WO1996011404A1 - Bindematrix und analysenelement zur simultananalyse verschiedener analyte - Google Patents

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WO1996011404A1
WO1996011404A1 PCT/EP1995/003875 EP9503875W WO9611404A1 WO 1996011404 A1 WO1996011404 A1 WO 1996011404A1 EP 9503875 W EP9503875 W EP 9503875W WO 9611404 A1 WO9611404 A1 WO 9611404A1
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Hans-Georg Batz
Peter Sluka
Wolfgang Mutter
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/553—Metal or metal coated

Definitions

  • the invention relates to a binding matrix made of a flat carrier material which is covered by a multiplicity of horizontally spatially separated regions which can be covered with different specific binding partners for free reactants, a corresponding analysis element, a method for its production and the use of the analysis element for the simultaneous detection of different free reactants or analytes or for the simultaneous detection of an analyte in different samples.
  • the most common method is to adsorptively load the wells of microtiter plates with different antibodies or via a fixation layer, such as RSA / streptavidin, and one analyte in each well to determine.
  • a fixation layer such as RSA / streptavidin
  • the comparatively large dimensions of microtiter plates require large amounts of reagent and samples. Due to the uneven geometry of the wells, only certain detection methods such as UV / VIS absorption or measurement of fluorescence in solution can be used as a measure of the binding of analyte to the solid phase.
  • reagent carriers for the parallel synthesis of different polypeptide or polynucleotide strange are described in WO 92/10092, WO 91/07087 and EP 0 138 855.
  • a homogeneous carrier material is uniformly functionalized over the entire surface by introducing amino groups.
  • a reactant with a photochemically cleavable group is bonded to this functionalized surface over a large area.
  • the photochemically cleavable group can be selectively removed at certain points and an amino acid or a nucleotide base can be selectively coupled chemically.
  • the same procedure can be continued at different sites with different amino acids or nucleotide bases.
  • a large number of different polynucleotide strands, which can be used for binding and determining complementary polynucleotide strands, are thus obtained on the support surface after many working steps.
  • the disadvantage of this method is that it is very complex to produce such a microstructuring with different analyte binding partners.
  • the assignment of binding partners at exposed areas is very uneven and not very reproducible.
  • EP-A-0 134 215, EP-A-0 304 202 and EP-A-0 271 974 describe miniaturized analysis elements in which antibody spots are applied by conventional coating techniques to, for example, polystyrene surfaces by adsorption.
  • the fluctuations in the surface assignments caused by strong heterogeneities of the surfaces occur and cause poor reproducibility of the measurement results.
  • Another problem is the non-specific binding of proteins from serum or plasma to the surface, which has a disadvantageous effect, in particular at low concentrations of the analytes and the solid-phase binding partners, both for the binding of the solid-phase binding partners and for the binding of the analyte to the solid-phase binding partner.
  • the object of the invention was therefore to eliminate the disadvantages of the prior art described above and to provide a binding matrix on which a large number of solid-phase bonding partners for different analytes can be easily reproduced on a very small area in a selectively adjustable surface coverage and at the same time locally can be applied to a limited extent separately from one another, with which, after the application of the various solid phase binding partners, a large number of free analytes from a solution can be bound and detected in a very small space, and with which the multiple analyte determination can thus be reproducibly and qualitatively reduced, while simultaneously reducing non-specific binding of sample components and in particular can be carried out quantitatively
  • the invention relates to a binding matrix comprising a flat carrier material which, parallel to its surface, is covered with a large number of horizontally spatially separated regions which contain binding partners immobilized, each of which is capable of binding a corresponding binding partner of a specific binding pair, characterized by that the areas are formed from a) metal layer spots not touching each other, b) thinned and essentially laterally homogeneous binding layers of a binding partner B 1 via anchor groups each bound to the surface of the metal spots
  • a flat binding matrix is understood to mean an essentially flat, preferably a planar, matrix. Although it can in principle have an arbitrarily large surface, the advantages of the invention over the prior art are particularly evident in the case of small surfaces. Analysis elements with a surface of are therefore advantageous less than 100 cm ⁇ , preferably between 1 cm ⁇ and 25 cm ⁇
  • metal spots are applied next to one another in the horizontal direction on the carrier material surface of the binding matrix These areas each preferably form a 10-100 nm thick layer on the carrier material and can take up any surface, that is to say circular or angular.
  • the advantages of the invention are particularly effective when these areas are very small with a diameter between 0.1 and 1 mm, very particularly preferably between 0.3 and 0.6 mm.
  • the metal layer areas should not touch each other, that is to say the free surfaces of the metal spots facing away from the carrier material should be surrounded by intermediate surfaces, the surfaces of which consist of a material different from the metal spots.
  • the intermediate surfaces between the metal spots are formed by a non-metallic carrier material itself.
  • carrier materials which have only a very slight non-specific interaction with biological molecules, e.g. Immunreagen ⁇ have.
  • a distance of 0.1 to 1 mm from the outer boundaries of the metal spots is advantageous in order to facilitate the later separate application of reagents.
  • the spots can have very small areas according to the invention, a very large number of spots can be accommodated on a very small surface of the carrier material.
  • Polystyrene, polycarbonate, polyethylene acrylate, polyethylene, polypropylene or glass, for example, can serve as the carrier material.
  • Precious metals in particular gold, silver or palladium, are preferably used as metals.
  • a "thinned" binding layer of a binding partner B 1 which is uniform on all metal spots or on different metal spots of different binding partners B 1 ', B1 " etc. is bound to the metal spots. However, only one type of binding partner should be bound in a diluted binding layer on each spot Such thinned binding layers are described in WO 92/10757, to which reference is made here in full.
