Verwendung von ultraphoben Oberflächen mit einer Vielzahl hydrophiler Bereiche zur Analyse von Proben
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Oberflächen mit hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen, die jeweils von ultraphoben Bereichen vollständig umschlossen sind zur massenspektrometrischen und/oder optischen Analyse von Proben. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zum exakten, kontaminationsfreien Dosieren von Flüssigkeiten.
Für die Analyse von Proben beispielsweise in der Wirkstoffchemie oder in der biologischen Forschung und Produktion haben sich vermehrt die Massenspektrometrie und/oder optische Detektionsverfahren durchgesetzt. Für die Analyse von in den Proben befindlichen Biomolekülen wird vorzugsweise die Massenspektrometrie mit Ionisierung durch Matrix-unterstützte Laserdesorption und Ionisierung (MALDI) eingesetzt.
Bei der massenspektrometrischen Analyse wird in der Regel ein Flüssigkeitstropfen auf einen gereinigten Probenträger aufgebracht, beispielsweise pipettiert, und dann analysiert. Diese Probenträger bestehen gemäß dem Stand der Technik aus Glas oder Metall und die Benetzungsfläche des Flüssigkeitstropfens entspricht in etwa dem Durchmesser des Flüssigkeitstropfens. Ein weiterer Probenträger wird in der DE 19754 978 A1 beschreiben, der eine vergleichsweise hydrophobe Oberfläche aus Telflon® oder Graphit aufweist, in die hydrophile Ankerbereiche eingearbeitet sind. Die Probenträger gemäß dem Stand der Technik haben jedoch den Nachteil, dass die mit ihnen durchgeführten Analysen oftmals vergleichsweise ungenau sind, weil Verunreinigungen der Probenträgeroberfläche und Stofftransportphänomene zwischen der Probenträgeroberfläche und dem Flüssigkeitstropfen die Messung beeinflussen.
Bei der optischen Analyse werden DNA-Sonden beispielsweise in Form von Flüssigkeitstropfen auf einen Probenträger aufgebracht und zum Beispiel mit einem Fluoreszenzmarker versetzt und dann optisch analysiert. Die Probenträger sind in der Regel aus Glas, so dass der Flüssigkeitstropfen mit einer vergleichsweise großen Fläche auf der Glasoberfläche aufliegt, wodurch bei der optischen Analyse ein
Hintergrundsignal auftritt, das die Qualität der Analyse beeinflußt. Dasselbe gilt für Teflon®-Oberflächen, in die hydrophile Ankerbereiche eingearbeitet sind. Diese Oberflächen sind beispielsweise in der DE 197 54 978 A1 offenbart. Aus der WO 98/45406 sind hydrophobe Oberflächen mit hydrophilen Mikrovolumina, in denen Flüssigkeit aufgefangen werden kann, bekannt. Auch diese Oberflächen weisen die oben genannten Nachteile auf.
Es stellt sich deshalb die Aufgabe ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem die massenspektroskopischen oder optischen Analysen von Proben verbessert werden können.
Gelöst wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch die Verwendung von Oberflächen mit hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen, die jeweils von ultraphoben Bereichen vollständig umschlossen sind zur massenspektrometrischen Analyse von Proben.
Die Oberfläche kann Teil eines beliebigen Flächengebildes oder darauf angeordnet sein. Vorzugsweise ist das Flächengebilde jedoch eine Platte mit einer ebenen Oberfläche, ganz besonders bevorzugt ein Probenträger, der jedoch vorzugsweise keine Einbuchtungen aufweist. Am meisten bevorzugt ist das erfindungsgemäße Flächengebilde eine Folie, deren Oberfläche hydrophile und/oder oleophile Bereiche aufweist, die jeweils von ultraphoben Bereichen vollständig umschlossen sind.
In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Oberfläche plan. Plan im Sinne der Erfindung bedeutet, dass die Oberfläche die für eine Ultraphobizität nötige Topographie jedoch keine Mikrovolumina aufweist, in denen Flüssigkeit gesammelt werden kann. Plane Oberflächen haben insbesondere den Vorteil, dass sie einfach herzustellen sind und dass ein Flüssigkeitstropfen nicht, wie aus dem Stand der Technik bekannt, in ein Mikrovolumen oder in einen Ankerbereich gedrückt werden muß. Darüber hinaus ist bei planen Oberflächen deren Einfluß auf den darauf liegenden Flüssigkeitstropfen besonders gering.
Die Proben, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden, können beliebige Substanzen aufweisen, die einer massenspektrometrischen Analyse
zugänglich sind. Vorzugsweise weist die Probe jedoch mindestens ein Biomolekül und/oder biologisches Material, besonders bevorzugt Nukleinsäuren, Nukleinsäureanaloga, Spiegelmere, Aptamere, Ribozyme, Peptide, Polypeptide, Proteine und/oder Antikörper auf. Vorzugsweise enthält die Probe neben den zu untersuchenden Substanzen mindestens ein weiteres Reagens. Weiterhin bevorzugt werden die zu analysierenden Substanzen zunächst auf den hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen abgelegt und dann vorzugsweise mit mindestens einem weiteren Reagens beaufschlagt, um die Reaktion der jeweils zu analysierenden Substanz auf das jeweilige Reagens zu untersuchen. Umgekehrt ist es natürlich auch denkbar, zunächst unterschiedliche Reagentien auf die hydro- und/oder oleophoben Bereiche zu dosieren und diese Stellen sodann mit den zu untersuchenden Substanzen zu beaufschlagen.
