DE4435727A1

DE4435727A1 - Bindematrix und Analyseelement zur Simultananalyse verschiedener Analyte

Info

Publication number: DE4435727A1
Application number: DE19944435727
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg Dipl Chem Dr Batz; Peter Dipl Chem Dr Sluka; Wolfgang Mutter
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1994-10-06
Filing date: 1994-10-06
Publication date: 1996-04-11
Also published as: WO1996011404A1; JPH10506996A; EP0784794A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Bindematrix aus einem flächenförmigen Trägermaterial, das von einer Vielzahl horizontal räumlich getrennter Bereiche bedeckt ist, die mit unterschiedlichen spezifischen Bindungspartnern für freie Reaktanden belegt werden können, ein entsprechendes Analysenelement, ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie die Verwendung des Analysen elementes zum gleichzeitigen Nachweis verschiedener freier Reaktanden oder Analyte oder zum gleichzeitigen Nachweis eines Analyten in verschiedenen Proben.

Um verschiedene Analyte aufgrund spezifischer Bindungsreaktionen räumlich nebeneinander nachzuweisen, zum Beispiel in Form eines Immunoassays, ist die gebräuchlichste Methode, die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit verschiedenen Antikörpern adsorptiv oder über eine Fixierungsschicht, wie zum Beispiel RSA/Streptavidin, zu beladen und in jeder Vertiefung einen Analyt zu bestimmen. Die vergleichsweise großen Abmessungen von Mikrotiterplatten erfordern große Mengen an Reagenz und Proben. Aufgrund der unebenen Geometrie der Wells können nur bestimmte Detektionsmethoden wie UV/VIS-Absorption oder Messung der Fluoreszenz in Lösung als Maß für die Bindung von Analyt an die Festphase angewandt werden.

Eine Verbesserung multipler Analytnachweise auf einem gemeinsamen Analysenträger wurde durch eine Miniatisierung der Analysenelemente durch Adsorption von Antikörpern oder Antigenspots auf Nitrocelullose erreicht (Walch et al., J. Immunol. Meth. (1984), 66, 99-102; Derer et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1984), 74, 85-92). Diese Analyseelemente werden ins besondere zur Allergiediagnostik verwendet. Wie bei Mikrotiterplatten ist der Nachteil auch hier, daß sich durch die adsorptive Beladung der Oberfläche mit immunologisch aktiven Reagenzien keine geordnete und definierte Belegung der Oberfläche einstellt, was sich ungün stig auf die Reproduzierbarkeit von Meßergebnissen auswirkt. Die starke Abhängigkeit des Variationskoeffizienten der Meßergebnisse von der Beschaffenheit der Oberfläche bei adsorptiver Beladung ist unter anderem im US-Patent 49 80 299 beschrieben. Während bei großen Oberflächen die statistischen Schwankungen der Oberflächenbelegung bei adsorptiver Beladung weniger ins Gewicht fallen, können sie sich bei zunehmender Miniaturisierung der Oberflächen auf die Reproduzierbarkeit sehr negativ auswirken, da hier insbesondere Mikro inhomogenitäten stärker ins Gewicht fallen. Quantitative Bestimmungen sind somit nur schwer möglich.

Multiple Reagenzträger zur parallelen Synthese verschiedener Polypeptid- oder Polynukleotid stränge sind in WO 92/10092, WO 91/07087 und EP 01 38 855 beschrieben. In WO 92/10092 wird ein homogenes Trägermaterial durch Einführung von Aminogruppen einheitlich über die gesamte Oberfläche funktionalisiert. An diese funktionalisierte Oberfläche wird großflächig ein Reaktand mit einer photochemisch abspaltbaren Gruppe gebunden. Durch Anlegen einer Maske kann an bestimmten Stellen selektiv die photochemisch abspaltbare Gruppe entfernt werden und selektiv eine Aminosäure oder eine Nukleotidbase chemisch gekuppelt werden. Durch Verwendung anderer Masken kann das gleiche Verfahren an anderen Stellen mit anderen Aminosäuren oder Nukleotidbasen fortgesetzt werden. Man erhält so auf der Träger oberfläche nach vielen Arbeitsschritten beispielsweise eine Vielzahl unterschiedlicher Poly nukleotidstränge, die zur Bindung und Bestimmung komplementärer Polynukleotidstränge dienen können. Nachteil bei diesem Verfahren ist, daß es sehr aufwendig ist, eine solche Mikrostrukturierung mit verschiedenen Analytbindungspartnern zu erzeugen. Die Belegung mit Bindungspartnern an belichteten Stellen ist sehr ungleichmäßig und wenig reproduzierbar.

In EP-A-01 34 215, EP-A-03 04 202 und EP-A-02 71 974 werden miniaturisierte Analysen elemente beschrieben, in denen Antikörperspots mit konventionellen Beschichtungstechniken auf beispielsweise Polystyroloberflächen durch Adsorption aufgebracht sind. Auch hier treten die durch starke Heterogenitäten der Oberflächen bedingten Schwankungen der Oberflächenbelegungen auf und bewirken eine schlechte Reproduzierbarkeit der Meßergeb nisse. Ein weiteres Problem sind unspezifische Bindungen von Proteinen aus Serum oder Plasma an die Oberfläche, was sich insbesondere bei kleinen Konzentrationen der Analyten und der Festphasenbindepartner sowohl für die Bindung der Festphasenbindepartner als auch für die Bindung des Analyten an den Festphasenbindepartner nachteilig auswirkt.

Aufgabe der Erfindung war es daher, die oben beschriebenen Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen und eine Bindematrix zur Verfügung zu stellen, auf die auf sehr kleiner Fläche eine Vielzahl von Festphasenbindungspartnern für verschiedene Analyte einfach repro duzierbar in einer gezielt einstellbaren Oberflächenbelegung und gleichzeitig örtlich begrenzt getrennt voneinander aufgebracht werden können, mit der nach Aufbringen der verschiedenen Festphasenbindungspartner eine Vielzahl von freien Analyten aus einer Lösung auf sehr engem Raum gebunden und detektiert werden können und mit dem die multiple Analytbestimmung somit in reproduzierbarer Weise unter gleichzeitiger Verminderung unspezifischer Bindungen von Probenbestandteilen sowohl qualitativ als auch insbesondere quantitativ durchgeführt werden kann.

