JPH10506996A - 多種検体の同時分析用結合マトリックスならびに分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の対象は、空間的に分離された多数の領域によって、水平方向に表面に対して平行に被覆されている、平坦な支持体を含有する結合マトリックスであって、各領域は固定された結合相手を含有しており、各結合相手は特異的結合対の対応する遊離の結合相手に結合することができる。そしてこの領域は、ａ）分離された金属被覆スポット、ｂ）アンカー基によって金属スポットに固定されている結合相手Ｂ１の、希薄な、本質的に横方向に均質な固定層で形成されている。この結合マトリックスには多数の同一または異なる結合相手を保有させることができ、したがって、１試料中の各種の被検体または各種の試料中の同一の被検体の同時分析用の分析成分として作用する。

Description

【発明の詳細な説明】 多種検体の同時分析用結合マトリックスならびに分析要素 本発明は、遊離の反応体に対する種々の特異的結合相手で覆われ得る複数の水 平的空間的に分離された領域で覆われた一つの平坦な支持体を含む結合マトリッ クス、対応する分析要素、種々の遊離反応体あるいは検体の同時測定あるいは種 々のサンプル中の1検体の同時測定のためのその分析要素の使用、およびその分 析要素の製造プロセスに関するものである。 例えばイムノアッセイなどの特異的結合反応に基づいて、並列下に、多種検体 を検出するために用いられる最も普通の方法は、マイクロタイタープレートのウ ェルの表面を吸着的に、あるいは例えばＢＳＡ/ストレプトアビジンなどの固定 化層を介して種々の抗体で覆い、各ウェルにおいて検体を定量するものである。 比較的大きな寸法のマイクロタイタープレートは大量の試薬とサンプルを必要と する。ウェルの幾何学的形状が一様でないため、検体の固相への結合の指標とし て、溶液状態でのUV/VIS吸収測定あるいは蛍光測定などの検出法を使用できるに すぎない。 通常の分析用担体上での複数検体テストの改良は、抗体あるいは抗原スポット のニトロセルロース上への吸着による分析要素のサイズ縮小化により行われた(W alchら、J．Immunol．Meth．(1984)，66，99-102; Dererら、J．Allergy Clin． Immunol．(1984)，74，85-92)。これらの分析要素は特にアレルギー診断に用い られる。マイクロタイタープレートの場合と同様に、この場合の欠点は、免疫活 性試薬の表面吸着被覆では表面が均等に覆われない結果となり、測定結果の再現 性に好ましくない影響を与えることである。吸着被覆における測定結果の変動係 数が、表面の状態に強く依存することは、とりわけ米国特許4,980,299に記載さ れている。吸着被覆の場合に、表面占有率の統計的変動は表面積が大きければそ れほど重要ではないが、表面積サイズが縮小するに従って、不均一性がより著し い影響を与えるため、測定結果の再現性に非常に悪影響を与える。したがって、 定量分析は極めて困難である。 種々のポリペプチドあるいはポリヌクレオチド鎖の並行合成用の多重試薬担体 についてはWO 92/10092，WO 91/07087及びEP 0 138 855に記載されている。WO 9 2/10092においては、均一支持体の全表面にアミノ基を導入し、その表面が均等 に官能化される。光化学的に開裂する基を持つ反応体をこの官能化表面の広範囲 にわたり結合させる。光化学的開裂基は、マスクすることによって特定場所で選 択的に除去され、アミノ酸あるいはヌクレオチド塩基が選択的化学的に結合され る。引き続いて別のマスクを使用し、それ以外の場所に別のアミノ酸あるいはヌ クレオチド塩基を結合できる。この方法により、複数の異なるポリヌクレオチド 鎖が多くのプロセス工程を経て担体表面に施され、その鎖は相補的ポリヌクレオ チド鎖と結合させてそれを判定するのに役立つ。この方法の欠点は、多種検体の 結合相手を持つ微細構造を作製するのに、多大の時間を要することである。露出 場所での結合相手の被覆は、非常に不規則で再現性に乏しい。 縮小サイズの分析要素はEP-A-0 134 215，EP-A-0 304 202及びEP-A-0 271 974 に記載され、そこでは抗体スポットはポリスチレン表面などに通常の被覆手法を 用いて吸着される。この場合には、表面の著しい不均一性のために表面占有率の 変動が生じ、測定結果の再現性が乏しくなる。さらに問題となるのは、表面への 血清あるいは血漿タンパク質の非特異的結合であり、これは検体及び固相結合相 手が低濃度の場合には、検体の固相結合相手との結合と同様、固相結合相手の結 合にとっても特に障害となる。 本発明の目的は、前述の先行技術における欠点を取り除き、マトリックス上の 非常に小さな領域に、多種検体に対応する複数の固相結合相手を単純でかつ再現 性のある方法で、表面被覆が明確に調節可能であるように施し、各固相結合相手 を互いに分離局在させ、固相結合相手を施した後に、溶液中から複数の遊離検体 が結合し、非常に小さなスペースでの検出が可能となり、従って多種検体測定を 再現性のある方法で実施でき、同時に定性的にまた特に定量的にも、サンプル成 分の非特異的結合を減少し得る、結合マトリックスを提供することである。 