JP2009168803A - 標的物質の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 検体中に含まれる濃度未知の標的物質の存在状態を測定する方法。
【解決手段】 既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係を得る段階と、を同一の認識部位を有する複数種類の既知物質について行う工程と、
検体に含まれる標的物質の数に起因するシグナルおよび前記検体に含まれる標的物質の数および分子量に起因するシグナルとを測定する工程と、から
検体に含まれる標的物質が一種類である場合には種類を特定し、検体に含まれる標的物質が複数種類である場合には濃度比を求める
標的物質の検出方法。
【選択図】 図１１
【解決手段】 既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係を得る段階と、を同一の認識部位を有する複数種類の既知物質について行う工程と、
検体に含まれる標的物質の数に起因するシグナルおよび前記検体に含まれる標的物質の数および分子量に起因するシグナルとを測定する工程と、から
検体に含まれる標的物質が一種類である場合には種類を特定し、検体に含まれる標的物質が複数種類である場合には濃度比を求める
標的物質の検出方法。
【選択図】 図１１
Description
標的物質の検出方法に関する。
近年、同一の認識物質を有する複数の標的物質の数および分子量を測定することが求められている。
例えば、脂肪細胞から分泌されるホルモンであるアディポネクチンは、抗動脈硬化作用やインスリン抵抗性改善作用などの生理活性を有しており、糖尿病発症や冠動脈疾患の危険因子の１つとして注目されている。このアディポネクチンは、血中で幾つかの存在状態（低分子量、中分子量、高分子量）を示し、特に高分子量アディポネクチンの存在量がメタボリック症候群の病態をより正確に診断できるとされている。それゆえアディポネクチンは、血中の濃度を測定するのみならず、その存在状態、つまりアディポネクチンの分子量を測定することも重要である。
このような課題に対して、特許文献１では、検体中の標的物質の測定と質量分析を目的として、表面プラズモン共鳴測定装置と質量分析装置を連結した技術が記載されている。この発明では、標的物質の有無もしくは濃度を表面プラズモン共鳴により測定し、質量分析により標的物質の分子量を測定できる。
しかしながら、質量分析機という非常に専門的な装置を必要とするため、検査の簡便さに欠ける。
特開２００６−２２６９５９
しかしながら、質量分析機という非常に専門的な装置を必要とするため、検査の簡便さに欠ける。
本発明の標的物質検出方法によれば、検体中に存在する標的物質数および分子量を検出することで標的物質の存在状態を簡便に検出することができる。
本発明は、
ｉ）既知物質の濃度と前記既知物質の数に起因するシグナルとの関係アおよび前記既知物質の濃度と前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係イを得る段階と、前記関係アと前記関係イから、前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係ウを得る段階と、を同一の認識部位を有する複数種類の既知物質について行う工程と、
ii）検体に含まれる標的物質の数に起因するシグナルおよび前記検体に含まれる標的物質の数および分子量に起因するシグナルとを測定する工程と、
iii）前記複数種類の既知物質の各々の種類における前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルの関係と、前記標的物質の数に起因するシグナルと、前記標的物質の数および分子量に起因するシグナルとから、
検体に含まれる標的物質が一種類である場合には前記複数の種類の既知物質のうちのいずれであるか判定し、
検体に含まれる標的物質が複数種類である場合には検体に含まれる標的物質を構成する複数種類の既知物質の濃度比を求める
工程と、
を行うことを特徴とする標的物質の検出方法である。
ｉ）既知物質の濃度と前記既知物質の数に起因するシグナルとの関係アおよび前記既知物質の濃度と前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係イを得る段階と、前記関係アと前記関係イから、前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係ウを得る段階と、を同一の認識部位を有する複数種類の既知物質について行う工程と、
ii）検体に含まれる標的物質の数に起因するシグナルおよび前記検体に含まれる標的物質の数および分子量に起因するシグナルとを測定する工程と、
iii）前記複数種類の既知物質の各々の種類における前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルの関係と、前記標的物質の数に起因するシグナルと、前記標的物質の数および分子量に起因するシグナルとから、
検体に含まれる標的物質が一種類である場合には前記複数の種類の既知物質のうちのいずれであるか判定し、
検体に含まれる標的物質が複数種類である場合には検体に含まれる標的物質を構成する複数種類の既知物質の濃度比を求める
工程と、
を行うことを特徴とする標的物質の検出方法である。
前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルおよび前記標的物質の数および分子量に起因するシグナルを、局在表面プラズモン共鳴法により測定することが好ましい。
前記既知物質の数に起因するシグナルおよび前記標的物質の数に起因するシグナルを、競合法により測定することが好ましい。