Die Aufgabe wird gelöst durch eine Bindematrix und ein Analysenelement wie es in den Ansprüchen charakterisiert ist.

Gegenstand der Erfindung ist eine Bindematrix enthaltend ein flächenförmiges Trägermaterial, das parallel zu seiner Oberfläche mit einer Vielzahl von horizontal räumlich getrennten Bereichen bedeckt ist, die Bindepartner immobilisiert enthalten, die jeweils fähig sind, einen entsprechenden Bindungspartner eines spezifischen Bindungspaares zu binden, dadurch ge kennzeichnet, daß die Bereiche gebildet werden aus

a) sich nicht berührenden Metallschichtspots,
b) über Ankergruppen jeweils an die Oberfläche der Metallspots gebundene verdünnte und im wesentlichen lateral homogene Bindeschichten eines Bindepartners B1.

Unter einer flächenförmigen Bindematrix wird eine im wesentlichen ebene, bevorzugt eine planare Matrix verstanden. Obwohl sie prinzipiell eine beliebig große Oberfläche besitzen kann, kommen die Vorteile der Erfindung gegenüber dem Stand der Technik insbesondere bei kleinen Oberflächen zum Tragen. Vorteilhaft sind daher Analysenelemente mit einer Oberfläche von unter 100 cm², bevorzugt zwischen 1 cm² und 25 cm².

Auf der Trägermaterialoberfläche der Bindematrix sind nebeneinander in horizontaler Richtung eine Vielzahl von sich nicht berührenden Metallschichtbereichen ("Metallspots") aufgebracht.

Diese Bereiche bilden jeweils bevorzugt eine 10-100 nm dicke Schicht auf dem Träger material und können beliebige Flächen einnehmen, also kreisförmig oder eckig sein. Die Vor teile der Erfindung kommen besonders dann zum Tragen, wenn diese Bereiche sehr klein sind mit einem Durchmesser zwischen 0,1 und 1 mm, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,3 und 0,6 mm.

Die Metallschichtbereiche sollen sich nicht berühren, das heißt die freien, von dem Träger material abgewandten Oberflächen der Metallspots sollen von Zwischenflächen umgeben sein, deren Oberflächen aus einem von den Metallspots verschiedenen Material besteht. Im bevor zugten Fall werden die Zwischenoberflächen zwischen den Metallspots von einem nicht metallischen Trägermaterial selbst gebildet. Günstig sind dabei Trägermaterialien, die nur eine sehr geringe unspezifische Wechselwirkung mit biologischen Molekülen, z. B. Immunreagen zien, haben. Günstig ist ein Abstand der äußeren Begrenzungen der Metallspots von 0,1-1 mm, um das spätere getrennte Auftragen von Reagenzien zu erleichtern.

Da die Spots erfindungsgemäß sehr kleine Flächen besitzen können, können auf einer sehr kleinen Trägermaterialoberfläche sehr viele Spots untergebracht werden.

Vorteilhaft sind 10-100 Spots pro cm² Oberfläche des Trägermaterials, besonders vorteilhaft 20-50.

Als Trägermaterial kann beispielsweise Polystyrol, Polycarbonat, Polyethylenacrylat, Polyethylen, Polypropylen oder Glas dienen.

Als Metalle werden bevorzugt Edelmetalle, insbesondere Gold, Silber oder Palladium verwen det.

An den Metallspots ist eine "verdünnte" Bindeschicht eines auf allen Metallspots einheitlichen Bindepartners B1 oder auf verschiedenen Metallspots unterschiedlicher Bindepartner B1′, B1′′ usw. gebunden. Auf jedem Spot soll dabei aber nur eine Art eines Bindepartners in einer verdünnten Bindeschicht gebunden sein. Solche verdünnte Bindeschichten sind in der WO 92/10757 beschrieben, auf die hier vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Unter einer "verdünnten" Bindeschicht wird eine Monoschicht eines von dem Trägermaterial in den Raum wegweisenden spezifischen Bindepartners einer Molekülsorte verstanden, wobei die Oberfläche des Metallspots nicht vollständig belegt ist. Der Belegungsgrad mit dem Binde partner, der ein Maß für die Verdünnung ist, kann ausgedrückt werden als Quotient aus gebundener Dicke der Bindeschicht dividiert durch die theoretische Schichtdicke bei dichter Packung.

Der Belegungsgrad der Metallspots mit einer Monoschicht des Bindepartner B1 ist kleiner als 100%, vorzugsweise 0,1-90%, bevorzugt 0,7-70%, besonders bevorzugt 1-40%.

Die Adsorption der Bindeschicht des Bindepartners wird über Ankergruppen vermittelt. Als Ankergruppen sind Thiol-, Disulphid-, oder Phosphingruppen geeignet. So sind zum Beispiel Thiol- oder Disulphidgruppen als Ankergruppen für Gold- oder Silberoberflächen und Phosphingruppen für eine Palladiumoberfläche besonders geeignet.

Vorzugsweise ist die Ankergruppe für die Adsorption an die Festphase nicht direkt am Binde partner angebracht, sondern ist über ein Spacermolekül, vorzugsweise über ein flexibles Spacermolekül, verknüpft. Besonders bevorzugt enthält das Spacermolekül mindestens eine Alkylengruppe der Formel (CH₂)_n, worin n eine natürliche Zahl von 1-30, vorzugsweise 2-30, besonders bevorzugt 2-15 darstellt. Auf seiner einen Seite enthält das Spacermolekül die Ankergruppe (zum Beispiel die Thiol- oder Disulphidgruppe), die zur Adsorption an die Ober fläche der Metallspots geeignet ist. Auf seiner anderen Seite, das heißt vom Trägermaterial weg, enthält das Spacermolekül eine oder mehrere Verknüpfungsgruppierungen, über die der Bindepartner oder eine Komponente davon mit dem Spacermolekül verknüpft ist. Bei diesen Verknüpfungsgruppierungen kann es sich zum Beispiel um eine Amino- oder Hydroxylfunktion handeln, die zum Beispiel mit einer Carboxylfunktion des Bindepartners unter Bildung einer Ester- oder Amidgruppe verknüpft ist. Das Spacermolekül kann jedoch auch als Ver knüpfungsgruppe eine Carboxylfunktion enthalten, die dann wiederum mit einer reaktiven Amino- oder Hydroxylfunktion des Bindepartners verknüpft ist.