これらの目的は、本請求項中で特徴付けられた結合マトリックス及び分析要素 を用いて達成できる。 本発明の主題は、平坦な支持体を含み、該平坦支持体が複数の水平的空間的に 分離された領域によってその表面に対して平行的に覆われ、各領域に固定された 結合相手を含み、各相手は特異的結合対の対応した結合相手と結合が可能であり 、 その領域が a)隣接しない金属層スポットと b)アンカー基を介して金属スポットの表面に結合する結合相手B1の希薄で本質的 に横方向に均一な結合層 から成ることを特徴とする結合マトリックスである。 平坦結合マトリックスは本質的に平坦であると解釈され、望ましくは平面状マ トリックスである。原則的には如何なるサイズの表面も可能であるが、本発明の 先行技術に対する技術上の利点は特に小サイズ表面で発揮される。したがって、 分析要素は表面が100cm²以下、好ましくは1cm²から25cm²の間で有利である。 結合マトリックスの支持体表面上に複数の非隣接金属層領域(金属スポット)を 水平方向に次々に施す。この領域はなるべく支持体上で10-100nmの厚さの層とし て形成するのが望ましく、例えば円形あるいは角形など所望のどのような領域と することもできる。本発明の利点は、この領域の直径が0.1−1mmの間、特に0.3 −0.6mmと非常に小さいときに発揮される。 金属層領域は互いに接触してはならない。すなわち支持体から離れて面してい る金属スポットの自由表面は中間領域に取り囲まれるべきであり、その表面は金 属スポットの表面とは異なる材料で構成される。金属スポット間の中間部分の表 面は、望ましくは非金属支持体で構成する。この場合の支持体材料は生体分子、 例えば免疫試薬、に対して極めて低い非特異的相互作用のみを持つことが好適で ある。金属スポットの外側境界間の距離は、その後の試薬の分離適用を容易にす るため0.1-1mmが望ましい。 本発明に従えばスポットは極めて小さな面積を有するので、極めて小さな支持 体表面上に非常に多くのスポットを収容できる。 支持体の表面cm²当たり10-100個のスポットが有利であり、20-50個のスポット は特に有利である。 支持体材料としては、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン アクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレンあるいはガラスが使用できる。 貴金属、特に金、銀あるいはパラジウムを金属として使用するのが望ましい。 すべての金属スポット上の均一な結合相手B1の“希薄”結合層、あるいは別の 金属スポット上の別の結合相手B1'、B1''などの“希薄”結合層は金属スポット と結合する。しかし、このプロセスでは1つのタイプの結合相手のみが希薄結合 層の各スポットと結合すべきである。このような希薄結合層はWO 92/10757に記 載されているが、ここにその全内容を参考として組み入れる。 “希薄”結合層とは、1分子種の特異的結合相手の単層であると解釈され、そ れは支持体から空間に離れて面し、金属スポット表面は完全には占有されていな い。結合相手による被覆度は希釈の目安となるが、それは結合層の厚みを最密理 論層厚みで割った商で表される。 結合相手B1の単層による金属スポットの被覆度は100％未満、0.1-90%が望まし く、さらに0.7-70%がより望ましく、1-40%が特に望ましい。 結合相手の結合層の吸着はアンカー基を介して行われる。チオール、ジスルフ ィドあるいはホスフィン基がアンカー基として適している。例えば、チオールあ るいはジスルフィド基は特に金、銀の表面へのアンカー基に適し、ホスフィン基 はパラジジウム表面へのアンカー基に適している。 固相への吸着に関してはアンカー基が結合相手に直接結合しないのが望ましく 、スペーサー分子、望ましくは可動性のスペーサー分子を介して連結される。ス ペーサー分子は式(CH₂)_nで示されるアルキレン基を少なくとも1個含むことが望 ましく、ここでnは1-30の自然数であるが、2-30が望ましく、2-15が特に望まし い。スペーサー分子の一端はアンカー基(例えば、チオールあるいはジスルフィ ド基)を持ち、これは金属スポット表面への吸着に適している。支持体から離れ た他端において、スペーサー分子は1個あるいは数個のリンカー基を持ち、それ を介して結合相手あるいはその構成部分がスペサー分子と連結する。これらリン カー基はアミノあるいはヒドロキシ基であってよく、例えば結合相手のカルボキ シ基とエステルあるいはアミド結合を形成して連結する。スペーサー分子はリン カー基としてカルボキシ基を含むこともでき、これは結合相手の反応性アミノ基 あるいはヒドロキシ基と連結する。 希薄結合層の製法はWO 92/10757に記載されている。 