Ganz besonders bevorzugt eignet sich die erfindungsgemäße Verwendung bei dem MALDI-Verfahren. Bei diesem Verfahren werden insbesondere Biomoleküle und/oder biologisches Material vorzugsweise mit einer Matrixsubstanz versetzt und diese Probe dann auf die hydro- und/oder oleophilen Bereiche dosiert, beispielsweise pipettiert. Diese Probe wird sodann auf der Oberfläche getrocknet. Die sich dabei bildenden Kristalle werden beispielsweise mit einem MALDI-TOF Massenspektroskop im linearen- oder im Reflektor-Betrieb untersucht. Details zu diesem Verfahren können Nordhoff et, al. „ MALDI-MS as a new method forthe analysis of nucleic acid (DNA and RNA) with molecular masses up to 150,000 Dalton, Application of modern mass spectrometric methods to plant science research, Oxford University press, (1996) Seite 86- 101 entnommen werden, das hiermit als Referenz eingeführt wird und somit als Teil der Offenbarung gilt. Durch die erfindungsgemäße Verwendung bei dem MALDI-Verfahren ist es möglich, Massenspektren hoher Qualität aufzunehmen. Der Fachmann weiß, dass auch zunächst die MALDI-Matrix auf die hydrophilen Bereiche dosiert und dort getrocknet werden kann und dass sodann die zu analysierende Probe auf die getrocknete MALDI-Matrix aufgetragen und wiederum getrocknet und dann analysiert wird.
Weiterhin ganz besonders bevorzugt eignet sich die erfindungsgemäße Verwendung bei der massenspektroskopischen SIMS (Secondary Ion Mass Spectrometry). Eine bevorzugte Ausführungsform des SIMS ist das TOF-SIMS (Time of Flight Secondary
Ion Mass Spectrometry), das beispielsweise von A. Benninghoven, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 1023 (1994) beschrieben wird. Diese Veröffentlichung wird hiermit als Referenz eingeführt und gilt somit als Teil der Offenbarung.
Ein Biomolekül im Sinne der vorliegenden Erfindungen ist ein beliebiges Molekül das im Laufe des Lebenszyklus eines beliebigen Virus oder ein- oder mehrzelligen Organismus von diesem hergestellt wird. Biomoleküle enthalten mindestens ein Sauerstoff-, Stickstoff, Schwefel-, und/oder Phosphoratom. Beispielhaft für Biomoleküle seien genannt: Spielgelmere, Aptamere, Ribozyme, Peptide, Polypeptide, Proteine, Antikörper, Nukleinsäuren, Nukleinsäureanaloga, DNA, Doppelstrang-DNA, RNA, Doppelstrang-RNA/DNA, Vitamine, Kohlenhydate, Hormone, Glycopeptide, Glycoproteine, Lipide, Fettsäuren und Cholesterin.
Biologisches Material im Sinne der Erfindungen enthält mindestens ein Biomolekül. Hierbei kann es sich aber auch um große Mengen desselben oder verschiedener Biomoleküle handeln. Diese können unorganisiert nebeneinander vorliegen oder aufgrund von Wechselwirkungen funktionale Einheiten aufbauen. Beispiele hierfür sind Proteinkomplexe, Genome, Zellkerne, Ribosomen, Zellen, Zellverbände, Gewebe oder vollständige Organismen.
Bei dem MALDI-VERFAHREN ist es vorteilhaft, wenn die ultraphobe Oberfläche elektrisch leitend ist.
Es war für den Fachmann überaus erstaunlich und nicht zu erwarten, dass es mit der erfindungsgemäßen Verwendung gelingt, Massenspektren mit einer hohen Qualität, guter Reproduzierbarkeit und geringen Meßfehlem zu erhalten. Die Kontamination der zu untersuchenden Probe durch die Oberfläche des Probenträgers selbst oder durch Verunreinigungen auf der Oberfläche des Probenträgers wird durch die erfindungsgemäße Verwendung stark reduziert. Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach und kostengünstig durchzuführen. Besonders bei der MALDI-Massen- spektrometrie erweist sich die erfindungsgemäße Verwendung als vorteilhaft.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von vorzugsweise planen Oberflächen mit hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen,
die jeweils von ultraphoben Bereichen vollständig umschlossen sind, zur optischen Analyse von Proben.
Vorzugsweise ist die Oberfläche plan. Plan im Sinne der Erfindung bedeutet, dass die Oberfläche die für eine Ultraphobizität nötige Topographie jedoch keine Mikrovolumina aufweist, in denen Flüssigkeit gesammelt werden kann. Plane Oberflächen haben insbesondere den Vorteil, dass sie einfach herzustellen sind und dass ein Flüssigkeitstropfen nicht, wie aus dem Stand der Technik bekannt, in ein Mikrovolumen oder in einen Ankerbereich gedrückt werden muß. Darüber hinaus ist bei planen Oberflächen der Einfluß auf den darauf liegenden Flüssigkeitstropfen besonders gering und es entstehen besonders wenig Hintergrundsignale.
Die Oberfläche kann Teil eines beliebigen Flächengebildes oder darauf angeordnet sein. Vorzugsweise ist das Flächengebilde jedoch eine Platte mit einer ebenen Oberfläche, ganz besonders bevorzugt ein Probenträger, der jedoch keine Einbuchtungen aufweist. Am meisten bevorzugt ist das erfindungsgemäße Flächengebilde eine Folie, deren Oberfläche hydrophile und/oder oleophile Bereiche aufweist, die jeweils von ultraphoben Bereichen vollständig umschlossen sind.
