EP3408025B1 - Röhre mit einer mikrofluidischen struktur und dazugehöriges verfahren - Google Patents

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EP3408025B1
EP3408025B1 EP17701136.8A EP17701136A EP3408025B1 EP 3408025 B1 EP3408025 B1 EP 3408025B1 EP 17701136 A EP17701136 A EP 17701136A EP 3408025 B1 EP3408025 B1 EP 3408025B1
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EP
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tube
reaction
microfluidic structure
sample material
bioanalytical
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Jürgen Rühe
Thomas Brandstetter
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Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
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Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
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Definitions

  • Embodiments of the present invention relate to a tube with a microfluidic structure, in particular to a tube in the form of a pipette in the tip of which the microfluidic structure is arranged. Further exemplary embodiments relate to carrying out an investigation in a pipette (pipette tip), for example carrying out a multi-stage bioanalytical reaction in a conical (pipette) tube by integrating a microfluidic device which generates at least two compartments.
  • the lab-on-a-pipette system is a special, advantageous addition to common lab-on-chip systems (laboratory-on-a-chip systems) with an upstream microtip, which is only used for targeted and exact Sample collection is used.
  • the analyzing lab-on-chip unit (fluidics and temperature control) was integrated into a specially developed pipette. The description of the production of corresponding microfluidic structures also corresponds to that of classic chip-based production processes.
  • the US 2007/0059215 A1 shows a micropipette in combination with a MEMS flow sensor.
  • the micropipette comprises a main section, an operating section and a pipe section, the pipe section defining an operating space.
  • the detection device is arranged at a suitable position in the operating space of the pipe section.
  • the MEMS flow sensor detects gas movement in the operating room.
  • the EP 1 381 468 B1 describes a device for taking an aliquot of a sample from a sealed container.
  • WO 2011/032228 A1 describes an experimental unit that has two interfaces - an interface for a pipette and an interface for a tip (sample holder). The experimental unit is thus connected in series between the tip and the pipette, the tip being used only for sample collection.
  • the WO 2006/029387 A1 describes a handy and portable microfluidic device that includes a cleaning chip and a syringe-like device for sample collection and movement. The sample is only prepared or purified.
  • the EP 0 803 064 B1 discloses a portable device for taking a fluid sample.
  • the device comprises a syringe, a housing having a first and second end, the first end being attached to the syringe, a receiving chamber contained in the housing, a filter device which has at least one hollow fiber membrane which is sealed by a plug of hardened adhesive in the A housing is contained between the receiving chamber and the second end, a piercing device which is attached to the second end of the housing, the housing being in fluid communication with the syringe and the piercing device, and a sensing device which is in the housing between the receiving chamber and the first end of the housing is included.
  • the object of the present invention is therefore to create a concept which on the one hand requires a simpler structure and on the other hand enables a more reliable examination of the sample.
  • Embodiments of the present invention provide a tube having an area tapering toward one end of the tube; an opening at the end of the tube for receiving a sample material; and a microfluidic structure disposed within the tube in the tapered region of the tube and connected to the opening, the microfluidic structure configured to perform a multi-stage bioanalytical reaction with the sample material; wherein the microfluidic structure has at least two reaction chambers for carrying out the multi-stage bioanalytical reaction; wherein the microfluidic structure has at least one ring-shaped component which bears against an inner wall of the tube; and wherein the microfluidic structure includes a moveable tubular component that abuts the inner wall of the tube in the tapered region of the tube and at least partially against the at least one annular component to form the at least two reaction chambers, the moveable tubular component being included the opening is connected; and wherein the tube is a tip of a pipette or a pipette.
  • a microfluidic structure which is arranged directly in a tapering region of a tube, such as, for example, a tip of a pipette or pipette tip, is used for analyzing or examining a sample by means of a multi-stage bioanalytical reaction.
  • a tube such as, for example, a tip of a pipette or pipette tip
  • Some exemplary embodiments make it possible to carry out bioanalytical detection reactions, which take place in several spatially or temporally separate steps, in the vessels which are used directly for the uptake and removal of sample material (e.g. pipette tubes).
  • sample material e.g. pipette tubes
  • This is made possible by subdivision of the vessel volume with the help of a movable fluid system. Its incorporation into the vessel volume forms at least two separate reaction spaces / compartments.
  • Tapered tubes in which a tubular fluid system sits on the inner cone are regarded as particularly suitable and advantageous designs. Appropriate functional designs solve common production-related and microfluidic problems of chip-based structures that have more than one reaction space.
  • FIG. 1 For exemplary embodiments, include the implementation of a sequential, multi-stage bioanalytical method (bioassay) in the volume of a conically tapering tube (in the form and function of a pipette tip), which is characterized in that an integrated microfluidic device generates at least two compartments in which analytical reagents are stored and can be reacted with a sample liquid in chronological order (successively / consecutively).
  • the peculiarity of the integrated microfluidic is that a nested tubular channel system sits loosely on the inner wall of the cone, thereby forming compartments and sealing them functionally.
  • the compartments formed are separated from one another by (ring-shaped) gaps / openings in hydrophobic surfaces.
  • Some exemplary embodiments make it possible to carry out complex, multi-stage and coherent reactions within the volume of a pipette tube in a very simple and inexpensive manner, as is usually used for taking up and taking out sample material.
  • FIG. 10 shows a schematic cross-sectional view of a tube 100 with a region 104 tapering towards one end 102 of the tube 100 and a microfluidic structure 106, which is arranged in the tapered region 104 of the tube 100, according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • the microfluidic structure 106 is connected to an opening 108 at the end 102 of the tube 100 for receiving a sample material, the microfluidic structure 106 being designed to carry out a multi-stage bioanalytical reaction with the sample material.
  • the tapering region 104 of the tube 100 can be tapered towards the end 102 of the tube 100 or be conical (hollow-conical).
  • the tapered region 104 of the tube 100 can thus have the shape of a tip or be tip-shaped.
  • the tube 100 can only consist of the tapered region 104.
  • the tube 100 can optionally also have a cylindrical (hollow cylindrical) region 110.
  • the tube can thus be both a pipette tip and a pipette with a tip, the microfluidic structure 106 being arranged within the tip 104.
  • the microfluidic structure 106 can be arranged only or exclusively within the tapered region 104 of the tube 100. However, it is also possible that the microfluidic structure 106 extends over the tapered region extends into the conical region 110. In this case, the microfluidic structure is (only) at least partially arranged within the tapered region 104 of the tube.
  • FIG. 14 shows schematic cross-sectional views of a tube 100 with a region 104 tapering towards one end 102 of the tube 100 and a microfluidic structure 106, which is arranged at least partially in the tapered region 104 of the tube 100, according to an exemplary embodiment of the present invention. Compared to that in Fig. 1 embodiment shown in 2a and 2b Details of the microfluidic structure 106 are shown.
  • the microfluidic structure 106 can have a movable, tubular component 114.
  • the moveable tubular component 114 may be connected to the opening 108 of the tube.
  • the microfluidic structure 106 can be designed to transfer a sample material received via the opening 108 of the tube via the movable, tubular component 114 in a first direction (in 2a and 2b to "up") to transport.
  • the microfluidic structure 106 can have at least two reaction chambers 112_1 to 112_3 (two reaction chambers 112_1 and 112_2 in Fig. 2a ; three reaction chambers 112_1 to 112_3 in Fig. 2b ) to carry out the multi-stage bioanalytical reaction.
  • the (at least) two reaction chambers 112_1 to 112_3 can be separated from one another.
  • the microfluidic structure 106 can be designed to move the sample material (previously transported in the first direction (upward) by the movable tubular component 114) in order to carry out the multi-stage bioanalytical reaction through the at least two reaction chambers 112_1 to 112_3 in a second direction (in Fig. 2 to "down") to transport.
  • an analytical reagent for the multi-stage bioanalytical reaction can be upstream in at least one of the at least two reaction chambers 112_1 to 112_3.
  • an analytical reagent for the multi-stage bioanalytical reaction can be upstream in at least one of the at least two reaction chambers 112_1 to 112_3.
  • analytical reagents upstream wherein the fluidic structure 106 may be configured to with the analytical reagents bring the sample material to the reaction in time order to carry out the multi-stage bioanalytical reaction.
  • the microfluidic structure 106 can have at least one ring-shaped component 116_1 and 116_2, which abuts an inner wall of the tube.
  • the movable, tubular component 114 is arranged such that it rests in the tapering region 104 of the tube on an inner wall of the tube and at least partially on the at least one annular component 116_1 and 116_2.
  • the movable, tubular component 114 can rest against the annular component 116 such that the at least two reaction chambers 112_1 to 112_3 formed are separated from one another by openings of hydrophobic surfaces or hydrophobic capillary openings.
  • Tube 100 may further include a filter or O-ring 120.
  • the sample material can, for example, be sucked up via the O-ring 120.
  • 2a and 2b show schematic representations of tip-shaped tubes 100 for taking up and taking out sample material with integrated tubular fluidics, which subdivides the volume of the tube 100 into two or three separate reaction areas 112_1 to 112_3 and enables multi-stage detection reactions to be carried out.