Die Herstellung von verdünnten Bindeschichten ist in WO 92/10757 beschrieben.

Eine erste Möglichkeit besteht darin, ein Spacermolekül zu verwenden, das mit zwei oder mehreren Molekülen, vorzugsweise zwei Molekülen des Bindepartners verknüpft ist. Ein Bei spiel für ein solches Spacermolekül ist Cystamin, das als Ankergruppe eine Disulphidgruppe und als Verknüpfungsgruppierung zwei Aminofunktionen enthält und daher mit zwei Mole külen eines aktivierten Bindepartners verknüpft werden kann. Solche Moleküle bilden bei Adsorption an eine Goldoberfläche eine verdünnte Bindeschicht mit einem Belegungsgrad wesentlich kleiner als 100% bezogen auf den Bindepartner.

Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung einer verdünnten Bindeschicht ist der Einbau einer hydrophilen Linkergruppe zwischen dem Spacermolekül und dem Bindepartner. Dieser Linker ist insbesondere ein geradkettiges Molekül mit einer Kettenlänge von 4-15 Atomen. Bevorzugt ist dabei eine Linkergruppe, die eine oder mehrere hydrophile Ethylenoxideinheiten, vorzugs weise zwischen 1 und 5 enthält. Besonders bevorzugt wird die hydrophile Linkergruppe durch ein Amin- oder Hydroxyl-terminiertes Polyethylenoxid gebildet.

Zwischen dem hydrophilen Linker und dem Bindepartner kann vorzugsweise ein weiteres Spacermolekül eingebaut werden, welches aus einer Alkylengruppe der Formel (CH₂)_n und einer Verknüpfungsgruppierung besteht, worin n eine natürliche Zahl von 2-15 ist. Als besonders geeigneter Linker hat sich 1,8-Diamino-3,6-Dioxaoctan erwiesen. Solche Verbin dungen bilden bei Adsorption an eine Goldoberfläche eine Monoschicht mit einer Belegungs dichte von beispielsweise 19% bei Biotin als Bindepartner aus, die in der Lage ist, einen freien Reaktionspartner (Streptavidin) mit hoher Affinität und innerhalb kürzester Zeit zu einem dichtgepackten Film zu binden. Solche verdünnten Bindeschichten sind daher besonders bevor zugt.

Ganz besonders bevorzugt sind die "verdünnten" Bindeschichten, die zusätzlich zu den über Ankergruppen und Spacern gebundenen Bindepartner auch noch Spacermoleküle enthalten, die zwar mit einer Ankergruppe verbunden sind, aber an die kein Bindepartner gebunden ist. Derartige Verbindungen werden im weiteren auch als Verdünnungsmoleküle bezeichnet. Wenn man zum Beispiel biotinylierte und nicht-biotinylierte Spacermoleküle im Verhältnis von 1 : 10 bis 1 : 2 einsetzt, so erhält man eine verdünnte Biotinmonoschicht, die einen freien Bindungs partner mit hoher Geschwindigkeit und großer Kapazität binden kann.

Geeignete Verdünnungsmoleküle enthalten eine Ankergruppe und einen Spacerbestandteil sowie gegebenenfalls ein Linkermolekül, wobei sich die Anzahl der CH₂-Gruppen des Spacermoleküls um nicht mehr als 1-5, bevorzugt nicht mehr als 1-2 C-Atome von der Anzahl der CH₂-Gruppen des Spacermoleküls unterscheidet, das an den Bindungspartner gebunden ist. Es hat sich weiterhin als zweckmäßig erweisen, daß die Mindestkettenlänge des Ver dünnungsmoleküls 6 Atome (ohne Ankergruppe und hydrophile Linkergruppe) beträgt.

Anstelle des Bindepartners befindet sich vorzugsweise an der von der Ankergruppe entfernten Ende des Verdünnungsmoleküls eine hydrophile Funktion, wie zum Beispiele eine Hydroxyl gruppe, eine Carbonsäuregruppe, eine Carbonsäureethylester- oder Methylestergruppe, eine Carbonsäureamidgruppe, eine mit ein oder zwei Methyl- oder Ethylgruppen substituierte Carbonsäureamidgruppe, eine Sulfonsäuregruppe oder eine Sulfonamidgruppe. Ebenso ist es bevorzugt, an das von der Ankergruppe entfernte Ende des Verdünnungsmoleküls einen hydrophilen Linker (gemäß obiger Definition) oder einen Teil eines hydrophilen Linkers zu binden.

Es ist auch möglich, einen Spacer mit Bindepartner und einen Spacer ohne Bindepartner über eine kovalente Bindung zu verknüpfen. Bei Verwendung von Gold- oder Silberoberflächen er folgt diese Verknüpfung vorzugsweise über eine Disulphidbrücke.

In solchen gemischten Bindeschichten, die aus Verdünnungsmolekülen (Spacermolekülen ohne Bindepartner) und aus Spacermolekülen mit Bindepartner bestehen, beträgt der Anteil der Spacermoleküle mit Bindepartner zweckmäßig 0,1-90 mol-%, vorzugsweise 0,5-50 mol-% und besonders bevorzugt 1-40 mol-%.

Als Bindepartner kann jeder Partner eines spezifischen Bindepaares benutzt werden, zum Bei spiel Antikörper, Antigene, Proteine, Lektine, Biotin, Streptavidin oder Polynukleotide. Be vorzugt ist auf allen Spots eine verdünnte Bindeschicht aufgebracht, die von demselben Binde partner B1 gebildet wird.

Dabei handelt es sich vorzugsweise um Biotin oder Biotin-Analoge Moleküle wie Desthio biotin, Iminobiotin oder HABA (4-Hydroxy-phenyl-azobenzoesäure), die ebenfalls mit Streptavidin reagieren.