Die Proben, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden, können beliebige Substanzen aufweisen, die einer optischen Analyse zugänglich sind. Vorzugsweise weist die Probe jedoch mindestens ein Biomolekül und/oder biologisches Material, besonders bevorzugt Nukleinsäuren, Nukleinsäureanaloga, Spiegelmere, Aptamere, Ribozyme, Polypeptide, Peptide und/oder Proteine auf. Vorzugsweise enthält die Probe neben den zu untersuchenden Substanzen mindestens ein weiteres Reagens. Weiterhin bevorzugt werden die zu analysierenden Substanzen zunächst auf den hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen abgelegt und dann vorzugsweise mit mindestens einem weiteren Reagens beaufschlagt, um die Reaktion der jeweils zu analysierenden Substanz auf das jeweilige Reagens zu untersuchen. Umgekehrt ist es natürlich auch denkbar, dass zunächst unterschiedliche Reagentien auf die hydro- und/oder oleophoben Bereiche zu dosieren und diese Stellen sodann mit den zu untersuchenden Substanzen zu beaufschlagen.
Ganz besonders eignet sich die erfindungsgemäße Verwendung für optische Detektionsverfahren. Die Detektionsverfahren können dabei sowohl spezielle Markierungen mit einschließen, aber auch markierungslos arbeiten. Die Verwendung von Reagenzien zur Markierung von Proben, die auf einen Biochip gegeben werden, ist beispielsweise in " DNA Arrays: Technologies and Experimental Strategies", edited by Elena Grigorenko, CRC Press LLC (2002) beschrieben. Diese Veröffentlichung wird hiermit als Referenz eingeführt und gilt somit als Teil der Offenbarung. Fluoreszenzfarbstoffe, die sich beispielsweise für die Detektion von Interaktionen von Proben mit auf einem Biochip immobilisierten Sonden eignen, sind zum Beispiel in Handbook of Fluorescent Probes and Research Products von Molecular Probes angegeben werden. Diese Veröffentlichung wird hiermit als Referenz eingeführt und gilt somit als Teil der Offenbarung. Neben den Standardfluoreszenzverfahren ist die erfindungsgemäße Verwendung auch für die Detektion von Farbstoffen geeignet, die eine spezifische zeitaufgelöste Fluoreszenzdetektion erlauben, wie sie beispielweise in Sauer M, Angerer B, Ankenbauer W, Foldes-Papp Z, Gobel F, Han KT, Rigler R, Schulz A, Wolfrum J, Zander C.Single molecule DNA sequencing in submicrometer Channels: State of the art and future prospects. J Biotechnol. 2001 Apr 13;86(3):181- 201 und Bader B, Butt E, Palmetshofer A, Walter U, Jarchau T, Drueckes P.A cGMP- dependent protein kinase assay for high throughput screening based on time- resolved fluorescence resonance energy transfer.J Biomol Screen. 2001 Aug;6(4):255-64.) beschrieben sind. Diese Veröffentlichungen werden hiermit als Referenz eingeführt und gelten somit als Teil der Offenbarung. Weiterhin schließt die erfindungsgemäße Verwendung auch die Benutzung von Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfer Systemen ein, die in Bader et al (siehe oben) und Oswald B, Gruber M, Böhmer M, Lehmann F, Probst M, Wolfbeis OS.Novel diode laser- compatible fluorophores and their application to Single molecule detection, protein labeling and fluorescence resonance energy transfer immunoassay.Photochem Photobiol. 2001 Aug;74(2):237-45. und Kimball SR, Horetsky RL.AIterations in interprotein interactions between translation initiation factors assessed by fluorescence resonance energy transfer.lnt J Biochem Cell Biol. 2001 Aug;33(8):797- 8Ö6.) beschrieben ist. Diese Veröffentlichungen werden hiermit als Referenz eingeführt und gilt somit als Teil der Offenbarung. Die Detektion von fluoreszenten Ereignissen auf dem Probenträger geschieht mit handelsüblichen Detektoren, die dem Stand der Technik entsprechen und beispielsweise in dem Buch "DNA Arrays:
Technologies and Experimental Strategies", edited by Elena Grigorenko, CRC Press LLC (2002)" genannt sind. Diese Veröffentlichung wird hiermit als Referenz eingeführt und gilt somit als Teil der Offenbarung. Die Detektion der Probenträger kann weiterhin durch verschiedene Standardverfahren, wie sie dem Fachmann für die Detektion von Fluorophoren geläufig sind, insbesondere Verfahren für die Detektion nach der Fluoreszenzanregung durch Auflicht und Durchlicht oder evaneszente Felder geschehen. Für die Detektion sind Photomultiplier, Photodioden und CCD Kameras geeignet. Die erfindungsgemäße Verwendung schließt auch die Verwendung von nicht fluoreszenten Markierüngsreagenzien mit ein. Solche Markierungsreaktionen umfassen auch das Markieren von Biomolekülen durch verschiedene, in molekularbiologen Labors oft verwendete Isotope, wie beispielsweise (superscript: 3)H, (superscript: 32)P, (superscript: 33)P und (superscript: 35)S und deren Detektion durch Röntgenfilme oder Phosphorscreens. Ein weiteres von der erfindungsgemäßen Verwendung umfaßtes Detektionsverfahren mit Markierungsreagentien ist die Verwendung und Detektion von lumineszenten Farbstoffen wie CDP-Star oder ähnlichen Luminophoren. Eine typische Applikation für die Detektion von hybridisierungsbasierten Hybridisierungsmethoden findet sich in Gold B, Radu D, Balanko A, Chiang CS. Diagnosis of Fragile X syndrome by Southern blot hybridization using a chemiluminescent probe: a laboratory protocol. Mol Diagn. 2000 Sep;5(3): 169-78. Diese Veröffentlichung wird hiermit als Referenz eingeführt und gilt somit als Teil der Offenbarung. Weiterhin umfaßt sind die markierungsfreien optischen Detektionsverfahren, beispielsweise der Oberflächen- plasmonenresonanz, das beispielsweise im Artikel Tokarska-Schlattner M, Wallimaηn T, Schlattner U. Related Articies to Multiple Interference of Anthracyclines with Mitochondrial Creatine Kinases: Preferential Damage of the Cardiac Isoenzyme and Its Implications for Drug Cardiotoxicity.Mol Pharmacol. 2002 Mar;61(3):516-523 und den dort enthaltenen Referenzen beschreiben ist. Dieser Artikel wird als Referenz eingeführt und gilt somit als Teil der Offenbarung.