  • a “thinned” binding layer is understood to mean a monolayer of a specific binding partner of a molecular type that points away from the carrier material into the space, the surface of the metal spot not being completely occupied.
  • the degree of coverage with the binding partner which is a measure of the dilution, can be expressed as the quotient of the bound thickness of the binding layer divided by the theoretical layer thickness in the case of dense packing.
  • the degree of coverage of the metal spots with a monolayer of the binding partner B1 is less than 100%, preferably 0.1 to 90%, preferably 0.7 to 70%, particularly preferably 1 to 40%.
  • the adsorption of the binding layer of the binding partner is mediated via anchor groups.
  • Thiol, disulphide or phosphine groups are suitable as anchor groups.
  • thiol or disulphide groups are particularly suitable as anchor groups for gold or silver surfaces and phosphine groups for a palladium surface.
  • the anchor group for adsorption to the solid phase is preferably not attached directly to the binding partner, but is linked via a spacer molecule, preferably via a flexible spacer molecule.
  • the spacer molecule particularly preferably contains at least one alkylene group of the formula (CH2) n. Where n is a natural number from 1-30, preferably 2-30, particularly preferably 2-15.
  • the spacer molecule contains the anchor group (for example the thiol or disulphide group), which is suitable for adsorption on the surface of the metal spots.
  • the spacer molecule contains one or more linkage groups via which the binding partner or a component thereof is linked to the spacer molecule.
  • linkage groups can be, for example, an amino or hydroxyl function which is linked, for example, to a carboxyl function of the binding partner to form an ester or amide group.
  • the spacer molecule can also contain a carboxyl function as a linking group, which in turn is then linked to a reactive amino or hydroxyl function of the binding partner.
  • a first possibility is to use a spacer molecule which is linked to two or more molecules, preferably two molecules of the binding partner.
  • a spacer molecule is cystamine, which contains a disulphide group as an anchor group and two amino functions as a linking group and can therefore be linked to two molecules of an activated binding partner.
  • cystamine which contains a disulphide group as an anchor group and two amino functions as a linking group and can therefore be linked to two molecules of an activated binding partner.
  • Another possibility for producing a dilute binding layer is the incorporation of a hydrophilic linker group between the spacer molecule and the binding partner.
  • This linker is in particular a straight-chain molecule with a chain length of 4-15 atoms.
  • a linker group is preferred which contains one or more hydrophilic ethylene oxide units, preferably between 1 and 5.
  • the hydrophilic linker group is particularly preferably formed by an amine- or hydroxyl-terminated polyethylene oxide.
  • a further spacer molecule which consists of an alkylene group of the formula (CH2) n and a linking group, in which n is a natural number from 2-15, can preferably be installed between the hydrophilic linker and the binding partner.
  • 1,8-diamino-3,6-dioxaoctane has proven to be a particularly suitable linker.
  • such compounds When adsorbed onto a gold surface, such compounds form a monolayer with an occupancy density of, for example, 19% with biotin as binding partner, which is able to form a free reaction partner (streptavidin) with high affinity and within a very short time to form a densely packed film to tie.
  • Such thinned binding layers are therefore particularly preferred.
  • the “diluted” binding layers which, in addition to the binding partners bound via anchor groups and spacers, also contain spacer molecules which are connected to an anchor group, but to which no binding partner is bound.
  • Such compounds are also referred to below as dilution molecules.
  • dilution molecules For example, if you have biotinylated and non-biotinylated spacer molecules in a ratio of 1:10 to 1 2, a dilute biotin monolayer is obtained which can bind a free binding partner at high speed and with a large capacity
  • Suitable dilution molecules contain an anchor group and a spacer component and optionally a linker molecule, the number of CH2 groups of the spacer molecule not more than 1-5, preferably not more than 1-2, of the number of CH2 groups of the spacer molecule distinguishes, which is bound to the binding partner. It has also proven to be expedient for the minimum chain length of the dilution molecule to be 6 atoms (without anchor group and hydrophilic linker group)
  • a hydrophilic function at the end of the diluent molecule remote from the anchor group, such as, for example, a hydroxyl group, a carboxylic acid group, a carboxylic acid ethyl ester or methyl ester group, a carboxylic acid amide group, a carboxylic acid amide group substituted with one or two methyl or ethyl groups , a sulfonic acid group or a sulfonamide group. It is also preferred to bind a hydrophilic linker (as defined above) or part of a hydrophilic linker to the end of the diluent remote from the anchor group.
  • the proportion of spacer molecules with binding partner is advantageously 0.1-90 mol%, preferably 0.5-50 mol. % and particularly preferably 1-40 mol%.
  • binding partner for example antibodies, antigens, proteins, lectins, biotin, streptavidin or polynucleotides.
  • a diluted binding layer, which is formed by the same binding partner B 1, is preferably applied to all spots.
  • biotin or biotin-analogous molecules such as destihobiotin, iminobiotin or HABA (4-hydroxyphenyl-azobenzoic acid), which also react with streptavidin.
  • binding partners In the case of antibodies, antigens, haptens or polynucleotides, it is also possible for different binding partners to form different, dilute binding layers on individual spots. This is particularly preferred for polynucleotides. In extreme cases there is a diluted binding layer of another binding partner on each metal spot. Such a binding matrix can already be used for binding and for detecting different free binding partners of the matrix binding partners. In addition, it is possible that different layers of binding layers of the same or different binding partners are applied, which have a different degree of dilution from spot to spot.
  • the degree of coverage of the binding partner B 1 of the first binding layer on the metal spots can be determined by measuring the thickness of the binding layer. The measured layer thickness decreases with the degree of coverage of the binding layer.
