wird, die sich rasch innerhalb der Kammer ausbreitet. Die Perlen 462 im Filterstapel 446 (38) werden durch die Druckimpulse in der Kammer 367 geschüttelt. Die Druckimpulse schleudern die Perlen in heftige Bewegung, und die Perlen brechen die Zellen oder Viren mechanisch auf, um den Analyten (z.B. Nucleinsäure) daraus freizusetzen. Wiederum Bezug nehmend auf 40 pumpt nach dem Aufbrechen der Zellen oder Viren die Spritzenpumpe 476 das freigesetzte intrazelluläre Material aus dem Behältnis 358 in den Sammelschlauch 480.
  • 41 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung, in der das Behältnis 358 eine feste Wand 488 zum Kontaktieren des Wandlers 314 besitzt. Die feste Wand 488 unterscheidet sich von der weiter oben in Zusammenhang mit 37 beschriebenen biegsamen Wand 440. Während die biegsame Wand typischerweise ein dünner Film ist, der sich unter seinem eigenen Gewicht verbiegt und seine Form nur dann bewahrt, wenn er an seinen Kanten gehalten wird, hält die feste Wand 488 ihre Form auch im ungestützten Zustand. Der Vorteil der Verwendung einer festen Wand zur Kontaktherstellung mit dem Wandler 314 besteht darin, dass es nicht notwendig ist, die Kammer 367 unter Druck zu setzen, um eine wirksame Kopplung des Wandlers 314 an der Wand 488 zu erreichen. Die elastische Rückschnellkraft der festen Wand 488 sorgt für die notwendige Kopplung des Wandlers 314 an der Wand. Allerdings ist die richtige Konstruktion der festen Wand 488 erforderlich, damit nicht die Wand durch die Schwingungsbewegungen des Wandlers 314 beschädigt wird (z.B. durch Schmelzen).
  • Insbesondere sollte die feste Wand 488 eine Eigenfrequenz aufweisen, die höher als die Schwingungsfrequenz ist, mit der der Wandler 314 betrieben wird. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis der Eigenfrequenz der Wand 488 zur Schwingungsfrequenz zumindest 2:1, noch bevorzugter 4:1. Darüber hinaus sollte die Wand 488 nicht so steif sein, dass sie die Schwingungsbewegung des Wandlers auf die Flüssigkeit in der Kammer 367 nicht übertragen kann. Es ist vorzuziehen, dass sich die Wand 488 über eine Entfernung im Bereich von 5 bis 40 μm verbiegen kann, noch bevorzugter etwa 20 μm (Spitze-Spitze), wenn der Wandler 314 eine Kraft im Bereich von 1 bis 10 Pfund (4,4 bis 44 N) an die Außenfläche der Wand 488 anlegt. Es ist noch bevorzugter, wenn sich die Wand 488 über eine Entfernung im Bereich von 5 bis 40 μm verbiegen kann, noch bevorzugter etwa 20 μm (Spitze-Spitze), wenn der Wandler 314 eine Kraft im Bereich von 2 bis 5 Pfund (9 bis 22 N) anlegt. Um diese Vorgaben zu erfüllen, ist die Wand 488 kuppelförmig und konvex in Bezug auf den Wandler 314 ausgestaltet (d.h. die Wand 488 krümmt sich nach außen hin zum Wandler). Der Vorteil der kuppelförmigen Konstruktion der Wand 488 besteht darin, dass die Kuppelform die Eigenfrequenz der Wand (im Vergleich zu einer flachen Wand) er höht, ohne dass die Wand so steif wäre, dass sie die Schwingungsbewegungen des Wandlers 314 auf die Kammer 367 nicht übertragen könnte.
  • 42 ist eine Querschnittsansicht der Wand 488. Der kuppelförmige Abschnitt 495 der Wand besitzt vorzugsweise einen Krümmungsradius R im Bereich von 6,3 bis 12,7 mm, wenn der Durchmesser D des kuppelförmigen Abschnitts etwa 11,1 mm beträgt. Noch bevorzugter besitzt der kuppelförmige Abschnitt 495 der Wand vorzugsweise einen Krümmungsradius R von etwa 9,5 mm, wenn der Durchmesser D des kuppelförmigen Abschnitts etwa 11,1 mm beträgt. Die Wand 488 enthält auch einen flachen Außenrand 497, um die Wand im Behältnis 358 festzuklemmen. Alternativ dazu kann die Wand 488 einstückig mit dem Stück 450 oder 452 (41) geformt sein. Die Dicke T der Wand liegt vorzugsweise im Bereich von 0,25 bis 1 mm. Wenn sie weniger als 0,25 mm beträgt, ist die Wand 488 möglicherweise zu schwach. Wenn die Wand eine Dicke von mehr als 1 mm aufweist, ist sie unter Umständen zu starr, um sich als Reaktion auf die Schwingungsbewegungen des Wandlers richtig zu verbiegen. In der hierin bevorzugten Ausführungsform besitzt die Wand 488 eine Dicke T von etwa 0,5 mm. Die Wand 488 ist vorzugsweise ein geformter Kunststoffteil. Geeignete Materialien für die Wand 488 sind Delrin® (Acetalharze oder Polymethylenoxid), Polypropylen oder Polycarbonat.
  • Die Wechselwirkung des Wandlers 314 mit der festen Wand 488 wird nun unter Bezugnahme auf 41 beschrieben. Vor dem Aktivieren des Wandlers werden Zielzellen oder Zielviren auf dem Filter 490 eingefangen, indem eine Fluidprobe durch die Kammer 367 gelenkt wird (z.B. unter Einsatz des in Zusammenhang mit 40 beschriebenen Fluidiksystems). Außerdem ist die Kammer 367 – so wie dies oben erläutert ist – mit einer Flüssigkeit wie z.B. Lysepuffer gefüllt. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Ausführungsformen erfordert allerdings die Kammer 367 keine Druckbeaufschlagung. Stattdessen ist es vorzuziehen, dass Umgebungsdruck in der Kammer aufrechterhalten wird. Der Wandler 314 steht mit der Außenfläche der Wand 488 in Kontakt, vorzugsweise unter Verwendung einer Stützstruktur, wie sie oben unter Bezugnahme auf 37 beschrieben ist. Insbesondere drückt eine Feder den Wandler vorzugsweise gegen die Wand 488, wobei dies mit einer Kraft im Bereich von 1 bis 10 Pfund (4,4 bis 44 N), noch bevorzugter im Bereich von 2 bis 5 Pfund (9 bis 22 N), erfolgt.
  • Um die Zellen oder Viren in der Kammer 367 aufzubrechen, wird der Wandler 314 aktiviert, d.h. in Schwingungsbewegung versetzt. Beim Schwingen der Spitze des Wandlers 314 verbiegt sich die Wand 488. Beim Vorwärtsimpuls (in 41 nach oben) drückt die Spitze des Wandlers 314 die Wand 488 und erzeugt einen Druckimpuls bzw. eine Druckwelle in der Kammer 367. Während des Rückwärtsimpulses (in 41 nach unten) bleibt die Wand 488 mit der Spitze des Wandlers 314 in Kontakt, da die Wand 488 eine Eigenfrequenz aufweist, die über der Schwingungsfrequenz des Wandlers liegt. In Ausführungsformen, in denen der Wandler ein die Kammer 367 einer Ultraschallbehandlung aussetzendes Ultraschallhorn ist, wird die Kammer 367 vorzugsweise 10 bis 40 s lang mit einer Frequenz im Bereich von 20–40 kHz ultraschallbehandelt. Im vorliegenden Beispiel für eine Arbeitsvorschrift wird die Kammer mit einer Frequenz von 40 kHz 15 s lang ultraschallbehandelt. Die Amplitude der Hornspitze liegt vorzugsweise im Bereich von 20 bis 25 μm (Spitze-Spitze-Messung), und die Eigenfrequenz der Wand 488 sollte über 40 kHz, vorzugsweise zumindest 80 kHz, noch bevorzugter zumindest 160 kHz, betragen.