Es war für den Fachmann überaus erstaunlich und nicht zu erwarten, dass es mit der erfindungsgemäßen Verwendung gelingt, Spektren mit einer hohen Qualität, guten Reproduzierbarkeit und geringen Meßfehlern zu erhalten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach und kostengünstig durchzuführen. Besonders bei der Floureszenzanalyse von Biomolekülen und/oder biologischem Material erweist sich
die erfindungsgemäße Verwendung als vorteilhaft, da störende Hintergrundsignale stark reduziert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von vorzugsweise planen Oberflächen mit hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen, die jeweils von ultraphoben Bereichen vollständig umschlossen sind, zur DNA Sequenzierung mit Hilfe der Methode Peptidnuceleinsäure (PNA).
Bei dieser Verwendung werden die PNA-Moleküle auf Gold, Silber, Paladium und/oder Platin immobilisiert und mit DNA-Einzelstängen hybridisiert. Die DNA-Kette, die an einem Strang hybridisiert wurde, kann durch Phosphat-Nachweis vorzugsweise mit SIMS detektiert werden. Einzelheiten des Verfahrens kann der Veröffentlichung von H.F. Aarlinghaus et. al., Surf. Interface Anal. 33, 35 (2002) entnommen werden, die hiermit als Referenz eingeführt wird und somit als Teil der Offenbarung gilt.
Das Gold.Silber, Paladium und/oder Platin stellt vorzugsweise den hydrophilen und/oder oleophilen Bereich dar. Diese können dadruch erzeugt werden, das Gold, Silber, Paladium und/oder Platin auf eine uitraphobe Oberfläche aufgetragen wird. Es ist aber auch denkbar, das die uitraphobe Schicht in ihrem Schichtaufbau eine Gold-, Silber-, Paladium- und/oder Platinschicht aufweist, die dann an den entsprechenden Stellen freigelegt wird, um die hydrophilen Bereiche zu erzeugen.
Die erfindungsgemäße Verwendung hat den Vorteil, dass der DNA keine Farbstoffe zugesetz werden müssen.
Die folgenden Ausführungen gelten für alle drei erfindungsgemäßen Verwendungen.
Ultraphob im Sinne der Erfindung bedeutet, dass der Kontaktwinkel eines Wasser- und/oder Öltropfens, der auf einer ultraphoben Oberfläche liegt, mehr als 150°, vorzugsweise mehr als 160° und am meisten bevorzugt mehr als 170° beträgt und/oder der Abrollwinkel 10° nicht überschreitet. Als Abrollwinkel wird der Neigungswinkel einer grundsätzlich planen aber strukturierten Oberfläche gegen die Horizontale verstanden, bei dem ein stehender Wasser- und/oder Öltropfen mit
einem Volumen von 10 μl aufgrund der Schwerkraft bei einer Neigung der Oberfläche bewegt wird. Solche ultraphoben Oberflächen sind zum Beispiel in der WO 98/23549, WO 96/04123, WO 96/21523, WO 00/39369, WO 00/39368, WO 00/39239, WO 00/39051, WO 00/38845 und WO 96/34697 offenbart, die hiermit als Referenz eingeführt werden und somit als Teil der Offenbarung gelten.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die ultraphoben Bereiche eine Oberflächentopographie auf, bei der die Ortsfrequenz der einzelnen Foyerkomponenten und deren Amplitude a (f) ausgedrückt durch das Integral S (log(f)) = a(f) . f errechnet zwischen den Integrationsgrenzen log (fι/μrrϊ1) = -3 und log (f2/μm"1) = 3 mindestens 0,3 beträgt und die aus einem hydrophoben oder insbesondere oleophoben Material besteht oder mit einem haltbar hydrophobierten und/oder insbesondere haltbar oleophobierten Material beschichtet sind. Eine solche uitraphobe Oberfläche ist in der internationalen Patentanmeldung WO 00/39240 beschrieben, die hiermit als Referenz eingeführt wird und somit als Teil der Offenbarung gilt.
Hydrophile und/oder oleophile Bereiche im Sinne der Erfindung sind Bereiche, auf denen ein Wasser- oder Öltropfen ablegbar ist; d.h. ein Wasser- oder Öltropfen, der an einem Pipettiersystem hängend mit dem hydrophilen und/oder oleophilen Bereich in Kontakt gebracht wird, bleibt daran hängen und löst sich somit von dem Pipettiersystem. Vorzugsweise nimmt ein Wasser- oder Öltropfen mit einem Volumen von 10 μl auf den hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen einen Randwinkel < 120°, vorzugsweise < 110°, ganz besonders bevorzugt < 90° ein und/oder der Abrollwinkel dieses Tropfens überschreitet 10°.