  • a binding layer with biotin as the binding partner has a thickness of 0.7 nm, this thickness being less than the calculated length of 3.7 nm of the molecule.
  • the present invention furthermore relates to a method for producing a binding matrix according to the invention, characterized in that a) metal layer spots are applied to the surface of the carrier material in such a way that they do not touch each other b) the free surface of the metal layer spots is in each case incubated with a reaction solution, containing molecules to create a thinned binding layer.
  • a first step discrete metal spots separated from one another in the horizontal direction are applied to the carrier material of the analytical element in a layer parallel to the surface of the carrier material. These spots are preferably applied in a regular pattern.
  • a mask is preferably used in which the desired pattern is left free and which is placed on the carrier material.
  • the pattern of the metal spots is then applied by vapor deposition or sputtering on the mask.
  • the surface of the carrier material can be provided beforehand with an adhesion promoter, for example chrome Analysis element for surface plasmon resonance are used, so a metal layer thickness of 10 - 100 nm is preferred. Otherwise, the thickness can also be greater
  • the individual metal spots are covered with a thinned binding layer.
  • the carrier element is advantageously immersed in a solution which contains the molecules necessary for producing a thinned first binding layer.
  • this can preferably be a mixture of anchor spacer molecules with and without a binding partner in a ratio determining the degree of thinning, on the other hand it can be a solution of those molecules which, as described above, likewise produce dilute binding layers
  • the diluted binding layers on different spots are to contain different binding partners, then different solutions are applied to individual spots, each containing a different binding partner in a form which produces a diluted binding layer.
  • different "degrees of dilution" of the binding films on different spots can also be achieved, for example by a different proportion of thinning molecules being present in the individual solutions, which are applied to different spots.
  • the spatially separate application of the reagents for dilute binding layers can be carried out using useful methods such as pipetting, stamping or printing techniques, for example ink-jet. If necessary, excess solution is removed again.
  • These thinned lateral binding layers are microscopically homogeneous, as can be demonstrated, for example, by surface plasmon microscopy (B Rothenhausler and W Knoll, Surface Plasmon Microscopy, Nature, Vol 332, page 615-617 (1988). With a resolution of 5 ⁇ , no thickness differences can be measured
  • a preferred embodiment is a binding matrix which contains a diluted binding layer of the same binding partner on each spot. Each of these binding layers can then be used for binding identical or different binding partners
  • this binding matrix with a thinned binding layer which is applied in the form of spatially separated discrete areas on the carrier material via metal spots, now serves for the reproducible and the degree of thinning of the respective binding layer adjustable or optimizable application of a large number of the same or different binding partners for free analytes to these discrete areas and thus forms the basis for a multianalytical analysis element which enables the simultaneous, precise qualitative but also quantitative determination of a large number of analytes in a sample or an analyte is allowed in various samples in a small space, only very small amounts of reagent being required and these determinations being little disturbed by non-specific binding of blood or serum components such as fibrinogen compared to conventional "Mul" tiparameter "analysis elements such as microtiter plates allow a much higher number of analysis areas. Up to 100,000 spots are possible on an area of 100 cm ⁇ , but the production of the binding matrix is nevertheless very simple
  • Another object of the invention is therefore an analysis element for the determination of different free reactants in a sample or for the determination of a reactant in different samples, containing a flat support material which covers a plurality of spatially separated areas parallel to its surface is on which different or identical specific binding partners for free reactants are immobilized, characterized in that it contains a binding matrix according to the invention to which one binders B 1 or, in the presence of an additional binding partner B2, one to B2 speci - contains fish-bound further binding layer which contains binding partner B3 on its surface for free reactants or analytes to be determined.
  • the multi-reactant analysis element according to the invention additionally contains a further binding layer of the same or different binding partners B3 for free reactants on each spot. Only one type of reactant binding partner is bound to each spot.
  • These reactant binding partners can be coupled to the binding partner B1 of the first binding layer via a specific binding site.
  • These specific binding sites can, for example, be an epitope for an antibody of the first binding layer or also a specific binding molecule, such as biotin, which is bound to the analyte binding partner and which binds with the binding partner of the first binding layer, e.g. Streptavidin, specifically couples.
  • reactant binding partners for free reactants in solution are used as reactant binding partners. These can be antibodies, antigens, haptens or nucleic acid strands.
  • a binding matrix on the spots of which there is a dilute binding layer of a uniform binding partner B1, serves directly for the reproducible application of a further layer from spot to spot of identical or different reactant binding partners B3, which bind to Bl via a specific binding site.
  • the diluted binding layers of the individual spots are each covered by a further monomolecular binding layer with a uniform binding partner B2.
  • the binding partner B2 has a specific binding point for Bl. Since this assignment can be reproduced very well according to the invention even on a very small area, surprisingly the binding partners B2 of the individual spots can in turn be very good for the reproducible assignment of an adjustable amount of a serve another binding layer with the same or different reactant binding partner B3 from spot to spot, which then have a specific binding site for B2. It is crucial for the advantages according to the invention in both embodiments that the binding matrices on the metal spots contain a diluted binding layer
  • each spot can be separately occupied with a reproducible and defined amount of reactant binding partners B3 - be it directly or via an intermediate binding partner layer B2 - without furthermore being unspecific Binding of sample components disturb this assignment.
  • This reproducible assignment is surprisingly achieved even with very small dimensions of the spots, which indicates a very low micro-inhomogeneity of the binding layers.
  • Another object of the invention is a method for producing an analytical element for the multiple determination of the same or different free reactants, characterized in that the free surfaces of the binding layers of a binding matrix are each incubated with the same or different solutions, the binding partners B3 for free reactants contain, the binding partners B3 have a specific binding site for the binding partners B 1 or B2
  • the different binding layers with the same or different binding partners for free reactants can be applied to the binding matrix in different ways.