  • Ein Vorteil der Verwendung der festen Grenzflächenwand 488 besteht darin, dass starke Druckabfälle in der Kammer 367 erreicht werden können, solang der statische Druck in der Kammer niedrig ist. Beispielsweise kann bei atmosphärischem Druck Kavitation (die Bildung und das Aufbrechen mikroskopischer Bläschen) in der Kammer 367 entstehen. Wenn diese Bläschen oder Hohlräume zu Resonanzgröße anwachsen, brechen sie plötzlich und heftig zusammen, wodurch es zu sehr ausgeprägten lokalen Druckveränderungen kommt. Diese Druckveränderungen setzen die Zellen oder Viren einem mechanischen Schock aus, was zu ihrem Aufbrechen führt. Das Aufbrechen der Zellen oder Viren kann auch durch jähe Druckanstiege infolge der Schwingungsbewegung des Wandlers hervorgerufen werden. Außerdem kann das Aufbrechen der Zellen oder Viren durch heftige Bewegungen der Perlen 462 in der Kammer 367 verursacht werden. Die Perlen werden durch die dynamischen Druckimpulse in der Kammer geschüttelt und brechen die Zellen oder Viren auf. In Versuchtests stellten die Anmelder fest, dass es üblicherweise notwendig ist, Perlen zu verwenden, um bestimmte Zelltypen (insbesondere Sporen) mit hochresistenten Zellwänden aufzubrechen. Andere Zelltypen wie etwa Blutzellen sind leichter aufzubrechen und können oft ohne Einsatz der Perlen 462 aufgebrochen werden.
  • Obwohl die Verwendung eines Ultraschallwandlers als bevorzugte Ausführungsform beschrieben wurde, ist zu beachten, dass verschiedene Arten von Wandlern bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung in Frage kommen. Der Wandler sollte zur Erzeugung von Druckimpulsen oder Druckwellen in der Kammer 367 fähig sein. Außerdem sollte er in der Lage sein, die Flüssigkeit in der Kammer mit hoher Geschwindigkeit zu erschüttern. Geeignete Wandler sind Ultraschall-, piezoelektrische, magnetostriktive oder elektrostatische Wandler. Der Wandler kann auch ein elektromagnetisches Gerät mit einer Wickelspule sein, z.B. ein Schwingspulenmotor oder eine Solenoidvorrichtung. Die Schwingungsfrequenz des Wandlers kann Ultraschall sein (d.h. über 20 kHz) oder unterhalb des Ultraschalls liegen (z.B. in einem Bereich von 60 bis 20.000 Hz). Der Vorteil der Verwendung hoher Frequenzen besteht darin, dass das Aufbrechen der Zellen rasch erfolgt und oft in 10 bis 20 s abgeschlossen ist. Der Nachteil liegt darin, dass Ultraschallwandler häufig teurer als einfache mechanische Vibratoren sind, z.B. ein Lautsprecher oder eine elektromagnetische Spulenvorrichtung. In einer alternativen Ausführungsform wird z.B. die feste Wand 488 in Kombination mit einem Lautsprecher oder einer elektromagnetischen Spulenvorrichtung verwendet, die mit einer Betriebsfrequenz im Bereich von 5 bis 10 kHz schwingt.
  • 43A43B zeigen eine weitere feste Wand 500 zum Kontaktieren eines erfindungsgemäßen Wandlers. Wie aus 43A ersichtlich, besitzt eine Seite der Wand 500 einen Mittelabschnitt 502 und eine Vielzahl an Versteifungsrippen 504, die sich radial aus dem Mittelabschnitt 502 erstrecken. Die Wand verfügt auch über zwischen den Rippen 504 ausgebildete Ausnehmungen 506. Wie aus 43B ersichtlich, besitzt die andere Seite der Wand 500 eine flache Oberfläche 508. 44 ist eine teilweise abgeschnittene isometrische Ansicht des Behältnisses 358 mit der Wand 500. Die Wand 500 ist vorzugsweise solcherart positioniert, dass die Seite der Wand mit der flachen Oberfläche im Inneren der Kammer 367 liegt und die Seite der Wand mit den Rippen 504 außerhalb der Kammer liegt. Die Rippen 504 sind vorteilhaft, da sie die Eigenfrequenz der Wand steigern, ohne zu bewirken, dass die Wand so steif ist, dass sie die Schwingungsbewegungen des Wandlers nicht auf die Kammer 367 übertragen kann.
  • 45 ist eine untere Draufsicht des Behältnisses 358 mit der Wand 500. Der Mittelabschnitt 502 bietet die Außenfläche der Wand 500 für das Kontaktieren eines Wandlers. Die Wechselwirkung der Wand 500 mit dem Wandler ist analog der Wechselwirkung der Wand 488 mit dem Wandler (s.o. unter Bezugnahme auf 41). Insbesondere bleibt die Wand 500 mit der Spitze des Wandlers in Kontakt, da die Wand 500 eine Eigenfrequenz aufweist, die über der Schwingungsfrequenz des Wandlers liegt. Daher ist keine Druckbeaufschlagung erforderlich, und es lässt sich Kavitation erzielen. Die unter Bezugnahme auf 4145 beschriebenen festen Wände 488, 500 können im Behältnis 358 verwendet werden, oder es können die Wände 488, 500 in einer vollständig einstückigen Kartusche verwendet werden, wie sie in 1 zu sehen ist.
  • 46 ist eine teilweise in Explosionsansicht dargestellte Abbildung eines erfindungsgemäßen Behältnisses 274 zur Aufbewahrung von aufzubrechenden Zellen oder Viren. 47 ist eine Vorderansicht des Behältnisses 274. Wie aus 4647 zu sehen, besitzt das Behältnis 274 eine Kammer 277 zur Aufbewahrung einer Flüssigkeit, die aufzubrechende Zellen oder Viren enthält. Das Behältnis besitzt einen starren Rahmen 278, der die Seitenwände 282A, 282B, 282C, 282D der Kammer 277 definiert. Der starre Rahmen 278 definiert auch eine Öffnung 276 und einen Kanal 288, der die Öffnung 276 mit der Kammer 277 verbindet. Das Behältnis weist außerdem dünne, flexible Lagen auf, die an gegenüber liegenden Seiten des starren Rahmens 278 befestigt sind, um zwei voneinander beabstandete, gegenüber liegende Hauptwände 280A, 280B der Kammer zu bilden. Die biegsamen Hauptwände 280A, 280B in 46 treten in der Explosionsansicht von 46 aus Gründen der Übersichtlichkeit aus dem starren Rahmen 278 heraus. Wenn das Behältnis 274 montiert ist, sind die Hauptwände 280A, 280B mit gegenüber liegenden Seiten des Rahmens 278 versiegelt, wie dies ausführlich weiter unten erläutert wird. Die Kammer 277 wird somit durch die beabstandeten, gegenüber liegenden Hauptwände 280A, 202B und durch die starren Seitenwände 282A, 282B, 282C, 282C, 282D die die Hauptwände miteinander verbinden, definiert.