本発明の標的物質検出方法によれば、検体中に存在する標的物質の数および分子量を検出することができ、検体中の標的物質の存在状態を簡便に検出することができる。
本発明の検出方法は、
ｉ）既知物質の濃度と前記既知物質の数に起因するシグナルとの関係アおよび前記既知物質の濃度と前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係イを得る段階と、前記関係アと前記関係イから、前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係ウを得る段階と、を同一の認識部位を有する複数種類の既知物質について行う工程と、
ii）検体に含まれる標的物質の数に起因するシグナルおよび前記検体に含まれる標的物質の数および分子量に起因するシグナルとを測定する工程と、
iii）前記複数種類の既知物質の各々の種類における前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルの関係と、前記標的物質の数に起因するシグナルと、前記標的物質の数および分子量に起因するシグナルとから、
検体に含まれる標的物質が一種類である場合には前記複数の種類の既知物質のうちのいずれであるか判定し、
検体に含まれる標的物質が複数種類である場合には検体に含まれる標的物質を構成する複数種類の既知物質の濃度比を求める
工程と、
を行うことを特徴とする標的物質の検出方法である。
ｉ）既知物質の濃度と前記既知物質の数に起因するシグナルとの関係アおよび前記既知物質の濃度と前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係イを得る段階と、前記関係アと前記関係イから、前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係ウを得る段階と、を同一の認識部位を有する複数種類の既知物質について行う工程と、
ii）検体に含まれる標的物質の数に起因するシグナルおよび前記検体に含まれる標的物質の数および分子量に起因するシグナルとを測定する工程と、
iii）前記複数種類の既知物質の各々の種類における前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルの関係と、前記標的物質の数に起因するシグナルと、前記標的物質の数および分子量に起因するシグナルとから、
検体に含まれる標的物質が一種類である場合には前記複数の種類の既知物質のうちのいずれであるか判定し、
検体に含まれる標的物質が複数種類である場合には検体に含まれる標的物質を構成する複数種類の既知物質の濃度比を求める
工程と、
を行うことを特徴とする標的物質の検出方法である。
ここで、物質の数に起因するシグナルを１つのパラメータとして考える。例えば、パラメータＡとする。また、物質の数と分子量に起因するシグナルを他のパラメータと考える。例えば、パラメータＢとする。
（第１の実施形態）
本発明の実施形態の一例である第１の実施形態について図１〜図４を用いて説明する。
本発明の実施形態の一例である第１の実施形態について図１〜図４を用いて説明する。
なお、本実施形態では、既知物質の数に起因するシグナルおよび標的物質の数に起因するシグナルを検出する方法として競合法を用いる。また、既知物質の数および分子量に起因するシグナルおよび標的物質の数および分子量に起因するシグナルを検出する方法として局在表面プラズモン法を用いた例で説明する。本実施形態の一例は、複数種類の既知物質が既知物質Ａと既知物質Ｂの２種類である場合を例にとって説明する。なお、既知物質Ｂの分子量は既知物質Ａよりも大きいと仮定し、さらに標的物質Ａのプローブに対する結合能は、標的物質Ｂよりも高いと仮定する。
以下、各工程について詳細に説明する。
ｉ）の工程について
ｉ）の工程では、
既知物質の濃度と前記既知物質の数に起因するシグナルとの関係アおよび前記既知物質の濃度と前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係イを得る段階と、前記関係アと前記関係イから、前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係ウを得る段階と、を同一の認識部位を有する複数種類の既知物質について行う。
ｉ）の工程では、
既知物質の濃度と前記既知物質の数に起因するシグナルとの関係アおよび前記既知物質の濃度と前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係イを得る段階と、前記関係アと前記関係イから、前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係ウを得る段階と、を同一の認識部位を有する複数種類の既知物質について行う。
図１（Ａ）に本実施形態で用いることのできる検出素子１の例を示す。
検出素子１は、基体２と、金属構造体４と、標的物質捕捉体５とを有している。
基体２は、検出素子１の支持体として機能するものである。基体２を構成する材料としては、シリコン、ガラス、ポリスチレン、ポリメタクリロ二トリルといったプラスチック等が上げられる。これらの中でも、ガラスやポリスチレン製のプラスチックが好ましい。また、基体は複数の層で構成されていても良い。基体が複数の層で構成される場合は、最表面の層が非特異吸着防止膜３であることが好ましい。また、最表面の層と接する層（表面から２番目の層）はＩＴＯやカーボン等で構成されていても良い。非特異吸着防止膜の例としては、牛血清アルブミン、スキムミルク、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