  • binding partners B3 for free reactants are applied as a solution to different spots, each covered with a first diluted binding layer and possibly covered with a further binding layer with the binding partner B2.
  • binding partners B3 must be applied all one have a common binding site for the uniform binding partner B1 of the first dilute binding layer or, if appropriate, the binding partner B2 of the second binding layer. They are preferably bound to a uniform binding molecule for the binding partner B 1 or B2.
  • binding partner B3 are different antibodies that are bound to biotin.
  • the analysis element can simultaneously measure a large number of samples which contain this antigen to the solid phase-bound antibody.
  • Another object of the invention is a method for the simultaneous determination of at least two reactants or analytes in a sample solution by means of specific binding reactions of the analytes with solid-phase-bound analyte binding partners on a flat analysis element, characterized in that the sample solution is contacted with an analysis element according to the invention and the presence or amount of solid-phase-bound analytes in different areas of the analysis element is determined separately.
  • Analytes can be: antibodies, antigens, haptens, nucleic acids, at least are partially complementary to a solid phase-bound nucleic acid, and other specific binding partners.
  • the detection of the binding of the analyte to the solid phase binding partner is made possible, for example, by the analyte carrying a labeling group or being labeled by binding with another free binding partner.
  • the markings which are customary in immunoassays or in DNA diagnostics come into question as the markings.
  • the markings with a direct marking, in particular with a fluorescent or luminescent constituent are advantageous Spots allows an exact qualitative or quantitative detection of this analyte.
  • location-resolving detection methods can preferably be used.
  • a preferred method is e.g. confocal scanning fluorescence microscopy.
  • the fluorescent dye used for marking is excited individually for fluorescence on each spot with the aid of a laser of suitable wavelength (scanning).
  • the emitted light is detected by means of sensitive detectors, e.g. integrating CCD cameras recorded, and quantified with suitable image evaluation software.
  • Other non-scanning fluorescence microscopic methods are also well suited for evaluation. In this case, several spots are viewed simultaneously in one image section. The individual spots are then evaluated, e.g. in succession with the help of suitable image analysis software.
  • Another method of measuring the binding of an analyte to the solid phase binding partner is optical, in particular reflection-optical techniques, in which the increase in the layer thickness of an extremely thin layer with the carrier-fixed binding partner can be observed by binding the free analyte.
  • optical in particular reflection-optical techniques
  • An overview of these techniques is given in Sadowsky: “Review of optical methods in immunosensing", SPIE, Vol. 1954, Optical Testing and Methology II (1988), 413-419. No special labeling of the analytes is necessary here.
  • a particularly preferred reflection-optical method is the detection of the binding of different analytes in different areas of the analysis element by means of surface plasmon resonance.
  • the analytical element consists of a transparent, dielectric material, on which a very small layer of a metallic conductive layer in spot form is applied, which carries the solid phase binding partner.
  • Such analysis elements are also often referred to as optical immune sensors. Examples of such optical immune sensors are described in EP-A 0 1 12 721, EP-A-0 276 142 and in EP-A-0 254 557
  • the sample is either applied to the analysis element over a large area or separately to individual spots. If necessary, additionally marked binding partners for the analytes to be determined are added. In this case, the analysis element is advantageously washed free of free labeling molecules before measuring the labeled analytes bound to the solid phase.
  • the analysis element can also be used to determine one or more analytes in various samples.
  • the invention therefore also relates to a method for the simultaneous determination of an analyte in different samples by means of specific binding reactions of the analyte with solid-phase-bound analyte binding partners on a surface-shaped analysis element, characterized in that different sample solutions are contacted with different areas of an analysis element according to the invention, the same analyte binding partners in the areas are bound and the presence or amount of the solid phase-bound analyte is determined separately in different areas.
  • the various sample solutions can be applied using standard application techniques such as pipetting, printing and stamping techniques or a micromultipin plate.
  • Another object of the invention is the use of the binding matrix or analysis elements according to the invention for the simultaneous detection of a large number of analytes, in particular in immunoassays, for example for allergy diagnostics or for DNA diagnostics, for example for screening a sample for polynucleotides with certain sequences.
  • the foils coated with gold spots and SAM were immersed in a streptavidin solution for one hour (concentration streptavidin: 0.5 mg / ml in 0.05 m K-phosphate buffer pH 7.2).
  • concentration streptavidin 0.5 mg / ml in 0.05 m K-phosphate buffer pH 7.2.
  • the chips were then washed with a solution of 50 mM K-phosphate buffer pH 7.2, 2% sucrose, 0.9% NaCl and 0.3% RSA II.
  • the chips were then dried at 25 ° C and 40% humidity for 20 hours.
  • the streptavidin-coated spots of the diluted hydrophobic binding layer from Example 1 were examined for non-specific binding of the fluorescent latex conjugate mediated by serum components.

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist eine Bindematrix enthaltend ein flächenförmiges Trägermaterial, das parallel in horizontaler Richtung zu seiner Oberfläche mit einer Vielzahl von räumlich getrennten Bereichen bedeckt ist, die Bindepartner immobilisiert enthalten, die jeweils fähig sind, einen entsprechenden freien Bindungspartner eines spezifischen Bindungspaares zu binden, dadurch gekennzeichnet, daß die Bereiche gebildet werden aus: a) sich nicht berührenden Metallschichtspots, b) über Ankergruppen jeweils an die Metallspots gebundene verdünnte und im wesentlichen lateral homogene Bindeschichten eines Bindepartners B1. Die Bindematrix kann mit einer Vielzahl gleicher oder unterschiedlicher Bindungspartner belegt werden und dient damit als Analytelement zur gleichzeitigen Bestimmung unterschiedlicher Analyte in einer Probe oder zur Bestimmung gleicher Analyte in verschiedenen Proben.

