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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Probenaufbereitungsplatte, die
verwendet wird, um eine Probe für
die Massenspektrometrie aufzubereiten. Insbesondere betrifft die
vorliegende Erfindung eine Probenplatte, die dazu verwendet wird,
sowohl eine Probe zu konzentrieren als auch Verunreinigungen aus
der Probe zu entfernen, während
eine einfache Handhabung von kleinen flüssigen Tröpfchen auf einer Oberfläche mit
einem minimalen Probenverlust bereitgestellt wird.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
massenspektrometrische Analyse von Analyten, wie beispielsweise
von kleinen Molekülen sowie
großen
Biomolekülen,
wie beispielsweise Proteine und Oligonukleotide, beinhaltet oftmals
eine Probenaufbereitung. Eine Grundregel lautet dabei, dass je sauberer
eine Probe vor der Analyse ist, desto besser ist oftmals das analytische
Ergebnis, das erhalten wird.
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Zur
Zeit wird die Probenpurifikation von Proben, die für eine massenspektrometrische
Analyse mit geringen Volumina, d.h. < 100 μl, vor dem Einbringen der Probe
in ein Massenspektrometer unter Verwendung einer Ionisationstechnik,
wie beispielsweise MALDI oder ein statisches Nanospray-Verfahren, bestimmt
sind, oftmals unter Verwendung von ZipTips®-Pipettensäulen von
der Millipore Corporation durchgeführt. Alternativ werden Mikrosäulen, die
mittels Gel-Ladespitzen hergestellt werden, oder kurze Stücke aus
Quarzglas, die mit einer chromatographischen stationären Phase
gepackt sind, verwendet, um die Probe zu reinigen. Beim statischen
Nanospray-Verfahren besteht das Ziel darin, die Probe mittels Elektrospray-Ionisation mit kleinen
Flussraten (20 bis 40 Nanoliter/Minute) von einem kleinen Probenanfangsvolumen
(ungefähr
1 bis 5 μl)
einzubringen, was eine ausgedehnte MS-Analysezeitdauer ermöglicht.
Dies wird erreicht, indem die Probe in einem Nanospray-Emitter angeordnet
wird, wobei es sich um eine ausgezogene Borsili katglasspitze handeln
kann, die mit einer leitfähigen
Beschichtung beschichtet ist, oder um eine "Düse" in einem Array aus mikrohergestellten
Düsen.
ZipTips-Säulen
oder andere hergestellte Mikrosäulen
werden momentan für die
Entfernung von Verunreinigungen vor der massenspektrometrischen
Analyse verwendet.
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Ein
Problem, das sich dem Praktiker bei der Anwendung von ZipTips-Säulen oder
Mikrosäulen
für die
Aufbereitung von Proben stellt, ist eine geringe Ausbeute insbesondere
beim Vorhandensein von Puffern, Reinigungsmitteln, Salzen und Chaotropen, wie
beispielsweise Tris, Natriumdodecylsulfat (SDS), Harnstoff und dergleichen.
Beispielsweise neigen Peptide, die nach einer Spaltung von getrennten
Proteinen in einem Gel aus eindimensionalen oder zweidimensionalen
Gelen extrahiert worden sind, wobei die Gele ungefähr 0,1%
SDS enthalten, dazu, unter Verwendung von ZipTips-Säulen oder
Mikrosäulen eine
geringe Ausbeute aufzuweisen. Ferner führt das Ansaugen von Proben
durch das gepackte Bett der ZipTips-Säule oftmals dazu, dass Probe
verloren geht.
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Darüber hinaus
ist die Verwendung von ZipTips-Pipettensäulen beim Konzentrieren einer
Probe (> 1,5 μl) sehr beschränkt. Die
für ZipTips-Säulen bestehenden
Beschränkungen
bestehen ebenso bei Aufbereitungen mit Mikrosäulen. Um die Konzentration
einer Probe unter Verwendung von ZipTips-Säulen oder einer Mikrosäule zu steigern,
müssen
mehrere Schritte dazu unternommen werden, eine Probe durch eine
dieser Vorrichtungen zu führen.
Wenn diese mehreren Schritte durchgeführt werden, dann kann mehr
und mehr der Probe verloren gehen, was zu einer schlechten Ausbeute
führt.