  • Sample liquids can be taken up very precisely from the outside via the conically tapering part of the tube (tip) 104 and can enter the first compartment 112_1 in the proximal (widened) area of the pipette via a central tubular channel 114 which loosely rests on the inner conical area 104 Tube 100.
  • the liquid transport is characterized in that it runs primarily in the direction of the cylinder / cone axis, ie vertically with the aid of pressure differences and centrifugal forces.
  • compartments 112_1 to 112_3 the liquid is preferably transported via centrifugal forces and in the direction of the cone tip, so that the liquid of a proximal compartment is forced into the closest distal compartment (in the direction of the cone tip) via the hydrophobic capillary opening.
  • the transport from compartment to compartment can be controlled, for example, by varying the capillary opening (length, width, surface) and the centrifugal force applied. This enables the spatial and temporal separation of reaction processes.
  • FIG. 10 shows a schematic view of a tube 100 with a region 104 tapering towards one end 102 of the tube 100 and a microfluidic structure 106, which is arranged at least partially in the tapered region 104 of the tube 100, according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • the microfluidic structure 106 comprises four reaction chambers 112_1 to 112_4, which are formed by three ring-shaped components 116_1 to 116_3 and the movable, tubular component 114.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of a microfluidic device 100 with a total of 4 compartments 112_1 to 112_4, which are separated from one another by capillary gaps / openings of different widths and lengths.
  • the two middle compartments (2 and 3) 112_2 and 112_3 each have an annular side pocket 118_1 and 118_2 in which liquid can be retained, for example for separate reactions or for skimming off unnecessary reaction solutions.
  • compartment 4 (112_4) the arrangement shown here results in three reaction spaces with a dead end function. If the tubular channels 104 are moved against the taper, the liquid can be emptied in the direction of the tip.
  • the microfluidic 106 integrated into the conical pipette tube 100 can also be designed such that individual compartments 112_2 and 112_3 form dead end-like pockets 118_1 and 118_2.
  • This allows reaction solutions to be divided up and reduced in volume before being transported to the next compartment.
  • the last (distal) compartment 112_4 closest to the tip can be characterized in that it is sealed in the direction of the cone by the integrated tubular channel system.
  • the centrifugal forces for liquid transport simultaneously promote the self-sealing structure.
  • the hydrophobic surfaces of the capillary gaps and the structure of the tubular channel system prevent evaporation of the liquid, so that even reactions in the boiling point of the reaction solution (e.g.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the targeted release of the reaction solution from the distal (facing the tip) compartment can be initiated by moving the tubular channel system 114 against the taper.
  • Reagents preferably freeze-dried
  • By storing all the reagents necessary for a reaction only the liquid absorption of the sample to be examined is necessary. This means that liquid samples from only a few microliters can be processed in the tapered tube (pipette tube) after completion of the detection reaction until the detection reaction is complete.
  • the detection can then take place externally in tube 100 or after the reaction solution has been released.
  • Devices and objects for generating pressure differences can be used for operation and for carrying out the assay.
  • possible application examples are all multi-stage bioanalytical methods of sample preparation and preparation with detection reaction.
  • a preferred example of this would be nucleic acid analysis.
  • a simple two-compartment system would be, for example, the combination and implementation of a so-called liquid DNA extraction with subsequent PCR.
  • An example of a three-stage system would be an RT-PCR consisting of cell disruption, reverse transcription and PCR in spatial separation.
  • Further application examples are enzymatic reactions in which the products can be used for further reactions in a temporal and spatial separation.
  • Another example would be the storage of reagents in the individual compartments, which enable a start-stop function for the reaction.
  • Embodiments create several advantages, as described below.
  • One advantage is that the structure and the functional principle of the microfluidics integrated in the pipette tube do not require any complex processes and procedures as are usually used in the microstructuring of chip structures.
  • the vertical arrangement of the compartments and the vertical liquid transport solve common problems of chip-based microfluidics.
  • pressure equalization and gas bubble formation, as well as the rapid filling of the compartments without air bubbles pose no problems.
  • the liquid can be taken in manually and without electrical pumps in a very precise manner (for example, using standard laboratory pipettes).
  • the liquid remains in the pipette tube (single-tube solution) during all steps of the analysis.
  • the self-sealing structure of the fluid system within the pipette tube enables both the centrifugation and the heating of the reaction solution without loss of liquid. Furthermore, the reaction solution can be released quickly and easily for detection (optional). Ultimately, the form and the lack of electrical interfaces enable simple parallelization as well as cost-effective integration into the standard laboratory equipment.
  • a microfluidic structure can be built up, which (1) a filter tip (e.g. ep Dualfilter TIPS®), (2) a silicone tube “long, thin” (e.g. inside diameter 0.5 mm; outside diameter 1.3 mm; length 25 mm) , (3) a silicone hose "thick, short” (e.g. inner diameter 1.58 mm; outer diameter 3.18 mm; length 4 mm), (4) instead of the dual filter of the filter tip, a short piece of an additional silicone hose can also be used (e.g.
  • the control elements can be (1) a commercially available pipette (e.g. Eppendorf Research ®), (2) a table centrifuge (e.g. peqlab ®, PerfectSpin ® Mini centrifuge with rotor insert for 0.5 ml reaction tubes) and (3) a PCR device for capillaries or Tubes (e.g. Roche LightCycler 1.5 ®) are used.
  • Fig. 4a shows a photo
  • Fig. 4b 10 shows a schematic cross-sectional view of a tube 100 with a region 104 tapering towards one end 102 of the tube 100 and a microfluidic structure 106, which is arranged in at least partially in the tapered region 104 of the tube 100, according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • the microfluidic structure 106 comprises two reaction chambers 112_1 and 112_2, which are formed via an annular component 116_1 and a movable, tubular component 114, as already described in relation to FIG Fig. 2a has been described in detail.
  • 4a and 4b to recognize an O-ring or filter 120.
  • Fig. 4a shows a photo shoot
  • Fig. 4b a schematic drawing showing the structure of the fluidics 106 and the resulting compartments 112_1 and 112_2 in the pipette tip 104.
  • blue hoses first hatching
  • green-yellow stripes second hatching
  • FIG. 5a-5e show schematic cross-sectional views of the in Fig. 2 Tube 100 shown in or after different steps of a method for examining a sample material with tube 100, according to an embodiment of the present invention.
  • Fig. 5a 10 is a schematic cross-sectional view of tube 100 prior to a step of soaking up sample material 130.
  • Lysis reagents 122 can be stored in front of an inside of the movable, tubular component 114, while PCR reagents 124 can be stored in the second reaction chamber 112_2.
  • Fig. 5b shows a schematic cross-sectional view of the tube 100 after a step of sucking up the sample material 130, whereby the sample material 130 has been transported through the movable, tubular component 114 into the first reaction chamber 112_1.
  • Fig. 5c shows a schematic cross-sectional view of the tube 100 during a centrifugation step, whereby the sample material passes from the first reaction chamber 112_1 into the second reaction chamber 112_2.
  • FIG. 5d shows a schematic cross-sectional view of tube 100 after the centrifugation step, whereby sample material 130 has completely passed from first reaction chamber 112_1 to second reaction chamber 112_2, where the sample material contacts PCR reagents 124, causing a second bioanalytical reaction comes with the sample material 130.
  • FIG. 10 shows a schematic cross-sectional view of tube 100 during the second bioanalytical reaction.
  • 5a to 5e show an exemplary schematic sequence in the case of upstream reagents (eg freeze-dried) for liquid DNA extraction (blue (first hatching), eg lysis of cell suspensions) with subsequent PCR (yellow (second hatching).
  • upstream reagents eg freeze-dried
  • lysis reagents 122, cell lysate, or DNA extract can be mixed directly with the reagents 124 of the PCR (green (third hatching))
  • the course of the reaction can be visualized using fluorescent dyes (turquoise (fourth hatching)).
  • FIG. 6a to 6d show schematic cross-sectional views of the in Fig. 2 Tube 100 shown in or after different steps of a method for taking a sample material after carrying out the multi-stage bioanalytical reaction, according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6a is a schematic cross-sectional view of tube 100 after performing the multi-stage bioanalytical reaction.
  • the sample material 130 (together with any reagents) is located in the second reaction chamber 112_2.
  • Figure 10 shows a schematic cross-sectional view of tube 100 after an application step a removal device 132 (eg a spiral wire) into the movable tubular component 114.
  • Fig. 6c shows a schematic cross-sectional view of the tube 100 in a step of shifting the movable tubular component 114 by applying the removal device 132 into the movable tubular component 114.
  • FIG. 14 shows a schematic cross-sectional view of tube 100 after the step of displacing movable tubular component 114, allowing sample material 130 to escape from tube 100.
  • 6a to 6d show schematic representations of how the reaction liquid 130 can be released for further investigations after the end of the reaction by subsequent application of a spiral wire 132.