Im Falle von Antikörpern, Antigenen, Haptenen oder Polynukleotiden ist es auch möglich, daß verschiedene Bindepartner unterschiedliche verdünnte Bindeschichten auf einzelnen Spots bilden. Dies ist bei Polynukleotiden besonders bevorzugt. Im Grenzfalle befindet sich auf jedem Metallspot eine verdünnte Bindeschicht eines anderen Bindepartners. Eine solche Bindematrix kann schon zur Bindung und zum Nachweis verschiedener freier Bindungspartner der Matrixbindepartner verwendet werden. Zusätzlich ist es möglich, daß auf verschiedenen Spots Bindeschichten des gleichen oder unterschiedlicher Bindepartner aufgebracht sind, die einen von Spot zu Spot unterschiedlichen Verdünnungsgrad aufweisen.

Der Belegungsgrad des Bindepartners B1 der ersten Bindeschicht auf den Metallspots läßt sich durch eine Dickenmessung der Bindeschicht bestimmen. Dabei nimmt die gemessene Schicht dicke mit dem Belegungsgrad der Bindeschicht ab. So hat eine Bindeschicht mit Biotin als Bindepartner eine Dicke von 0,7 nm, wobei diese Dicke geringer als die errechnete Länge von 3,7 nm des Moleküls ist.

Weiterhin ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Bindematrix, dadurch gekennzeichnet, daß

a) Metallschichtspots auf die Trägermaterialoberfläche in der Weise aufgebracht werden, daß sie sich nicht berühren
b) die freie Oberfläche der Metallschichtspots jeweils mit einer Reaktionslösung inkubiert wird, die Moleküle zur Erzeugung einer verdünnten Bindeschicht enthält.

In einem ersten Schritt werden auf das Trägermaterial des Analysenelementes in horizontaler Richtung voneinander getrennte diskrete Metallspots in einer Schicht parallel zur Oberfläche des Trägermaterials aufgebracht. Bevorzugt werden diese Spots in einem regelmäßigen Muster aufgebracht. Um das gewünschte Muster von Metallspots auf der Trägermaterialoberfläche zu erhalten, wird bevorzugt eine Maske verwendet, in der das gewünschte Muster freigelassen ist und die auf das Trägermaterial aufgelegt wird. Über die Maske wird dann das Muster der Metallspots durch Aufdampfen oder Aufsputtern aufgebracht. Gegebenenfalls kann die Trägermaterialoberfläche vorher mit einem Haftvermittler, zum Beispiel Chrom, versehen werden. Je nach späterem Verwendungszweck kann die Dicke der aufgebrachten Metallspots unterschiedlich sein. Soll das Analysenelement für Oberflächenplasmonresonanz verwendet werden, so ist eine Metallschichtdicke von 10-100 nm bevorzugt. Ansonsten kann die Dicke auch größer sein.

Neben dem Aufbringen von Metallspots über eine Maske ist es auch möglich, das Analysen element ganzflächig mit einer Metallschicht zu überziehen und durch Wegätzen von Metall nachträglich ein gewünschtes Spotmuster zu erzeugen. Möglich ist auch, ein Spotmuster auf einer Metalloberfläche durch Überziehen des Metalls mit einem nichtmetallischen Überzug, z. B. Wachs, zu erzeugen, wobei der Überzug die Zwischenflächen zwischen den Spots dar stellt.

In einem zweiten Schritt werden die einzelnen Metallspots mit einer verdünnten Bindeschicht überzogen. Soll diese verdünnte Bindeschicht auf allen Spots diesselbe sein, wird das Träger element vorteilhafterweise in eine Lösung eingetaucht, die die für die Erzeugung einer ver dünnten ersten Bindeschicht notwendigen Moleküle enthält. Dies kann zum einen bevorzugt eine Mischung aus Anker-Spacer-Molekülen mit und ohne Bindungspartner in einem den Ver dünnungsgrad bestimmenden Verhältnis sein, zum anderen kann dies eine Lösung aus solchen Molekülen sein, die wie oben beschrieben ebenfalls verdünnte Bindeschichten erzeugen.

Sollen die verdünnten Bindeschichten auf verschiedenen Spots unterschiedliche Bindepartner enthalten, so werden verschiedene Lösungen auf einzelne Spots aufgegeben, die jeweils einen anderen Bindungspartner in einer eine verdünnte Bindeschicht erzeugenden Form enthalten. Statt dessen oder zusätzlich können so auch unterschiedliche "Verdünnungsgrade" der Binde filme auf verschiedenen Spots erzeugt werden, indem z. B. ein unterschiedlicher Anteil an Ver dünnungsmolekülen in den einzelnen Lösungen vorhanden ist, die auf verschiedene Spots auf gegeben werden. Die räumlich getrennte Aufgabe der Reagenzien für verdünnte Binde schichten kann über gebräuchliche Methoden wie Pipettieren, Stempel- oder Drucktechniken, z. B. Ink-Jet, erfolgen. Gegebenenfalls wird überschüssige Lösung wieder entfernt.

Diese verdünnten lateralen Bindeschichten sind mikroskopisch homogen, wie zum Beispiel durch Surface Plasmon Microscopy nachweisbar (B. Rothenhäusler und W. Knoll, Surface Plasmon Microscopy, Nature, Vol. 332, Seite 615-617 (1988). Bei einer Auflösung von 5 µm sind keine Dickenunterschiede meßbar.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine Bindematrix, die auf jedem Spot eine verdünnte Bindeschicht des gleichen Bindepartners enthält. Jede dieser Bindeschichten kann dann ihrer seits zur Bindung gleicher oder unterschiedlicher Bindungspartner dienen.