Ferner führt
ein Ansaugen einer Probe durch eine Zip-Tips-Säule oder eine Mikrosäule oftmals
dazu, dass Luft in das Packbett eingebracht wird, was zu einer schlechten Retention/Ausbeute
der untersuchten Analyten führt.
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Ein
weiteres Problem, das sich Praktikern auf diesem Gebiet stellt,
ist die Schwierigkeit, Mikrolitervolumina durch ZipTips-Säulen oder
eine Mikrosäule
mit dem gleichzeitigen Probenverlust zu bearbeiten.
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Momentan
besteht ein Bedarf für
eine Probenaufbereitungsvorrichtung, die wirksam Verunreinigungen
aus der Probe entfernt, die Probe konzentriert und eine einfache
Bearbeitung bzw. Handhabung von kleinen Flüssigkeitsvolumina erlaubt.
Die vorliegende Erfindung stellt sich den vorstehend erwähnten Problemen
und liefert eine Lösung,
die wirksam die dem Stand der Technik anhaftenden Nachteile überwindet.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Probenaufbereitungsplatte, die
verwendet wird, um eine Probe für
die massenspektrometrische Analyse aufzubereiten. Insbesondere betrifft
die vorliegende Erfindung eine Probenplatte, die dazu verwendet
wird, eine Probe zu konzentrieren und Verunreinigungen aus der Probe
zu entfernen, während
gleichzeitig eine einfache Bearbeitung bzw. Handhabung von kleinen
Flüssigkeitströpfchen auf
einer Oberfläche mit
einem minimalen Probenverlust ermöglicht wird.
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Gemäß einer
Ausführungsform
wird eine Probenplatte für
die massenspektrometrische Analyse beschrieben, die eine Plattform
umfasst. In dieser Ausführungsform
besteht die Plattform aus einem ebenen Substrat. Das Substrat umfasst
hydrophobe Bereiche und hydrophile Bereiche. Die hydrophilen Bereiche
sind Zielbereiche zum Aufnehmen eines flüssigen Probentröpfchens.
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In
einer Ausführungsform
wird eine Probenplatte für
die massenspektrometrische Analyse beschrieben, die eine Plattform
umfasst. In dieser Ausführungsform
besteht die Plattform aus einem Substrat, in dem eine oder mehrere
Vertiefungen angeordnet sind. Jede dieser Vertiefungen weist einen
hydrophoben Wandbereich und einen hydrophilen Bodenbereich auf.
Diese Vertiefungen sind dazu gedacht, Proben aufzunehmen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird ein Verfahren zum Aufbereiten einer Probe für die massenspektrometrische
Analyse beschrieben. Dieses Verfahren umfasst das Bereitstellen
einer Probenplatte gemäß der vorliegenden
Erfindung. Sodann wird eine flüssige
Probe auf die hydrophilen Stellen entlang eines ebenen Substrats
aufgebracht, das hydrophobe und hydrophile Bereiche aufweist. Alternativ
wird die flüssige
Probe auf eine Vertiefung innerhalb der Probenplatte aufgebracht,
die eine Vielzahl von Vertiefungen umfasst. Dann wird der Probe
erlaubt, zu trocknen, so dass jedwedes restliche Probenmaterial
innerhalb der hydrophoben Vertiefung konzentriert wird.
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Gemäß einem
besonderen Aspekt dieser Ausführungsform
wird ein Tröpfchen
von Lösungsmittel
zu einer Probenplatte hinzugefügt,
wo Lösungsmittel
zu der getrock neten Probe zugeführt wird,
und wird sodann zu einer leitfähig
beschichteten gezogenen Spitze einer Borosilikatglaskapillare für eine statische
Nanospray-Analyse überführt.
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Gemäß einem
weiteren besonderen Aspekt dieser Ausführungsform wird ein Tröpfchen von
Lösungsmittel
der getrockneten Probe zugefügt,
die sich auf der Probenplatte befindet. Die flüssige Probe wird sodann auf
eine MALDI-Target-Platte überführt. Sobald
sich diese auf der Target-Platte befindet, wird sodann eine MALDI-Matrix in Vorbereitung
der MALDI-MS-Analyse zugefügt.