第1法は2個あるいは数個、望ましくは2個の結合相手分子と連結するスペーサ ー分子を使用する。この種のスペーサー分子の例としてシスタミンがあり、それ はアンカー基としてジスルフィド基を、リンカー基として2個のアミノ基を含む ので、活性化された結合相手の2分子と連結できる。金表面に吸着されたとき、 このような分子は結合相手に対して被覆率が100%よりかなり低い希薄結合層を形 成する。 希薄結合層作製の別法は、スペーサー分子と結合相手の間に親水性リンカー基 を入れることである。このリンカー基は特に4-15原子から成る直鎖分子である。 この場合には、リンカー基は1個あるいは数個、望ましくは1-5個の親水性エチレ ンオキシドを含むことが望ましい。親水性リンカー基としては、アミンあるいは ヒドロキシ末端を持つポリエチレンオキシドを含むことが特に望ましい。 さらに1つのスペーサー分子を親水性リンカーと結合相手の間に挿入すること が望ましく、それは式(CH₂)_nで示すアルキレン基とリンカー基で構成され、ここ でnは2-15の自然数である。特に1,8ジアミノ−3,6-ジオキサオクタンが適したリ ンカーであることが証明された。このような化合物を金表面に吸着させると、例 えばビオチンが結合相手の場合には被覆率19%の単層を形成する。ビオチンは遊 離の反応相手(ストレプトアビジン)と高親和力で結合し、密な充填フィルムを極 めて短時間に生成することができる。このような希薄結合層は特に好ましいもの である。 “希薄”結合層としては、アンカー基とスペーサーを介して結合する結合相手 に加えて、結合相手は結合していないがアンカー基とは連結している追加のスペ ーサー分子を含むことが極めて望ましい。そのような化合物は以下では希釈分子 として示される。例えば、ビオチン化および非ビオチン化スペーサー分子を1:10 から1:2の比率で用いると、遊離の結合相手と高速、高結合能で結合し得る希薄 ビオチン単層が得られる。 適切な希釈分子はアンカー基とスペーサー成分を含み、希望する場合はリンカ ー分子を含むが、その際スペーサー分子のCH₂基の数は、結合相手と結合してい るスペーサー分子のCH₂基数と比べ1-5以上は異ならず、1-2炭素原子以内の差で あることが望ましい。さらに希釈分子としては最小6原子の鎖長(アンカー基及び 親水性リンカー基なしで)が適当である。 アンカー基から最も離れた希釈分子端の結合相手の代わりに、ヒドロキシ基、 カルボン酸基、カルボン酸エチルエステル基またはメチルエステル基、カルボン 酸アミド基、1個あるいは2個のメチルまたはエチル基で置換したカルボン酸アミ ド基、スルフォン酸基、スルフォンアミド基のような親水性基があることが望ま しい。また、アンカー基から最も離れた希釈分子端には親水性リンカー(上に定 義)あるいはその1部分が結合することも望ましい。 結合相手をもつスペーサーおよび結合相手をもたないスペーサーを共有結合を 介して連結することも可能である。金あるいは銀表面を用いるとき、この連結は ジスルフィド橋で行うことが望ましい。 希釈分子(結合相手なしのスペーサー分子)と結合相手を持つスペーサー分子か ら成る混合結合層においては、結合相手を持つスペーサー分子の割合は、約0.1- 90mol%で、0.5-50mol%が望ましく、1-40mol%が特に望ましい。 結合相手としては、特異的結合対の相手、例えば、抗体、抗原、タンパク質、 レクチン、ビオチン、ストレプトアビジン、ポリヌクレオチドなどのいずれをも 用い得る。同一の結合相手B1で形成される希薄結合層を全スポットに適用するの が望ましい。 それらはビオチン、あるいはやはりストレプトアビジンと反応するデスチオビ オチン、イミノビオチン、HABA(4-ヒドロキシ−フェニル−アゾ安息香酸)などの ビオチン類似体が望ましい。 抗体、抗原、ハプテン、ポリヌクレオチドの場合は、種々の結合相手が個々の スポット上で異なる希薄結合層を形成することが可能である。これは、ポリヌク レオチドの場合に特に望ましい。境界域の場合には、別の結合相手の希薄結合層 が各金属スポット上に存在する。そのような結合マトリックスは既にマトリック ス結合相手の種々の遊離結合相手の結合、測定に用いられている。さらに、個々 のスポットに同一あるいは異なる結合相手の結合層を希釈の程度がスポット毎に 異なるように施すことも可能である。 金属スポット上の第1結合層の結合相手B1の被覆率は、結合層の厚みを測定し て決め得る。この場合、層厚みの測定値は結合層の被覆の程度と共に減少する。 結合相手としてビオチンを持つ結合層は0.7nm厚みであるが、この厚みは分子長 の計算値である3.7nmより小さい。 本発明のさらに別の主題は、 ａ）支持材表面に、金属層スポットが互いに接触しないように施され、 ｂ）各金属層スポットの自由表面を、希薄結合層を製造するための分子を含有す る反応溶液とともにインキュベートする、 ことを特徴とする、本発明による結合マトリックスの製造方法である。 第１段階において、分析用要素の支持材に対し、水平方向に互いに分離された 孤立金属スポットを、この支持材の表面に平行な層状になるように施す。