  • Das Behältnis 274 enthält auch einen Tauchkolben 284, der nach der Zugabe der Zellen oder Viren in die Kammer 277 in den Kanal 288 eingesetzt wird. Der Tauchkolben 284 drückt Gas im Behältnis 274 zusammen, wodurch der Druck in der Kammer 277 ansteigt. Das durch den Tauchkolben 284 komprimierte Gas ist typischerweise den Kanal 288 füllende Luft. Die Druckbeaufschlagung der Kammer 277 zwingt die biegsame Wand 280A dazu, sich an die Oberfläche des Wandlers anzupassen (in 4647 nicht dargestellt), wie dies ausführlich weiter unten beschrieben ist. Der Tauchkolben 284 schließt auch die Öffnung 276 und dichtet die Kammer 277 von der das Behältnis umgebenden Umwelt ab.
  • Im Allgemeinen kann der Tauchkolben jede beliebige Vorrichtung sein, die eine Dichtung mit den Wänden des Kanals 288 herstellen und Gas im Behältnis komprimieren kann. Solche Vorrichtungen sind ohne jede Beschränkung der Allgemeinheit z.B. Kolben, Stopfen oder Stöpsel. Der Tauchkolben 284 der bevorzugten Ausführungsform enthält einen Stiel 290 und einen auf dem Stiel befindlichen Kolben 292. Wenn der Tauchkolben 284 in den Kanal 288 eingesetzt ist, stellt der Kolben 292 eine Dichtung mit den Innenwänden des Kanals her und drückt Luft im Kanal zusammen. Der Kolben 292 ist vorzugsweise eine einstückig mit dem Stiel 290 ausgebildete (z.B. geformte) Schale. Alternativ dazu kann der Kolben 292 ein am Stiel befestigtes, getrenntes elastomeres Stück sein.
  • Der Tauchkolben 284 enthält vorzugsweise auch einen Ausrichtungsring 294, der den Stiel umgibt, um den Tauchkolben 284 in koaxialer Ausrichtung mit dem Kanal 288 zu halten, wenn der Tauchkolben in den Kanal eingesetzt ist. Der Ausrichtungsring 294 ist vorzugsweise einstückig mit dem Stiel 290 ausgebildet (z.B. geformt). Der Stiel 290 kann gegebenenfalls Stützrippen 293 für die Versteifung und Festigung des Stiels enthalten. Der Tauchkolben 284 enthält auch eine am Stiel 290 befestigte Tauchkolbenkappe 296. Wie aus 47 ersichtlich, enthält die Kappe 296 einen Schnappring 297, und das Behältnis enthält eine ringförmige Ausnehmung 279 um die Öffnung 276 zur Aufnahme des Schnapprings 297. Die Kappe 296 kann gegebenenfalls einen Hebelabschnitt 298 aufweisen, der gehoben wird, um den Tauchkolben 284 aus dem Kanal 288 zu entfernen. Das Behältnis 274 kann auch Fingergreifer 287 zur manuellen Handhabung des Behältnisses aufweisen.
  • 51 ist eine isometrische Ansicht einer Vorrichtung 304 zum Aufbrechen von Zellen oder Viren. Die Vorrichtung 204 enthält einen Wandler 314, vorzugsweise ein Ultraschallhorn, um Druckimpulse in der Kammer des Behältnisses 274 zu erzeugen. Die Vorrichtung 304 besitzt überdies eine Stützstruktur 306 zum Aneinanderhalten des Wandlers 314 und des Behältnisses 274. Die Stützstruktur 306 enthält eine Basis 308 und eine erste an der Basis befestigte Halterung 310 zum Halten des äußeren Gehäuses des Wandlers 314. Die Halterung 310 weist eine Bohrung zur Aufnahme des Wandlers 314 und Schrauben oder Bolzen 312 auf, die angezogen sind, um das Außengehäuse des Horns in der Halterung festzuklemmen. Die Basis 308 kann gegebenenfalls Bolzenlöcher 320 zum Verbolzen der Stützstruktur 306 mit einer Oberfläche, z.B. einer Arbeits- oder Werkplatte, aufweisen.
  • Wie aus 52 ersichtlich, besitzt die Stützstruktur 306 auch eine Halterung 316 zum Halten des Behältnisses 274. Die Halterung 316 ist mittels einer Führung 318 gleitend an der Basis 308 montiert. Die Führung 318 kann fix an der Basis 308 befestigt oder einstückig mit dieser ausgebildet sein. Die Führung 318 weist zwei Führungsstifte 322 auf, und die Halterung 316 besitzt zwei Führungsschlitze 324 zur Aufnahme der Führungsstifte 322. Die Halterung 316 kann somit auf den Führungsstiften 322 gleiten. Wie aus der teilweise abgeschnittenen Ansicht von 53 erkennbar, ist die Halterung 316 ausgebildet, das Behältnis 274 so zu halten, dass die Außenfläche der biegsamen Wand 280A gegenüber der Spitze 326 des Wandlers 314 frei liegt. Die Führung 318 ist zweckmäßig mit dem Wandler 314 ausgerichtet, um die Halterung 316 in eine Position gleiten zu lassen, an der die Außenfläche der biegsamen Wand 280A die Spitze 326 berührt.
  • 54 ist eine isometrische Ansicht der Halterung 316. Diese besitzt einen Körper 317, in dem die Führungsschlitze 324 zur Aufnahme der Führungsstifte ausgebildet sind. Der Körper verfügt auch über eine Ausnehmung 334 zur Aufnahme des Behältnisses 274. Die Form der Ausnehmung 334 stimmt mit der Form des unteren Abschnitts des Rahmens 278 überein, so dass der Rahmen satt anliegend in die Ausnehmung 334 passt. Die Halterung 316 enthält ein Rückhalteelement 328, das mittels Schrauben oder Bolzen 330 am Körper 317 befestigt ist. Das Rückhalteelement 328 und der Körper 317 definieren einen Schlitz 332, durch den der Rahmen 278 eingesetzt wird, wenn der Rahmen 278 in die Ausnehmung 334 gesetzt wird. Das Rückhalteelement 328 hält den Rahmen 278 in der Ausnehmung. Der Körper 317 besitzt auch eine an die Ausnehmung 334 angrenzende Öffnung 336. Die Form der Öffnung 336 stimmt mit der Form der Kammer 277 überein.