Hat die verdünnte Bindeschicht auf allen Spots an ihrer Oberfläche den gleichen Bindungs partner, dient diese Bindematrix mit einer verdünnten Bindeschicht, die in Form von räumlich getrennten diskreten Bereichen auf dem Trägermaterial über Metallspots aufgebracht ist, nun zum reproduzierbaren und über den Verdünnungsgrad der jeweiligen Bindeschicht einstell baren bzw. optimierbaren Aufbringen einer Vielzahl von gleichen oder unterschiedlichen Bin dungspartnern für freie Analyten auf diese diskreten Bereiche und bildet somit die Grundlage für ein Multianalyt-Analyseelement, das die gleichzeitige, genaue qualitative aber auch quanti tative Bestimmung einer Vielzahl von Analyten in einer Probe oder eines Analyten in verschie denen Proben auf engem Raum erlaubt, wobei nur sehr geringe Reagenzmengen benötigt werden und diese Bestimmungen wenig durch unspezifische Bindungen von Blut- oder Serum bestandteilen wie z. B. Fibrinogen gestört werden. Gegenüber konventionellen "Multiparameter"-Analyseelementen wie Mikrotiterplatten ist dabei eine wesentlich höhere Zahl von Analysebereichen möglich. Auf einer Fläche von 100 cm² sind bis zu 100 000 Spots möglich, wobei die Herstellung der Bindematrix trotzdem sehr einfach ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Analyseelement zur Bestimmung unter schiedlicher freier Reaktanden in einer Probe oder zur Bestimmung eines Reaktanden in ver schiedenen Proben, enthaltend ein flächenförmiges Trägermaterial, das parallel zu seiner Ober fläche mit einer Vielzahl von räumlich getrennten Bereichen bedeckt ist, auf denen unterschied liche oder gleiche spezifische Bindungspartner für freie Reaktanden immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß es eine erfindungsgemäße Bindematrix enthält, an die eine an die Binde partner B1 oder, bei Vorhandensein eines zusätzlichen Bindepartners B2, eine an B2 spezi fisch gebundene weitere Bindeschicht enthält, die an ihrer Oberfläche Bindungspartner B3 für zur bestimmende freie Reaktanden oder Analyte enthält.

Neben der ersten verdünnten Bindeschicht auf jedem Metallspot enthält demnach das erfin dungsgemäße Multi-Reaktanden-Analyseelement zusätzlich auf jedem Spot eine weitere Bindeschicht gleicher oder unterschiedlicher Bindungspartner B3 für freie Reaktanden. Dabei ist auf jedem Spot nur eine Sorte von Reaktandenbindungspartnern gebunden. Diese Reak tandenbindungspartner können über eine spezifische Bindungsstelle mit dem Bindungspartner B1 der ersten Bindeschicht gekoppelt sein. Diese spezifischen Bindestellen können zum Beispiel ein Epitop für einen Antikörper der ersten Bindeschicht sein oder auch ein an die Analytbindepartner gebundenes spezifisches Bindemolekül, wie z. B. Biotin, das mit dem Bin dungspartner der ersten Bindeschicht, z. B. Streptavidin, spezifisch koppelt.

Als Reaktandenbindungspartner werden spezifische Bindungspartner für freie, sich in Lösung befindende Reaktanden verwendet. Dies können Antikörper, Antigene, Haptene oder Nuklein säurestränge sein.

In einer Ausführungsform dient eine Bindematrix, auf deren Spots sich eine verdünnte Binde schicht eines einheitlichen Bindepartners B1 befindet, direkt zur reproduzierbaren Aufgabe einer weiteren Schicht von Spot zu Spot gleicher oder verschiedener Reaktandenbindungs partner B3, die über eine spezifische Bindungsstelle an B1 binden.

In einer anderen Ausführungsform werden die verdünnten Bindeschichten der einzelnen Spots jeweils durch eine weitere monomolekulare Bindeschicht mit einem einheitlichen Bindepartner B2 belegt. Dabei hat der Bindepartner B2 eine spezifische Bindestelle für B1. Da diese Bele gung erfindungsgemäß auch auf sehr kleiner Fläche sehr gut reproduzierbar ist, können über raschenderweise die Bindepartner B2 der einzelnen Spots wiederum sehr gut für die reprodu zierbare Belegung einer einstellbaren Menge einer weiteren Bindeschicht mit von Spot zu Spot gleicher oder verschiedener Reaktandenbindungspartner B3 dienen, die dann eine spezifische Bindestelle für B2 haben.

Entscheidend für die erfindungsgemäßen Vorteile bei beiden Ausführungsformen ist, daß die Bindematrices auf den Metallspots eine verdünnte Bindeschicht enthalten.

Es hat sich dabei überraschenderweise herausgestellt, daß bei Anwesenheit einer verdünnten Bindeschicht auf jedem Spot der erfindungsgemäßen Bindematrix, jeder Spot separat mit einer reproduzierbaren und definierten Menge an Reaktandenbindungspartnern B3 belegt werden kann - sei es direkt oder über eine Bindepartnerzwischenschicht B2 -, ohne daß darüberhinaus unspezifische Bindungen von Probenbestandteilen diese Belegung stören. Diese reproduzier bare Belegung wird überraschenderweise auch bei sehr kleinen Abmessungen der Spots erreicht, was auf eine sehr geringe Mikroinhomogenität der Bindeschichten schließen läßt. Dadurch werden Analysenelemente mit einer Vielzahl von Spots mit einer konstanten und homogenen Bindepartner-Belegung jedes Spots auf sehr kleinem Raum ermöglicht. Zusätzlich läßt sich die Belegung der verschiedenen Spots mit Reaktandenbindungspartnern überraschen derweise auch über den Verdünnungsgrad der verschiedenen Bindeschichten einfach und reproduzierbar steuern, so daß jeder Bindeschichtenspot individuell bezüglich des nachzu weisenden Reaktanden und bezüglich erforderlicher Sensitivität zum Nachweis dieses Reak tanden eingestellt werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Analysen elementes zur multiplen Bestimmung gleicher oder unterschiedlicher freier Reaktanden, da durch gekennzeichnet, die freien Oberflächen der Bindeschichten einer Bindematrix jeweils mit gleichen oder unterschiedlichen Lösungen inkubiert werden, die Bindepartner B3 für freie Reaktanden enthalten, wobei die Bindepartner B3 eine spezifische Bindestelle für die Binde partner B1 oder B2 haben.

Das Aufbringen der verschiedenen Bindeschichten mit gleichen oder verschiedenen Bindungs partnern für freie Reaktanden auf die Bindematrix kann auf verschiedene Weise erfolgen.