Erfindungsgemäß wird die Oberfläche der hydrophilen und/oder oleophilen Bereiche jeweils von einem ultraphoben Bereich vollständig umschlossen. Durch diese Ausführungsform ist es möglich einen Flüssigkeitstropfen an einem ganz bestimmten Ort abzulegen und dort vergleichsweise fest zu verankern.
Bevorzugt ist die Oberfläche im wesentlichen ultraphob und weist eine Vielzahl von hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen auf. Die hydrophilen und/oder oleophilen Bereiche können auf der ultraphoben Oberfläche beispielsweise durch chemische
und/oder mechanische Abtragung zumindest eines Teils der Schichtdicke der ultraphoben Schicht, vorzugsweise mittels Laser, erzeugt werden. Vorzugsweise werden die hydrophilen und/oder oleophilen Bereiche jedoch durch eine Modifikation lediglich der obersten Moleküllage der ultraphoben Oberfläche erzeugt. Vorzugsweise ist diese Modifikation eine mechanische und/oder thermische Ablation, bei der vorzugsweise jedoch nur maximal eine Moleküllage der ultraphoben Oberfläche abgetragen wird. Weiterhin bevorzugt erfolgt die Modifikation durch die thermische oder chemische Veränderung der ultraphoben Oberfläche jedoch ohne Abtragung, wie sie beispielsweise in der DE 199 10 809 A1 beschrieben ist, die hiermit als Referenz eingeführt wird und somit als Teil der Offenbarung gilt. Bei dieser Modifikation der ultraphoben Oberfläche bleibt deren Schichtdicke im wesentlichen unverändert. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform sind die hydrophilen und/oder oleophilen Bereiche auf Teilen der ultraphoben Oberfläche reversibel erzeugbar. Derartige Oberflächen bzw. Verfahren zur reversiblen Hydro- oder Oleophilierung von Teilen der ultraphoben Oberflächen sind in der deutschen Parallelanmeldung mit dem internen Aktenzeichen Sy 0029 beschrieben, die hiermit als Referenz eingeführt wird und somit als Teil der Offenbarung gilt.
Die hydrophilen und/oder oleophilen Bereiche können jede beliebige Form und Größe aufweisen. Vorzugsweise haben sie jedoch eine Fläche von 1 μm2 - 10 mm2. Auf einer derartigen Fläche läßt sich ein Flüssigkeitstropfen mit einem Durchmesser von 5 nm - 5 mm absetzen und vorzugsweise so verankern, dass er sich selbst nach unten hängend nicht von der Oberfläche löst.
Die erfindungsgemäße Verwendung eignet sich insbesondere im Bereich der Wirkstofforschung und im Bereich der Biotechnologie. Diese Verwendungen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum exakten, kontaminationsfreien Dosieren von vorzugsweise sehr kleinen Flüssigkeitsvolumina auf Oberflächen mit hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen, die jeweils von ultraphoben Bereichen vollständig umschlossen sind, bei dem die zu dosierende Flüssigkeit, vorzugsweise in Form eines Tropfens mit mindestens einem hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen der Oberfläche in Kontakt gebracht und wieder
entfernt wird und dabei das zu dosierende Flüssigkeitsvolumen an dem hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen der Oberfläche haftet.
Er war für den Fachmann überaus erstaunlich, dass es mit diesem Verfahren gelingt, Flüssigkeitstropfen mit einem exakten, reproduzierbaren Volumen auf eine Oberfläche zu dosieren, ohne dass der Flüssigkeitstropfen von der Oberfläche kontaminiert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach und kostengünstig durchzuführen.
Das Volumen der Flüssigkeit, die mit den hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen in Kontakt gebracht wird, muß mindestens so groß sein wie das zu dosierende Volumen. Vorzugsweise ist es jedoch wesentlich größer, so dass auf mehrere hydrophile und/oder oleophile Bereiche Flüssigkeit dosiert werden kann.
Das dosierte Flüssigkeitsvolumen ergibt sich vorzugsweise aufgrund der Größe der hydrophilen und/oder oleophilen Bereiche und der zu dosierenden Flüssigkeit. Je größer die hydrophilen und/oder oleophilen Bereiche um so größer ist der dosierte Flüssigkeitstropfen.
Bezüglich der hydrophilen und/oder oleophilen Bereiche, der ultraphoben Oberfläche und deren Erzeugung wird auf die gesamte oben stehende Offenbarung verwiesen, die demnach auch für diesen Gegenstand der Erfindung gilt.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der Beispiele 1 - 4 sowie der Figuren 1 - 5 erläutert. Diese Erläuterungen sind lediglich beispielhaft und schränken den allgemeinen Erfindungsgedanken nicht ein.
Beispiel 1
Herstellung einer ultraphoben Oberfläche:
Ein walzpoliertes AIMg3-Blech mit einer Fläche von 26 x 76 mm2 und einer Dicke von 0,15 mm wurde bei Raumtemperatur mit Chloroform (p. a.) anschließend 20 Sekunden (s) in wässriger NaOH (5g/l) bei 50 °C entfettet.
Danach wurde 20s in H3PO4 (1 OOg/l) vorgebeizt, 30s in dest. Wasser gespült und 90s in einer Mischung von HCI/H3BO3 G'e 4g/l) bei 35 °C und 120mA/cm2 bei 35 V Wechselspannung elektrochemisch gebeizt.