これら のスポットは好ましくは規則的配列パターンで施される。支持材表面に所望の金 属スポットパターンを得るためには、所望のパターン部分が開けられている、支 持材表面に置かれるマスクを使用するのが好ましい。その後、蒸着またはスパッ タリングによって、このマスクを通して金属スポットのパターンが施される。場 合によっては、あらかじめ担体用材表面にクロムなどの粘着性補助剤を具備させ ておくこともできる。施される金属スポットの厚さは、その後の目的とする用途 に応じて変更することができる。分析用要素を表面プラスモン共鳴のために使用 することを目的とするならば、金属スポットの厚さは10−100nmが好ましい。そ の他の場合は、厚さがより大きいものでもよい。 マスクを介した金属スポットの施用のほかに、分析用要素の全範囲を金属層で 被覆し、その後、金属をエッチングによって除去することによって、所望のスポ ットパターンを製造することもまた可能である。金属を例えばワックスなどの非 金属性コーティングによって被覆して、金属表面にスポットパターンを製造する ことも可能である。この場合は、被覆部分がスポット間の中間帯となる。 第２段階において、個々の金属スポットを希薄結合層で被覆する。この希薄結 合層が全スポットについて同一の場合は、希薄第１結合層を製造するのに必要な 分子を含有する溶液に支持体要素を浸漬させるのが有効である。これは、一つに は、好ましくは結合相手を含むアンカー−スペーサー分子と含まないアンカー− スペーサー分子との希薄化度を決定付ける割合での混合物とすることができ、ま た他方、上記のような、希薄結合層をも形成するような分子の溶液とすることも できる。 異なるスポット上の希薄結合層が異なる結合相手を含むようにする場合は、そ れぞれ別の結合相手を含有する、希薄結合を形成する形態の各種の溶液を、個々 のスポットに施す。この方法において、この代わりに、またはこれに加えて、例 えば、異なるスポットに施す個々の溶液中の希釈用分子を各種の割合にすること によって、異なるスポット上の希薄化の程度が異なる結合フィルムを製造するこ とができる。希薄結合層のための試薬の空間的に分別された適用は、ピペッティ ング、スタンピング、または印刷手法、例えばインクジェットなどの一般的な方 法によって達成することができる。必要ならば、過剰の溶液を再度除去する。 これらの希薄結合層の側面は顕微鏡的に均質であり、例えば、表面プラスモン 顕微鏡試験によって判定することができる（B.Rothenhausler and W.Knoll,Surf ace Plasmon Microscopy,Nature,Vol.332，page 615-617(1988)）。解像能5μm において、厚さにおける差異は測定されない。 好ましい一態様は、各スポット上に同一の結合相手の希薄結合層を含有する結 合マトリックスである。次にこれらの結合層のそれぞれを同一のまたは異なる結 合相手と結合するために使用することができる。 希薄結合層が全スポット上の表面に同一の結合相手を有している場合、支持材 上に空間的に分離された孤立領域の形態の金属スポット上に適用されている希薄 結合層を有しているこの結合マトリックスは、これらの孤立領域上に遊離の被検 体に対する多数の同一または異なる結合相手を再現性を保って施すのにそのまま 使用される。この結合相手の施用はそれぞれの結合層の希薄化の程度によって調 整して最適化することができ、これによって、小空間において、極めて少量の試 薬のみを要して、１試料中の多数の被検体または異なる試料中の１被検体を、同 時に、定性的に厳密に、そしてまた定量的に判定するための、多重被検体分析用 要素の基盤を形成する。そして、これらの判定は、例えばフィブリノーゲンなど の血液または血清成分の非特異的結合による妨害の程度が少ない。マイクロタイ タープレートなどの従来の“マルチパラメーター”分析用要素に比較して、実質 的により多数の分析領域数を達成することが可能である。100cm²の表面に100,00 0スポットまで可能であり、それにもかかわらず、結合マトリックスの製造は非 常に単純である。 したがって、本発明のさらに別の主題は、１試料中の各種の遊離の反応体の判 定用、または各種の試料中の１反応体の判定用の分析用要素であって、遊離の反 応体に対する異なった、または同一の特異的結合相手が固定されている、空間的 に分離された多数の領域で表面に平行に被覆された、平坦な支持材を含有する要 素であり、この要素が、結合相手Ｂ１、またはさらに追加された結合相手Ｂ２が 存在する場合にはＢ２に特異的に結合している、判定すべき遊離の反応体または 被検体に対する結合相手Ｂ３を表面に含有する結合層をさらに含有する、本発明 による結合マトリックスを含有していることを特徴とするものである。 したがって、各金属スポット上の第１の希薄結合層に加えて、本発明による多 重反応体分析用要素は、各スポット上に遊離の反応体に対する同一のまたは異な る結合相手Ｂ３の結合層をさらに含有する。