金属構造体４は、複数存在し、基体２の表面に互いに離間して整列またはランダムに配列されており、局在表面プラズモン共鳴を誘起する。このような金属構造体の材料としては、金、銀、銅、白金、アルミニウムもしくはそれらの合金などが好ましく、それらの中でも金が好ましい。また、金属構造体の大きさは５ｎｍ〜１４５０ｎｍの範囲内にあることが好ましい。さらに好ましい大きさは５０ｎｍ〜４５０ｎｍである。金属構造体の形状は、局在表面プラズモン共鳴を利用した測定を行うことができるものであれば何でも良く、例えば、球形、ロッド型、針状、中空素子、異なる金属の層状構造、誘電体との層状構造、チューブ型等の形状とすることができる。また、局在表面プラズモン共鳴測定を行うことができるのであれば、例えば、凹凸、突起を有していてもよい。
標的物質捕捉体５は、標的物質、既知物質および標識プローブと特異的に結合するものであり、金属構造体４の表面に固定されている。標的物質捕捉体５と標的物質の組み合わせとしては、抗原−抗体、酵素−基質、ホルモン−レセプター、タンパク質−ペプチド、糖鎖−糖鎖、糖鎖−抗体、核酸−抗体、核酸−タンパク質などが挙げられる。なお、標的物質捕捉体５と標的物質の組み合わせがａ−ｂと表記する場合は、標的物質捕捉体５がａであり標的物質がｂである場合と、標的物質捕捉体５がｂであり標的物質がａである場合の両方を含む。
上記検出素子１を用いて各濃度の既知物質Ａ７と標識プローブ６と競合反応をさせる。
図１（Ｂ）は、既知物質Ａ７と標識プローブ６との競合反応を示す図である。各濃度において、既知物質Ａ７と標識プローブ６が競合的に前記標的物質捕捉体５と結合し、金属構造体４−標的物質捕捉体５−標識プローブ６の複合体と、金属構造体４−標的物質捕捉体５−既知物質Ａ７の複合体が形成される。
得られる各濃度の既知物質Ａと標識プローブのシグナルとの関係ア−（１）を図２に９で示す。図２の縦軸である標識プローブ６のシグナルは、競合反応において標的物質捕捉体５に結合した既知物質Ａの数に起因するシグナルである。したがって、得られる検量線である前記既知物質Ａの濃度と標識プローブ６から得られるシグナルとの関係（関係ア−（１））を示す検量線は、既知物質Ａの濃度と既知物質Ａの数に起因するシグナルとの関係を示している。
次に、既知物質Ａの濃度と、標的物質捕捉体５に結合した既知物質の局在表面プラズモン共鳴に起因するシグナルとの関係（関係イ−（１））を示す検量線（図３における１３）を得る。局在表面プラズモン共鳴測定は、検出素子１が有する金属構造体４の表面近傍の屈折率の変化を測定する測定法である。局在表面プラズモン共鳴測定のシグナルには標的物質捕捉体５に結合した既知物質Ａの数の情報と、既知物質Ａの分子量（大きさ）の情報が含まれている。したがって、既知物質Ａの濃度と標的物質捕捉体５に結合した既知物質Ａの局在表面プラズモン共鳴のシグナルとの関係イ−（１）を示す検量線は、既知物質Ａの濃度と既知物質Ａの数および分子量に起因するシグナルとの関係を示している。ここで、既知物質Ａが多量体である場合は、既知物質Ａの分子量は前記多量体の分子量とする。例えば、既知物質Ａが、既知物質ａがｂ個連結した多量体である場合、既知物質Ａの分子量はａｂである。
なお、既知物質Ａの濃度と標的物質捕捉体５に結合した既知物質Ａの局在表面プラズモン共鳴のシグナルとの関係イ−（１）を取得する際は、局在表面プラズモン共鳴のシグナルと標識プローブのシグナルを同時に取得しても良いし、別に取得しても良い。前者の場合、既知物質Ａが第１の濃度である場合に標識プローブのシグナルと局在表面プラズモン共鳴のシグナルとを取得し、その後、既知物質Ａの濃度を第２の濃度として標識プローブのシグナルと局在表面プラズモン共鳴のシグナルを取得する。すなわち、関係ア−（１）および関係イ−（１）を同時に取得する。また、後者の場合は、関係ア−（１）である各濃度における既知物質Ａの標識プローブのシグナルを取得した後に、関係イ−（１）である各濃度における既知物質Ａの局在表面プラズモン共鳴のシグナルを取得する。もしくは各濃度における既知物質Ａの局在表面プラズモン共鳴のシグナル（関係イ−（１））を取得した後に、各濃度における既知物質Ａの標識プローブのシグナル（関係ア−（１））を取得する。
そして、得られた関係ア−（１）と関係イ−（１）とから、図４の１７に示す前記既知物質Ａの数に起因するシグナルと前記既知物質Ａの数および分子量に起因するシグナルとの関係ウ−（１）を得る。
次に、既知物質Ｂについても同様にして、既知物質Ｂの数に起因するシグナル（関係ア−（２））を取得する。
図１（Ｃ）では、前記標識プローブ６と既知物質Ｂ８が競合的に前記標的物質捕捉体５と結合し、金属構造体４−標的物質捕捉体５−標識プローブ６の複合体と、金属構造体４−標的物質捕捉体５−既知物質Ｂ８の複合体が形成される。
得られる各濃度の既知物質Ｂと標識プローブのシグナルとの関係ア−（２）を図２に１０に示す。得られる検量線である前記既知物質Ｂの濃度と標識プローブ６から得られるシグナルとの関係（関係ア−（２））を示す検量線は、既知物質Ｂの濃度と既知物質Ｂが標的物質捕捉体に結合した数に起因するシグナルとの関係を示している。なお図２における点α１１と点β１２は、標識プローブのシグナルが同じであり、既知物質Ａの標的物質捕捉体５に結合した総数と既知物質Ｂの標的物質捕捉体５に結合した総数が同じであることを示している。
次に、前記既知物質Ｂの濃度と、標的物質捕捉体５に結合した既知物質Ｂの局在表面プラズモン共鳴に起因するシグナルとの関係（関係イ−（２））を示す検量線（図３における１４）を得る。既知物質Ｂの濃度と標的物質捕捉体５に結合した既知物質Ｂの局在表面プラズモン共鳴のシグナルとの関係イ−（２）を示す検量線は、既知物質Ｂの濃度と既知物質Ｂの数および分子量に起因するシグナルとの関係を示している。なお、図３における点γ１５と点θ１６は、局在表面プラズモン共鳴のシグナルが同じであることを示しており、既知物質Ａの標的物質捕捉体５に結合した総分子量（標的物質Ａの分子量×結合した数）と既知物質Ｂの標的物質捕捉体５に結合した総分子量（標的物質Ｂの分子量×結合した数）が同じであることを意味している。