Description

Bindematrix und Analysenelement zur Simultananalyse verschiedener Analyte
Die Erfindung betrifft eine Bindematrix aus einem flächenf imigen Trägermaterial, das von einer Vielzahl horizontal räumlich getrennter Bereiche bedeckt ist, die mit unterschiedlichen spezifischen Bindungspartnern für freie Reaktanden belegt werden können, ein entsprechendes Analysenelement, ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie die Verwendung des Analysen¬ elementes zum gleichzeitigen Nachweis verschiedener freier Reaktanden oder Analyte oder zum gleichzeitigen Nachweis eines Analyten in verschiedenen Proben.
Um verschiedene Analyte aufgrund spezifischer Bindungsreaktionen räumlich nebeneinander nachzuweisen, zum Beispiel in Form eines Immunoassays, ist die gebräuchlichste Methode, die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit verschiedenen Antikörpern adsorptiv oder über eine Fixierungsschicht, wie zum Beispiel RSA / Streptavidin, zu beladen und in jeder Vertiefung einen Analyt zu bestimmen. Die vergleichsweise großen Abmessungen von Mikrotiterplatten erfordern große Mengen an Reagenz und Proben. Aufgrund der unebenen Geometrie der Wells können nur bestimmte Detektionsmethoden wie UV/VIS-Absorption oder Messung der Fluoreszenz in Lösung als Maß für die Bindung von Analyt an die Festphase angewandt werden.
Eine Verbesserung multipler Analytnachweise auf einem gemeinsamen Analysenträger wurde durch eine Miniatisierung der Analysenelemente durch Adsorption von Antikörpern oder Antigenspots auf Nitrocelullose erreicht (Walch et al., J. Immunol. Meth. (1984), 66, 99-102; Derer et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1984), 74, 85-92). Diese Analyseelemente werden ins¬ besondere zur Allergiediagnostik verwendet. Wie bei Mikrotiterplatten ist der Nachteil auch hier, daß sich durch die adsorptive Beladung der Oberfläche mit immunologisch aktiven Reagenzien keine geordnete und definierte Belegung der Oberfläche einstellt, was sich ungün¬ stig auf die Reproduzierbarkeit von Messergebnissen auswirkt. Die starke Abhängigkeit des Variationskoeffizienten der Meßergebnisse von der Beschaffenheit der Oberfläche bei adsorptiver Beladung ist unter anderem im US-Patent 4,980,299 beschrieben. Während bei großen Oberflachen die statistischen Schwankungen der Oberflachenbelegung bei adsorptiver Beladung weniger ins Gewicht fallen, können sie sich bei zunehmender Miniaturisierung der Oberflachen auf die Reproduzierbarkeit sehr negativ auswirken, da hier insbesondere Mikro- inhomogenitaten starker ins Gewicht fallen. Quantitative Bestimmungen sind somit nur schwer möglich.
Multiple Reagenztrager zur parallelen Synthese verschiedener Polypeptid- oder Polynukleotid- strange sind in WO 92/10092, WO 91/07087 und EP 0 138 855 beschrieben. In WO 92/10092 wird ein homogenes Tragermaterial durch Einfuhrung von Aminogruppen einheitlich über die gesamte Oberflache funktionalisiert An diese funktionalisierte Oberflache wird großflächig ein Reaktand mit einer photochemisch abspaltbaren Gruppe gebunden. Durch Anlegen einer Maske kann an bestimmten Stellen selektiv die photochemisch abspaltbare Gruppe entfernt werden und selektiv eine Aminosäure oder eine Nukleotidbase chemisch gekuppelt werden. Durch Verwendung anderer Masken kann das gleiche Verfahren an anderen Stellen mit anderen Aminosäuren oder Nukleotidbasen fortgesetzt werden. Man erhält so auf der Träger¬ oberfläche nach vielen Arbeitsschritten beispielsweise eine Vielzahl unterschiedlicher Poly- nukleotidstränge, die zur Bindung und Bestimmung komplementärer Polynukleotidst ränge dienen können. Nachteil bei diesem Verfahren ist, daß es sehr aufwendig ist, eine solche Mikrostrukturierung mit verschiedenen Analytbindungspartnem zu erzeugen. Die Belegung mit Bindungspartnern an belichteten Stellen ist sehr ungleichmäßig und wenig reproduzierbar.