この場合、各スポットにはただ１つ の型の反応体の結合相手のみが結合する。これらの反応体の結合相手は第１の結 合層の結合相手Ｂ１に特異的結合部位を介して連結することができる。これらの 特異的結合部位は例えば第１の結合層の抗体に対するエピトープであるか、また は、例えば、第１の結合層の結合相手、例えばストレプトアビジン、に特異的に 結合するビオチンなどの、被検体の結合相手に結合している特異的結合分子であ る。 溶液中に存在する遊離の反応体に対する特異的結合相手を反応体の結合相手と して使用する。これらとしては、抗体、抗原、ハプテンまたは核酸鎖が可能であ る。 １つの態様において、スポット上に単一の結合相手Ｂ１の希薄結合層が存在し ている結合マトリックスを使用して、特異的結合部位を介してＢ１に結合する、 スポット間で同一または異なった、反応体の結合相手Ｂ３のさらに別の結合層を 再現性を保って施す。 別の態様において、個々のスポットの希薄結合層を、単一の結合相手Ｂ２を含 有するさらに別の単分子結合層によってそれぞれ被覆する。この場合、結合相手 Ｂ２はＢ１に対する特異的結合部位を有する。本発明によるこの被覆は非常に小 さな範囲で極めて再現性もあるので、驚くべきことに、個々のスポットの結合相 手Ｂ２は次にそのまますぐに、各スポット間で同一または異なった、この場合に はＢ２に対する特異的結合部位を有する、反応体の結合相手Ｂ３を含有する調整 可能な量の結合層で再現性を保ってさらに被覆するのに使用することができる。 両態様に関する発明としての利点の決定的な因子は、金属スポット上の結合マ トリックスが希薄結合層を含有する点である。 この点について、本発明による結合マトリックスの各スポット上に希薄結合層 が存在する場合、驚くべきことに、各スポットを、直接にまたは結合相手Ｂ２の 中間層を介して、再現性があり確定された量の反応体の結合相手Ｂ３で個別に被 覆することができ、この被覆を妨害する試料成分の非特異的結合が追加されるこ とがないことがわかった。この再現性のある被覆は、驚くべきことに、非常に小 さな寸法のスポットでも成功し、このことは結合層の微小な不均質度が非常に低 いことを示唆する。これによって、非常に小さな範囲内の各スポットに一定で均 質な結合相手による被覆を有する多数のスポットを含有する分析用要素が可能と なる。その上、反応体の結合相手による各種スポットの被覆もまた驚くほど単純 であり、そして検出すべき反応体について、またこの反応体を検出するのに要求 される感度について、各結合層スポットを個々に調整するため、各種結合層の希 薄化の程度によって、再現性を保って調節することができる。 本発明のさらに別の主題は、結合マトリックスの結合層の自由表面を、遊離の 反応体に対する結合相手Ｂ３を含有する同一のまたは異なる溶液とともにそれぞ れインキュベートするものであって、この結合相手Ｂ３が結合相手Ｂ１またはＢ ２に対する特異的結合部位を有することを特徴とする、同一のまたは異なる遊離 の反応体の多重判定のための分析用要素の製造方法である。 遊離の反応体に対する同一のまたは異なる結合相手を含有する各種結合層の結 合マトリックス上への適用は、種々の方法で実施することができる。 最も単純な場合、それぞれが第１の希薄結合層によって、また場合によっては 結合相手Ｂ２を含有する結合層によってさらに被覆されている各種スポット上に 、遊離の反応体に対する同一のまたは異なる結合相手Ｂ３を溶液にしてピペット で施す。これらの結合相手Ｂ３はすべて、第１の希薄結合層の単一結合相手Ｂ１ に対し、または適用されているならば第２の結合層の結合相手Ｂ２に対し、共通 の結合部位を有していなければならない。これらは好ましくは、結合相手Ｂ１ま たはＢ２に対する単一の結合分子に結合している。結合相手Ｂ３の例としては、 ビ オチンに結合している各種の抗体がある。そこで、希薄ビオチン結合層およびこ こに結合したストレプトアビジン結合面で被覆した各種スポットに、各種ビオチ ン化抗体を施す。ここで、ストレプトアビジンは全部で４つの結合部位を有して いるので、これらの抗体はストレプトアビジン面に結合する。この方法によって 、極めて小さな範囲に多数の種々の遊離の反応体を結合させる領域を有する分析 用要素が得られる。これらの反応体の結合相手の層は結合マトリックスの結合層 の再現性のある被覆を形成する。 遊離の抗原に対する結合相手の単一のビオチン化抗体を各スポットに施す場合 、その分析用要素は固相に結合されている抗体に対するこの抗原を含有する多数 の試料を同時に測定するのに使用することができる。 それぞれのスポットに異なる結合相手を施すための別の方法は、印刷手法若し くはスタンプ手法、特にインクジェット、またはマイクロタイタープレートに異 なる試薬を施すのと同様のマイクロマルチピンプレートによる適用である。必要 ならば、過剰の溶液を再度除去する。 