Dies trifft ebenso für
Fälle zu,
wo das UV-absorbierende Molekül
kovalent an der Oberfläche
gebunden ist und somit einen integralen Teil des Substrats ausmacht.
Alternativ kann eine DIOS-Prozedur (direkte Ionisierung auf Silizium;
direct ionization on silicon) verwendet werden, wo es sich bei der
Matrix um ein poröses
oder ein nicht poröses
Siliziumsubstrat handelt.
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Bei
einem noch weiteren Aspekt dieser Ausführungsform wird ein Tröpfchen von
Lösungsmittel auf
die getrocknete Probe aufgebracht. Sodann wird die flüssige Probe
zu einem Probengefäß für eine weitere
Analyse überführt. Die
weitere Analyse kann beispielsweise daraus bestehen, dass die Probe
einer LC/MS unterzogen wird, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Zusätzlich kann
die Probe Nanospray, automatisiertem Nanospray, MALDI und dergleichen unterzogen
werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1(a) zeigt eine Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung und 1(b) zeigt eine einzelne
Vertiefung.
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2 zeigt eine weitere Ausführungsform, wobei
das Substrat eine ebene Struktur ist. 2(a) zeigt
einen Aspekt der vorliegenden Ausführungsform und 2(b) zeigt
eine perspektivische Seitenansicht dieser Ausführungsform.
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3 zeigt
ein Flussdiagramm, das eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung darstellt.
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4 zeigt
ein Flussdiagramm, das eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung darstellt, die eine robotische Vorrichtung
verwendet.
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5 zeigt
ein Nanospray-Massenspektrum einer tryptischen Spaltung von BSA
in situ, die unter Verwendung der Probenplatte gemäß der vorliegenden
Erfindung durchgeführt
worden ist.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Probenaufbereitungsplatte, die
verwendet wird, um eine Analytenprobe für eine massenspektrometrische Analyse
aufzubereiten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine
Probenplatte, die verwendet wird, um eine Probe zu konzentrieren,
die einen oder mehrere Analyten enthält, und um eine Probe zu reinigen
bzw. zu purifizieren, indem Verunreinigungen entfernt werden, während eine
einfache Bearbeitung bzw. Handhabung von kleinen Flüssigkeitströpfchen auf
einer Oberfläche
mit einem minimalen Probenverlust ermöglicht wird.
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Die
Probe gemäß der vorliegenden
Erfindung kann Proteine, Peptide, Nukleinsäuren und andere kleinere Moleküle von biologischem
Interesse, wie beispielsweise Arzneimittel, Arzneimittelmetaboliten
usw. umfassen, die außerdem
von einem Material gebunden werden können, das in dem hydrophilen
Vertiefungsbereich enthalten ist. Die Probe kann Verunreinigungen
enthalten, wie beispielsweise Salz, Harnstoff usw., die während der
Probenaufbereitung eliminiert werden.
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1 zeigt eine Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung. Anders als bei bekannten Probenplatten weist die Probenplatte 10 gemäß der vorliegenden
Erfindung eine Plattform 14 auf, in der eine Vielzahl von
Vertiefungen 12 definiert sind. Gemäß einem Aspekt dieser Ausführungsform
kann es sich bei der Plattform 10 um eine Mikrotiterplatte
mit 96 Vertiefungen handeln. Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung handelt es sich bei der Plattform 10
um eine Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen. Die vorliegende Erfindung
umfasst jedwede Mikroplattentiterkonfiguration. Es ist wünschenswert,
dass jede Vertiefung eine Volumenkapazität von ungefähr 0,5 μl bis ungefähr 100 μl aufweist. Die Vertiefungen in
einer Ausführungsform
sind kegelförmig
mit einem hydrophilen Boden (Bodenbereich) und hydrophoben Wänden. Die
Form der Vertiefung muss nicht kegelförmig sein, sondern könnte ebenso
kreisförmig
sein oder eine beliebige geometrische Konfiguration annehmen. Bei
dieser Ausführungsform
ist lediglich wichtig, dass unabhängig von der Konfiguration
die Plattform Vertiefungen definiert, die einen hydrophoben Wandbereich
und einen hydrophilen Bodenbereich aufweisen.