Im einfachsten Falle werden mit einer Pipette auf verschiedene Spots, die jeweils mit einer ersten verdünnten Bindeschicht bedeckt sind und gegebenenfalls mit einer weiteren Binde schicht mit dem Bindepartner B2 bedeckt sind, gleiche oder verschiedene Bindungspartner B3 für freie Reaktanden als Lösung aufgebracht. Diese Bindungspartner B3 müssen alle eine gemeinsame Bindungsstelle für den einheitlichen Bindepartner B1 der ersten verdünnten Binde schicht oder gegebenenfalls den Bindungspartner B2 der zweiten Bindeschicht aufweisen. Bevorzugt sind sie an ein einheitliches Bindemolekül für den Bindungspartner B1 oder B2 gebunden. Ein Beispiel für Bindungspartner B3 sind unterschiedliche Antikörper, die an Biotin gebunden sind. Auf unterschiedliche Spots, die mit einer verdünnten Biotinbindeschicht und einer daran gebundenen Streptavidinbindephase belegt sind, werden dann unterschiedliche biotinylierte Antikörper aufgebracht, wobei sich diese an die Streptavidinphase binden, da Streptavidin insgesamt 4 Bindungsstellen hat. Man erhält so ein Analysenelement, das auf engstem Raum Felder zur Bindung vieler unterschiedlicher freier Reaktanden besitzt. Diese Reaktandenbindungspartnerschichten bilden eine reproduzierbare Belegung der Bindeschichten der Bindematrix.

Wird auf jedem Spot ein einheitlicher biotinylierter Antikörper des Bindungspartners für ein freies Antigen aufgebracht, können mit dem Analyseelement gleichzeitig eine Vielzahl von Proben gemessen werden, die dieses Antigen zu dem festphasengebundenen Antikörper enthal ten.

Weitere Möglichkeiten zur Aufgabe verschiedener Bindungspartner auf die jeweiligen Spots stellen Drucktechniken oder Stempeltechniken, insbesondere Ink-Jet, oder die Aufgabe mittels einer Mikromultipin-Platte analog zur Aufgabe verschiedener Reagenzien bei Mikrotiter platten, dar. Gegebenenfalls wird überschüssige Lösung wieder entfernt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung min destens zweier Reaktanden oder Analyten in einer Probelösung mittels spezifischer Bindungs reaktionen der Analyten mit festphasengebundenen Analytbindungspartnern auf einem flächen förmigen Analysenelement, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probenlösung mit einem erfindungsgemäßen Analysenelement kontaktiert und die Anwesenheit oder Menge fest phasengebundener Analyte in verschiedenen Bereichen des Analysenelementes getrennt bestimmt.

Analyt und festphasengebundener Reaktandenbindungspartner bilden dabei ein spezifisches Bindepaar. Analyte können sein: Antikörper, Antigene, Haptene, Nukleinsäuren, die zumindest teilweise komplementär zu einer festphasengebundenen Nukleinsäure sind, und andere spezi fische Bindungspartner.

Der Nachweis der Bindung des Analyten an den Festphasenbindungspartner wird beispiels weise dadurch ermöglicht, daß der Analyt eine Markierungsgruppe trägt oder durch Bindung mit einem weiteren freien Bindungspartner eine Markierung erhält. Als Markierung kommen die bei Immunoassays oder in der DNA-Diagnostik üblichen Markierungen in Frage. Vorteil haft ist insbesondere die Markierung mit einer Direktmarkierung, insbesondere mit einem fluoreszierenden oder lumineszierenden Bestandteil. Die dadurch ermöglichte optische Beob achtung der Bindung des Analyten an den Festphasenbindungspartner eines bestimmten Spots erlaubt einen genauen qualitativen oder quantitativen Nachweis dieses Analyten.

Um die Bindung der Analyte auf einzelnen Spots nebeneinander und insbesondere auch quanti tativ nachweisen zu können, können bevorzugt ortsauflösende Detektionsmethoden verwendet werden. Eine bevorzugte Methode ist z. B. die konfocale scanning Fluoreszenzmikroskopie. Bei dieser Methode wird auf jedem Spot einzeln der zur Markierung verwendete Fluoreszenz farbstoff mit Hilfe eines Lasers geeigneter Wellenlänge zur Fluoreszenz angeregt (scanning). Das emitierte Licht wird mittels empfindlicher Detektoren, wie z. B. integrierender CCD- Cameras aufgezeichnet, und mit geeigneter Bildauswerte-Software quantifiziert. Auch andere, nichtscannende fluoreszenzmikroskopische Methoden sind zur Auswertung gut geeignet. In diesem Fall werden mehrere Spots in einem Bildausschnitt gleichzeitig betrachtet. Die Auswer tung der einzelnen Spots erfolgt dann z. B. hintereinander mit Hilfe geeigneter Bildauswerte- Software.

Eine weitere Meßmethode der Bindung eines Analyten an den Festphasenbindungspartner stellen optische, insbesondere reflektionsoptische Techniken dar, bei denen die Zunahme der Schichtdicke einer extrem dünnen Schicht mit dem trägerfixierten Bindungspartner durch Bindung des freien Analyten beobachtet werden kann. Ein Überblick über diese Techniken wird gegeben in Sadowsky: "Review of optical methods in immunosensing", SPIE, Vol. 1954, Optical Testing and Methology II (1988), 413-419. Hier ist keine spezielle Markierung der Analyte nötig.

Ein besonders bevorzugtes reflektionsoptisches Verfahren ist der Nachweis der Bindung ver schiedener Analyten in verschiedenen Bereichen des Analysenelementes durch Oberflächen plasmonenresonanz. Bei diesen Verfahren besteht das Analysenelement aus einem durchsich tigen, dielektrischen Material, auf dem in sehr geringer Schicht eine metallisch leitende Schicht in Spotform aufgebracht ist, welche den Festphasen-Bindungspartner trägt. Solche Analyse elemente werden vielfach auch als optische Immunsensoren bezeichnet. Beispiele für solche optischen Immunsensoren sind in der EP-A 01 12 721, EP-A-02 76 142 und in der EP-A-02 54 557 beschrieben.

Auch andere ortsauflösende Detektionsmethoden wie z. B. elektrochemische Messungen, Leit fähigkeitsänderungen oder Messung von radioaktiver Markierung sind möglich. Zur Analyse einer Probe auf bestimmte Analyte wird die Probe entweder großflächig auf das Analyse element oder separat auf einzelne Spots aufgebracht. Gegebenenfalls werden zusätzlich mar kierte Bindungspartner für die zu bestimmenden Analyte zugegeben. In diesem Fall wird das Analyseelement vor Messung der an die Festphase gebundenen markierten Analyte vorteil hafterweise von freien Markierungsmolekülen frei gewaschen.