  • the wire 132 can be inserted into the pipette tip in the case of the O-ring from the pipette side (top) or in the case of the filter from the tip (bottom). In both cases, the wire 132 is used to move the long, thin tube 114 upward so that the liquid 130 can escape through the tip by actuating the pipette.
  • FIG. 7a to 7e show schematic cross-sectional views of the in Fig. 2 Tube 100 shown in or after different steps of a method for examining a sample material with tube 100, according to an embodiment of the present invention.
  • Fig. 7a 10 is a schematic cross-sectional view of tube 100 prior to a step of soaking up sample material 130.
  • the removal device 132 for example a spiraled wire
  • the lysis reagents 122 can be arranged upstream on the removal device 132.
  • PCR reagents 124 can be arranged upstream in the second reaction chamber 112_2.
  • Fig. 7b shows a schematic cross-sectional view of the tube 100 after a step of sucking up the sample material 130, whereby the sample material 130 has been transported through the movable, tubular component 114 into the first reaction chamber 112_1.
  • Fig. 7c shows a schematic cross-sectional view of the tube 100 during a centrifugation step, whereby the sample material passes from the first reaction chamber 112_1 into the second reaction chamber 112_2.
  • FIG. 7d 14 shows a schematic cross-sectional view of tube 100 of FIG the step of centrifuging, whereby the sample material 130 has completely passed from the first reaction chamber 112_1 into the second reaction chamber 112_2, where the sample material comes into contact with the PCR reagents 124, resulting in a second bioanalytical reaction with the sample material 130.
  • Fig. 5e shows a schematic cross-sectional view of the tube 100 after the second bioanalytical reaction and the displacement of the movable tubular component, whereby the sample material can escape from the tube 100.
  • 7a to 7e show schematic representations of an application similar to that 5a to 5e .
  • the wire 132 is part of the fluidics right from the start.
  • the lysis reagents 124 are even stored on the surface of the wire 132 and washed off the sample 130 when it is sucked up.
  • An advantage here is a better mixing of the lysis reagents 122 with the sample 130 and a simpler introduction of the lysis reagents 122.
  • the further course is the same as in FIG 5b to 5e described, in addition, however, the function of as below 6a to 6d already integrated.
  • Fig. 8 shows a photo of a pipette tip (lab in a pipette tip) through a filter disc.
  • the pipette tip there is a PCR product with the dye SYBR Green I which can be excited with blue light ( ⁇ 495nm) in the wavelength range of fluorescein and emits green light ( ⁇ 520 nm).
  • Fig. 9 shows a photo of a gel electrophoresis (1.5% agarose; 70 V; 45 min.) of two PCR products.
  • the positive control (item) was tempered in a plastic capillary.
  • PCR in tip the pipette tip was filled with 10 ⁇ l of the PCR solution.
  • the temperature was controlled in a Roche LightCycler 1.5 ®.
  • FIG. 12 shows a flow diagram of a method 200 according to an embodiment of the present invention.
  • the method 200 includes a step 202 of receiving a sample material through an opening of a tube, the tube having a tapered area toward an end of the tube that forms the opening.
  • the method further includes a step 204 of performing a multi-stage bioanalytical reaction with a microfluidic structure disposed within the tube in the tapered region of the tube and connected to the opening.
  • the pipette tip In contrast to conventional concepts, in which the pipette tip is only seen as an addition / extension, this represents one in exemplary embodiments an essential part of the analyzing system and the fluidics.
  • aspects have been described in connection with a device, it goes without saying that these aspects also represent a description of the corresponding method, so that a block or a component of a device is also to be understood as a corresponding method step or as a feature of a method step. Analogously, aspects that have been described in connection with or as a method step also represent a description of a corresponding block or detail or feature of a corresponding device.
  • Some or all of the method steps can be carried out by a hardware apparatus (or using a hardware device). Apparatus), such as a microprocessor, a programmable computer or an electronic circuit. In some embodiments, some or more of the most important process steps can be performed by such an apparatus.

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Description

  • Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf eine Röhre mit einer mikrofluidischen Struktur, insbesondere auf eine Röhre in Form einer Pipette in dessen Spitze die mikrofluidische Struktur angeordnet ist. Weitere Ausführungsbeispiele beziehen sich auf eine Durchführung einer Untersuchung in einer Pipette (Pipettenspitze), beispielsweise auf die Durchführung einer mehrstufigen bioanalytischen Reaktion in einem konischen (Pipetten-) Röhrchen durch Integration einer mikrofluidischen Vorrichtung, die mindestens zwei Kompartimenten erzeugt.
  • Modifikationen von Pipettenspitzen und entsprechende funktionale Formen sind teils weit verbreitet [1-3]. Die bekannten Ansätze beschreiben lediglich eine Vereinfachung einzelner Analyseschritte, insbesondere der Probenvorbereitung und Probenaufarbeitung. Mikrofluidische Systeme, die in der Lage sind mehrere zusammenhängende Analyseschritte durchzuführen sind besonders vorteilhaft wenn kleinste Probenvolumina in einem geschlossenen Ablauf prozessiert und analysiert werden müssen[4]. Dabei finden die Analyseschritte fast immer diskontinuierlich statt, d.h. es sind prinzipiell immer mehrere diskrete Reaktionsräume erforderlich oder zumindest mehrere Start-Stopp-Phasen notwendig um einen Analyten aufzunehmen, für die Nachweisreaktion vorzubereiten und letztendlich den analysierenden Schritt durchzuführen. Das Ziel ist gewöhnlich, dass Automation und ein geschlossener Ablauf aller notwendigen Schritte mögliche manuelle Fehler bei insbesondere sehr kleinen Probenvolumina reduzieren soll. Betrachtet man die Tauglichkeit automatisierter mikrofluidischer Systeme für die Vor-Ort-Analyse, bzw. in kleinen dezentralisierten Laboreinrichtungen, so werden insbesondere technische Lösungen als vorteilhaft erachtet, die robust sind, sich durch einfache Handgriffe bedienen lassen, möglichst wenige elektronische Komponenten besitzen und dadurch wenig Energie benötigen [5, 6]. Obwohl es viele technische Lösungsvorschläge individueller Probleme gibt, sind Beispiele einfacher geschlossener Systeme kaum auffindbar. Neben der Komplexität mehrstufige bioanalytische Prozesse in eine mikrofluidische Einheit zu integrieren, besteht zusätzlich das Problem der Probenaufnahme bei kleinen Volumina oder Partikeln wie z.B. Zellen. Das LAB-ON-A-Pipette System (dt. Labor-in-einer-Pipette System) [7, 8] kombiniert hierfür eine spezielle "micro aspiration tip" Spitze mit einer mikro-fluidischen analysierenden Einheit, um insbesondere genetische Einzelzellanalysen zu optimieren. Bei diesem System werden ebenfalls alle zur Nachweisreaktion notwendigen Reagenzien vorgelagert. Letztendlich handelt es sich aber bei dem Lab-on-a-Pipette System um eine spezielle vorteilhafte Ergänzung gängiger Lab-on-Chip Systeme (dt. Labor-auf-einem-Chip Systeme) durch eine vorgelagerte Mikrospitze, die lediglich der gezielten und exakten Probenaufnahme dient. Die analysierende Lab-on-Chip Einheit (Fluidik und Temperierung) wurde dabei in eine speziell entwickelte Pipette integriert. Auch die Beschreibung der Herstellung entsprechender mikrofluidischer Strukturen entspricht denen klassischer chipbasierter Herstellungsverfahren.
  • Aufgrund prozesstechnischer Entwicklungen von mikrofluidischen Plattformen besitzen derzeitige integrative Systeme eine, wie der Name schon sagt, platte Form im Sinne eines Chips, einer Disk oder einer Kassette [6]. Mag dieser Aufbau produktionsbedingt z.T. noch deutliche Vorteile besitzen, so ergeben sich beim mikrofluidischen Ablauf, bzw. dem mikrofluidischen Transport von Flüssigkeiten häufig intrinsische Probleme. Beispiele sind das Benetzen von Oberflächen und damit verbunden das lufblasenfreie Füllen von Kompartimenten [9], die Bildung von Gasblasen [10] sowie der Druckausgleich [11, 12]. Durch die vertikale Begrenzung des flachen Aufbaus und die horizontale Lage des Fluidmanagements kann keine natürliche Trennung von Gas- und wässriger Phase stattfinden. Desweiteren müssen, um die Flüssigkeitsmengen zu bewegen und einen reibungslosen automatisierten Ablauf zu gewähren, derzeit sowohl spezielle als auch große und komplexe Geräteplattformen verwendet werden [13, 14]. Beides führt dazu, dass derzeitige Lösungsansätze als umsetzbar aber kaum praktikabel gelten. Eine äußerst komplexe Fluidik ist für einen Einmalgebrauch meist teuer in der Produktion und birgt zusätzlich eine höhere Gefahr der Störanfälligkeit. Große und komplexe Geräteplattformen bieten gewöhnlich Lösungen für eine individuelle Fluidik auf die sie zugeschneidert wurden. Der mögliche Preis für solche Geräte ist meist unrentabel, sofern nicht ein breites Einsatzspektrum gewährleistet wird. Ein weiterer Nachteil mikrofluidische Plattformen ist die Schnittstelle zwischen Probe und Fluidik, d.h. das Beladen/Füllen der mikrofluidischen Einheit. Bis auf wenige Ausnahmen [7, 8] besitzen Lab-on-chip Systeme keine adäquaten Möglichkeiten eine Probe direkt aufzunehmen und zu verarbeiten.