本発明のさらに別の主題は、試料溶液を本発明による分析用要素と接触させ、 固相に結合した被検体の存在またはその量を、分析用要素のそれぞれの領域にお いて別々に測定することを特徴とする、被検体と平坦な分析用要素上の固相に結 合した被検体の結合相手との特異的な結合反応による、試料溶液中の少なくとも ２種の反応体または被検体の同時判定方法である。 この場合、被検体と固相に結合した反応体の結合相手は特異的結合対を形成す る。被検体としては、抗体、抗原、ハプテン、固相に結合した核酸に対して少な くとも部分的に相補的な核酸、およびその他の特異的結合相手がある。 固相の結合相手に対する被検体の結合は、例えば、標識基を有するか、または 遊離の結合相手とさらに結合することによって標識を獲得した被検体の結果とし て検出される。考慮に入れられる標識はイムノアッセイまたはＤＮＡ診断におけ る通常の標識である。直接標識、特に蛍光または発光成分によって標識するのが 殊に効果的である。この標識によって可能となる、特定のスポットの固相の結合 相手に対する被検体の結合の光学測定によって、この被検体の厳密に定性的なま たは定量的な検出が実施される。 個々のスポット上の被検体の結合を次々に、そして特に定量的に検出すること を可能にするには、局所分解検出(locally resolving detection)法を使用する のが好ましい。好ましい方法の１つは、例えば、同焦点走査型(confocal scanni ng)蛍光顕微鏡法である。この方法において、適当な波長のレーザー（走査）に よって、標識のために使用された蛍光染料が励起されて、各スポット上で個々に 蛍光を発する。放出された光を例えば積算型ＣＣＤカメラなどの感度のよい検出 器によって記録し、好適な画像分析ソフトウェアによって定量する。その他の非 走査型蛍光顕微鏡法もまたこの分析によく適合する。この場合、１画面に複数の スポットが同時に観察される。その後、個々のスポットを例えば、好適な画像分 析ソフトウェアによって、連続的に分析する。 固相の結合相手への被検体の結合を測定するさらに別の方法は、光学的手法で あり、特に、遊離の被検体と結合することに起因する、支持体に固定された結合 相手を含有する極めて薄い層の厚さの増加を観察することができる、反射−光学 手法である。これらの手法の考察が、Sadowsky:“Review of optical methods i n immunosensing”,SPIE,vol.1954,Optical Testing and Methology II(1988),4 13-419，に述べられている。この場合、被検体の特別な標識は必要でない。 特に好ましい反射−光学法は、表面プラスモン共鳴(surface plasmon resonan ce)によって、分析用要素の異なる領域中の各種被検体の結合を検出するもので ある。この方法において、分析用要素は透明な誘電性物質の上に固相の結合相手 を保有している金属の導電層の極めて薄い層がスポット状に適用されたもので構 成されている。このような分析用要素はしばしば光学免疫センサーと称される。 こうした光学免疫センサーの例がEP-A 0 112 721，EP-A-0 276 142およびEP-A-0 254 557に記載されている。 電気化学測定、導電性の変化、または放射性標識の測定などの、その他の局所 分解検出法もまた可能である。特定の被検体について試料を分析するためには、 分析用要素の大きな範囲に施すか、または個々のスポットに別々に施す。場合に よっては、判定すべき被検体に対するさらに別の標識された結合相手を添加する 。この場合、固相に結合した標識被検体を測定する前に、分析用要素を洗浄して 、遊離の標識分子を除去する方が効果的である。 分析用要素は異なる試料中の１またはそれ以上の被検体を測定するのにも使用 することができる。 したがって、本発明の主題として、異なる試料溶液を、対象の被検体の結合相 手が領域内に結合している、本発明による分析用要素の異なる領域と接触させ、 固相に結合した被検体の存在またはその量を異なる領域でそれぞれ測定すること を特徴とする、被検体と平坦な分析用要素上の固相結合した被検体の結合相手と の特異的結合反応による、異なる試料中の１被検体の同時測定方法もまたあげら れる。 この場合、各種の試料溶液をピペット、印刷若しくはスタンプ手法などの標準 的適用手法、またはマイクロマルチピンプレートによって施すことができる。 本発明のさらに別の主題は、特に、例えばアレルギー診断または、例えば特定 の配列を有するポリヌクレオチドについて試料をスクリーニングする、ＤＮＡ診 断のためのイムノアッセイにおいて、多数の被検体を同時に検出するための、本 発明による結合マトリックスおよび分析用要素の使用である。 実施例 １ １．蒸着被覆によるスポットの製造 Leybold高真空被覆装置（Univex 450）において、寸法8×8cmの“Lexan”ポリ カーボネート箔（製造社：General Electric，厚さ0.75mm）上に金属マスク（d= 0.5mm，物質：アルミニウム）を介して、36×36の円形の金スポット（総計1296 スポット）を等間隔で蒸着させた。