Nach 30s Spülung in dest. Wasser und 30s alkalischer Spülung in wässriger NaOH (5g/l) wurde erneut 30s in dest. Wasser gespült und anschließend 90s in H2SO4 (200g/l) bei 25 °C mit 30mA/cm2 bei 50 V Gleichspannung anodisch oxidiert.
Danach wurde 30s in dest. Wasser, dann 60s bei 40 °C in NaHCO3 (20 g/l), dann wieder 30s in dest. Wasser gespült und 1 Stunde bei 80 °C im Trockenschrank getrocknet.
Das so behandelte Blech wurde mit einer etwa 40nm dicken Goldschicht durch Kathodenzerstäubung im Hochvakuum beschichtet. Schließlich wurde die Probe 24 Stunden durch Tauchen in eine Lösung des Thiols CF3-(CF2)7-(CH2)2-SH in Benzotrifluorid (p. a., 1 g/l) bei Raumtemperatur in einem geschlossenen Gefäß mit einer Monolage beschichtet, anschließend mit Benzotrifluorid (p. a.) gespült und getrocknet.
Die Oberfläche weist für Wasser einen statischen Randwinkel von 178 °C auf. Bei einer Neigung der Oberfläche um < 2°C rollt ein Wassertropfen des Volumens 10 μl ab.
Beispiel 2
Bei diesem Beispiel wird ein Probenträger mit einer Oberfläche gemäß Beispiel 1 eingesetzt. Auf die ungereinigte, uitraphobe Oberfläche dieses Probenträgers wurden mit einer Piezodispensierstation verschiedene Aliquots von MALDI-Matrices z.B. 3- Hydroxypicolinsäure, Sinapinsäure und α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure gelöst in Aceton, Acetonitril oder einem Gemisch aus Wasser und einem der genannten organischen Lösungsmittel, wobei der Lösemittelgehalt mindestens 50 Vol.-% betragen sollte, dispensiert. Nach dem schnellen Verdampfen des Lösemittels scheiden sich alle getesteten Matrices in Form kleiner Kristalle als hydrophile Bereichen der ultraphoben Oberfläche ab und hafteten so fest daran, dass sie weder
mit einem Wischtuch noch mit Preßluft abgelöst werden konnten. Die mit Matrices belegten Orte hatten jeweils einen Durchmesser von 200 - 1000 μm. Auf die mit Matrices belegten Orte wurden jeweils 0,5 - 2,0 μl verschiedener Proben, die Biomoleküle aufwiesen, dosiert. Die Proben enthielten beispielsweise Peptide oder Proteine gelöst in 0,1% TFA(Trifluoressigsäure)-Wasser oder Oligonukleotide gelöst in einem Gemisch aus 50 Vol.-% Wasser und 50 Vol.-% Acetonitril, wobei der Gehalt an Biomolekül jeweils 0,1-1 pmol pro μl betrug. Die Proben wurden mit einer Handpipette auf die Matrices aufgetragen und bei Raumtemperatur eingedampft und anschließend in einem MALDI-TOF-Massenspektrometer MTP Autoflex der Firma Bruker Daltonik GmbH, 28359 Bremen im linearen- oder Reflektor-Betrieb analysiert. In allen Fällen wurden reproduzierbar Massenspektren hoher Qualität aufgenommen, obwohl die uitraphobe Oberfläche vor der jeweiligen Anwendung nicht gereinigt wurde. Dies ist besonders für die Analyse von Nukleinsäuren wichtig, die durch geringste Kontaminationen beispielsweise durch Na- oder K-Salze auf den Probenträgern verfälscht werden. Derartige Kontaminationen können schon auftreten, wenn Probenträger einige Zeit der normalen Laborluft ausgesetzt sind.
Beispiel 3:
Beispiel 3a:
Ein Probenträger Bruker 384/400 der Firma Bruker Daltonik GmbH, 28359 Bremen, der den Probenträgern gemäß der DE 197 54 978 A1 entspricht, wurde intensiv gereinigt und unmittelbar vor der Anwendung mit hochreinem doppelt-destilliertem Wasser abgespült. Der Probenträger ist aus Edelstahl und weist eine ca. 5 μm dicke Teflon®-ähnliche Beschichtung auf, die an 384 Stellen unterbrochen ist. Die Unterbrechungen sind regelmäßig auf dem Probenträger angeordnet und weisen jeweils einen Durchmesser von 400 μm auf. Die Edelstahloberfläche der Unterbrechungen wirkt als hydrophiler Anker für Flüssigkeitstropfen, die auf der Oberfläche des Probenträgers gelagert werden. Auf diesen Probenträger wurden jeweils 0,5 μl einer 50 mM Lösung von Hydroxypicolinsäure in 50 Vol.-% Acetonitirl / 50 Vol.-% Wasser aufpipettiert und eingedampft. Nach dem Verdampfen des Lösemittels liegt die MALDI-Matrix als kristalline Schicht im wesentlichen nur auf den hydrophilen Ankern vor. Auf die mit MALDI-Matrix belegten Orte wurde jeweils 0,5 μl eines DNA 25mer
Oligonukleotides gelöst in doppelt- destilliertem Wasser dosiert, wobei der Gehalt an Oligonukleotid 1 pmol pro μl betrug. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde anschließend in einem MALDI-TOF-Massenspektrometer MTP Autoflex der Firma Bruker Daltonik GmbH, 28359 Bremen ein Massenspektrum ermittelt. Ein repräsentatives Ergebnis dieser Analyse kann Figur 1a entnommen werden.