  • Wie in der Querschnittsansicht von 56 zu sehen ist, befindet sich – wenn das Behältnis 274 in die Halterung 316 eingesetzt ist – die Öffnung 336 neben der biegsamen Wand 280B. Die Öffnung 336 ist somit solcherart positioniert, dass sich die biegsame Wand 280B nach außen in die Öffnung ausdehnen kann. Die Halterung 316 hält nur den Rahmen des Behältnisses 274, so dass die biegsamen Wände 280A, 280B von der Halterung nicht eingeschränkt bzw. befestigt werden. Die biegsame Wand 280A kann sich demnach ungehindert mit der Hornspitze 326 nach innen und außen bewegen, während die Schwingungsbewegung von der Spitze 326 auf die Wand 280A übertragen wird. Die biegsame Wand 280B kann sich auch ungehindert nach innen oder außen bewegen, während Druckimpulse die Kammer 277 erfassen. Dadurch kann sich die Flüssigkeit in der Kammer 277 ungehindert bewegen, während sie die dynamischen Druckimpulse aufnimmt, wodurch das Aufbrechen von Zellen in der Kammer 277 verbessert wird. Das Entlüften der Öffnung 336 erfolgt durch die im Körper der Halterung 316 ausgebildete erste und zweite Bohrung 338, 344. Ein Ende der schmäleren Bohrung 338 ist mit der Öffnung 336 verbunden, und das andere Ende ist mit der größeren Bohrung 344 verbunden. Die Bohrung 344 erstreckt sich durch den Körper der Halterung 316 hindurch, damit Gas (z.B. Luft) aus der Öffnung 336 entweichen kann. Das Entlüften verhindert, dass sich Druck in der Öffnung 336 ansammelt, wenn sich die biegsame Wand 280B in die Öffnung ausdehnt. Ein derartiger Druck würde die Bewegung der Wand 280B einschränken.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 54 besitzt das Behältnis 274 eine knollenförmige Lasche 275, die sich vom unteren Teil des Rahmens 278 ausgehend erstreckt. Die Halterung 316 besitzt im Körper 317 angrenzend an die Ausnehmung 334 ausgebildete Löcher 340. Wenn der Rahmen 278 in die Ausnehmung 334 eingesetzt ist, befindet sich die Lasche 275 zwischen den Löchern 340. Die Löcher 340 dienen der Aufnahme der Rückhaltestifte. Wie aus 55 zu sehen, verlaufen die Rückhaltestifte 342 ausgehend von der Führung 318 (aus der die Führungsstifte aus Gründen der Übersichtlichkeit in 55 entfernt sind) und sind auf gegenüber liegenden Seiten der birnenförmigen Lasche 275 positioniert, wenn sich das Behältnis 274 in den Kontakt mit der Hornspitze 326 bewegt. Der Abstand der Stifte 342 ist geringer als die Breite der Birne, so dass die Stifte 342 die Lasche 275 und somit das Behältnis 274 nach unten halten, während Ultraschallenergie vom Wandler 314 auf das Behältnis übertragen wird. Dies stellt sicher, dass sich das Behältnis 274 infolge der Bewegung der Hornspitze 326 nicht aus seiner Position hebt. Alternativ dazu kann eine Muffe oder ein anderer zweckmäßiger Rückhaltemechanismus dazu dienen, das Behältnis 274 festzuhalten.
  • Bezug nehmend auf 56 enthält die Stützstruktur 306 auch einen elastischen Körper wie z.B. eine Feder 366, um eine Kraft an die Halterung 316 anzulegen und somit die Wand 280A der Kammer 277 gegen die Hornspitze 326 zu drücken. Wenn die Wand 280A mit der Hornspitze 326 in Kontakt steht, ist die durch die Feder angelegte Kraft konstant, was für konsistente Kopplung und Kraftübertragung vom Wandler 314 auf das Behältnis 274 sorgt. Die Feder 366 ist in der Bohrung 344 positioniert. Die Halterung 316 besitzt eine Innenfläche, die die Verbindungsstelle der größeren Bohrung 344 und der schmäleren Bohrung 338 umgibt. Ein Ende der Feder 366 berührt die Innenfläche und das andere Ende einen Stab 348, der sich von der Führung 318 erstreckt. Die Feder 366 wird somit zwischen der Oberfläche der Halterung 316 und dem Stab 348 zusammengedrückt, so dass sie die Halterung 316 und demnach die biegsame Wand 280A des Behälters 274 gegen die Spitze 326 drückt.
  • Die Größenordnung der durch die Feder 366 erzeugten Kraft kann durch Ändern der Vorlast auf der Feder justiert werden. Die Stützstruktur 306 enthält einen Stab 348, der ein Ende der Feder berührt. Die Führung 318 weist eine erste Bohrung zur Aufnahme des Stabs 348 und eine zweite Bohrung zur Aufnahme einer Stellschraube 349 auf, die den Stab 348 an einer fixen Position hält. Um die Vorlast auf der Feder 366 zu justieren, wird die Schraube 349 gelockert, der Stab 348 an eine neue Position bewegt und die Schraube 349 neu angezogen, um den Stab 348 an der neuen Position zu halten. Der Stab 348 und die Stellschraube 349 bieten somit einen einfachen Mechanismus zur Einstellung der Vorlast auf der Feder 366. Sobald die Vorlast auf der Feder 366 justiert ist, um für geeignete Kopplungskraft zwischen der Wand 280A und der Hornspitze 326 zu sorgen, ist es wünschenswert, die Vorlast von einer Nutzung der Vorrichtung bis zur nächsten konstant zu halten, so dass schlüssige Vergleiche zwischen unterschiedlichen durch die Vorrichtung aufgebrochenen Proben gezogen werden können.
  • Die biegsame Wand 280A erleichtert die Übertragung von Schwingungsbewegung vom Wandler 314 auf die Kammer 277. Die Wand 280A ist ausreichend biegsam, um sich an die Oberfläche der Spitze 326 des Wandlers anzupassen, was eine zufrieden stellende Kopplung zwischen der Spitze 326 und der Wand 280A bewirkt. Die Oberfläche der Spitze 326, die die Wand 280A berührt, ist vorzugsweise planar (z.B. eben), um Leistungskopplung über die gesamte Oberfläche sicherzustellen. Alternativ dazu kann die Spitze 326 eine geringfügig gekrümmte (z.B. kugelförmige) Oberfläche für das Kontaktieren der Wand 280A aufweisen. Die gegenüber liegende Wand 280B ist vorzugsweise ausreichend biegsam, um sich nach innen und außen zu bewegen, wenn dynamische Druckimpulse in der Kammer 277 erzeugt werden. Dies ermöglicht der Flüssigkeit in der Kammer 277 mehr Bewegungsfreiheit, wenn sie die Druckimpulse aufnimmt, und verbessert somit den Betrieb und die Funktionsweise der Kammer 277.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 46 sind die Wände 280A, 280B vorzugsweise flexible Lagen oder Filme aus polymerem Material wie z.B. Polypropylen, Polyethylen, Polyester oder andere Polymere. Die Filme können entweder schichtenförmig, z.B. Laminate, oder homogen sein. Geschichtete Filme sind vorzuziehen, da sie im Allgemeinen höhere Festigkeit und strukturelle Integrität aufweisen als homogene Filme. Alternativ dazu können die Wände 280A, 280B jedes andere beliebige Material umfassen, das zu einer dünnen, biegsamen Lage geformt werden kann. Um die Flexibilität und den Energietransfer zu verbessern, liegt die Dicke jeder Wand vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 0,2 mm, noch bevorzugter im Bereich von 0,025 bis 0,1 mm. Wie oben bereits beschrieben, wird der Tauchkolben 284 in den Kanal 288 geschoben, nachdem die Zellen oder Viren der Kammer 277 zugesetzt wurden. Der Tauchkolben 284 drückt Luft im Kanal 288 zusammen, wodurch der Druck in der Kammer 277 ansteigt. Die Druckbeaufschlagung der Kammer 277 gewährleistet die wirksame Kopplung zwischen der Wand 280A und der Spitze des Wandlers 314.