In EP-A-0 134 215, EP-A- 0 304 202 und EP-A-0 271 974 werden miniaturisierte Analysen¬ elemente beschrieben, in denen Antikörperspots mit konventionellen Beschichtungstechniken auf beispielsweise Polystyroloberflächen durch Adsorption aufgebracht sind. Auch hier treten die durch starke Heterogenitäten der Oberflächen bedingten Schwankungen der Oberflächenbelegungen auf und bewirken eine schlechte Reproduzierbarkeit der Messergeb¬ nisse. Ein weiteres Problem sind unspezifische Bindungen von Proteinen aus Serum oder Plasma an die Oberfläche, was sich insbesondere bei kleinen Konzentrationen der Analyten und der Festphasenbindepartner sowohl für die Bindung der Festphasenbindepartner als auch für die Bindung des Analyten an den Festphasenbindepartner nachteilig auswirkt. Aufgabe der Erfindung war es daher, die oben beschriebenen Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen und eine Bindematπx zur Verfügung zu stellen, auf die auf sehr kleiner Flache eine Vielzahl von Festphasenbmdungspartnern für verschiedene Analyte einfach repro¬ duzierbar in einer gezielt einstellbaren Oberflachenbelegung und gleichzeitig ortlich begrenzt getrennt voneinander aufgebracht werden können, mit der nach Aufbringen der verschiedenen Festphasenbindungspartner eine Vielzahl von freien Analyten aus einer Losung auf sehr engem Raum gebunden und detektiert werden können und mit dem die multiple Analytbestimmung somit in reproduzierbarer Weise unter gleichzeitiger Verminderung unspezifischer Bindungen von Probenbestandteilen sowohl qualitativ als auch insbesondere quantitativ durchgeführt werden kann
Die Aufgabe wird gelost durch eine Bindematrix und ein Analysenelement wie es in den Ansprüchen charakterisiert ist
Gegenstand der Erfindung ist eine Bindematrix enthaltend ein flachenfbrmiges Tragermaterial, das parallel zu seiner Oberflache mit einer Vielzahl von horizontal raumlich getrennten Bereichen bedeckt ist, die Bindepartner immobilisiert enthalten, die jeweils fähig sind, einen entsprechenden Bindungspartner eines spezifischen Bindungspaares zu binden, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die Bereiche gebildet werden aus a) sich nicht berührenden Metallschichtspots, b) über Ankergruppen jeweils an die Oberflache der Metallspots gebundene verdünnte und im wesentlichen lateral homogene Bindeschichten eines Bindepartners B 1
Unter einer flächenf rmigen Bindematrix wird eine im wesentlichen ebene, bevorzugt eine planare Matrix verstanden Obwohl sie prinzipiell eine beliebig große Oberflache besitzen kann, kommen die Vorteile der Erfindung gegenüber dem Stand der Technik insbesondere bei kleinen Oberflachen zum Tragen Vorteilhaft sind daher Analysenelemente mit einer Oberfläche von unter 100 cm^, bevorzugt zwischen 1 cm^ und 25 cm^
Auf der Tragermaterialoberflache der Bindematrix sind nebeneinander in horizontaler Richtung eine Vielzahl von sich nicht berührenden Metallschichtbereichen ("Metallspots") aufgebracht Diese Bereiche bilden jeweils bevorzugt eine 10 - 100 nm dicke Schicht auf dem Träger¬ material und können beliebige Flächen einnehmen, also kreisförmig oder eckig sein. Die Vor¬ teile der Erfindung kommen besonders dann zum Tragen, wenn diese Bereiche sehr klein sind mit einem Durchmesser zwischen 0, 1 und 1 mm, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,3 und 0,6 mm.
Die Metallschichtbereiche sollen sich nicht berühren, das heißt die freien, von dem Träger¬ material abgewandten Oberflachen der Metallspots sollen von Zwischenflächen umgeben sein, deren Oberflachen aus einem von den Metallspots verschiedenen Material besteht. Im bevor¬ zugten Fall werden die Zwischenoberflächen zwischen den Metallspots von einem nicht¬ metallischen Tragermaterial selbst gebildet Gunstig sind dabei Tragermaterialien, die nur eine sehr geringe unspezifische Wechselwirkung mit biologischen Molekülen, z.B. Immunreagen¬ zien, haben. Gunstig ist ein Abstand der äußeren Begrenzungen der Metallspots von 0, 1 - 1 mm, um das spatere getrennte Auftragen von Reagenzien zu erleichtern.
Da die Spots erfindungsgemäß sehr kleine Flächen besitzen können, können auf einer sehr kleinen Tragermaterialoberflache sehr viele Spots untergebracht werden.
Vorteilhaft sind 10-100 Spots pro cm^ Oberfläche des Trägermaterials, besonders vorteilhaft
20-50.
Als Trägermaterial kann beispielsweise Polystyrol, Polycarbonat, Polyethylenacrylat, Polyethylen, Polypropylen oder Glas dienen.
Als Metalle werden bevorzugt Edelmetalle, insbesondere Gold, Silber oder Palladium verwen¬ det.
An den Metallspots ist eine "verdünnte" Bindeschicht eines auf allen Metallspots einheitlichen Bindepartners B 1 oder auf verschiedenen Metallspots unterschiedlicher Bindepartner B 1', Bl" usw. gebunden. Auf jedem Spot soll dabei aber nur eine Art eines Bindepartners in einer verdünnten Bindeschicht gebunden sein. Solche verdünnte Bindeschichten sind in der WO 92/10757 beschrieben, auf die hier vollinhaltlich Bezug genommen wird. Unter einer "verdünnten" Bindeschicht wird eine Monoschicht eines von dem Trägermaterial in den Raum wegweisenden spezifischen Bindepartners einer Molekülsorte verstanden, wobei die Oberfläche des Metallspots nicht vollständig belegt ist. Der Belegungsgrad mit dem Binde¬ partner, der ein Maß für die Verdünnung ist, kann ausgedrückt werden als Quotient aus gebundener Dicke der Bindeschicht dividiert durch die theoretische Schichtdicke bei dichter Packung.
Der Belegungsgrad der Metallspots mit einer Monoschicht des Bindepartner Bl ist kleiner als 100%, vorzugsweise 0, 1- 90 %, bevorzugt 0,7 - 70%, besonders bevorzugt 1 - 40%.
Die Adsorption der Bindeschicht des Bindepartners wird über Ankergruppen vermittelt. Als Ankergruppen sind Thiol-, Disulphid-, oder Phosphingruppen geeignet. So sind zum Beispiel Thiol- oder Disulphidgruppen als Ankergruppen für Gold- oder Silberoberflächen und Phosphingruppen für eine Palladiumoberfläche besonders geeignet.