得られた関係ア−（２）と関係イ−（２）とから、図４の１８に示す前記既知物質Ｂの数に起因するシグナルと前記既知物質Ｂの数および分子量に起因するシグナルとの関係ウ−（２）を得る。
なお、標識プローブ６は、検出素子１が有する標的物質捕捉体５と特異的に結合するものであって、標識部位を有するものである。このような標識プローブ６としては、既知物質に標識部位を付与したものであっても良いし、前記既知物質とは異なるものに標識部位を付与したものであっても良い。標識プローブ６の標識部位としては、例えば、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）や西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（ＨＲＰ）などの酵素、金コロイドや銀コロイドなどの金属微粒子、磁気微粒子、蛍光色素、発光基質、発色基質、量子ドットなどを用いることができる。
ii）の工程について
ii）の工程では、前記検体に含まれる標的物質の数に起因するシグナルと、前記検体に含まれる標的物質の数および分子量に起因するシグナルとを測定する。
ii）の工程では、前記検体に含まれる標的物質の数に起因するシグナルと、前記検体に含まれる標的物質の数および分子量に起因するシグナルとを測定する。
ii）の工程では、ｉ）の工程で、既知物質の数に起因するシグナルおよび既知物質の数および分子量に起因するシグナルを取得した方法と同様にして、競合法および局在表面プラズモン共鳴法を用いて、検体に含まれる標的物質の数に起因するシグナルと標的物質の数および分子量に起因するシグナルを得る。
iii）の工程について
iii）の工程では、ｉ）の工程で得られた関係ウ−（１）および関係ウ−（２）と、ii）の工程で得られた標的物質捕捉体に結合した前記標的物質の数に起因するシグナルと、標的物質捕捉体に結合した前記標的物質の数および分子量に起因するシグナルと、を解析する。これにより、標的物質を構成する既知物質（既知物質Ａ、Ｂ）の濃度比を定量的もしくは定性的に検出することができる。
iii）の工程では、ｉ）の工程で得られた関係ウ−（１）および関係ウ−（２）と、ii）の工程で得られた標的物質捕捉体に結合した前記標的物質の数に起因するシグナルと、標的物質捕捉体に結合した前記標的物質の数および分子量に起因するシグナルと、を解析する。これにより、標的物質を構成する既知物質（既知物質Ａ、Ｂ）の濃度比を定量的もしくは定性的に検出することができる。
具体的には、図４において、iii）の工程により得られたシグナルのプロットが点Ｅであった場合、点Ｅの座標（Ｅｘ、Ｅｙ）と、点Ｆの座標（Ｅｘ、Ｆｙ）と、点Ｇの座標（Ｅｘ、Ｇｙ）とから標的物質を構成する既知物質の濃度比を定量的もしくは定性的に検出する。ここで、点Ｆとは、関係ウ−（２）である既知物質Ｂの数に起因するシグナルと数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線における点ＥのＸ座標と同じＸ座標を有する点である。また、点Ｇとは、関係ウ−（１）である既知物質Ａの数に起因するシグナルと数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線における点ＥのＸ座標と同じＸ座標を有する点である。すなわち、点ＥのＹ座標であるＥｙが、Ｇｙ＜Ｅｙ＜Ｆｙであれば、標的物質には既知物質Ａと既知物質Ｂの両方が含まれていることが定性的にわかる。
また、Ｅｙ＝Ｇｙであれば、標的物質は既知物質Ａであり、Ｅｙ＝Ｆｙであれば、標的物質は既知物質Ｂであることがわかる。さらに、Ｇｙ＜Ｅｙ＜Ｆｙである場合には、｜Ｆｙ−Ｅｙ｜と｜Ｇｙ−Ｅｙ｜との比により、標的物質を構成する既知物質Ａと既知物質Ｂとの比を定量的に求めることができる。
（第２の実施形態）
以下、本発明の実施形態の一例である第２の実施形態について図５〜図８を用いて説明する。
以下、本発明の実施形態の一例である第２の実施形態について図５〜図８を用いて説明する。
なお、本実施形態と第１の実施形態が異なる点は、ｉ）およびii）の工程において、既知物質の数に起因するシグナルおよび標的物質の数に起因するシグナルを検出する測定法として２ステップサンドイッチ法を用いること、既知物質の数および分子量に起因するシグナルおよび標的物質の数および分子量に起因するシグナルを検出する測定法として反射率測定干渉分光法を用いること、および検出素子が反射率測定干渉分光を行える素子であることである。これら以外は第１の実施形態と同様であるため、ｉ）およびii）の工程についてのみ説明する。なお、既知物質Ｃの分子量は既知物質Ｄよりも大きいと仮定し、さらに既知物質Ｃの結合能は、既知物質Ｄと同等と仮定する。
ｉ）の工程について
既知物質の濃度と前記既知物質の数に起因するシグナルとの関係アおよび前記既知物質の濃度と前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係イを得る段階と、前記関係アと前記関係イから、前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係ウを得る段階と、を同一の認識部位を有する複数種類の既知物質について行う。
既知物質の濃度と前記既知物質の数に起因するシグナルとの関係アおよび前記既知物質の濃度と前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係イを得る段階と、前記関係アと前記関係イから、前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係ウを得る段階と、を同一の認識部位を有する複数種類の既知物質について行う。