  • Es ist hierin vorzuziehen, die Kammer 277 einem Druck im Bereich von 2 bis 50 psi (14 bis 344 kPa) über Umgebungsdruck auszusetzen. Dieser Bereich ist hierin vorzuziehen, da 2 psi (14 kPa) im Allgemeinen ausreicht, um die wirksame Kopplung des Wandlers 314 an der biegsamen Wand 280A zu gewährleisten, während Drücke von über 50 psi (344 kPa) möglicherweise das Aufplatzen der Wände 280A, 280B oder die Verformung des Rahmens des Behältnisses 274 bewirken. Noch bevorzugter wird die Kammer 277 einem Druck im Bereich von 8 bis 15 psi (55 bis 103 kPa) über Umgebungsdruck ausgesetzt. Dieser Bereich ist noch bevorzugter, da er zuverlässig innerhalb der oben beschriebenen praktikablen Grenzwerte liegt.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Aufbrechen von Zellen oder Viren unter Verwendung der Vorrichtung 304 wird nun unter Bezugnahme auf 4656 beschrieben. Bezug nehmend auf 50 werden Perlen 301 in die Kammer 277 des Behältnisses eingebracht, um das Aufbrechen der Zellen oder Viren zu verbessern. Im Allgemeinen können die Perlen 301 aus Glas, Kunststoff, Polystyrol, Latex, Kristallen, Metallen, Metalloxiden oder Nicht-Glas-Silicaten bestehen. Die Perlen 301 können porös oder nicht-porös sein und besitzen vorzugsweise einen Durchmesser im Bereich von 1 bis 200 μm. Noch bevorzugter sind die Perlen 301 entweder Polystyrol-Perlen, Borsilicatglas-Perlen oder Sodakalkglas-Perlen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 100 μm. Die Perlen 301 können mittels eines Trichters in die Kammer 277 eingefüllt werden. Der Trichter sollte ausreichend lang sein, um sich von der Öffnung 276 durch den Kanal 288 bis in die Kammer 277 zu erstrecken. Nach dem Einsetzen des Trichters in das Behältnis 274 werden die Perlen 301 in den Trichter gefüllt und das Behältnis 274 (z.B. gegen eine Arbeitsplatte) leicht geklopft, bis die Perlen 301 sich am Boden der Kammer 277 absetzen. Es ist vorzuziehen, dass sich der Trichter durch den Kanal 288 und in die Kammer 277 erstreckt, wenn die Perlen 301 der Kammer zugesetzt werden, um zu verhindern, dass die Perlen den Kanal verschmutzen. Die Gegenwart von Perlen im Kanal 288 würde die anschließende Hubbewegung des Tauchkolbens in den Kanal beeinträchtigen. Die Menge der in die Kammer 277 gefüllten Perlen 301 ist vorzugsweise ausreichend, um etwa 10 bis 40 % des Fassungsvermögens der Kammer zu füllen. In der hierin bevorzugten Ausführungsform besitzt z.B. die Kammer 277 ein Fassungsvermögen von etwa 100 μl, wobei 30 bis 40 mg Perlen in die Kammer eingebracht werden.
  • Nach dem Einfüllen der Perlen 301 in die Kammer 277 wird diese mit einer die aufzubrechenden Zellen oder Viren enthaltenden Flüssigkeit gefüllt. Die Kammer 277 kann mittels einer Pipette mit einer Pipettenspitze 300 (z.B. einer herkömmlichen 200 μl-Ladespitze) gefüllt werden. Alternativ dazu kann die Kammer 277 mittels einer Spritze oder einem anderen zweckmäßigen Injektionssystem befüllt werden. Die Flüssigkeit sollte ein Medium sein, durch das Druckwellen oder Druckimpulse übertragen werden können. Beispielsweise kann die Flüssigkeit entionisiertes Wasser oder Ultraschallgel zum Halten der Zellen oder Viren in Suspension oder Lösung umfassen. Alternativ dazu kann die Flüssigkeit eine die Zellen oder Viren enthaltende biologische Probe umfassen. Geeignete Proben sind Körperflüssigkeiten (z.B. Blut, Harn, Speichel, Sputum, Samenflüssigkeit, Rückenmarksflüssigkeit, Schleim usw.) oder Umweltproben wie z.B. Grund- oder Abwasser. Die Probe kann in unbehandelter Form vorliegen oder mit Verdünnern oder Puffern gemischt sein. Die Flüssigkeit oder das Gel kann auch ein oder mehrere Lysemittel enthalten, um das Aufbrechen der Zellen oder Viren zu unterstützen. Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung ist jedoch, dass aggressive Lysemittel für das erfolgreiche Aufbrechen der Zellen oder Viren nicht erforderlich sind.
  • Nach dem Befüllen des Behältnisses 274 mit der Flüssigkeit wird der Tauchkolben 284 in den Kanal 288 eingesetzt, um das Behältnis 274 abzudichten und unter Druck zu setzen. Durch das Einsetzen des Tauchkolbens 284 drückt der Kolben 292 Gas im Kanal 288 zusammen, wodurch der Druck in der Kammer 277 ansteigt, vorzugsweise auf etwa 8 bis 15 psi (55 bis 103 kPa) über Umgebungsdruck, wie dies oben beschrieben ist.
  • Bezug nehmend auf 56 wird die Halterung 316 dann von der Spitze 326 des Wandlers 314 (in Richtung des Stabs 348) weggeschoben oder weggezogen, so dass das Behältnis 274 in die Halterung eingesetzt werden kann. Das Behältnis 274 wird dann in die Halterung 316 eingebracht. Während des Einsetzens des Behältnisses 274 sollte die Halterung in einem ausreichenden Abstand von den Rückhaltestiften 342 gehalten werden, um Freiraum zwischen den Stiften 342 und der Lasche 275 zu schaffen. Nach dem Einsetzen des Behältnisses 274 in die Halterung 316 wird diese vorsichtig losgelassen, und die Feder 366 drückt die Halterung 316 entlang der Führung 318, bis die Wand 280A die Oberfläche der Hornspitze 326 berührt und sich an diese anpasst. Wenn die Wand 280A an die Hornspitze 326 gekoppelt ist, legt die Feder an die Halterung 316 und somit auch an das Behältnis 274 eine im Wesentlichen konstante Kraft an, um die Wand 280A gegen die Hornspitze 326 zu drücken. Die durch die Feder 366 erzeugte Kraft stellt eine wirksame Kopplung zwischen der Wand 280A und der Hornspitze 326 sicher, während Energie in die Kammer 277 übertragen wird. Wie aus 55 ersichtlich, gleitet – wenn sich das Behältnis 274 in den Kontakt mit der Spitze 326 bewegt – die Lasche 275 zwischen den Rückhaltestiften 342. Die Stifte 342 verhindern, dass das Behältnis als Reaktion auf die Schwingungsbewegung der Spitze 326 nach oben gleitet.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 56, werden die Zellen oder Viren in der Kammer 277 dann durch Druckimpulse und die resultierende Perlenbewegung in der Kammer 277 infolge der Schwingung der Spitze 326 gegen die biegsame Wand 280A auf gebrochen. Die Größenordnung der durch die Feder 366 erzeugten Kraft beim Zusammendrücken der Wand 280A und der Spitze 326 ist wichtig, um konsistenten Energietransfer zwischen dem Wandler 314 und der Kammer 277 zu erreichen. Wenn die Kraft zu gering ist, wird die Wand 280A nur schwach an der Spitze 326 festgehalten, was zu mangelhafter Übertragung der Schwingungsbewegung des Wandlers 314 führt. Wenn die Kraft hingegen zu groß ist, kann es während der Schallbehandlung zur Beschädigung des Behälters 274 oder der Wand 280A kommen. Eine dazwischen liegende Kraft führt zu äußerst konsistenter und reproduzierbarer Energieübertragung vom Wandler 314 auf die Kammer 277. Es ist hierin vorzuziehen, dass die Feder 366 eine Kraft im Bereich von 0,25 bis 4 Pfund (1 bis 18 N) anlegt, wobei eine Kraft von etwa 1 Pfund (4,4 N) am bevorzugtesten ist.