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Das
Substrat, das die Plattform 14 ausbildet, kann bestehen
aus, ist jedoch nicht beschränkt
auf Kunststoff, Polyprolen, PTFE, Teflon, Edelstahl, Aluminium,
Glas, Silizium und dergleichen. 1b zeigt eine
Darstellung einer einzelnen Vertiefung 12 mit einem Flüssigkeitströpfchen 22,
das darin angeordnet ist. Die Vertiefungen 12 beherbergen
wirksam ein Flüssigkeitströpfchen 22,
das innerhalb der Vertiefung angeordnet ist. Die Vertiefung 12 weist
einen hydrophoben Wandbereich 16 in Umfangsrichtung auf. Unter
hydrophob wird eine Oberfläche
verstanden, die nicht befeuchtet werden kann und flüssigkeitsabweisend
ist, einschließlich
solcher Flüssigkeiten,
die organischer Natur sind. Dieser Wandbereich 16 besteht
aus hydrophobem Material, wie beispielsweise Teflon, PDMF und/oder
anderen hydrophoben Substanzen, die bekannt sind. Wenn ein Flüssigkeitströpfchen 22 zu
einer Vertiefung 12 hinzugefügt wird, die diesen hydrophoben
Wandbereich 16 aufweist, dann gibt es eine thermodynamische
Abstoßungskraft
zwischen dem Vertiefungsbereich 16 der Vertiefung 12 und
der Oberfläche
des Flüssigkeitströpfchens.
Diese Abstoßung
fördert
die strukturelle Integrität
des wässrigen
Tröpfchens.
Das Tröpfchen 22 muss
in der Vertiefung 12 verankert werden. Dies wird durch
einen hydrophilen Bereich 18 erreicht, der aus hydrophilen
Materialien besteht, wie beispielsweise Polystyrol und/oder anderen
hydrophilen bekannten Substanzen. Die hydrophile Oberfläche des Bodenbereichs 18 bildet
polare Wechselwirkungen mit polaren Gruppen aus, die an der Oberfläche des Tröpfchens 22 vorhanden
sind. Diese nicht kovalenten Wechselwirkungen sind ausreichend,
um das Tröpfchen 22 innerhalb
der Vertiefung 12 an Ort und Stelle zu halten. Unter hydrophil
wird eine Oberfläche verstanden,
die befeuchtet werden kann, einschließlich mittels nicht-wässriger
Flüssigkeiten.
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In
einer Ausführungsform
kann die Oberfläche
eines Substrats unter Verwendung von beispielsweise Teflon beschichtet
werden. Die Beschichtung kann aufgesprüht werden oder mittels eines
Wärmeschrumpfens
aufgebracht werden. Bei dem genauen Aufbringungsvorgang kann es
sich um ein bekanntes Verfahren handeln. Die beschichtete Struktur
kann ein mikrofeines oder ein strukturiertes Aussehen aufweisen.
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2 zeigt eine weitere Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung. Bei dieser Ausführungsform handelt es sich
bei der Probenaufbereitungsplatte um eine ebene Fläche. Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst eine Oberfläche der
Platte 10' hydrophile
Zonen 24 und hydrophobe Zonen 26 (siehe 2a).
Die hydrophoben Zonen (oder Bereiche) 26 können aus
einer hydrophoben Substanz, wie beispielsweise Teflon, bestehen.
Andere hydrophobe Substanzen können
ebenso verwendet werden. Die hydrophilen Zonen 24 entlang
einer Oberfläche
der Platte 10' können aus
Polystyrol oder aus anderen hydrophilen Substanzen bestehen. 2b zeigt
eine Seitenansicht der Probenplatte 10'. In 2b dient
das Substrat 28 als die Basis für die Platte 10'. Auf einer
Oberfläche
des Substrats 28' liegen
die hydrophoben Zonen 26 und die hydrophilen Zonen 24.