Das Analysenelement kann auch zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten in verschie denen Proben benutzt werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung eines Analyten in verschiedenen Proben mittels spezifischer Bindungsreaktionen des Analyten mit festphasengebundenen Analytbindungspartnern auf einem flächenförmigen Analyseelement, dadurch gekennzeichnet, daß man verschiedene Probenlösungen mit verschiedenen Bereichen eines erfindungsgemäßen Analyseelements kontaktiert, wobei in den Bereichen gleiche Analytbindungspartner gebunden sind und die Anwesenheit oder Menge des festphasenge bundenen Analyt in verschiedenen Bereichen getrennt bestimmt.

Die verschiedenen Probelösungen können dabei durch übliche Aufgabetechniken wie Pipettieren, Druck- und Stempeltechniken oder eine Mikromultipinplatte aufgegeben werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Binde matrixes bzw. Analysenelemente zum gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl von Analyten insbesondere in Immunoassays, beispielsweise für die Allergiediagnostik oder für die DNA Diagnostik, beispielsweise zum Screenen einer Probe auf Polynucleotide mit bestimmten Sequenzen.

Beispiel 1 1. Herstellung der Spots durch Aufdampfen

Auf "Lexan" Polycarbonatfolien (Hersteller: General Electric, Dicke 0,75 mm) mit den Ab messungen 8×8 cm wurden über eine Metallmaske (d=0,5 mm, Material: Aluminium) in einer Leybold Hochvakkum-Beschichtungsanlage (Univex 450) 36×36 runde Goldspots (insgesamt 1296 Spots) in gleichmäßigen Abständen aufgedampft. Die Schichtdicke des aufgedampften Goldes beträgt 300 nm. Der Durchmesser der Spots beträgt 1 mm, der Abstand von Spot zu Spot ebenfalls 1 mm nach allen Seiten.

2. Beschichtung der Multi-Goldspotplatte mit "verdünnten" Biotinthiol-Bindeschichten 2.1 "Hydrophile" Schicht

2,8 mg (5×10^-5 m) der Biotin-Thiolverbindung I und 8,7 mg (4,5×10^-4 m) des Verdünners II wurden in 100 ml 0,05 m Kaliumphosphatpuffer pH 7,25 gelöst. In diese Lösung wurden die frisch beschichteten Polycarbonatfolien getaucht. Nach einer Stunde wurden die Platten ent nommen, 2× mit Wasser (bidest.) gewaschen und an der Luft getrocknet.

2.2. "Hydrophobe" Schicht

2,94 mg (5×10^-5 m) der Biotin-Thiolverbindung III und 9,2 mg (4,5×10^-4 m) des Verdünners IV wurden in 100 ml Ethanol p.a. gelöst. In diese Lösung wurden die frisch beschichteten Polycarbonatfolien getaucht. Nach 4 Stunden wurden die Platten entnommen, 2× mit Ethanol p.a. gewaschen und an der Luft getrocknet.

3. Aufbringen von Streptavidin

Die mit Goldspots und SAM beschichteten Folien wurden 1 Stunde in eine Streptavidinlösung getaucht (Konzentration Streptavidin: 0,5 mg/ml in 0,05 m K-Phosphatpuffer pH 7,2). Die Chips wurden danach mit einer Lösung aus 50 mM K-Phosphat-Puffer pH 7,2, 2% Saccharose, 0,9% NaCl und 0,3% RSA II gewaschen. Die Chips wurden anschließend bei 25°C und 40% Luftfeuchtigkeit 20 Stunden getrocknet.

4. Durchführung eines TSH-Tests

Auf den mit Streptavidin beschichteten Spots wurde ein TSH-Test nach folgendem Schema durchgeführt:

1. Inkubation mit <TSH< MAK 1.20-Bi (1 : 4) für 45 Minuten, Konzentration des MAK 20 µg/ml, Puffer 20 mM K-Phosphat pH 7,4.
2. Waschen mit bidest. Wasser.
3. 45 Minuten Inkubation mit TSH Standard "Enzymun", Fa. Boehringer GmbH.
4. Waschen mit bidest. Wasser.
5. 30 Minuten Inkubation mit Fluoreszenz-Latex-Antikörper (A8)-Konjugat, 0,05% Fest stoffanteil in 20 mM K-Phosphat Puffer pH 7,4.
6. Waschen mit bidest. Wasser.
7. Messung am konfokalen Floureszenzmikroskop (Fa. Biorad).

Ergebnisse

Es wurden zwei Standards (10 µU und 2 µU) vermessen. Dabei wurden die folgenden relati ven Intensitäten erhalten:

Graphische Auswertung der Meßergebnisse (Anzahl von Pixeln gegen Fluoreszenzintensität) für die hydrophobe verdünnte Bindeschicht siehe Fig. 1, 2.

Beispiel 2 Überprüfung der unspezifischen Bindung

Die mit Streptavidin beschichteten Spots der verdünnten hydrophoben Bindeschicht aus Beispiel 1 wurden auf über Serumbestandteile vermittelte unspezifische Bindung des Fluoreszenzlatexkonjugats untersucht.

1. Waschen mit bidest. Wasser
2. 45 Minuten Inkubation mit Probe (Standards bzw. Serum)
3. Waschen mit bidest. Wasser
4. 30 Minuten Inkubation mit Fluoreszenz-Latex-Antikörper (A8)-Konjugat
5. Waschen mit bidest. Wasser
6. Messung am konfocalen Fluoreszenzmikroskop.

Ergebnisse

Es zeigt sich, daß Serumbestandteile die Messung nicht stören.

Claims

1. Bindematrix enthaltend ein flächenförmiges Trägermaterial, das parallel in horizontaler Richtung zu seiner Oberfläche mit einer Vielzahl von räumlich getrennten Bereichen bedeckt ist, die Bindepartner immobilisiert enthalten, die jeweils fähig sind, einen ent sprechenden freien Bindungspartner eines spezifischen Bindungspaares zu binden, dadurch gekennzeichnet, daß die Bereiche gebildet werden aus

a) sich nicht berührenden Metallschichtspots,
b) über Ankergruppen jeweils an die Metallspots gebundene verdünnte und im wesent lichen lateral homogene Bindeschichten eines Bindepartners B1.

2. Bindematrix gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Belegung 0,1 bis 90% der maximalen Belegung beträgt.