  • Wenn der Wandler 314 aktiviert ist, schwingt die Spitze 326, um Ultraschallenergie in die Kammer 277 zu übertragen. Es besteht eine Beziehung zwischen der Kopplungsstärke zwischen der Wand 280A und der Spitze 326 und der erwünschten Amplitude der Schwingungsbewegung der Spitze 326. Es sollte zwischen der Kopplungsstärke und der Amplitude Gleichgewicht herrschen. Im Allgemeinen erfordert eine geringe Kopplungskraft eine größere Amplitude, um das Aufbrechen der Zellen oder Viren zu bewirken, während eine größere Kopplungskraft weniger Amplitude benötigt, um das Aufbrechen zu bewirken. Im Fall des hierin bevorzugten Bereichs an Kopplungskräften (0,25 bis 4 Pfund bzw. 1 bis 18 N) sollte die Spitze-Spitze-Amplitude der Schwingungsbewegungen im Bereich von 4 bis 40 μm liegen, wobei eine bevorzugte Spitze-Spitze-Amplitude 15 μm beträgt.
  • Ultraschallwellen werden vorzugsweise mit einer Frequenz im Bereich von 20 bis 50 kHz in die Kammer 277 übertragen, wobei eine Frequenz von etwa 40 kHz vorzuziehen ist. Die Dauer der Ultraschallbehandlung der Kammer 277 liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 30 s. Dieser Bereich ist deshalb vorzuziehen, da es üblicherweise zumindest 5 s braucht, um die Zellen oder Viren in der Kammer aufzubrechen, während eine Ultraschallbehandlung der Kammer über mehr als 30 s wahrscheinlich die aus den aufgebrochenen Zellen oder Viren freigesetzte Nucleinsäure denaturiert oder schert. Umfangreiches Scheren der Nucleinsäure könnte die anschließende Amplifikation oder Detektion beeinträchtigen. Am bevorzugtesten wird die Kammer etwa 10 bis 20 s lang ultraschallbehandelt – dieser Zeitraum liegt zuverlässig innerhalb der oben angegebenen praktikablen Grenzwerte. Der optimale Zeitraum, über den eine bestimmte Zellprobe Ultraschallenergie ausgesetzt werden soll, kann empirisch festgelegt werden.
  • Nach dem Aufbrechen der Zellen oder Viren wird das Behältnis 274 aus der Halterung 316 entfernt, indem diese von der Spitze 326 weggezogen und das Behältnis aus der Halterung entnommen wird. Das Gel oder die Flüssigkeit, das bzw. die die aufgebrochenen Zellen und freigesetzte Nucleinsäure enthält, wird dann aus dem Behältnis 274 entfernt. Dies kann durch Zentrifugieren des Behältnisses 274 und Entfernen des Überstands z.B. mittels einer Pipette oder Spritze erfolgen. Alternativ dazu kann die Flüssigkeit aus dem Behältnis 274 entfernt werden, indem das Behältnis auf seine Kante gestellt und geneigt wird, bis die Perlen ausfällen. Die Perlen setzen sich üblicherweise in etwa 15 bis 20 s ab. Nach dem Setzen der Perlen wird der Tauchkolben aus dem Behältnis 274 gezogen und die Flüssigkeit mittels einer Spritze oder Pipette entfernt. Die in der Flüssigkeit enthaltene freigesetzte Nucleinsäure kann anschließend unter Anwendung auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Techniken amplifiziert und detektiert werden.
  • Ein Vorteil der Vorrichtung und des Verfahrens der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das rasche und wirksame Aufbrechen von Zellen oder Viren, inklusive harter Sporen, ohne Einsatz aggressiver Chemikalien ermöglicht wird. Außerdem bewirken die Vorrichtung und das Verfahren die äußerst konsistente und reproduzierbare Lyse von Zellen oder Viren, so dass man vergleichbare und schlüssige Ergebnisse bei mehrmaligem Gebrauch der Vorrichtung erzielt. Die Energiemenge, die von der Flüssigkeit und den Perlen in der Kammer 277 absorbiert wird, hängt von der Amplitude der Schwingungen der Spitze 326, von der Masse des Inhalts der Kammer 277, vom Druck in der Kammer 277 sowie von der Kopplungskraft zwischen der Spitze 326 und der Wand 280A ab. Alle vier dieser Parameter sollten von einer Verwendung der Vorrichtung bis zur nächsten im Wesentlichen konstant gehalten werden, um wiederholt das gleiche Ausmaß an Aufbrechen zu erzielen.
  • Es sind zahlreiche Modifikationen der in 56 gezeigten Vorrichtung möglich. Beispielsweise kann die Halterung 316 in unterschiedlicher Weise gleitend an der Basis 308 montiert sein – z.B. mittels Schienen, Rädern, Gleiten in einer Nut, Gleiten in einem Zylinder usw. Alternativ dazu kann die Halterung 316 fix an der Basis 308 befestigt und der Wandler 314 gleitend an der Basis montiert sein. In dieser Ausführungsform ist ein elastischer Körper positioniert, um eine Kraft an den Wandler 314 anzulegen (entweder direkt oder an eine das Horn haltende Halterung), damit die Hornspitze 326 und die Wand 280A zusammengedrückt werden.
  • Außerdem kann in jeder dieser Ausführungsformen der elastische Körper so positioniert sein, dass der Wandler 314 oder das Behältnis 274 zueinander geschoben oder gezogen werden. Beispielsweise kann die Feder 366 positioniert sein, um die Halterung 316 hin zur Hornspitze 326 zu ziehen oder zu schieben oder den Wandler 314 hin zur Halterung 316 zu schieben oder zu ziehen. Außerdem können mehrere elastische Körper vorgesehen sein, um Kräfte sowohl an das Behältnis 274 als auch an den Wandler 314 anzulegen, damit sie zueinander geschoben oder gezogen werden können. Alle diese Ausführungsformen fallen in den Schutzbereich der Erfindung.
  • Obwohl in 37 und 56 eine Schraubenfeder 366 zu sehen ist, ist zu beachten, dass jede Art von elastischem Körper in Frage kommt. Geeignete elastische Körper sind u.a. Schraubenfedern, Wellenfeder, Torsionsfedern, Biegefedern, Blattfedern, elliptische Federn, halbelliptische Federn, Gummifedern und atmosphärische Federn. Der elastische Körper kann auch Druckluft oder zusammengedrückter Kautschuk sein. Vorzugsweise ist der elastische Körper eine Schraubenfeder. Schraubenfedern sind vorzuziehen, da sie einfach und kostengünstig in der Vorrichtung angeordnet werden können und eine niedrige Federkonstante aufweisen. Ein Druckluftsystem kommt auch in Frage, ist aber deutlich teurer. In Ausführungsformen, in denen der elastische Körper eine Feder ist, sollte die Feder eine niedrige Federkonstante aufweisen, vorzugsweise weniger als 4 Pfund/Zoll. Eine niedrige Federkonstante minimiert den Einfluss, den Variationen in der Dicke der Kammer 277 (infolge kleiner Variationen während der Produktion, Befüllung oder Druckbeaufschlagung des Behältnisses) auf die Größenordnung der Kraft ausüben, die von der Feder aufgewendet wird, um die Wand 280A und die Hornspitze 326 aneinander zu drücken.