Die hydrophilen Bereiche 24 dienen dazu, einen wässrigen
Flüssigkeitstropfen,
der eine Probe eines oder mehrerer Analyten enthält, zu verankern, während die
hydrophoben Bereiche 26 die Aufrechterhaltung der strukturellen
Tröpfchenintegrität befördern. Das
Substrat 28 kann aus Kunststoff, Polymer, Edelstahl, Aluminium,
Glas, Silizium oder dergleichen bestehen. Optional können Wände (nicht
gezeigt) um den Umfang der Probenplatte 10' angeordnet sein. Wenn diese Wände vorhanden
sind, dann bestehen diese typischerweise aus einer hydrophoben Substanz,
wie beispielsweise Teflon. Die Ausrichtung der zwei Bereiche an
der Oberfläche
muss nicht genau sein. Das hydrophile Material kann ein wenig über dem
umgebenden hydrophoben Bereich abstehen oder die Oberfläche des
hydrophilen Materials kann ein wenig unterhalb angeordnet sein.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
das Konzentrieren einer Probe, das Entfernen von Verunreinigungen
und vereinfacht die Bearbeitung bzw. Handhabung von geringen Flüssigkeitsmengen
ohne den gleichzeitigen Verlust von Probe. Die Probe wird aufgrund
der Oberflächenspannung
des Probentröpfchens
konzentriert. Wenn das Lösungsmittel
verdampft, dann werden die Analyten zu dem hydrophilen Bereich der
Vertiefung gezogen. Die Analyten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf
Proteine, Peptide, kleine Moleküle
von biologischem Interesse, die mit dem hydrophilen Material eine
Verbindung eingehen können.
Die Analyten gehen mit dem hydrophilen Abschnitt der Vertiefung
eine Bindung ein. Wenn die Probenplatte gewaschen wird, dann werden
Verunreinigungen entfernt, während
die Analyten unversehrt bleiben. Die Proben, die entlang der Probenplatte
angeordnet sind, können
unter Verwendung beispielsweise einer Pipette ohne Weiteres verarbeitet
werden. Da es gemäß der vorliegenden
Erfindung keine Schritte gibt, die Vorrichtungen mit gepackten Betten
involvieren, wird der Probenverlust auf ein Mindestmaß beschränkt.
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Gemäß einer
Ausführungsform
wird ein Verfahren zum Aufbereiten einer Probe für die massenspektrometrische
Analyse beschrieben. Ein Flüssigkeitströpfchen 22,
das möglicherweise
die untersuchte Probe enthält,
wird auf der Probenplatte 10 gemäß der vorliegenden Erfindung
angeordnet (siehe 1). Die Probenplatte 10 umfasst
eine oder mehrere Vertiefungen 12. Jede Vertiefung 12 definiert
einen hydrophoben Wandbereich 16 und einen hydrophilen
Bodenbereich 18 (siehe 1b). Das
Flüssigkeitströpfchen 22 ist
innerhalb einer oder mehrerer Vertiefungen 12 angeordnet.
Der Probe wird es sodann ermöglicht,
innerhalb der Vertiefungsstruktur 12 zu trocknen. Es kann
der Probe ermöglicht
werden, bei Atmosphärentemperatur
und Atmosphärendruck zu
trocknen, oder erhöhte
Temperaturen können
verwendet werden, um die Probe zu trocknen, die in einem Bereich
von ungefähr
30°C bis
ungefähr
60°C liegen
können.
Um beim Trocknungsprozess behilflich zu sein, kann die Probenplatte 10,
die die Probe enthält,
unter Verwendung einer Vakuumvorrichtung einem geringeren Druck
ausgesetzt werden. Ferner kann Wärme
auf die Probenplatte aufgebracht werden, während ein Vakuum aufgebracht
wird. Wenn beispielsweise eine Probenaufbereitung eine bedeutende
Menge Salz enthält,
dann kann es vorteilhaft sein, ein Vakuum zu verwenden, um das Trocknen des
Probentröpfchens
zu erleichtern. Wenn die Analyten sich bei erhöhten Temperaturen zersetzen, dann
kann das Anwenden eines Vakuums bei der Entfernung von Verunreinigungen
behilflich sein. Die Verwendung eines Vakuums ermöglicht es,
niedrige Temperaturen beim Trocknen zu verwenden.
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Alternativ
handelt es sich bei der Probenplatte 10' gemäß der vorliegenden Erfindung
um eine Oberfläche,
die ein Substrat 28 umfasst, auf der sich hydrophile Zonen 24 und
hydrophobe Zonen 26 befinden (siehe 2).