図５（Ａ）は本実施形態における検出素子２１を示すものである。
検出素子２１は、基体２０と、標的物質捕捉体１９とを有している。
基体２０は反射率測定干渉分光法における干渉色を示し得る光学薄膜を表面に有している。なお、基体は複数の層で構成されていても良い。基体が複数の層で構成される場合は、最表面の層が非特異吸着防止膜２２であることが好ましい。
標的物質捕捉体１９は基体２０の表面に固定されている。標的物質捕捉体１９は、既知物質、標的物質と特異的に結合するものである。標的物質捕捉体１９と標的物質の組み合わせとしては、第１の実施形態と同様である。
基体２０の表面に固定された標的物質捕捉体１９に、各濃度の既知物質Ｃ２４を特異的に結合させる。そして、前記既知物質Ｃの濃度と、標的物質捕捉体１９に結合した既知物質Ｃの反射率測定干渉分光法における干渉色に起因するシグナルとの関係（関係イ−（３））を示す検量線（図７における３０）を得る。
次に、各濃度の既知物質Ｃ２４−標的物質捕捉体１９の複合体に対し、標識プローブ２３を更に結合させる。これにより、既知物質Ｃ２４が各濃度である際の標的物質捕捉体１９−既知物質Ｃ２４−標識プローブ２３の複合体が形成される。その上で、標識プローブ２３のシグナルを測定し、図６の２８に示す既知物質Ｃの濃度と既知物質Ｃの数に起因するシグナルとの関係ア−（３）を得る。
そして、得られた関係ア−（３）と関係イ−（３）とから、図８の２６に示す既知物質Ｃの数に起因するシグナルと前記既知物質Ｃの数および分子量に起因するシグナルとの関係ウ−（３）を得る。
既知物質Ｄについても同様に、基体２０の表面に固定された標的物質捕捉体１９に、各濃度の既知物質Ｄ２５を特異的に結合させる。そして、前記既知物質Ｄの濃度と、標的物質捕捉体１９に結合した既知物質Ｃの反射率測定干渉分光法における干渉色に起因するシグナルとの関係（関係イ−（４）を示す検量線（図７における３１））を得る。
次に、各濃度の既知物質Ｄ２５−標的物質捕捉体１９の複合体に対し、標識プローブ２３を更に結合させる。これにより、既知物質Ｄ２５が各濃度である際の標的物質捕捉体１９−既知物質Ｄ２５−標識プローブ２３の複合体が形成される。その上で、標識プローブ２３のシグナルを測定し、図６の２９に示す既知物質Ｄの濃度と既知物質Ｄの数に起因するシグナルとの関係ア−（４）を得る。
そして、得られた関係ア−（４）と関係イ−（４）とから、図８の２７に示す既知物質Ｄの数に起因するシグナルと前記既知物質Ｄの数および分子量に起因するシグナルとの関係ウ−（４）を得る。
（ii）（ｉ）の工程における測定と同様に、２ステップサンドイッチ法を用いて標的物質の数に起因するシグナルを測定し、反射率測定干渉分光法を用いて標的物質の数および分子量に起因するシグナルを測定する。
なお、第１の実施形態では、既知物質の数に起因するシグナルおよび標的物質の数に起因するシグナルを測定する方法として競合法、既知物質の数および分子量に起因するシグナルおよび標的物質の数および分子量に起因するシグナルを測定する方法として局在表面プラズモン共鳴法を例に挙げて説明した。また、第２の実施形態では、既知物質の数に起因するシグナルおよび標的物質の数に起因するシグナルを測定する方法としてサンドイッチ法、既知物質の数および分子量に起因するシグナルおよび標的物質の数および分子量に起因するシグナルを測定する方法として反射率測定干渉分光法を例に挙げて用いた。
しかしながら、本発明においては、既知物質の数に起因するシグナル、標的物質の数に起因するシグナル、既知物質の数および分子量に起因するシグナル、標的物質の数および分子量に起因するシグナルを測定する方法は、既知物質および標的物質の結合数や濃度を測定可能な方法であれば何でもよい。
第１および第２の実施形態で用いた方法以外の既知物質の数に起因するシグナルおよび標的物質の数に起因するシグナルを測定する方法としては、ラジオイムノアッセイ法、酵素イムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法、蛍光増強イムノアッセイ法、蛍光消光イムノアッセイ法、基質標識蛍光イムノアッセイ法、蛍光偏光イムノアッセイ法、発光イムノアッセイ法、化学発光イムノアッセイ法、化学発光酵素イムノアッセイ法、生物発光酵素イムノアッセイ法、生物発光補酵素イムノアッセイ法、ＤＮＡプローブ法、インターカレーター法などが挙げられる。また、既知物質の数および分子量に起因するシグナルと標的物質の数および分子量に起因するシグナルを測定する方法として特開２００６−１３３１３７に開示されている電気化学測定を、また、既知物質の数に起因するシグナルおよび標的物質の数に起因するシグナルを測定する方法として電気化学測定を利用したイムノアッセイ法を組み合わせても良い。
さらに、第１および第２の実施形態で用いた方法以外の既知物質と標的物質の数および分子量を測定する方法としては、表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、光導波路分光測定法、電気化学測定法、ファブリペロー法、カンチレバー法などが挙げられる。
以下、本発明の実施例を説明する。
（実施例１）
本実施例は、検体に含まれる標的物質が一種類であり、ストレプトアビジンもしくはビオチン抗体のいずれであるかを判定する検出方法である。そして、既知物質の数および分子量に起因するシグナルおよび標的物質の数および分子量に起因するシグナルを測定する方法として局在表面プラズモン共鳴法を用いた。また、既知物質の数に起因するシグナルおよび標的物質の数に起因するシグナルを測定する方法として競合イムノアッセイ法を利用した。