  • In der US 8,394,625 B2 wird ein Lab-on-a-Pipette System beschrieben, welches eine Kombination aus einem Lab-on-Chip System und einer Mikrospitze ist. Die Mikrospitze ist dabei eine Erweiterung einer Chip-Plattform, wobei die Fluidik und Analytik im Lab-on-Chip System erfolgt.
  • Die US 2007/0059215 A1 zeigt eine Mikropipette in Kombination mit einem MEMS Strömungssensor. Die Mikropipette umfasst einen Hauptabschnitt, einen Betriebsabschnitt und einen Rohrabschnitt, wobei der Rohrabschnitt einen Betriebsraum definiert. Die Erfassungsvorrichtung ist an einer geeigneten Position im Betriebsraum des Rohrabschnitts angeordnet. Der MEMS Strömungssensor erfasst dabei eine Gasbewegung in dem Betriebsraum.
  • Die EP 1 381 468 B1 beschreibt eine Vorrichtung zum Entnehmen eines Aliquots einer Probe aus einem verschlossenen Behälter.
  • In der WO 2011/032228 A1 wird eine experimentelle Einheit beschrieben, die zwei Schnittstellen aufweist - eine Schnittstelle für eine Pipette und eine Schnittstelle für eine Spitze (Probenaufnahme). Die experimentelle Einheit ist somit in Reihe zwischen der Spitze und der Pipette verbunden, wobei die Spitze lediglich zur Probenaufnahme dient.
  • Die WO 2006/029387 A1 beschreibt ein handliches und portables mikrofluidisches Gerät, welches einen Reinigungschip und eine spritzenartige Vorrichtung zur Probenaufnahme und Bewegung umfasst. Dabei erfolgt lediglich eine Vorbereitung bzw. Aufreinigung der Probe.
  • Die EP 0 803 064 B1 offenbart eine tragbare Vorrichtung zur Entnahme einer Fluidprobe. Die Vorrichtung umfasst eine Spritze, ein Gehäuse mit einem ersten und zweiten Ende, wobei das erste Ende an der Spritze befestigt ist, eine in dem Gehäuse enthaltene Aufnahmekammer, eine Filtervorrichtung, welche zumindest eine Hohlfasermembran aufweist, die durch einen Stopfen aus gehärtetem Klebstoff in dem Gehäuse zwischen der Aufnahmekammer und dem zweiten Ende enthalten ist, eine Einstechvorrichtung, die an dem zweiten Ende des Gehäuses befestigt ist, wobei das Gehäuse in Fluidverbindung mit der Spritze und der Einstechvorrichtung ist, und eine Fühlvorrichtung, die in dem Gehäuse zwischen der Aufnahmekammer und dem ersten Ende des Gehäuses enthalten ist.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Konzept zu schaffen, welches einerseits einen einfacheren Aufbau erfordert und eine andererseits eine zuverlässigere Untersuchung der Probe ermöglicht.
  • Diese Aufgabe wird durch die unabhängigen Patentansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen finden sich in den abhängigen Patentansprüchen.
  • Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung schaffen eine Röhre mit einem zu einem Ende der Röhre hin verjüngenden Bereich; einer Öffnung an dem Ende der Röhre zum Aufnehmen eines Probenmaterials; und einer mikrofluidischen Struktur, die innerhalb der Röhre in dem verjüngenden Bereich der Röhre angeordnet ist und die mit der Öffnung verbunden ist, wobei die mikrofluidische Struktur ausgebildet ist, um mit dem Probenmaterial eine mehrstufige bioanalytische Reaktion durchzuführen; wobei die mikrofluidische Struktur zumindest zwei Reaktionskammern zur Durchführung der mehrstufigen bioanalytischen Reaktion aufweist; wobei die mikrofluidische Struktur zumindest eine ringförmige Komponente aufweist, die an einer Innenwand der Röhre anliegt; und wobei die mikrofluidische Struktur eine bewegliche, schlauchförmige Komponente aufweist, die in dem verjüngenden Bereich der Röhre an der Innenwand der Röhre und zumindest teilweise an der zumindest einen ringförmigen Komponente anliegt, um die zumindest zwei Reaktionskammern zu bilden, wobei die bewegliche, schlauchförmige Komponente mit der Öffnung verbunden ist; und wobei die Röhre eine Spitze einer Pipette oder eine Pipette ist.
  • Gemäß dem Konzept der vorliegenden Erfindung wird zur Analyse bzw. Untersuchung einer Probe mittels einer mehrstufigen bioanalytischen Reaktion eine mikrofluidische Struktur verwendet, die direkt in einem sich verjüngenden Bereich einer Röhre, wie z.B. einer Spitze einer Pipette bzw. Pipettenspitze, angeordnet ist. Dies ermöglicht eine zuverlässige und kostengünstige Durchführung komplexer, mehrstufiger Reaktionen direkt innerhalb des sich verjüngenden Bereichs der Röhre.
  • Manche Ausführungsbeispiele ermöglichen es, bioanalytische Nachweisreaktionen, die in mehreren räumlich oder zeitlich getrennten Schritten ablaufen, in den Gefäßen durchzuführen, die direkt der Auf- und Entnahme von Probenmaterial dienen (z.B. Pipetten-Röhrchen). Ermöglicht wird dies durch eine Unterteilung des Gefäßvolumens mithilfe einer beweglichen Fluidik. Dessen Inkorporation in das Gefäßvolumen bildet dabei mindestens zwei getrennte Reaktionsräume/Kompartimente. Als besonders geeignete und vorteilhafte Ausführungen werden konisch zulaufende Röhrchen angesehen in denen eine schlauchförmige Fluidik dem inneren Konus aufsitzt. Entsprechende funktionale Ausführungen lösen gängige produktionstechnische und mikrofluidische Probleme chipbasierter Strukturen, die mehr als einen Reaktionsraum besitzen.
  • Weitere Ausführungsbeispiele umfassen die Durchführung eines sequenziellen, mehrstufigen bioanalytischen Verfahrens (bioassay) in dem Volumen eines konisch zulaufenden Röhrchens (in Form und Funktion einer Pipettenspitze), welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine integrierte mikrofluidische Vorrichtung mindestens zwei Kompartimente erzeugt, in denen analytische Reagenzien vorgelagert und mit einer Probenflüssigkeit in zeitlicher Folge (sukzessiv/konsekutiv) zur Reaktion gebracht werden können. Die Besonderheit der integrierten Mikrofluidik besteht darin, dass ein verschachteltes schlauchförmiges Kanalsystem lose der Innenwand des Konus aufsitzt, dadurch Kompartimente bildet und diese funktional abdichtet. Die gebildeten Kompartimente sind durch (ringförmige) Spalten/Öffnungen hydrophober Oberflächen voneinander getrennt. Durch Bewegung des Kanalsystems entgegen der Verjüngung kann die Flüssigkeit über die Konus-Öffnung zu jedem Zeitpunkt gezielt freigesetzt werden.
  • Manche Ausführungsbeispiele ermöglichen in einer sehr einfachen und kostengünstigen Weise die Durchführung komplexer, mehrstufiger und zusammenhängender Reaktionen innerhalb des Volumens eines Pipetten-Röhrchens, wie es üblicherweise zur Auf- und Entnahme von Probenmaterial genutzt wird.
  • Weitere Ausführungsbeispiele schaffen ein Verfahren, mit folgenden Schritten:
    • Aufnehmen eines Probenmaterials durch eine Öffnung einer Röhre, wobei die Röhre einem zu einem Ende der Röhre hin, die die Öffnung bildet, einen verjüngenden Bereich aufweist; und
    • Durchführen einer mehrstufigen bioanalytischen Reaktion mit einer mikrofluidischen Struktur, die innerhalb der Röhre in dem verjüngenden Bereich der Röhre angeordnet ist und mit der Öffnung verbunden ist.