Ein Flüssigkeitströpfchen,
das eine zu untersuchende Analytenprobe enthält, wird auf der Probenplatte 10' und vorzugsweise
auf einer oder mehreren hydrophilen Zonen 24 angeordnet.
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Im
Gebrauch wird eine Probenplatte, und zwar entweder eine Probenplatte,
die Vertiefungen enthält,
oder eine Probenplatte, die keine Vertiefungen enthält, zunächst mit
einem Lösungsmittel
vorbehandelt, um die Arbeitsfläche
zu reinigen (d.h. die Fläche,
auf der die Probe angeordnet werden soll). Typischerweise wird Methanol
oder Acetonitril mit ungefähr
0,1 bis 1,0% Ameisensäure
(oder ~ 0,1 bis 1,0% Trifluorsäure, "TFA" oder ~ 0,1 bis 2,0%
Essigsäure)
zum Vorbehandeln der Fläche
verwendet. Die Arbeitsfläche
der Platte wird sodann getrocknet. Die Probe, die die zu untersuchenden
Analyten enthält, wird
sodann auf der Arbeitsfläche
der Platte entweder in einer Vertiefung oder auf einer hydrophilen Stelle
angeordnet. Die Probe muss einen pH-Wert aufweisen, der kleiner
als 4,0 ist, wobei dieser Wert des gesamten Prozesses beibehalten
werden muss, indem flüchtige
organische Säuren
zugefügt
werden. Das Zuführlösungsmittel,
in dem die Probe enthalten ist, umfasst beispielsweise ungefähr 0,1 bis
1,0% Ameisensäure
oder ungefähr
0,1 bis 1,0% TFA oder ungefähr
0,1 bis 2,0% Essigsäure
mit einer organischen Komponente, die bis zu ungefähr 30% des
Lösungsmittels
ausmacht. Methanol oder Acetonitril sind lediglich zwei Beispiele
für geeignete
Lösungsmittel,
die in dem Zuführlösungsmittel
verwendet werden können.
Im Fall von Polystyrol oder anderen hydrophilen Bindematerialien
kann ein Modifikator (modifier), wie beispielsweise ein Reinigungsmittel (beispielsweise
0,1% SDS) oder ein Denaturierungsmittel (beispielsweise Harnstoff)
oder chaotropische Mittel zu dem Zuführlösungsmittel hinzugefügt werden,
um die Bindung der gewünschten
Analyten an die Oberfläche
zu verstärken.
Da dieser Modifikator sodann beim Waschschritt entfernt wird, wird
dieser nicht die Qualität
des MS-Spektrums beeinflussen. Die Probe kann somit getrocknet werden.
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Anschließend kann
ein Waschlösungsmittel verwendet
werden. Dieses Waschlösungsmittelumfasst
ungefähr
0,1 bis 1,0% Ameisensäure
oder ungefähr
0,1 bis 1,0% TFA oder ungefähr
0,1 bis 2,0% Essigsäure.
Nach dem Waschschritt kann die Probe unter Verwendung eines Extraktionslösungsmittels extrahiert
werden. Ein Beispiel für
ein Extraktionslösungsmittel
ist Acetonitril oder Methanol (~ 5 bis 100%). Ein besonderes Beispiel
für ein
Extraktionslösungsmittel
ist eine Lösung,
die ungefähr
70% Acetonitril und ungefähr
0,1 bis 10% Ameisensäure
umfasst.
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Als
ein illustratives Beispiel stellt 3 ein Flussdiagramm
für die
Verwendung der vorliegenden Erfindung dar, wobei es sich bei der
Probe um ein Protein handelt. Sobald Proteine gebunden sind, können diese
immobilisiert werden, um somit eine selektive Purifikation des Proteins
aus einer Lösung zu
ermöglichen,
was es möglich
macht, dass eine proteolytische Spaltung in situ durchgeführt wird.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber herkömmlichen Proteinspaltungsansätzen, wie
beispielsweise eine Spaltung in der Lösung, besteht darin, dass alle
Spaltungsschritte, einschließlich
der Purifikation, der Konzentration, der Reduktion, der Alkylierung
und der Spaltung auf der einen Fläche durchgeführt werden.