Vorzugsweise ist die Ankergruppe für die Adsorption an die Festphase nicht direkt am Binde¬ partner angebracht, sondern ist über ein Spacermolekül, vorzugsweise über ein flexibles Spacer olekül, verknüpft. Besonders bevorzugt enthält das Spacermolekül mindestens eine Alkylengrυppe der Formel (CH2)n. worin n eine natürliche Zahl von 1-30, vorzugsweise 2-30, besonders bevorzugt 2-15 darstellt. Auf seiner einen Seite enthält das Spacermolekül die Ankergruppe (zum Beispiel die Thiol- oder Disulphidgruppe), die zur Adsorption an die Ober¬ fläche der Metallspots geeignet ist. Auf seiner anderen Seite, das heißt vom Trägermaterial weg, enthält das Spacermolekül eine oder mehrere Verknüpfüngsgruppierungen, über die der Bindepartner oder eine Komponente davon mit dem Spacermolekül verknüpft ist. Bei diesen Verknüpfüngsgruppierungen kann es sich zum Beispiel um eine Amino- oder Hydroxylfünktion handeln, die zum Beispiel mit einer Carboxylfunktion des Bindepartners unter Bildung einer Ester- oder Amidgruppe verknüpft ist. Das Spacermolekül kann jedoch auch als Ver- knüpfüngsgruppe eine Carboxylfunktion enthalten, die dann wiederum mit einer reaktiven Amino- oder Hydroxylfünktion des Bindepartners verknüpft ist.
Die Herstellung von verdünnten Bindeschichten ist in WO 92/10757 beschrieben. Eine erste Möglichkeit besteht darin, ein Spacermolekül zu verwenden, das mit zwei oder mehreren Molekülen, vorzugsweise zwei Molekülen des Bindepartners verknüpft ist. Ein Bei¬ spiel für ein solches Spacermolekül ist Cystamin, das als Ankergruppe eine Disulphidgruppe und als Verknupfüngsgruppierung zwei Aminofünktionen enthalt und daher mit zwei Mole¬ külen eines aktivierten Bindepartners verknüpft werden kann. Solche Moleküle bilden bei Adsorption an eine Goldoberflache eine verdünnte Bindeschicht mit einem Belegungsgrad wesentlich kleiner als 100% bezogen auf den Bindepartner
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung einer verdünnten Bindeschicht ist der Einbau einer hydrophilen Linkergruppe zwischen dem Spacermolekül und dem Bindepartner. Dieser Linker ist insbesondere ein geradkettiges Molekül mit einer Kettenlange von 4-15 Atomen. Bevorzugt ist dabei eine Linkergruppe, die eine oder mehrere hydrophile Ethylenoxideinheiten, vorzugs¬ weise zwischen 1 und 5 enthalt. Besonders bevorzugt wird die hydrophile Linkergruppe durch ein Amin- oder Hydroxyl-terminiertes Polyethylenoxid gebildet.
Zwischen dem hydrophilen Linker und dem Bindepartner kann vorzugsweise ein weiteres Spacermolekül eingebaut werden, welches aus einer Alkylengruppe der Formel ( CH2)n und einer Verknupfüngsgruppierung besteht, worin n eine natürliche Zahl von 2-15 ist. Als besonder geeigneter Linker hat sich l,8-Diamino-3,6-Dioxaoctan erwiesen. Solche Verbin¬ dungen bilden bei Adsorption an eine Goldoberfläche eine Monoschicht mit einer Belegungs¬ dichte von beispielsweise 19% bei Biotin als Bindepartner aus, die in der Lage ist, einen freien Reaktionspartner (Streptavidin) mit hoher Affinität und innerhalb kürzester Zeit zu einem dichtgepackten Film zu binden. Solche verdünnten Bindeschichten sind daher besonders bevor¬ zugt.
Ganz besonders bevorzugt sind die "verdünnten" Bindeschichten, die zusätzlich zu den über Ankergruppen und Spacem gebundenen Bindepartner auch noch Spacermoleküle enthalten, die zwar mit einer Ankergruppe verbunden sind, aber an die kein Bindepartner gebunden ist. Derartige Verbindungen werden im weiteren auch als Verdünnungsmoleküle bezeichnet. Wenn man zum Beispiel biotinylierte und nicht-biotinylierte Spacermoleküle im Verhältnis von 1 : 10 bis 1 2 einsetzt, so erhalt man eine verdünnte Biotinmonoschicht, die einen freien Bindungs¬ partner mit hoher Geschwindigkeit und großer Kapazität binden kann
Geeignete Verdunnungsmolekule enthalten eine Ankergruppe und einen Spacerbestandteil sowie gegebenenfalls ein Linkermolekul, wobei sich die Anzahl der CH2-Gruppen des Spacermoleküls um nicht mehr als 1-5, bevorzugt nicht mehr als 1-2 C-Atome von der Anzahl der CH2-Gruppen des Spacermoleküls unterscheidet, das an den Bindungspartner gebunden ist. Es hat sich weiterhin als zweckmäßig erweisen, daß die Mindestkettenlange des Ver- dunnungsmolekuls 6 Atome (ohne Ankergruppe und hydrophile Linkergruppe) betragt
Anstelle des Bindepartners befindet sich vorzugsweise an der von der Ankergruppe entfernten Ende des Verdünnungsmoleküls eine hydrophile Funktion, wie zum Beispiele eine Hydroxyl¬ gruppe, eine Carbonsauregruppe, eine Carbonsaureethylester- oder Methylestergruppe, eine Carbonsaureamidgruppe, eine mit ein oder zwei Methyl- oder Ethylgruppen substituierte Carbonsaureamidgruppe, eine Sulfonsauregruppe oder eine Sulfonamidgruppe. Ebenso ist es bevorzugt, an das von der Ankergruppe entfernte Ende des Verdünnungsmoleküls einen hydrophilen Linker (gemäß obiger Definition) oder einen Teil eines hydrophilen Linkers zu binden.