  • Ausführungsbeispiele werden bezugnehmen auf die beiliegenden Figuren näher erläutert. Es zeigen:
    • Fig. 1
    eine schematische Querschnittsansicht einer Röhre mit einem zu einem Ende der Röhre hin sich verjüngenden Bereich und einer mikrofluidischen Struktur, die in dem sich verjüngenden Bereich der Röhre angeordnet ist, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
    Fig. 2a-2b
    schematische Querschnittsansichten einer Röhre mit einem zu einem Ende der Röhre hin sich verjüngenden Bereich und einer mikrofluidischen Struktur, die zumindest teilweise in dem sich verjüngenden Bereich der Röhre angeordnet ist, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
    Fig. 3
    eine schematische Querschnittsansicht einer Röhre mit einem zu einem Ende der Röhre hin sich verjüngenden Bereich und einer mikrofluidischen Struktur, die zumindest teilweise in dem sich verjüngenden Bereich der Röhre angeordnet ist, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
    Fig. 4a-4b
    ein Foto und eine schematische Querschnittsansicht einer Röhre mit einem zu einem Ende der Röhre hin sich verjüngenden Bereich und einer mikrofluidischen Struktur, die in zumindest teilweise in dem sich verjüngenden Bereich der Röhre angeordnet ist, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
    Fig. 5a-5e
    zeigen schematische Querschnittsansichten der in Fig. 2 gezeigten Röhre bei bzw. nach Unterschiedlichen Schritten eines Verfahrens zum Untersuchen eines Probenmaterials mit der Röhre, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
    Fig. 6a-6d
    zeigen schematische Querschnittsansichten der in Fig. 2 gezeigten Röhre bei bzw. nach Unterschiedlichen Schritten eines Verfahrens zum Entnehmen eines Probenmaterials nach der Durchführung der mehrstufigen bioanalytischen Reaktion, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
    Fig. 7a-7e
    zeigen schematische Querschnittsansichten der in Fig. 2 gezeigten Röhre bei bzw. nach Unterschiedlichen Schritten eines Verfahrens zum Untersuchen eines Probenmaterials mit der Röhre, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
    Fig. 8
    eine Fotoaufnahme einer Pipettenspitze durch eine Filterscheibe;
    Fig. 9
    eine Fotoaufnahme einer Gelelektrophorese von zwei PCR Produkten; und
    Fig. 10
    ein Flussdiagramm eines Verfahrens, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
  • In der nachfolgenden Beschreibung der Ausführungsbeispiele der Erfindung werden in den Figuren gleiche oder gleichwirkende Elemente mit den gleichen Bezugszeichen versehen, so dass deren Beschreibung in den unterschiedlichen Ausführungsbeispielen untereinander austauschbar ist.
  • Fig. 1 zeigt eine schematische Querschnittsansicht einer Röhre 100 mit einem zu einem Ende 102 der Röhre 100 hin sich verjüngenden Bereich 104 und einer mikrofluidischen Struktur 106, die in dem sich verjüngenden Bereich 104 der Röhre 100 angeordnet ist, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die mikrofluidische Struktur 106 ist mit einer Öffnung 108 an dem Ende 102 der Röhre 100 zum Aufnehmen eines Probenmaterials verbunden, wobei die mikrofluidische Struktur 106 ausgebildet ist, um mit dem Probenmaterial eine mehrstufige bioanalytische Reaktion durchzuführen.
  • Bei Ausführungsbeispielen kann der sich verjüngende Bereich 104 der Röhre 100 zu dem Ende 102 der Röhre 100 hin konisch zulaufend bzw. kegelförmig (hohlkegelförmig) sein. Der sich verjüngende Bereich 104 der Röhre 100 kann somit die Form einer Spitze aufweisen bzw. spitzenförmig sein. Die Röhre 100 kann dabei nur aus dem sich verjüngenden Bereich 104 bestehen. Die Röhre 100 kann jedoch auch optional einen zylinderförmigen (hohlzylinderförmigen) Bereich 110 aufweisen. Die Röhre kann somit sowohl eine Pipettenspitze als auch eine Pipette mit einer Spitze sein, wobei die mikrofluidische Struktur 106 innerhalb der Spitze 104 angeordnet ist.
  • Wie in Fig. 1 gezeigt ist, kann die mikrofluidische Struktur 106 nur bzw. ausschließlich innerhalb des sich verjüngenden Bereichs 104 der Röhre 100 angeordnet sein. Es ist jedoch auch möglich, dass sich die mikrofluidische Struktur 106 über den verjüngenden Bereich hinaus bis in den kegelförmigen Bereich 110 erstreckt. In diesem Fall ist die mikrofluidische Struktur also (nur) zumindest teilweise innerhalb des sich verjüngenden Bereichs 104 der Röhre angeordnet.
  • Fig. 2a und 2b zeigen schematische Querschnittsansichten einer Röhre 100 mit einem zu einem Ende 102 der Röhre 100 hin sich verjüngenden Bereich 104 und einer mikrofluidischen Struktur 106, die zumindest teilweise in dem sich verjüngenden Bereich 104 der Röhre 100 angeordnet ist, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Im Vergleich zu dem in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel werden in Fig. 2a und 2b Details der mikrofluidischen Struktur 106 gezeigt.
  • Wie in Fig. 2a und 2b zu erkennen ist, kann die mikrofluidische Struktur 106 eine bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 aufweisen. Die bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 kann mit der Öffnung 108 der Röhre verbunden sein. Die mikrofluidische Struktur 106 kann dabei ausgebildet sein, um ein über die Öffnung 108 der Röhre aufgenommenes Probenmaterial über die bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 in eine erste Richtung (in Fig. 2a und 2b nach "oben") zu transportieren.
  • Ferner kann die mikrofluidische Struktur 106 zumindest zwei Reaktionskammern 112_1 bis 112_3 (zwei Reaktionskammern 112_1 und 112_2 in Fig. 2a; drei Reaktionskammern 112_1 bis 112_3 in Fig. 2b) zur Durchführung der mehrstufigen bioanalytischen Reaktion aufweisen. Die (zumindest) zwei Reaktionskammern 112_1 bis 112_3 können voneinander getrennt sein. Die mikrofluidische Struktur 106 kann dabei ausgebildet sein, um das (zuvor durch die bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 in die erste Richtung (nach "oben) transportierte) Probenmaterial zur Durchführung der mehrstufigen bioanalytische Reaktion durch die zumindest zwei Reaktionskammern 112_1 bis 112_3 in eine zweite Richtung (in Fig. 2 nach "unten") zu transportieren.
  • Mit der in Fig. 2 gezeigten mikrofluidischen Struktur 106 ist es somit möglich, die mehrstufige bioanalytische Reaktion sequentiell bzw. in zeitlich getrennten Schritten durchzuführen. Beispielsweise kann hierzu in zumindest einer der zumindest zwei Reaktionskammern 112_1 bis 112_3 ein analytisches Reagenz für die mehrstufige bioanalytische Reaktion vorgelagert sein. Natürlich können auch in den zumindest zwei Reaktionskammern 112_1 bis 112_3, d.h. in den zwei Reaktionskammern 112_1 und 112_2 (in Fig. 2a und 2b) bzw. in den drei Reaktionskammern 112_1 bis 112_3 in Fig. 2b, analytische Reagenzien vorgelagert sein, wobei die fluidische Struktur 106 ausgebildet sein kann, um die analytischen Reagenzien mit dem Probenmaterial in zeitlicher Reihenfolge zur Reaktion zu bringen, um die mehrstufige bioanalytische Reaktion durchzuführen.
  • Um die zumindest zwei Reaktionskammern 112_1 bis 112_3 zu bilden, kann die mikrofluidische Struktur 106 zumindest eine ringförmige Komponente 116_1 und 116_2 aufweisen, die an einer Innenwand der Röhre anliegt. Die bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 ist dabei so angeordnet, dass diese in dem sich verjüngenden Bereich 104 der Röhre an einer Innenwand der Röhre und zumindest teilweise an der zumindest einen ringförmigen Komponente 116_1 und 116_2 anliegt. Die bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 kann dabei so an der ringförmigen Komponente 116 anliegen, dass die gebildeten zumindest zwei Reaktionskammern 112_1 bis 112_3 durch Öffnungen hydrophober Oberflächen oder hydrophobe kapillare Öffnungen voneinander getrennt sind.
  • Die Röhre 100 kann ferner einen Filter bzw. O-Ring 120 umfassen. Über den O-Ring 120 kann das Probenmaterial beispielsweise aufgesaugt werden.
  • Mit anderen Worten, Fig. 2a und 2b zeigen schematische Darstellungen spitzenförmiger Röhrchen 100 zur Auf- und Entnahme von Probenmaterial mit integrierter schlauchförmiger Fluidik, die das Volumen des Röhrchens 100 in zwei, bzw. drei getrennte Reaktionsbereiche 112_1 bis 112_3 unterteilt und die Durchführung mehrstufiger Nachweisreaktionen ermöglicht.
  • Probenflüssigkeiten können von extern über den konisch zulaufenden Teil des Röhrchens (Spitze) 104 sehr präzise aufgenommen werden und können über einen zentralen schlauchförmigen Kanal 114, der lose dem inneren konischen Bereich 104 aufsitzt, in das erste Kompartiment 112_1 im proximalen (geweiteter) Bereich des Pipetten-Röhrchens 100 gelangen. Der Flüssigkeitstransport ist dadurch gekennzeichnet, dass er primär in Richtung der Zylinder-/Kegelachse, d.h. vertikal mithilfe von Druckdifferenzen und Zentrifugalkräften verläuft. Zwischen den Kompartimenten 112_1 bis 112_3 erfolgt der Flüssigkeitstransport vorzugsweise über Zentrifugalkräfte und in Richtung der Konus-Spitze, so dass die Flüssigkeit eines proximalen Kompartiments über die hydrophobe kapillare Öffnung in das nächstgelegene distale Kompartiment (in Richtung Konus-Spitze) gezwungen wird. Bei mehr als zwei Kompartimenten 112_1 bis 112_3 kann so z.B. durch Variation der Kapillaröffnung (Länge, Weite, Oberfläche) sowie der applizierten Zentrifugalkraft der Transport von Kompartiment zu Kompartiment gesteuert werden. Dies ermöglicht die örtliche und zeitliche Trennung von Reaktionsabläufen.