Ferner werden reduzierende und alkylierende Mittel, die zu einer
Inaktivierung von Enzymen führen
können,
ohne Weiteres vor der Spaltung von der hydrophoben Oberfläche entfernt. Zusätzliche
Vorteile gegenüber
herkömmlichen
Spaltungstechniken umfassen: minimaler Probenverlust; Proteindialyse
ist nicht erforderlich; selektives Entfernen von Peptiden nach der
Spaltung sowie gesteigerte Reaktionsraten mit gesteigerten Reagenzkonzentrationen.
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In 3 wird
die Probe, die eine Proteinlösung
enthält,
auf der Oberfläche
der Probenaufbereitungsplatte gemäß der vorliegenden Erfindung
angeordnet. Einige Proteinproben erfordern entweder eine Reduktion
oder eine Alkylierung. Dies könnte nach
dem Anordnen der Probe auf der Probenplatte durchgeführt werden.
Das Hinzufügen
eines organischen Lösungsmittels
kann dabei behilflich sein, das Protein auf der Platte zu immobilisieren.
Geeignete organische Lösungsmittel
umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Acetonitril, Methanol,
Isopropylalkohol oder Kombinationen davon. Die Konzentration dieser
Lösungsmittel
kann im Bereich von 0,1% bis 100% liegen. Das organische Lösungsmittel
wird letztendlich verdampfen. Das immobilisierte Protein kann sodann
beispielsweise mit 0,1% Ameisensäure (oder
dessen Äquivalent)
gewaschen werden. Nach dem Waschen kann ein proteolytisches Enzym
unter für
die Proteolyse geeigneten Bedingungen zu der immobilisierten Probe
hinzugefügt
werden. Dieser proteolytische Schritt erzeugt kleinere Peptidproben mittels
des Ausgangsproteins. Diese Peptidproben können sodann auf der Platte
immobilisiert werden, indem wiederum die Aufbereitung einem organischen
Lösungsmittel
unterzogen wird. Die Plattenaufbereitung kann sodann unter Verwendung
von beispielsweise 0,1% Ameisensäure
erneut gewaschen werden. Die Peptidproben können sodann unter Verwendung
eines hochprozentigen organischen Lösungsmittels extrahiert werden
und einer weiteren Analyse, wie beispielsweise einer Massenspektrometrie,
unterzogen werden. Der Fachmann erkennt, dass Variationen des vorstehend
Beschriebenen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang
der Erfindung abzuweichen.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Tröpfchen eines Extraktionslösungsmittels
zu der Probe hinzugefügt,
das innerhalb der Vertiefungsstruktur angeordnet ist oder alternativ
innerhalb eines hydrophilen Bereichs der ebenen Probenplatte angeordnet
ist. Das Extraktionslösungsmittel
umfasst eine organische Komponente, die ungefähr 5 bis 100% oder mehr der
gesamten Lösungsmittelzusammensetzung
ausmachen kann. Zusätzlich
bestehen ungefähr
0,1 bis 10% des Lösungsmittels
aus einer Säure,
wie beispielsweise Ameisensäure
oder dergleichen. Sobald das Lösungsmittel hinzugefügt worden
ist, wird die Probe sodann zu einer leitfähig beschichteten Borsilikatglaskapillare
mit gezogener Spitze für
eine statische Nanospray-Analyse übertragen.
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In
einem weiteren Aspekt wird ein Tröpfchen eines Lösungsmittels
zu der Probe hinzugefügt,
die in der Vertiefungsstruktur der Probenplatte vorhanden ist. Nach
dem Hinzufügen
des Lösungsmittels
wird die Probe zu einer MALDI-Target-Platte übertragen. Sobald diese sich
auf der MALDI-Target-Platte befindet, wird eine Mischung mit der übertragenen
Probe unter Verwendung einer MALDI-Matrix, wie beispielsweise α-Cyan-4-Hydroxyphenylpropensäure ausgebildet.
Die Probe kann nun einer MALDI-Analyse unterzogen werden.
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Gemäß einem
noch weiteren Aspekt wird ein Tröpfchen
eines Lösungsmittels
zu der Probe hinzugefügt,
die innerhalb der Vertiefung der Probenplatte angeordnet ist. Die
Probe wird sodann zu einem Probenbehältnis für eine weitere Analyse übertragen. Die
Probe kann beispielsweise für
LC/MS, MALDI, Nanospray usw. verwendet werden.