本実施例は、検体に含まれる標的物質が一種類であり、ストレプトアビジンもしくはビオチン抗体のいずれであるかを判定する検出方法である。そして、既知物質の数および分子量に起因するシグナルおよび標的物質の数および分子量に起因するシグナルを測定する方法として局在表面プラズモン共鳴法を用いた。また、既知物質の数に起因するシグナルおよび標的物質の数に起因するシグナルを測定する方法として競合イムノアッセイ法を利用した。
＜検出素子の作製＞
平均粒径１００ｎｍの金微粒子含有溶液（ＢＢＩ社製）を純水で３０％に希釈し、９６穴アミノ化プレート（住友ベークライト製）の各ウェルに導入した。その後、前記プレートを室温で２４時間静置させ、前記金属微粒子をプレートに固定し、微小金属構造体をウェル表面に有する基体を作製した。
平均粒径１００ｎｍの金微粒子含有溶液（ＢＢＩ社製）を純水で３０％に希釈し、９６穴アミノ化プレート（住友ベークライト製）の各ウェルに導入した。その後、前記プレートを室温で２４時間静置させ、前記金属微粒子をプレートに固定し、微小金属構造体をウェル表面に有する基体を作製した。
次に前記基体の各ウェルに、１０μｇ／ｍｌのビオチン化抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ 製）を１００μｌずつ添加し、４℃で一晩反応させ、標的物質捕捉体であるビオチン化抗体を基体表面に固定させた。その後、前記基体の各ウェルに１％ カゼイン（テクノケミカル製）を２５０μｌずつ添加し、３７℃で２時間反応させ、基体表面に非特異吸着防止膜を形成した。
以上により、標的物質検出素子を作製した。
＜競合イムノアッセイ＞
既知物質としてストレプトアビジン（フナコシ製）およびビオチン抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ 製）を用い、各既知物質の希釈溶液（１×１０−３〜１０−１１ｇ／ｍｌ）を準備した。また、競合物質である標識プローブとしてＨＲＰ標識ビオチン抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ 製）を用い、１×１０−６ｇ／ｍｌに調整した。
既知物質としてストレプトアビジン（フナコシ製）およびビオチン抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ 製）を用い、各既知物質の希釈溶液（１×１０−３〜１０−１１ｇ／ｍｌ）を準備した。また、競合物質である標識プローブとしてＨＲＰ標識ビオチン抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ 製）を用い、１×１０−６ｇ／ｍｌに調整した。
次に、前記検出素子のうち４８ウェルにストレプトアビジンの希釈溶液を、残りの４８ウェルにビオチン抗体の希釈溶液を、それぞれ５０μｌずつ添加した。その後、前記検出素子９６ウェルに、前記ＨＲＰ標識ビオチン抗体を５０μｌずつ加え、３７℃で２時間静置した。
＜局在表面プラズモン共鳴測定＞
前記競合イムノアッセイを行った検出素子をマイクロプレートリーダー（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）に挿入し、局在表面プラズモン共鳴測定を行った。
前記競合イムノアッセイを行った検出素子をマイクロプレートリーダー（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）に挿入し、局在表面プラズモン共鳴測定を行った。
局在表面プラズモン共鳴測定より得られたスペクトル変化量（シフト量）を縦軸に、ストレプトアビジンおよびビオチン抗体の添加濃度を横軸にプロットして作成した関係アを示す検量線を図９に示す。
＜酵素イムノアッセイ＞
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）を用いて、前記競合イムノアッセイを行った検出素子を発色させた。また、発色反応は、前記マイクロプレートリーダーを用いて測定した。
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）を用いて、前記競合イムノアッセイを行った検出素子を発色させた。また、発色反応は、前記マイクロプレートリーダーを用いて測定した。
発色反応により得られたシグナル（吸光度）を縦軸に、ストレプトアビジンおよびビオチン抗体の添加濃度を横軸にプロットして作成した関係イを示す検量線を図１０に示す。
＜シグナルの解析＞
図１１は、前記発色反応により得られたシグナル（吸光度）を横軸に、前記局在表面プラズモン共鳴測定より得られたシフト量を縦軸にプロットして得られた関係ウを示す解析結果である。図１１の解析結果において、横軸は検出素子表面の標的物質捕捉体であるビオチンに結合した既知物質の結合数に起因するシグナルであり、縦軸は、ビオチンに結合した既知物質の数および分子量に起因するシグナルである。したがって、本解析結果から、使用したビオチン抗体は、ストレプトアビジンよりも分子が大きいことが確認できる。
図１１は、前記発色反応により得られたシグナル（吸光度）を横軸に、前記局在表面プラズモン共鳴測定より得られたシフト量を縦軸にプロットして得られた関係ウを示す解析結果である。図１１の解析結果において、横軸は検出素子表面の標的物質捕捉体であるビオチンに結合した既知物質の結合数に起因するシグナルであり、縦軸は、ビオチンに結合した既知物質の数および分子量に起因するシグナルである。したがって、本解析結果から、使用したビオチン抗体は、ストレプトアビジンよりも分子が大きいことが確認できる。