  • Fig. 3 zeigt eine schematische Ansicht einer Röhre 100 mit einem zu einem Ende 102 der Röhre 100 hin sich verjüngenden Bereich 104 und einer mikrofluidischen Struktur 106, die zumindest teilweise in dem sich verjüngenden Bereich 104 der Röhre 100 angeordnet ist, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Im Vergleich zu dem in Fig. 2a und 2b gezeigten Ausführungsbeispielen, umfasst die mikrofluidische Struktur 106 vier Reaktionskammern 112_1 bis 112_4, die über drei ringförmige Komponenten 116_1 bis 116_3 sowie die bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 gebildet werden.
  • Mit anderen Worten, Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 mit insgesamt 4 Kompartimenten 112_1 bis 112_4, die durch unterschiedlich breite und lange kapillare Spalten/Öffnungen voneinander getrennt sind. Die beiden mittleren Kompartimente (2 und 3) 112_2 und 112_3 besitzen jeweils eine ringförmige Seitentasche 118_1 und 118_2 in denen Flüssigkeit zurückgehalten werden kann, z.B. für separate Reaktionen oder zum Abschöpfen überflüssiger Reaktionslösungen. Zusammen mit Kompartiment 4 (112_4) ergeben sich durch die hier dargestellte Anordnung drei Reaktionsräume mit Sackgassenfunktion. Werden die Schlauchförmigen Kanäle 104 entgegen der Verjüngung bewegt, kann die Flüssigkeit in Richtung Spitze entleert werden.
  • Wie in Fig. 3 zu erkennen ist, kann die in das konische Pipetten-Röhrchen 100 integrierte Mikrofluidik 106 auch so gestaltet werden, dass einzelne Kompartimente 112_2 und 112_3 sackgassenartige Taschen 118_1 und 118_2 bilden. Dadurch können Reaktionslösungen aufgeteilt und vor dem Transport in das nächste Kompartiment volumenmäßig reduziert werden. Das letzte, der Spitze am nächsten gelegene (distale) Kompartiment 112_4 kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es von dem integrierten schlauchförmigen Kanalsystem in Richtung des Konus abgedichtet ist. Hierbei begünstigen die Zentrifugalkräfte für den Flüssigkeitstransport simultan den selbstdichtenden Aufbau. Des Weiteren können die hydrophoben Oberflächen der Kapillarspalten sowie der Aufbau des schlauchförmigen Kanalsystems ein Verdunsten der Flüssigkeit verhindern, so dass selbst Reaktionen im Bereich des Siedepunktes der Reaktionslösung (z.B. PCR (polymerase chain reaction, dt. Polymerase-Kettenreaktion) mit Temperaturen von bis zu über 95°C) über einen langen und praktikablen Zeitraum möglich sind. Das gezielte Freisetzen der Reaktionslösung aus dem distalen (der Spitze zugewandten) Kompartiment kann durch eine Bewegung des schlauchförmigen Kanalsystems 114 entgegen der Verjüngung initiiert werden. In den Kompartimenten selbst, aber auch in den jeweiligen Übergängen/Verbindungen, können Reagenzien (in bevorzugter Weise gefriergetrocknet) vorgelagert werden. Durch das Vorlagern aller für eine Reaktion notwendiger Reagenzien ist nur die Flüssigkeitsaufnahme der zu untersuchenden Probe notwendig. Dies bedeutet, dass Flüssigkeitsproben von nur wenigen Mikrolitern nach einmaliger Aufnahme bis zum Abschluss der Nachweisreaktion in dem konisch zulaufenden Röhrchen (Pipetten-Röhrchen) prozessiert werden können. Je nach Methode kann die Detektion dann im Röhrchen 100 oder nach Freisetzten der Reaktionslösung auch extern stattfinden. Geräte und Gegenstände zur Erzeugung von Druckunterschieden (z.B. Laborpipette), von Zentrifugalkräften und zur Temperierung können zur Bedienung und der Assay-Durchführung verwendet werden. Mögliche Anwendungsbeispiele sind prinzipiell alle mehrstufigen bioanalytische Verfahren der Proben Vor- und Aufbereitung mit Nachweisreaktion. Als bevorzugtes Beispiel wäre hierfür die Nukleinsäure-Analytik zu nennen. Ein einfaches Zwei-Kompartimente-System wäre z.B. die Kombination und Durchführung einer sogenannten flüssigen DNA Extraktion mit anschließender PCR. Ein Beispiel für ein dreistufiges System wäre z.B. eine RT-PCR, bestehend aus Zellaufschluss, Reverse Transkription und PCR in räumlicher Trennung. Weitere Anwendungsbeispiele sind Enzymatische Reaktionen, bei denen die Produkte in einer zeitlichen und räumlichen Trennung für weitere Reaktionen genutzt werden können. Ein weiteres Beispiel wäre auch die Lagerung von Reagenzien in den einzelnen Kompartimenten, die eine Start-Stop-Funktion für die Reaktion ermöglichen.
  • Ausführungsbeispiele schaffen mehrere Vorteile, wie im Folgenden beschrieben wird. Ein Vorteil ist, dass der Aufbau und das Funktionsprinzip der in das Pipetten-Röhrchen integrierten Mikrofluidik bedürfen keiner aufwendigen Prozesse und Verfahren wie sie üblicherweise bei der Mikrostrukturierung von Chipstrukturen angewandt werden. Ferner werden durch die Vertikale Anordnung der Kompartimente sowie der vertikale Flüssigkeitstransportes gängige Probleme der chipbasierten Mikrofluidik gelöst. Hinzu kommt, dass durch die Anordnung des Flüssigkeitstransportes Druckausgleich und Gasblasenbildung, sowie das rasche luftblasenfreie Füllen der Kompartimente keine Probleme darstellen. Darüber hinaus kann die Flüssigkeitsaufnahme manuell und ohne elektrische Pumpen in sehr präziser Weise (z.B. auch über Standard-Laborpipetten) erfolgen. Des Weiteren bleibt die Flüssigkeit bei allen Schritten der Analyse in dem Pipetten-Röhrchen (Einrohrlösung). Eine Transferierung der Probe in die analysierende Mikrofluidik ist nicht nötig. Ferner ermöglicht der selbstdichtende Aufbau der Fluidik innerhalb des Pipetten-Röhrchens sowohl das Zentrifugieren, als auch deren Erhitzen der Reaktionslösung ohne Flüssigkeitsverlust. Ferner kann zur Detektion (fakultativ) die Reaktionslösung schnell und einfach freigesetzt werden. Letztendlich wird durch die Form und das Fehlen elektrischer Schnittstellen eine einfache Parallelisierung, sowie kostengünstige Integration in die Standard-Laborausrüstung ermöglicht.
  • Im Folgenden wird ein Aufbau beschrieben, mit dem mindestens zwei separate Reaktionen, wie z.B. Zelllysen/DNA Extraktion und PCR, in einer Pipettenspitze durchgeführt werden können. Beispielhaft kann eine mikrofluidische Struktur aufgebaut werden, welche (1) eine Filterspitze (z.B. ep Dualfilter T.I.P.S.®), (2) einen Silikonschlauch "lang, dünn" (z.B. Innendurchmesser 0,5 mm; Außendurchmesser 1,3 mm; Länge 25 mm), (3) einen Silikonschlauch "dick, kurz" (z.B. Innendurchmesser 1,58 mm; Außendurchmesser 3,18 mm; Länge 4 mm), (4) anstelle des Dualfilters der Filterspitze kann auch ein kurzes Stück eines zusätzlichen Silikonschlauchs eingesetzt werden (z.B. Innendurchmesser 0,5 mm; Außendurchmesser 3,7mm; Länge 3 mm), und (5) einen Spiraldraht (z.B. tordierter Flachdraht aus Edelstahl 0,1 x 0,5 mm) aufweist. Als Bedienungselemente können dabei (1) eine handelsübliche Pipette (z.B. Eppendorf Research ®), (2) eine Tischzentrifuge (z.B. peqlab ®, PerfectSpin ® Mini Zentrifuge mit Rotor-Einsatz für 0.5 ml Reaktionsgefäße) und (3) ein PCR Gerät für Kapillaren oder Röhrchen (z.B. Roche LightCycler 1.5 ®) zum Einsatz kommen.