Beispiel 3b:
Das Beispiel 3b entspricht im wesentlichen dem Beispiel 3a, nur dass in diesem Fall der Probenträger nach der intensiven Reinigung und vor der Spülung mit hochreinem doppelt-destilliertem Wasser 12 Stunden lang offen jedoch ohne Berührung auf einem Labortisch in der Laborluft gelagert wurde. Ein repräsentatives Ergebnis dieser Analyse kann Figur 1b entnommen werden.
Beispiel 3c:
Bei diesem Beispiel wird ein Probenträger mit einer Oberfläche gemäß Beispiel 1 eingesetzt, der intensiv gereinigt, 12 Stunden lang offen, jedoch ohne Berührung auf einem Labortisch in der Laborluft gelagert und unmittelbar vor der Anwendung mit hochreinem doppelt-destilliertem Wasser abgespült wurde. Auf diesen Probenträger wurden sodann Acetonitriltropfen jeweils mit einem Volumen von 0,1 μl und jeweils in einem Abstand von 4,5 mm zueinander dosiert. Die Acetonitriltropfen benetzen die uitraphobe Oberfläche und dienten als hydrophile Anker (Bereiche) der MALDI-Matrix Hydroxypicolinsäure (20 mM), die in einem 20 Vol.-% Acetonitirl / 80 Vol.-% Wasser- Gemisch gelöst ist und die jeweils als Tropfen mit einem Volumen von 0,5 μl direkt auf die mit Acetonitirl benetzten Bereiche der ultraphoben Oberfläche dosiert werden, bevor das Acetonitril verdampft ist. Die MALDI-Matrix-Lösung benetzt die uitraphobe Oberfläche nicht. Nach dem Verdampfen des Lösemittels liegt die MALDI-Matrix als kristalline Schicht vor. Auf die kristallinen Matrices wurden jeweils 0,5 μl eines DNA 25mer Oligonukleotides gelöst in doppelt-destilliertem Wasser dosiert, wobei der Gehalt an Oligonukleotid 1 pmol pro μl betrug und diese Lösung die uitraphobe Oberfläche nicht benetzt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurden anschließend in einem MALDI-TOF-Massenspektrometer MTP Autoflex der Firma Bruker Daltonik GmbH, 28359 Bremen Massenspektren aufgenommen. Ein repräsentatives Ergebnis
dieser Analyse kann Figur 1c entnommen werden. Nach der Untersuchung wird der Probenträger mit einem 80 Vol.-% Acetonitirl / 20 Vol.-% Wasser-Gemisch gereinigt und kann dann wiederverwendet werden.
Figur 1 zeigt jeweils ein repräsentatives Ergebnis der Versuche 3 a - c, wobei die Buchstaben der Spektren mit den Buchstaben der Beispiele 3 korrespondieren. Die gewünschten Signale des Molekülionenpeaks wurde in allen drei Fällen auf eine Intensität von 100 bei. Einheiten eingestellt. In allen drei Spektren dominiert das gewünschte Signal (M+ H)+ der einfach protionierten und damit einfach positiv geladenen freien Säure des Oligonukleotids. Bei den Kurven a und b, entsprechend den Beispielen 3a und 3b, weist das Signal jedoch bei höheren m/z-Werten Satelitensignale mit einem konstanten Abstand von m/z 22 auf. Die Satelitensignale belegen, dass neben den gewünschten Molekülionenspezies auch Natriumassoziierte Molekülionen detektiert wurden, die bekanntermaßen auf Kontaminationen der Proben durch Staub bzw. daraus in der Gegenwart von Luftfeuchtigkeit freigesetzten Substanzen hindeuten. Die Kurve c, die dem Beispiel 3c entspricht weist die Satelitensignale wenn überhaupt nur in sehr reduzierter Form auf. Satelitensignale bedingen, dass das gesamte Signal auf mehrere Spezies verteilt und damit das Verhältnis zwischen dem eigentlichen Signal und dem Hintergrundrauschen verschlechtert wird, wodurch die Nachweisempfindlichkeit der jeweiligen Messung negativ beeinflußt wird. Darüber hinaus erschweren Satelitensignale die Analyse von komplexen oligonukleotid-Mischungen, weil sich die Satelitensignale gegebenenfalls mit gewünschten Signalen überlagern können.
Beispiel 4:
Beispiel 4a:
Auf einen oben beschriebenen gereinigten Probenträger Bruker 384/400 wurden Flüssigkeitstropfen mit verschiedenen DNA-Sonden aufgebracht und auf dem Probenträger immobilisiert. Die immobilisierten DNA-Sequenzen wurden mit einer mit dem Farbstoff Cy5 markierten Mischung von cDNAs hybridisiert. Die hybridisierte cDNA wurde dabei aus muriner Leber RNA durch eine reverse Transkriptasereaktion und den Einbau von mit Cy5 markierten Nukleotiden erhalten. Die so erhaltenen
Flüssigkeitstropfen wurden mit einem Genepix 4000 B Gerät der Firma Axon Instruments, Union City, Ca, USA analysiert. Das Ergebnis der Analyse ist in Figur 2a, b, c ersichtlich.