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Die
hierin beschriebenen Verfahren können unter
Verwendung einer geeigneten robotischen Vorrichtung, wie beispielsweise
dem Packard Multiprobe II von der Firma Perkin Elmer Life Sciences,
durchgeführt
werden. 4 zeigt ein Beispiel für die Benutzung
einer robotischen Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
Wie sich 4 entnehmen lässt, kann
der Vorgang beliebig in drei Schritte unterteilt werden. Der erste
Schritt betrifft die Probenplattenaufbereitung. Dieser Schritt kann
die Vorkonditionierung der Platte unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels
umfassen, der von dem Entfernen des Lösungsmittels von der Platte
gefolgt wird. Der nächste
Schritt ist die Probenhinzufügung.
Die Probe wird zu der Platte hinzugefügt. Gemäß einem Aspekt wird die Probe
zu einem hydrophilen Bereich der Platte hinzugefügt. Die Probe kann sodann unter
Verwendung von beispielsweise erhöhten Temperaturen getrocknet
werden. Die Probe kann sodann gewaschen werden. Bei diesem Schritt
wird die Waschlösung,
beispielsweise Ameisensäure,
zu der Probe, die in der Platte enthalten ist, hinzugefügt. Es wird der
Waschlösung
ermöglicht,
für ungefähr eine
Minute lang zu stehen, wobei der Fachmann jedoch die optimale Zeitdauer
bestimmen kann. Sodann wird die Waschlösung von der Oberfläche der
Platte beispielsweise mittels Ansaugen entfernt. Der Waschvorgang
kann wiederholt und/oder modifiziert werden und innerhalb des Schutzumfangs
der Erfindung verbleiben. An diesem Punkt kann die Platte für eine weitere
Verarbeitung und Analyse entfernt werden.
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BEISPIEL
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Tryptische Spaltung von
BSA:
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Ein
Beispiel für
die tryptische in situ-Spaltung von 3 pmol von Bovinserumalbumin
(BSA) vor einer Nanospray-Massenspektrometrie der gespaltenen Peptide
ist in Fi gur 5 dargestellt. Tryptische Peptide von BSA sind durch
einen Pfeil gekennzeichnet.
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Eine
Probe von BSA (3 pmol) wurde auf einer Probenplatte gemäß der vorliegenden
Erfindung angeordnet. Nach dem Anordnen der BSA wurde das Protein
mit DTT (30 mM) bzw. IAA (40 mM) reduziert und alkylisiert und anschließend unter
Verwendung von Trypsin (250 ng) über
einen Zeitraum von 5 Stunden gespalten. Die gespalteten Peptide
sind mit 0,1% Ameisensäure
gewaschen worden und vor der Analyse mit organischem Lösungsmittel
extrahiert worden. Die extrahierte Probe wurde sodann einer Massenspektrometrie
unterzogen. Die Proben wurden unter Verwendung eines Q-Tof-Massenspektrometers
analysiert, das mit einer Nanospray-Quelle ausgestattet gewesen
ist. Die verwendeten Kapillar- und Kegelspannungen betrugen 900
bzw. 40 Volt. Die Kegelgasflussrate betrug 50 1/Stunde.
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Obgleich
diese Erfindung insbesondere unter Bezug auf die spezifischen Ausführungsformen dargestellt
und beschrieben worden ist, erkennt der Fachmann, dass zahlreiche Änderungen
hinsichtlich der Form und hinsichtlich von Details vorgenommen werden
können,
ohne vom Geist und Schutzumfang der Erfindung abzuweichen, wie dieser
in den anhängen
Ansprüchen
definiert ist.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Eine
Probenaufbereitungsplatte, die verwendet wird, um eine Probe für die Massenspektrometrie aufzubereiten,
wird beschrieben. Insbesondere wird eine Probenplatte verwendet,
um eine Probe zu konzentrieren und um Verunreinigungen aus der Probe zu
entfernen, während
eine einfache Bearbeitung von kleinen Flüssigkeitströpfchen auf einer Oberfläche mit
minimalem Probenverlust ermöglicht
wird.