  • Fig. 4a zeigt ein Foto und Fig. 4b eine schematische Querschnittsansicht einer Röhre 100 mit einem zu einem Ende 102 der Röhre 100 hin sich verjüngenden Bereich 104 und einer mikrofluidischen Struktur 106, die in zumindest teilweise in dem sich verjüngenden Bereich 104 der Röhre 100 angeordnet ist, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die mikrofluidische Struktur 106 umfasst zwei Reaktionskammern 112_1 und 112_2, die über eine ringförmige Komponenten 116_1 und eine bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 gebildet werden, wie dies bereits in Bezug auf Fig. 2a detailliert beschrieben wurde. Ferner ist in Fig. 4a und 4b ein O-Ring bzw. Filter 120 zu erkennen.
  • Mit anderen Worten, Fig. 4a zeigt eine Fotoaufnahme und Fig. 4b eine schematische Zeichnung die den Aufbau der Fluidik 106 und die dadurch resultierenden Kompartimente 112_1 und 112_2 in der Pipettenspitze 104 zeigen. Bei der Fotoaufnahme wurde zur besseren Sichtbarkeit für die Schläuche blau (erste Schraffur) und für den Gummiring grüngelb-gestreift (zweite Schraffur) verwendet.
  • Fig. 5a-5e zeigen schematische Querschnittsansichten der in Fig. 2 gezeigten Röhre 100 bei bzw. nach Unterschiedlichen Schritten eines Verfahrens zum Untersuchen eines Probenmaterials mit der Röhre 100, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
  • Im Detail zeigt Fig. 5a eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 vor einem Schritt des Aufsaugens des Probenmaterials 130. Wie in Fig. 5a zu erkennen ist, können an einer Innenseite der beweglichen, schlauchförmigen Komponente 114 Lyse Reagenzien 122 vorgelagert werden, während in der zweiten Reaktionskammer 112_2 PCR Reagenzien 124 vorgelagert werden können. Fig. 5b zeigt eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 nach einem Schritt des Aufsaugens des Probenmaterials 130, wodurch das Probenmaterial 130 durch die bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 in die erste Reaktionskammer 112_1 transportiert wurde. Durch den Transport des Probenmaterials durch die bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 ist das Probenmaterial mit den Lyse Reagenzien 122, die an der Innenwand der bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 vorgelagert waren, in Kontakt getreten, wodurch es zu einer ersten bioanalytische Reaktion mit dem Probenmaterial kam. Fig. 5c zeigt eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 bei einem Schritt des Zentrifugierens, wodurch das Probenmaterial von der ersten Reaktionskammer 112_1 in die zweite Reaktionskammer 112_2 gelangt. Fig. 5d zeigt eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 nach dem Schritt des Zentrifugierens, wodurch das Probenmaterial 130 vollständig von der ersten Reaktionskammer 112_1 in die zweite Reaktionskammer 112_2 gelangt ist, wo das Probenmaterial mit den PCR Reagenzien 124 in Kontakt tritt, wodurch es zu einer zweiten bioanalytische Reaktion mit dem Probenmaterial 130 kommt. Fig. 5e zeigt eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 während der zweiten bioanalytischen Reaktion.
  • Mit anderen Worten, Fig. 5a bis 5e zeigen einen beispielhaften schematischen Ablauf im Falle von vorgelagerten Reagenzien (z.B. Gefriergetrocknet) zur flüssigen DNA Extraktion (blau (erste Schraffur), z.B. Lyse von Zellsuspensionen) mit anschließender PCR (gelb (zweite Schraffur). Durch die Wahl geeigneter Lyse Reagenzien 122 können Zelllysat, bzw. DNA Extrakt, direkt mit den Reagenzien 124 der PCR gemischt werden (grün (dritte Schraffur)). Der Reaktionsverlauf kann durch fluoreszierende Farbstoffe (türkis (vierte Schraffur)) sichtbar gemacht werden.
  • Fig. 6a bis 6d zeigen schematische Querschnittsansichten der in Fig. 2 gezeigten Röhre 100 bei bzw. nach Unterschiedlichen Schritten eines Verfahrens zum Entnehmen eines Probenmaterials nach der Durchführung der mehrstufigen bioanalytischen Reaktion, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
  • Im Detail zeigt Fig. 6a eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 nach der Durchführung der mehrstufigen bioanalytischen Reaktion. Wie in Fig. 6a zu erkennen ist, befindet sich nach der mehrstufigen bioanalytischen Reaktion das Probenmaterial 130 (zusammen mit etwaigen Reagenzien) in der zweiten Reaktionskammer 112_2. Fig. 6b zeigt eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 nach einem Schritt des Applizierens einer Entnahmevorrichtung 132 (z.B. eines spiralisierten Drahtes) in die bewegliche, schlauchförmige Komponente 114. Fig. 6c zeigt eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 bei einem Schritt des Verschiebens der bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 durch das Applizieren der Entnahmevorrichtung 132 in die bewegliche, schlauchförmige Komponente 114. Fig. 6d zeigt eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 nach dem Schritt des Verschiebens der beweglichen, schlauchförmigen Komponente 114, wodurch das Probenmaterial 130 aus der Röhre 100 entweichen kann.
  • Mit anderen Worten, Fig. 6a bis 6d zeigen schematische Darstellungen wie nach dem Ende der Reaktion durch nachträgliches Applizieren eines spiralisierten Drahtes 132 die Reaktionsflüssigkeit 130 für weiterführende Untersuchungen freigesetzt werden kann. Der Draht 132 kann im Falle des O-Rings von der Pipettenseite (oben) oder im Falle des Filters von der Spitze (unten) in die Pipettenspitze eingeführt werden. In beiden Fällen soll mit dem Draht 132 der lange, dünne Schlauch 114 nach oben bewegt werden, damit durch Betätigung der Pipette die Flüssigkeit 130 durch die Spitze entweichen kann.
  • Fig. 7a bis 7e zeigen schematische Querschnittsansichten der in Fig. 2 gezeigten Röhre 100 bei bzw. nach Unterschiedlichen Schritten eines Verfahrens zum Untersuchen eines Probenmaterials mit der Röhre 100, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
  • Im Detail zeigt Fig. 7a eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 vor einem Schritt des Aufsaugens des Probenmaterials 130. Wie in Fig. 5a zu erkennen ist, kann die Entnahmevorrichtung 132 (z.B. ein spiralisierter Draht) bereits in die bewegliche, schlauchförmige Komponente eingeführt sein, wobei die Lyse Reagenzien 122 auf der Entnahmevorrichtung 132 vorgelagert sein können. Ferner können in der zweiten Reaktionskammer 112_2 PCR Reagenzien 124 vorgelagert sein. Fig. 7b zeigt eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 nach einem Schritt des Aufsaugens des Probenmaterials 130, wodurch das Probenmaterial 130 durch die bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 in die erste Reaktionskammer 112_1 transportiert wurde. Durch den Transport des Probenmaterials durch die bewegliche, schlauchförmige Komponente 114 ist das Probenmaterial mit den Lyse Reagenzien 122, die auf der Entnahmevorrichtung 132 vorgelagert waren, in Kontakt getreten, wodurch es zu einer ersten bioanalytische Reaktion mit dem Probenmaterial kam. Fig. 7c zeigt eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 bei einem Schritt des Zentrifugierens, wodurch das Probenmaterial von der ersten Reaktionskammer 112_1 in die zweite Reaktionskammer 112_2 gelangt. Fig. 7d zeigt eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 nach dem Schritt des Zentrifugierens, wodurch das Probenmaterial 130 vollständig von der ersten Reaktionskammer 112_1 in die zweite Reaktionskammer 112_2 gelangt ist, wo das Probenmaterial mit den PCR Reagenzien 124 in Kontakt tritt, wodurch es zu einer zweiten bioanalytische Reaktion mit dem Probenmaterial 130 kommt. Fig. 5e zeigt eine schematische Querschnittsansicht der Röhre 100 nach der zweiten bioanalytischen Reaktion und dem Verschieben der beweglichen, schlauchförmigen Komponente, wodurch das Probenmaterial aus der Röhre 100 entweichen kann.
  • Mit anderen Worten, Fig. 7a bis 7e zeigen schematische Darstellungen einer Anwendung ähnlich der Fig. 5a bis 5e. In diesem Fall ist der Draht 132 schon zu Beginn Teil der Fluidik. Die Lyse Reagenzien 124 werden in diesem Fall sogar auf der Oberfläche des Drahtes 132 vorgelagert und beim Aufsaugen der Probe 130 von diesem abgewaschen. Ein Vorteil hierbei ist eine bessere Durchmischung der Lyse Reagenzien 122 mit der Probe 130 und ein einfacheres Einbringen der Lyse Reagenzien 122. Der weitere Verlauf ist wie bei Fig. 5b bis 5e beschrieben, zusätzlich ist jedoch die Funktion von wie unter Fig. 6a bis 6d beschrieben bereits integriert.