蒸着した金の層の厚さは300nmである。スポ ットの直径は1mm、スポットとスポットの距離も四方ともに1mmである。 ２．“希薄”ビオチンチオール結合層による、多重金スポットプレートの被覆 ２．１“親水性”層 ビオチンチオール化合物Ｉ 2.8mg（5×10^-5 M）および希釈剤II 8.7mg(4.5×1 0^-4 M)を0.05Mリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.25）100ml中に溶解した。被覆直後 のポリカーボネート箔をこの溶液に浸漬した。１時間後、プレートを取り出し、 水（再蒸留）で２回洗浄し、空気乾燥した。 ２．２“疎水性”層 ビオチンチオール化合物III 2.94mg(5×10^-5 M)および希釈剤IV 9.2mg(4.5×1 0^-4 M)をエタノールp.a．100ml中に溶解した。被覆直後のポリカーボネート箔を この溶液に浸漬した。４時間後、プレートを取り出し、エタノールp.a．で２回 洗浄し、空気乾燥した。 ３．ストレプトアビジンの適用 金スポットおよびＳＡＭで被覆した箔をストレプトアビジン溶液（ストレプト アビジン濃度：0.05M Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ7.2）中0.5mg/ml）に１時間浸漬 した。続いてチップを50mM Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ7.2）、２％ショ糖、0.9％ ＮａＣｌおよび0.3％ＢＳＡIIの溶液で洗浄した。続いてチップを25℃、湿度40 ％で20時間乾燥した。 ４．ＴＳＨ試験操作 ストレプトアビジンで被覆したスポット上で、以下の図式にしたがって、ＴＳ Ｈ試験を実施した。 1.〈ＴＳＨ〉ＭＡＢ 1.20−Ｂｉ（１：４）（濃度 ＭＡＢ20μg/ml、緩衝液20m M Ｋ−リン酸（ｐＨ7.4））とともに45分インキュベートする。 2.再蒸留水で洗浄する。 3.ＴＳＨ標準液“Enzymun”，Boehringer GmbH Co．とともに45分インキュベー トする。 4.再蒸留水で洗浄する。 5.蛍光−ラテックス抗体（Ａ８）複合体（20mM Ｋ−リン酸（ｐＨ7.4）中0.05％ 固体含有率）とともに30分インキュベートする。 6.再蒸留水で洗浄する。 7.同焦点蛍光顕微鏡（Biorad Co.）で測定する。 結果 ２つの標準品（10μUおよび2μU）を測定した。この方法において、以下の比 強度が得られた。 疎水性希薄結合層に関する測定結果（蛍光強度に対するピクセル(pixel)の数 ）のグラフによる分析を図１，２に示す。 実施例２ 非特異的結合の確認 実施例１の希薄疎水性結合層のストレプトアビジンで被覆したスポットを、血 清成分によって仲介された蛍光ラテックス複合体の非特異的結合に関して試験し た。 1.再蒸留水で洗浄する。 2.試料（標準品または血清）とともに45分インキュベートする。 3.再蒸留水で洗浄する。 4.蛍光ラテックス抗体（Ａ８）複合体とともに30分インキュベートする。 5.再蒸留水で洗浄する。 6.同焦点蛍光顕微鏡で測定する。 結果 これによると、血清成分は測定を妨害しないことがわかる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スルカ，ペーター ドイツ連邦共和国 ディー−82362 ヴァ イルハイム，セイント−アンナ ヴェーク 17 (72)発明者 ミュッター，ヴォルフガング ドイツ連邦共和国 ディー−82347 バー ンリード，ヴェーターシュタイナーシュト ラーセ ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．空間的に分離された多数の領域によって、水平方向に表面に対して平行に被 覆されている、平坦な支持体を含有する結合マトリックスであって、各領域は特 異的結合対の対応する遊離の結合相手と結合することができる、固定された結合 相手を含有しており、この領域が、 ａ）隣接していない金属層スポット、 ｂ）アンカー基を介して各金属スポットに結合している結合相手Ｂ１の、希薄 で、かつ本質的に横方向に均質な結合層、 で構成されている、結合マトリックス。 ２．被覆が最大被覆の0.1〜90％である、請求項１記載の結合マトリックス。 ３．被覆が最大被覆の0.5〜70％である、請求項２記載の結合マトリックス。 ４．被覆が最大被覆の1〜40％である、請求項３記載の結合マトリックス。 ５．金属層スポットが金、銀またはパラジウムで構成され、そしてアンカー基が チオール、ジスルフィドまたはホスフィン基である、請求項１〜４のいずれか１ つに記載の結合マトリックス。 ６．アンカー基が可動性スペーサー分子を介して結合相手Ｂ１に連結している、 請求項１〜５のいずれか１つに記載の結合マトリックス。 ７．可動性スペーサー分子が式（ＣＨ₂）_n（ｎは１〜30の自然数）のアルキレン 基を１以上含有する、請求項１〜６のいずれか１つに記載の結合マトリックス。 ８．