  • Ein weiterer Vorteil des Behältnisses 274 besteht darin, dass die Kammer 277 die Zellen oder Viren in einem dünnen Flüssigkeitsvolumen hält, das problemlos einheitlich ultraschallbehandelt werden kann. Bezug nehmend auf 4849 ist es hierin vorzuziehen, das Behältnis 274 so zu konstruieren, dass jede der Seitenwände 282A, 282B, 282C, 282D der Kammer eine Länge L im Bereich von 5 bis 20 mm besitzt, die Kammer eine Breite W im Bereich von 7 bis 30 mm besitzt und die Kammer eine Dicke T im Bereich von 0,5 bis 5 mm besitzt. Zusätzlich dazu besitzt die Kammer 277 vorzugsweise eine Breite W, die größer als ihre Dicke T ist. insbesondere ist das Verhältnis zwischen der Breite W der Kammer und ihrer Dicke T vorzugsweise zumindest 2:1. Noch bevorzugter beträgt das Verhältnis zwischen der Breite W der Kammer und ihrer Dicke T zumindest 4:1. Diese Verhältnisse sind vorzuziehen, da sie es erlauben, dass das gesamte Volumen der Kammer 277 rasch und gleichmäßig ultraschallbehandelt werden kann. Im Allgemeinen liegt das Fassungsvermögen der Kammer 277 vorzugsweise im Bereich von 0,02 bis 1 ml.
  • Wiederum Bezug nehmend auf 56 ist der Wandler 314 vorzugsweise ein Ultraschallhorn. Die Dicke der Kammer 277 (und somit der Abstand zwischen den Wänden 280A und 280B) ist vorzugsweise kleiner als die Hälfte des Durchmessers der Spitze 326 des Horns. Diese Beziehung zwischen der Dicke der Kammer 277 und dem Durchmesser der Spitze 326 gewährleistet, dass die vom Wandler 314 empfangene Ultraschallenergie im gesamten Volumen der Kammer 277 im Wesentlichen einheitlich ist. In der hierin bevorzugten Ausführungsform besitzt die Spitze 326 z.B. einen Durchmesser von 6,35 mm und die Kammer 277 eine Dicke von etwa 1,0 mm. Außerdem sollte die Hauptwand 280A etwas größer als die Oberfläche der Hornspitze 326 sein, die gegen die Wand 280A drückt. Dies ermöglicht es der biegsamen Wand 280A, sich als Reaktion auf die Schwingungsbewegung der Hornspitze 326 zu verbiegen.
  • Es folgt eine Beschreibung eines bevorzugten Verfahrens zur Herstellung des Behältnisses 274 unter Bezugnahme auf 4647. Das Behältnis 274 kann durch Formen des starren Rahmens 278 unter Anwendung bekannter Spritzgusstechniken gefertigt werden. Der Rahmen 278 wird vorzugsweise einstückig aus polymerem Material wie z.B. Polypropylen oder Polycarbonat geformt. Nach der Herstellung des Rahmens 278 werden dünne, flexible Lagen zugeschnitten und mit gegenüber liegenden Seiten des Rahmens 278 versiegelt, um die Hauptwände 282A, 282B der Kammer 277 zu bilden.
  • Die Hauptwände 282A, 282B sind vorzugsweise gegossene oder extrudierte Filme aus polymerem Material, z.B. Polypropylenfilme, die zugeschnitten und am Rahmen 278 befestigt werden, wobei hier die folgenden Verfahren zur Anwendung kommen. Ein erstes Filmstück wird über eine Seite des unteren Abschnitts des Rahmens 278 gelegt. Der Rahmen 278 enthält vorzugsweise einen Befestigungsstab 299, um die oberen Filmkante auszurichten. Der Film wird über den unteren Abschnitt des Rahmens 278 gelegt, so dass die obere Filmkante mit dem Befestigungsstab 299 ausgerichtet ist und der Film den unteren Abschnitt des Rahmens 278 unterhalb des Befestigungsstabes 299 vollständig abdeckt. Der Film sollte größer als der untere Abschnitt des Rahmens 278 sein, so dass er leicht gehalten und flach über den Rahmen gezogen werden kann. Der Film wird dann zugeschnitten, um mit der Kontur des Rahmens übereinzustimmen, indem am Rahmen jener Abschnitt des Films festgeklemmt wird, der den Rahmen bedeckt, und die Filmabschnitte abgeschnitten werden, die über den Umfang des Rahmens hinausragen, z.B. unter Verwendung von Laser oder einer Stanze. Dann wird der Film klebend am Rahmen angeschweißt, wobei dies vorzugsweise mittels Laser erfolgt.
  • Der Film wird danach dichtend mit dem Rahmen 278 verbunden, vorzugsweise mittels Heißversiegeln. Das Heißversiegeln ist vorzuziehen, da es eine starke Dichtung entstehen lässt, ohne dass mögliche Schmutzstoffe in das Behältnis eindringen, wie dies bei Klebe- oder Lösungsmittelklebetechniken der Fall sein könnte. Ferner ist das Heißversiegeln auch einfach und kostengünstig. Mindestens sollte der Film vollständig mit den Oberflächen der Seitenwände 282A, 282B, 282C 282D versiegelt sein. Noch bevorzugter ist der Film zusätzlich dazu mit den Oberflächen der Stützrippen 295 und dem Befestigungsstab 299 versiegelt. Das Heißversiegeln kann z.B. mittels einer Heizplatte erfolgen. Ein identisches Verfahren kann für das Schneiden und Versiegeln einer zweiten Lage mit der gegenüber liegenden Seite des Rahmens 278 gewählt werden, um so die Herstellung der Kammer 277 abzuschließen.
  • Der Tauchkolben 284 besteht vorzugsweise ebenfalls aus polymerem Material (z.B. Polypropylen oder Polycarbonat) und wird mittels bekannter Spritzgusstechniken erzeugt. Wie aus 46 ersichtlich ist, können der Rahmen 278, der Tauchkolben 284 und der den Tauchkolben mit dem Rahmen verbindende Streifen 286 alle in der gleichen Form ausgestaltet werden, um einen einstückigen Teil zu bilden. Diese Ausführungsform des Behältnisses eignet sich besonders für die manuelle Nutzung, bei der eine Bedienperson das Behältnis füllt und den Tauchkolben 284 in den Kanal 288 einsetzt. Der Streifen 286 stellt sicher, dass der Tauchkolben 284 nicht verloren geht oder auf den Boden fällt.
  • Der Tauchkolben 284 ist hierin als einfacher, wirkungsvoller und kostengünstiger Mechanismus vorzuziehen, der den Druck in der Kammer 277 erhöht und diese gegenüber der sie umgebenden Umwelt abdichtet. Es ist allerdings zu beachten, dass der Schutzumfang der Erfindung nicht auf diese Ausführungsform beschränkt ist. Es gibt zahlreiche andere in Frage kommende Techniken zur Abdichtung bzw. Versiegelung und Druckbeaufschlagung des Behältnisses. Außerdem kann jede beliebige zweckmäßige Druckquelle zur Druckbeaufschlagung der Kammer herangezogen werden. Geeignete Druckquellen sind Spritzenpumpen, Druckluftquellen, pneumatische Pumpe oder Verbindungen mit externen Druckquellen.
  • Obwohl in der obigen Beschreibung zahlreiche Spezifika beschrieben sind, sollten diese lediglich als Beispiele für hierin bevorzugte Ausführungsformen interpretiert werden. Das Behältnis zum Halten der Zellen oder Viren muss nicht einer der Spezialbehälter sein, wie sie oben in den zahlreichen Ausführungsformen erläutert sind. Jede Art von Behältnis mit einer Kammer zur Aufbewahrung der Zellen oder Viren kann zur Durchführung der Erfindung herangezogen werden. Zweckmäßige Behält nisse sind u.a. Reaktionsgefäße, Küvetten, Kassetten und Kartuschen. Das Behältnis kann mehrere Kammern und/oder Kanäle aufweisen, um mehrere Funktionen in Zusammenhang mit der Handhabung der Proben zu erfüllen; der Behälter kann aber auch nur eine einzelne Kammer zum Halten von aufzubrechenden Zellen oder Viren besitzen.