3. Bindematrix gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Belegung 0,5 bis 70% der maximalen Belegung beträgt.

4. Bindematrix gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Belegung 1 bis 40% der maximalen Belegung beträgt.

5. Bindematrix nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Metall schichtspots aus Gold, Silber oder Palladium bestehen und die Ankergruppen Thiol-, Disulfid- oder Phosphingruppen darstellen.

6. Bindematrix nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Anker gruppe mit dem Bindepartner B1 über ein flexibles Spacermolekül verknüpft ist.

7. Bindematrix nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das flexible Spacermolekül mindestens eine Alkylengruppe der Formel (CH₂)_n enthält, worin n eine natürliche Zahl zwischen 1 und 30 ist.

8. Bindematrix nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Spacermolekül mit zwei oder mehreren Molekülen des Bindepartners verknüpft ist.

9. Bindematrix gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich zwischen dem Spacermolekül und dem Bindepartner eine hydrophile Linkergruppe befindet.

10. Bindematrix nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Binde schichten der einzelnen Bereiche neben dem mit Bindepartnern verknüpften Spacer moleküle noch Spacermoleküle enthalten, die mit Ankergruppen versehen sind, aber nicht mit Bindepartnern verknüpft sind.

11. Bindematrix gemäß Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallspots einen Durchmesser von 0,1-1 mm besitzen.

12. Bindematrix gemäß Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß pro cm² der Binde matrix zwischen 10 und 100 Metallspots aufgebracht sind.

13. Bindematrix gemäß einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß auf einzelnen Spots unterschiedlich verdünnte Bindeschichten aufgebracht sind.

14. Bindematrix gemäß Anspruch 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß auf einzelnen oder allen Metallspots Bindeschichten mit unterschiedlichen Bindepartnern aufgebracht sind.

15. Bindematrix gemäß Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß auf den Metallspots Bindeschichten mit den gleichen Bindepartnern aufgebracht sind.

16. Bindematrix nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindepartner B1 Biotin oder ein Biotinanalogon ist.

17. Bindematrix nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindepartner B1 ein oder mehrere verschiedene mit Antikörpern bindefähige Antigene oder Haptene darstellt.

18. Bindematrix nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindepartner B1 ein oder mehrere verschiedene Polynukleotide darstellt.

19. Bindematrix gemäß Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß an die Binde schichten des Bindepartners B1 jeweils eine weitere Bindeschicht eines in allen Bereichen gleichen Bindepartners B2 gebunden ist, der fähig ist, freie Bindungspartner eines spezifi schen Bindungspaares zu binden und über eine spezifische Bindestelle an B1 gebunden ist.

20. Bindematrix nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindepartner B1 Biotin und der weitere Bindepartner B2 Streptavidin ist.

21. Analysenelement zur Bestimmung unterschiedlicher freier Reaktanden in einer Probe oder zur Bestimmung eines Reaktanden in verschiedenen Proben, enthaltend ein flächen förmiges Trägermaterial, das parallel zu seiner Oberfläche mit einer Vielzahl von horizon tal räumlich getrennten Bereichen bedeckt ist, auf denen unterschiedliche oder gleiche spezifische Bindungspartner für freie Reaktanden immobilisiert sind, dadurch gekenn zeichnet, daß es eine Bindematrix gemäß einem der Ansprüche 15, 16, 19 oder 20, an die c) eine an die Bindepartner B1 oder, bei Vorhandensein eines zusätzlichen Bindepartners B2, eine an B2 spezifisch gebundene weitere Bindeschicht enthält, die an ihrer Oberfläche Bindungspartner B3 für zur bestimmende freie Reaktanden enthält.

22. Analyseelement gemäß Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Binde partner B1 Biotin ist, der eine verdünnte Schicht auf den Metallspots bildet, der Binde partner B2 Streptavidin ist und die Bindungspartner B3 biotinylierte Reaktandenbindungs partner sind.

23. Verfahren zur Herstellung einer Bindematrix gemäß den Ansprüchen 1-18, dadurch ge kennzeichnet, daß

24. Verfahren zur Herstellung einer Bindematrix gemäß Anspruch 19 oder 20, dadurch ge kennzeichnet, daß die verdünnten Bindeschichten einer Bindematrix gemäß Anspruch 15 oder 16 jeweils mit einer Reaktionslösung inkubiert werden, die einen weiteren Binde partner B2 für einen freien Bindungspartner mit einer spezifischen Bindestelle für den Bindepartner B1 enthält.

25. Verfahren zur Herstellung eines Analysenelementes gemäß Anspruch 21-22, dadurch ge kennzeichnet, daß die freien Oberflächen der Bindeschichten einer Bindematrix gemäß einem der Ansprüche 15, 16, 19 oder 20 jeweils mit gleichen oder unterschiedlichen Lösun gen inkubiert werden, die Bindepartner B3 für freie Reaktanden enthalten, wobei die Bindepartner B3 eine spezifische Bindestelle für die Bindepartner B1 oder B2 haben.

26. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung verschiedener freier Reaktanden in einer Probenlösung oder eines freien Reaktanden in verschiedenen Probelösungen mittels spezi fischer Bindungsreaktionen der Reaktanden mit festphasengebundenen Reaktanden bindungspartnern auf einem flächenförmigen Analysenelement, durch Kontaktieren und Bindung der Reaktanden an diskrete, räumlich voneinander getrennte Binde-Bereiche des Analyseelements und Bestimmung der festphasengebundenen Reaktanden in den verschie denen Bereichen getrennt voneinander, dadurch gekennzeichnet, daß ein Analyseelement gemäß Anspruch 21 oder 22 verwendet wird.

27. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie erfolgt.

28. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung mittels Oberflächenplasmonresonanz erfolgt.

29. Verwendung einer Bindematrix gemäß einem der Ansprüche 1-20 oder eines Analysen elementes gemäß einem der Ansprüche 21-22 zum multiplen Analytnachweis.

30. Verwendung einer Bindematrix gemäß einem der Ansprüche 1-20 oder eines Analysen elementes gemäß einem der Ansprüche 21-22 für Immunoassays.

31. Verwendung einer Bindematrix gemäß einem der Ansprüche 1-20 oder eines Analysen elementes gemäß einem der Ansprüche 21-22 zur DNA-Diagnostik.