  • Fig. 8 zeigt eine Fotoaufnahme einer Pipettenspitze (Lab in a Pipette Tip, dt. Labor in einer Pipettenspitze) durch eine Filterscheibe. In der Pipettenspitze befindet sich ein PCR Produkt mit dem Farbstoff SYBR Green I der im Wellenlängenbereich von Fluorescein mit blauem Licht (∼495nm) angeregt werden kann und grünes Licht (∼520 nm) abgibt.
  • Fig. 9 zeigt eine Fotoaufnahme einer Gelelektrophorese (1,5 % Agarose; 70 V; 45 min.) von zwei PCR Produkten. Die Positivkontrolle (Pos.) wurde in einer Kunststoffkapillare temperiert. Bei der PCR in einer Pipettenspitze (PCR in tip) wurde die Pipettenspitze mit 10 µl der PCR Lösung gefüllt. Die Temperierung erfolgte in einem Roche LightCycler 1.5 ®.
  • Fig. 10 zeigt ein Flussdiagramm eines Verfahrens 200, gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Das Verfahren 200 umfasst einen Schritt 202 des Aufnehmens eines Probenmaterials durch eine Öffnung einer Röhre, wobei die Röhre einem zu einem Ende der Röhre hin, die die Öffnung bildet, einen verjüngenden Bereich aufweist. Ferner umfasst das Verfahren einen Schritt 204 des Durchführens einer mehrstufigen bioanalytischen Reaktion mit einer mikrofluidischen Struktur, die innerhalb der Röhre in dem verjüngenden Bereich der Röhre angeordnet ist und mit der Öffnung verbunden ist.
  • Im Gegensatz zu herkömmlichen Konzepten, bei denen die Pipettenspitze nur als Ergänzung/Erweiterung gesehen wird, stellt diese bei Ausführungsbeispielen einen essentiellen Teil des analysierenden Systems und der Fluidik dar. Bei Ausführungsbeispielen wird das Probenröhrchen (Pipettenspitze) selbst zur Fluidik mit zumindest zwei Reaktionsräumen (=experimentelle Einheit). Dies bedeutet auch, dass nicht eine experimentelle Einheit in die Spitze eingefügt wird, sondern die Spitze selbst essentieller Teil der Analytischen Struktur ist.
  • Obwohl manche Aspekte im Zusammenhang mit einer Vorrichtung beschrieben wurden, versteht es sich, dass diese Aspekte auch eine Beschreibung des entsprechenden Verfahrens darstellen, sodass ein Block oder ein Bauelement einer Vorrichtung auch als ein entsprechender Verfahrensschritt oder als ein Merkmal eines Verfahrensschrittes zu verstehen ist. Analog dazu stellen Aspekte, die im Zusammenhang mit einem oder als ein Verfahrensschritt beschrieben wurden, auch eine Beschreibung eines entsprechenden Blocks oder Details oder Merkmals einer entsprechenden Vorrichtung dar. Einige oder alle der Verfahrensschritte können durch einen Hardware-Apparat (oder unter Verwendung eines Hardware-Apparats), wie zum Beispiel einen Mikroprozessor, einen programmierbaren Compu-ter oder eine elektronische Schaltung ausgeführt werden. Bei einigen Ausführungsbeispie-len können einige oder mehrere der wichtigsten Verfahrensschritte durch einen solchen Apparat ausgeführt werden.
  • Die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele stellen lediglich eine Veranschaulichung der Prinzipien der vorliegenden Erfindung dar. Es versteht sich, dass Modifikationen und Variationen der hierin beschriebenen Anordnungen und Einzelheiten anderen Fachleuten einleuchten werden. Deshalb ist beabsichtigt, dass die Erfindung lediglich durch den Schutzumfang der nachstehenden Patentansprüche und nicht durch die spezifischen Einzelheiten, die anhand der Beschreibung und der Erläuterung der Ausführungsbeispiele hierin präsentiert wurden, beschränkt sei.
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Claims (13)

  1. Röhre (100), mit folgenden Merkmalen:
    einem zu einem Ende (102) der Röhre (100) hin verjüngenden Bereich (104);
    einer Öffnung (108) an dem Ende (102) der Röhre (100) zum Aufnehmen eines Probenmaterials; und
    einer mikrofluidischen Struktur (106), die innerhalb der Röhre (100) in dem verjüngenden Bereich (104) der Röhre (100) angeordnet ist und die mit der Öffnung (108) verbunden ist, wobei die mikrofluidische Struktur (106) ausgebildet ist, um mit dem Probenmaterial eine mehrstufige bioanalytische Reaktion durchzuführen;
    wobei die mikrofluidische Struktur (106) zumindest zwei Reaktionskammern (112_1:112_3) zur Durchführung der mehrstufigen bioanalytischen Reaktion aufweist;
    wobei die mikrofluidische Struktur (106) zumindest eine ringförmige Komponente (116_1:116_2) aufweist, die an einer Innenwand der Röhre (100) anliegt; und
    wobei die mikrofluidische Struktur (106) eine bewegliche, schlauchförmige Komponente (114) aufweist, die in dem verjüngenden Bereich (104) der Röhre (100) an der Innenwand der Röhre (100) und zumindest teilweise an der zumindest einen ringförmigen Komponente (116_1;116_2) anliegt, um die zumindest zwei Reaktionskammern (112_1:112_3) zu bilden, wobei die bewegliche, schlauchförmige Komponente (114) mit der Öffnung (108) verbunden ist; und
    wobei die Röhre (100) eine Spitze einer Pipette oder eine Pipette ist.
  2. Röhre (100) nach Anspruch 1, wobei die mikrofluidische Struktur (106) ausgebildet ist, um die mehrstufige bioanalytische Reaktion sequentiell durchzuführen.
  3. Röhre (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die mikrofluidische Struktur (106) ausgebildet ist, um die mehrstufige bioanalytische Reaktion in zeitlich getrennten Schritten durchzuführen.
  4. Röhre (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die zumindest zwei Reaktionskammern (112_1:112_3) voneinander getrennt sind.
  5. Röhre (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei in zumindest einer der zumindest zwei Reaktionskammern (112_1:112_3) ein analytisches Reagenz (122;124) für die mehrstufige bioanalytische Reaktion vorgelagert ist.
  6. Röhre (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei in den zumindest zwei Reaktionskammern (112_1:112_3) analytische Reagenzien (122; 124) vorgelagert sind;
    wobei die fluidische Struktur (106) ausgebildet ist, um die analytischen Reagenzien (122;124) mit dem Probenmaterial in zeitlicher Reihenfolge zur Reaktion zu bringen, um die mehrstufige bioanalytische Reaktion durchzuführen.
  7. Röhre (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die bewegliche, schlauchförmige Komponente (114) so an der zumindest einen ringförmigen Komponente (116_1;116_2) anliegt, dass die gebildeten zumindest zwei Reaktionskammern (112_1:112_3) durch Öffnungen hydrophober Oberflächen oder hydrophobe kapillare Öffnungen voneinander getrennt sind.
  8. Röhre (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die bewegliche, schlauchförmige Komponente (114) entnehmbar oder verschiebbar ist, um das Probenmaterial nach der Durchführung der mehrstufigen bioanalytischen Reaktion aus der Röhre (100) zu entnehmen.
  9. Röhre (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die mikrofluidische Struktur (106) oder zumindest eine Komponente der mikrofluidischen Struktur (106) beweglich oder verschiebbar ausgebildet ist.
  10. Verfahren (200) zur Durchführung einer mehrstufigen bioanalytischen Reaktion mit einer Röhre (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Verfahren aufweist:
    Aufnehmen (202) eines Probenmaterials durch die Öffnung der Röhre (100); und
    Durchführen (204) der mehrstufigen bioanalytischen Reaktion mit der mikrofluidischen Struktur der Röhre (100).
  11. Verfahren (200) nach Anspruch 10, wobei das Verfahren (200) ferner aufweist:
    Transportieren des Probenmaterials bei der Aufnahme des Probenmaterials durch die mikrofluidische Struktur (106) in eine erste Richtung; und
    Transportieren des Probenmaterials zur Durchführung der mehrstufigen bioanalytische Reaktion durch die mikrofluidische Struktur (106) in eine zweite Richtung;
    wobei die erste Richtung und zweite Richtung entgegengesetzt sind.
  12. Verfahren (200) nach einem der Ansprüche 10 bis 11, wobei das Verfahren (200) ferner aufweist:
    Transportieren des Probenmaterials durch die mikrofluidische Struktur (106) durch Druckdifferenzen und/oder Zentrifugalkräfte.
  13. Verfahren (200) nach Anspruch 12, wobei die bewegliche, schlauchförmige Komponente (114) so an der zumindest einen ringförmigen Komponente (116_1;116_2) anliegt, dass die gebildeten zumindest zwei Reaktionskammern (112_1:112_3) durch Öffnungen hydrophober Oberflächen oder hydrophobe kapillare Öffnungen voneinander getrennt sind, wobei das Verfahren (200) ferner aufweist:
    Steuern des Transports des Probenmaterials zwischen den zumindest zwei Reaktionskammern (112_1:112_2) durch Variation der Kapillaröffnung und/oder der applizierten Zentrifugalkraft.
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