Beispiel 4b:
Bei diesem Beispiel wird ein Probenträger mit einer Oberfläche gemäß Beispiel 1 eingesetzt, auf den Acetonitriltropfen jeweils mit einem Volumen von 0, 1μl und jeweils in einem Abstand von 4,5 mm zueinander dosiert. Die Acetonitriltropfen benetzen die uitraphobe Oberfläche und dienten als hydrophile Anker (Bereiche) für Flüssigkeitstropfen mit verschiedenen DNA-Sonden, die jeweils als Tropfen mit einem Volumen von 0,5 μl direkt auf die mit Acetonitirl benetzten Bereiche der ultraphoben Oberfläche dosiert werden, bevor das Acetonitril verdampft ist. Die Flüssigkeitstropfen mit verschiedenen DNA-Sonden benetzen die uitraphobe Oberfläche nicht. Die so immobilisierten DNA-Sequenzen wurden mit einer mit dem Farbstoff Cy5 markierten Mischung von cDNAs hybridisiert. Die hybridisierte cDNA wurde dabei aus muriner Leber RNA durch eine reverse Transkriptasereaktion und den Einbau von mit Cy5 markierten Nukleotiden erhalten. Die so erhaltenen Flüssigkeitstropfen wurden mit einem Genepix 4000 B Gerät der Firma Axon analysiert. Das Ergebnis der Analyse ist in Figur 3 ersichtlich. Der Probenträger wird nach der Untersuchung gereinigt und wiederverwendet. Die Reinigung erfolgt durch Waschen mit einem Acetonitril/Wasser-Gemisch.
Figur 2 zeigt die Ergebnisse des Beispiels 4a. In der Figur 2a ist der Probenträger abgebildet. Die hellen Punkte stellen Flüssigkeitstropfen dar, die an den hydrophilen Ankern immobilisiert sind. In der Abbildung 2b sind vier Flüssigkeitstropfen und deren Umfeld vergrößert dargestellt. Es ist deutlich zu erkennen, dass die immobilisierte Flüssigkeit nicht auf die Bereiche der hydrophilen Anker beschränkt ist, sondern dass sich gewisse Flüssigkeitsanteile auch auf der Teflon®-Oberfläche befinden. Die zu der Abbildung 2b gehörende weitergehende und detaillierte Analyse des Fluoreszenzbildes ist in Form eines Histogrammes der zugehörigen Pixelwerte entlang der hellen Spots in Abbildung 2c dargestellt. Idealerweise sollten Fluoreszenzsignale nur dort entstehen, wo DNA auf den Probenträger verbracht wurde, woraus in der Regel Histogramme mit Peaks in regelmäßigen Abständen
ohne ein Hintergrundsignal resultieren. In dem vorliegenden Fall ist jedoch zwischen den Peaks ein deutliches Hintergrundsignal zu sehen, das 10 - 20% der gesamten Signalstärke beträgt und das die Genauigkeit der Analyse der vorliegenden Versuchsanordnung limitiert.
Figur 3 zeigt einen Teil des Histogramms (drei Flüssigkeitstropfen) das aus den Versuchen gemäß Beispiel 4b resultiert. Es zeigt sich deutlich, dass das Histogramm nur drei Peaks im Bereich der Flüssigkeitstropfen und kein Hintergrundrauschen aufweist. Die Signale sind gaussförmig und klar voneinander getrennt. Es ist eine sehr genaue Analyse der Versuchsanordnung möglich. Dies ist besonders gut an dem in Figur 3 gezeigten Histogramm visualisiert, da das dort äußerst rechts liegende Signal nur maximal 20% der Signalhöhe der anderen in der Figur gezeigten Signale erreicht und bei einem Hintergrundsignal analog zu dem in Figur 2b nicht detektierbar gewesen wäre.
In Figur 4 wird das erfindungsgemäße Verfahren erläutert. In Figur 4a ist ein Ausschnitt der Oberfläche 2 eines Probenträgers 6 dargestellt. Die Oberfläche 2 weist uitraphobe Bereiche 5 und hydrophile Bereiche 3 auf. Auf den ultraphoben Bereichen 5 weist ein 10 μl Wassertropfen einen Randwinkel von > 178° und einen Abrollwinkel von < 2° auf. Die hydrophilen Bereiche 3 (nur einer dargestellt) sind von ultraphoben Bereichen 5 vollständig umschlossen. Auf dem hydrophilen Bereich 3 weist ein 10 μl Wassertropfen einen Randwinkel von < 90° und einen Abrollwinkel von > 10° auf. In dem vorliegenden Fall ist der hydrophile Bereich 3 im Vergleich zu den ultraphoben Bereichen 5 etwas erhaben dargestellt. Der Fachmann erkennt, dass dies nicht der Fall sein muß, sondern dass der hydrophile Bereich 3 auch mit den ultraphoben Bereichen 5 fluchten oder in diese eingearbeitet sein kann. In Figur 4b ist dargestellt, wie ein Wassertropfen 4, der an einer Pipette oder an einem Stab hängt mit dem hydrophilen Bereich in Kontakt gebracht wird. Durch die Ultra- phobizität der Oberfläche 5, die den hydrophilen Bereich 3 vollständig umschließt, ist der Randwinkel des Wassertropfens 4 so groß, dass er nur den hydrophilen Bereich 3 und nicht den ultraphoben Bereich 5 berührt. Figur 4c zeigt die Situation nachdem der Tropfen 4 von dem hydrophilen Bereich abgehoben worden ist. Ein kleiner Teil 1 des Tropfens 4 bleibt an dem hydrophilen Bereich hängen. Das Volumen der Flüssigkeit 1 , das an dem hydrophilen Bereich haftet ist proportinal zu dessen jeweiliger
Fläche und sehr viel kleiner als das Volumen des Tropfens 4, so dass der erfindungsgemäße Dosiervorgang mit einem Tropfen 4 mehrfach wiederholt werden kann.
Figur 5 zeigt eine uitraphobe Oberfläche 7 mit einer Vielzahl hydrophiler Bereiche 8, deren Oberfläche von den ultraphoben Bereichen vollständig umschlossen sind.