そして、得られた関係ウを示す解析結果を標準検量線として用いることで、検体中に含まれる濃度未知の標的物質が前記ストレプトアビジンもしくはビオチン抗体のいずれであるかを同定する場合、図１１に示した解析結果のどちらに近似しているかを調べることでいずれであるかを判定することができる。
また、以下の実施例により標的物質を検出することもできる。
（実施例２）
本実施例は、検体中に標的物質が２種存在し、その含有比を求める検出方法である。そして、既知物質と標的物質の数および分子量に起因するシグナルを測定する方法として反射率測定干渉分光法を用い、既知物質および標的物質の数を測定する方法としてサンドイッチイムノアッセイ法を利用する検出方法である。
本実施例は、検体中に標的物質が２種存在し、その含有比を求める検出方法である。そして、既知物質と標的物質の数および分子量に起因するシグナルを測定する方法として反射率測定干渉分光法を用い、既知物質および標的物質の数を測定する方法としてサンドイッチイムノアッセイ法を利用する検出方法である。
＜検出素子の作製＞
窒化シリコンを成膜したシリコンウェハー（４ｃｍ×４ｃｍ）と、φ７ｍｍで１６個の穴あけ加工を施したＰＭＭＡ（４ｃｍ×４ｃｍ）を張り合わせる。次に、γ−アミノプロピルトリエトキシシランをウェル内に塗布することでアミノ基導入を導入し、これを基体とする。
窒化シリコンを成膜したシリコンウェハー（４ｃｍ×４ｃｍ）と、φ７ｍｍで１６個の穴あけ加工を施したＰＭＭＡ（４ｃｍ×４ｃｍ）を張り合わせる。次に、γ−アミノプロピルトリエトキシシランをウェル内に塗布することでアミノ基導入を導入し、これを基体とする。
次に前記基体の各ウェルに、血液型Ａ抗原（Ｄｅｘｔａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とグルタルアルデヒドの混合溶液を１００μｌずつ添加し、化学架橋により基体表面に標的物質捕捉体である抗原を固定する。その後、前記基体の各ウェルに３％ スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）を２５０μｌずつ添加し、３７℃で２時間反応させ、基体表面に非特異吸着防止膜を形成する。
以上により、標的物質検出素子を作製した。
＜サンドイッチイムノアッセイ＞
既知物質としてＩｇＧ型抗Ａ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ 社製）およびＩｇＭ型抗Ａ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ 社製）を用い、既知物質の希釈溶液（１×１０−４〜１０−１１ｇ／ｍｌ）を各々準備する。また、サンドイッチ抗体としてＨＲＰ標識ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ抗体（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ 社製）を用いる。
既知物質としてＩｇＧ型抗Ａ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ 社製）およびＩｇＭ型抗Ａ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ 社製）を用い、既知物質の希釈溶液（１×１０−４〜１０−１１ｇ／ｍｌ）を各々準備する。また、サンドイッチ抗体としてＨＲＰ標識ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ抗体（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ 社製）を用いる。
まず、それぞれの標的物質を検出素子に添加し、３７℃で２時間反応後、反射率測定干渉分光法によりシグナルを取得する。その後、サンドイッチ抗体を各ウェルに１００μｌずつ添加し、３７℃で２時間反応させる。
＜反射率測定干渉分光法＞
バイオセンサーアレイシステム（フルイドウェアテクノロジーズ製）を用いて、前記イムノアッセイによる反射スペクトルを測定する。
バイオセンサーアレイシステム（フルイドウェアテクノロジーズ製）を用いて、前記イムノアッセイによる反射スペクトルを測定する。
そして、反射率測定干渉分光法より得られたスペクトル変化量（シフト量）を縦軸に、ＩｇＧ型抗Ａ抗体およびＩｇＭ型抗Ａ抗体の添加濃度を横軸にプロットして、各既知物質の濃度と既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係アを示す検量線を作成する。
＜酵素イムノアッセイ＞
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）を用いて、前記サンドイッチイムノアッセイを行った検出素子を発色させる。また、発色反応は、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ 製）を用いて行う。
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）を用いて、前記サンドイッチイムノアッセイを行った検出素子を発色させる。また、発色反応は、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ 製）を用いて行う。
そして、発色反応により得られたシグナル（吸光度）を縦軸に、ＩｇＧ型抗Ａ抗体およびＩｇＭ型抗Ａ抗体の添加濃度を横軸にプロットして、各既知物質の濃度と既知物質の数に起因する関係イを示す検量線を作成する。
＜シグナルの解析＞
前記発色反応により得られるシグナル（吸光度）を横軸に、前記反射率測定干渉分光法より得られるシフト量を縦軸にプロットして、各既知物質の数に起因するシグナルと各既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係ウを示す標準検量線を作成する。