１つのスペーサー分子が結合相手の２または数個の分子と連結している、請 求項６または７記載の結合マトリックス。 ９．スペーサー分子と結合相手の間に親水性リンカー基が配置されている、請求 項６または７記載の結合マトリックス。 10．個々の領域の結合層が、結合相手に連結しているスペーサー分子の他に、ア ンカー基とともに供給されるが、結合相手に連結していないスペーサー分子を含 有する、請求項６または７記載の結合マトリックス。 11．金属スポットの直径が0.1〜1mmである、請求項1〜10のいずれか１つに記載 の結合マトリックス。 12．結合マトリックス１cm²あたり10〜100個の金属スポットが施される、請求 項１〜11のいずれか１つに記載の結合マトリックス。 13．個々のスポットに異なる希釈度の結合層が施される、請求項１〜12のいずれ か１つに記載の結合マトリックス。 14．個々のまたは全ての金属スポットに異なる結合相手を含有する結合層が施さ れる、請求項１〜13のいずれか１つに記載の結合マトリックス。 15．同一の結合相手を含有する結合層が金属スポットに施される、請求項１〜12 のいずれか１つに記載の結合マトリックス。 16．結合相手Ｂ１がビオチンまたはビオチン類似体である、請求項15記載の結合 マトリックス。 17．結合相手Ｂ１が、抗体に結合することができる１または数種の抗原またはハ プテンである、請求項14または15記載の結合マトリックス。 18．結合相手Ｂ１が、１または数種の異なるポリヌクレオチドである、請求項14 または15記載の結合マトリックス。 19．結合相手Ｂ１の結合層のそれぞれに、全領域において同一の結合相手Ｂ２の 結合層がさらに結合しており、そしてこのＢ２は特異的結合対の遊離の結合相手 と結合することが可能であり、かつ特異的結合部位を介してＢ１に結合している 、請求項15または16記載の結合マトリックス。 20．結合相手Ｂ１がビオチンであり、そして追加された結合相手Ｂ２がストレプ トアビジンである、請求項19記載の結合マトリックス。 21．遊離の反応体に対する異なるまたは同一の特異的結合相手が固定されている 、水平方向に空間的に分離された多数の領域によって、表面に平行に被覆されて いる、平坦な支持体を含有する、１試料中の異なる遊離の反応体の判定、または 各種試料中の１反応体の判定のための分析用要素であって、ｃ）結合相手Ｂ１に 特異的に結合している、または追加の結合相手Ｂ２が存在する場合はＢ２に特異 的に結合している、判定すべき遊離の反応体に対する結合相手Ｂ３を表面に含有 する結合層をさらに含有している、請求項15，16，19または20のいずれか１つに 記載された結合マトリックスを含有する、分析用要素。 22．結合相手Ｂ１が金属スポット上で希薄層を形成するビオチンであり、結合相 手Ｂ２がストレプトアビジンであり、そして結合相手Ｂ３がビオチン化された 反応体の結合相手である、請求項20または21記載の分析用要素。 23．ａ）支持材表面に、金属層スポットを互いに接触しないような形式で施し、 ｂ）希薄結合層を形成させる分子を含有する反応溶液とともに、各金属層スポ ットの自由表面をインキュベートする、 請求項１〜18のいずれか１つに記載された結合マトリックスの製造方法。 24．請求項15または16記載の結合マトリックスの希薄結合層のそれぞれを、結合 相手Ｂ１に対する特異的結合部位を有する、遊離の結合相手に対する結合相手Ｂ ２を含有する反応溶液とともにインキュベートすることからなる、請求項19また は20記載の結合マトリックスの製造方法。 25．請求項15，16，19または20のいずれか１つに記載された結合マトリックスの 結合層の自由表面を、結合相手Ｂ１またはＢ２に対する特異的結合部位を有する 、遊離の反応体に対する結合相手Ｂ３を含有する同一のまたは異なる反応溶液と ともにインキュベートすることからなる、請求項21または22記載の分析用要素の 製造方法。 26．平坦な分析用要素上の固相に結合した反応体の結合相手と反応体との特異的 な結合反応によって、１試料溶液中の異なる遊離の反応体または各種試料溶液中 の１つの遊離の反応体の同時判定方法であって、請求項21または22記載の分析用 要素を使用し、反応体を分析用要素の空間的に分離されて孤立している結合領域 と接触させて結合させ、それぞれの領域において固相に結合した反応体を別々に 判定する方法。 27．同焦点蛍光顕微鏡法によって判定を実施する、請求項26記載の方法。 28．表面プラスモン共鳴によって判定を実施する、請求項26記載の方法。 29．被検体の多重検定のための、請求項1〜20のいずれか１つに記載された結合 マトリックスまたは請求項21〜22のいずれか１つに記載された分析用要素の使用 。 30．イムノアッセイのための、請求項1〜20のいずれか１つに記載された結合マ トリックスまたは請求項21〜22のいずれか１つに記載された分析用要素の使用。 31．ＤＮＡ診断のための、請求項1〜20のいずれか１つに記載された結合マトリ ックスまたは請求項21〜22のいずれか１つに記載された分析用要素の使用。