  • Außerdem kann die Stützstruktur zum Aneinanderdrücken des Wandlers und der Behälterwand alternative Formen aufweisen. Beispielsweise enthält in einer alternativen Ausführungsform die Stützstruktur eine Klemme bzw. einen Schraubstock, um den Wandler und das Behältnis aneinander zu pressen. In einer weiteren Ausführungsform besitzt die Vorrichtung ein Drucksystem für das Anlegen von Luftdruck, damit auf diese Weise der Wandler und das Behältnis aneinander gedrückt werden. Alternativ dazu kann Magnet- oder Schwerkraft dazu dienen, den Wandler und das Behältnis aneinander zu drücken. In jeder Ausführungsform der Erfindung kann Kraft an den Wandler, an das Behältnis oder sowohl an den Wandler als auch an das Behältnis angelegt werden.

Claims (24)

  1. Vorrichtung zum Aufbrechen von Zellen oder Viren, wobei die Vorrichtung Folgendes umfasst: a) ein Behältnis mit einer Kammer zum Halten der Zellen oder Viren, worin das Behältnis zumindest eine biegsame, die Kammer definierende Wand umfasst und worin die Wand eine Oberfläche außerhalb der Kammer aufweist; b) eine Druckquelle zum Anheben des statischen Drucks in der Kammer auf einen Druck über dem Umgebungsdruck außerhalb des Behältnisses; und c) einen Wandler zum Erschüttern der äußeren Oberfläche der biegsamen Wand.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Druckquelle ausreicht, um den statischen Druck in der Kammer auf zumindest 5 psi (34 kPa) über dem Umgebungsdruck anzuheben.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Druckquelle ausreicht, um den statischen Druck in der Kammer auf zumindest 15 psi (103 kPa) über dem Umgebungsdruck außerhalb des Behältnisses anzuheben.
  4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin die biegsame Wand eine Lage oder einen Film aus einem Polymermaterial umfasst.
  5. Vorrichtung nach Anspruch 4, worin die Wand eine Dicke in einem Bereich von 0,025 bis 0,1 mm aufweist.
  6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin die biegsame Wand ein Elastomer umfasst.
  7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiters umfassend Perlen in der Kammer zum Aufbrechen der Zellen oder Viren.
  8. Vorrichtung nach Anspruch 7, worin die Perlen eine Bindungsaffinität für die aufzubrechenden Zellen oder Viren aufweisen.
  9. Vorrichtung nach Anspruch 7, worin die Perlen eine Bindungsaffinität für das intrazelluläre Material, das aus den aufgebrochenen Zellen oder Viren austritt, aufweisen.
  10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiters umfassend einen ersten Satz an Perlen in der Kammer zum Binden der Zellen oder Viren und einen zweiten Satz an Perlen in der Kammer zum Aufbrechen der Zellen oder Viren.
  11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die Kammer zumindest zwei Öffnungen aufweist, die angeordnet sind, um den Fluss einer Fluidprobe durch die Kammer zu ermöglichen und worin die Vorrichtung zudem zumindest ein Filter in der Kammer zum Einfangen der Zellen oder Viren, während die Fluidprobe durch die Kammer fließt, umfasst.
  12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, weiters umfassend eine Trägerstruktur, um das Behältnis und den Wandler aneinander anstoßend zu halten, sodass der Wandler die äußere Oberfläche der Wand berührt, und um eine im Wesentlichen konstante Kraft an das Behältnis oder den Wandler anzulegen, um den Wandler und die Wand aneinander zu drücken, worin die Trägerstruktur Folgendes umfasst: a) eine Basis; b) eine an der Basis angebrachte erste Halterung zum Halten des Wandlers; c) eine gleitbar an der Basis befestigte Halterung zum Halten des Behältnisses und zum Positionieren des Behältnisses anstoßend an den Wandler, sodass die äußere Oberfläche der Wand den Wandler berührt; und d) zumindest einen elastischen Körper zum Anlegen der im Wesentlichen konstanten Kraft an die zweite Halterung, um die Wand gegen den Wandler zu drücken.
  13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin die Kammer durch Folgendes definiert ist: a) eine erste Wand zum Berühren des Wandlers, wobei die erste Wand ausreichend biegsam ist, um sich an eine Oberfläche des Wandlers anzupassen; b) eine von der ersten Wand beabstandete zweite Wand, wobei die zweite Wand ausreichend biegsam ist, um sich als Reaktion auf dynamische Druckveränderungen in der Kammer nach innen oder nach außen zu bewegen; und c) einen steifen Rahmen, der die Seitenwände der Kammer definiert, wobei die Seitenwände die biegsamen Wände miteinander verbinden; und worin die Vorrichtung weiters eine Trägerstruktur umfasst, um das Behältnis und den Wandler aneinander anstoßend zu halten, sodass der Wandler die äußere Oberfläche der ersten Wand berührt, und um eine im Wesentlichen konstante Kraft an das Behältnis oder den Wandler anzulegen, um den Wandler und die erste Wand aneinander zu drücken, worin die Trägerstruktur eine Halterung zum Halten des Rahmens umfasst, sodass die biegsamen Wände von der Halterung im Wesentlichen unbeeinträchtigt sind.
  14. Vorrichtung nach Anspruch 13, worin die Halterung einen Körper mit einer Vertiefung zur Aufnahme des Rahmens und einer Öffnung in der Nähe der Vertiefung umfasst, wobei die Öffnung angeordnet ist, um die Ausdehnung der zweiten Wand nach außen zuzulassen, wenn das Behältnis in der Vertiefung angeordnet ist.
  15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin der Wandler ein Ultraschallhorn umfasst.
  16. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin das Horn eine Spitze zum Berühren der Wand aufweist und worin die Dicke der Kammer gleich der Hälfte des Durchmessers der Spitze oder weniger ist.
  17. Verfahren zum Aufbrechen von Zellen oder Viren, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) das Einbringen i) der aufzubrechenden Zellen oder Viren und ii) einer Flüssigkeit in die Kammer eines Behältnisses; worin das Behältnis zumindest eine biegsame, die Kammer definierende Wand umfasst; b) das Anheben des statischen Drucks in der Kammer auf einen Druck über dem Umgebungsdruck außerhalb des Behältnisses; und c) das Erschüttern der äußeren Oberfläche der biegsamen Wand mithilfe eines Wandlers, um Druckimpulse oder Druckwellen in der Kammer zu erzeugen.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, worin der Schritt des Einbringens der Zellen oder Viren in die Kammer das Einfangen der Zellen oder Viren mit zumindest einem in der Kammer angeordneten Filter umfasst.
  19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, weiters umfassend den Schritt des Schüttelns der Perlen in der Kammer zum Aufbrechen der Zellen oder Viren.
  20. Verfahren nach Anspruch 17, worin die Wand eine Lage oder einen Film aus einem Polymermaterialumfasst.
  21. Verfahren nach Anspruch 17, worin der statische Druck in der Kammer auf zumindest 5 psi (34 kPa) über dem Umgebungsdruck außerhalb des Behältnisses angehoben wird.
  22. Verfahren nach Anspruch 17, worin der statische Druck in der Kammer auf zumindest 15 psi (103 kPa) über dem Umgebungsdruck außerhalb des Behältnisses angehoben wird.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, worin der Wandler ein Ultraschallhorn umfasst.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 23, worin der Wandler die Wand um eine Distanz im Bereich von 5 bis 40 μm wölbt, wenn der Wandler eine Kraft im Bereich von 1 bis 10 Pfund (4,4 bis 44 N) an die Wand anlegt.
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