前記発色反応により得られるシグナル（吸光度）を横軸に、前記反射率測定干渉分光法より得られるシフト量を縦軸にプロットして、各既知物質の数に起因するシグナルと各既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係ウを示す標準検量線を作成する。
最後に、標的物質を含む検体を用いて、反射率測定干渉分光法および発色反応によって各々シグナルを得る。その上で、同一の吸光度におけるシフト量（前記反射率測定干渉分光法より得られるシフト量）を比較することで、検体中の標的物質であるＩｇＭおよびＩｇＧの含有比を得ることができる。
１ 検出素子
２ 基体
３ 非特異吸着防止剤
４ 金属構造体
５ 標的物質捕捉体
６ 標識プローブ
７ 既知物質Ａ
８ 既知物質Ｂ
９ 既知物質Ａの検量線
１０ 既知物質Ｂの検量線
１１ 点α
１２ 点β
１３ 既知物質Ａの検量線
１４ 既知物質Ｂの検量線
１５ 点γ
１６ 点θ
１７ 既知物質Ａにおける数に起因するシグナルと数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線
１８ 既知物質Ｂにおける数に起因するシグナルと数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線
１９ 標的物質捕捉体
２０ 基体
２１ 検出素子
２２ 非特異吸着防止剤
２３ 標識プローブ
２４ 既知物質Ｃ
２５ 既知物質Ｄ
２６ 既知物質Ｃにおける数に起因するシグナルと数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線
２７ 既知物質Ｄにおける数に起因するシグナルと数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線
２８ 既知物質Ｃの濃度と既知物質Ｃの数に起因するシグナルとの関係を示す曲線
２９ 既知物質Ｄの濃度と既知物質Ｄの数に起因するシグナルとの関係を示す曲線
３０ 既知物質Ｃの濃度と既知物質Ｃの数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線
３１ 既知物質Ｄの濃度と既知物質Ｄの数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線
２ 基体
３ 非特異吸着防止剤
４ 金属構造体
５ 標的物質捕捉体
６ 標識プローブ
７ 既知物質Ａ
８ 既知物質Ｂ
９ 既知物質Ａの検量線
１０ 既知物質Ｂの検量線
１１ 点α
１２ 点β
１３ 既知物質Ａの検量線
１４ 既知物質Ｂの検量線
１５ 点γ
１６ 点θ
１７ 既知物質Ａにおける数に起因するシグナルと数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線
１８ 既知物質Ｂにおける数に起因するシグナルと数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線
１９ 標的物質捕捉体
２０ 基体
２１ 検出素子
２２ 非特異吸着防止剤
２３ 標識プローブ
２４ 既知物質Ｃ
２５ 既知物質Ｄ
２６ 既知物質Ｃにおける数に起因するシグナルと数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線
２７ 既知物質Ｄにおける数に起因するシグナルと数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線
２８ 既知物質Ｃの濃度と既知物質Ｃの数に起因するシグナルとの関係を示す曲線
２９ 既知物質Ｄの濃度と既知物質Ｄの数に起因するシグナルとの関係を示す曲線
３０ 既知物質Ｃの濃度と既知物質Ｃの数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線
３１ 既知物質Ｄの濃度と既知物質Ｄの数および分子量に起因するシグナルとの関係を示す曲線
Claims (3)
- ｉ）既知物質の濃度と前記既知物質の数に起因するシグナルとの関係アおよび前記既知物質の濃度と前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係イを得る段階と、前記関係アと前記関係イから、前記既知物質の数に起因するシグナルと前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルとの関係ウを得る段階と、を同一の認識部位を有する複数種類の既知物質について行う工程と、
ii）検体に含まれる標的物質の数に起因するシグナルおよび前記検体に含まれる標的物質の数および分子量に起因するシグナルとを測定する工程と、
iii）前記複数種類の既知物質の各々の種類における前記関係ウと、前記標的物質の数に起因するシグナルと、前記標的物質の数および分子量に起因するシグナルとから、
検体に含まれる標的物質が一種類である場合には前記複数の種類の既知物質のうちのいずれであるか判定し、
検体に含まれる標的物質が複数種類である場合には検体に含まれる標的物質を構成する複数種類の既知物質の濃度比を求める
工程と、
を行うことを特徴とする標的物質の検出方法。 - 前記既知物質の数および分子量に起因するシグナルおよび前記標的物質の数および分子量に起因するシグナルを、局在表面プラズモン共鳴法により測定することを特徴とする請求項１に記載の標的物質の検出方法。
- 前記既知物質の数に起因するシグナルおよび前記標的物質の数に起因するシグナルを、競合法により測定することを特徴とする請求項１または２に記載の標的物質の検出方法。
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