Es ist auch möglich, einen Spacer mit Bindepartner und einen Spacer ohne Bindepartner über eine kovalente Bindung zu verknüpfen. Bei Verwendung von Gold- oder Silberoberflächen er¬ folgt diese Verknüpfung vorzugsweise über eine Disulphidbrücke.
In solchen gemischten Bindeschichten, die aus Verdünnungsmolekülen (Spacermolekülen ohne Bindepartner) und aus Spacermolekülen mit Bindepartner bestehen, beträgt der Anteil der Spacermoleküle mit Bindepartner zweckmäßig 0,1 - 90 mol %, vorzugsweise 0,5 - 50 mol. % und besonders bevorzugt 1-40 mol %.
Als Bindepartner kann jeder Partner eines spezifischen Bindepaares benutzt werden, zum Bei¬ spiel Antikörper, Antigene, Proteine, Lektine, Biotin, Streptavidin oder Polynukleotide. Be¬ vorzugt ist auf allen Spots eine verdünnte Bindeschicht aufgebracht, die von demselben Binde¬ partner B 1 gebildet wird. Dabei handelt es sich vorzugsweise um Biotin oder Biotin-Analoge Moleküle wie Desthio- biotin, Iminobiotin oder HABA (4-Hydroxy-phenyl-azobenzoesaure), die ebenfalls mit Streptavidin reagieren.
Im Falle von Antikörpern, Antigenen, Haptenen oder Polynukleotiden ist es auch möglich, daß verschiedene Bindepartner unterschiedliche verdünnte Bindeschichten auf einzelnen Spots bilden. Dies ist bei Polynukleotiden besonders bevorzugt. Im Grenzfalle befindet sich auf jedem Metallspot eine verdünnte Bindeschicht eines anderen Bindepartners. Eine solche Bindematrix kann schon zur Bindung und zum Nachweis verschiedener freier Bindungspartner der Matrixbindepartner verwendet werden Zusatzlich ist es möglich, daß auf verschiedenen Spots Bindeschichten des gleichen oder unterschiedlicher Bindepartner aufgebracht sind, die einen von Spot zu Spot unterschiedlichen Verdünnungsgrad aufweisen.
Der Belegungsgrad des Bindepartners B 1 der ersten Bindeschicht auf den Metallspots läßt sich durch eine Dickenmessung der Bindeschicht bestimmen. Dabei nimmt die gemessene Schicht¬ dicke mit dem Belegungsgrad der Bindeschicht ab. So hat eine Bindeschicht mit Biotin als Bindepartner eine Dicke von 0,7 nm, wobei diese Dicke geringer als die errechnete Länge von 3,7 nm des Moleküls ist.
Weiterhin ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Bindematrix, dadurch gekennzeichnet, daß a) Metallschichtspots auf die Tragermaterialoberflache in der Weise aufgebracht werden, daß sie sich nicht berühren b) die freie Oberfläche der Metallschichtspots jeweils mit einer Reaktionslösung inkubiert wird, die Moleküle zur Erzeugung einer verdünnten Bindeschicht enthält.
In einem ersten Schritt werden auf das Trägermaterial des Analysenelementes in horizontaler Richtung voneinander getrennte diskrete Metallspots in einer Schicht parallel zur Oberfläche des Trägermaterials aufgebracht. Bevorzugt werden diese Spots in einem regelmäßigen Muster aufgebracht. Um das gewünschte Muster von Metallspots auf der Tragermaterialoberflache zu erhalten, wird bevorzugt eine Maske verwendet, in der das gewünschte Muster freigelassen ist und die auf das Tragermaterial aufgelegt wird Über die Maske wird dann das Muster der Metallspots durch Aufdampfen oder Aufsputtem aufgebracht Gegebenenfalls kann die Tragermaterialoberflache vorher mit einem Haftvermittler, zum Beispiel Chrom, versehen werden Je nach spaterem Verwendungszweck kann die Dicke der aufgebrachten Metallspots unterschiedlich sein Soll das Analysenelement für Oberflachenplasmonresonanz verwendet werden, so ist eine Metallschichtdicke von 10 - 100 nm bevorzugt Ansonsten kann die Dicke auch großer sein
Neben dem Aufbringen von Metallspots über eine Maske ist es auch möglich, das Analysen¬ element ganzflachig mit einer Metallschicht zu überziehen und durch Wegatzen von Metall nachtraglich ein gewünschtes Spotmuster zu erzeugen Möglich ist auch, ein Spotmuster auf einer Metalloberflache durch Überziehen des Metalls mit einem nichtmetallischen Überzug, z B Wachs, zu erzeugen, wobei der Überzug die Zwischenflachen zwischen den Spots dar¬ stellt
In einem zweiten Schritt werden die einzelnen Metallspots mit einer verdünnten Bindeschicht überzogen. Soll diese verdünnte Bindeschicht auf allen Spots diesselbe sein, wird das Trager¬ element vorteilhafterweise in eine Losung eingetaucht, die die für die Erzeugung einer ver¬ dünnten ersten Bindeschicht notwendigen Moleküle enthält. Dies kann zum einen bevorzugt eine Mischung aus Anker-Spacer-Molekülen mit und ohne Bindungspartner in einem den Ver- dunnungsgrad bestimmenden Verhältnis sein, zum anderen kann dies eine Losung aus solchen Molekülen sein, die wie oben beschrieben ebenfalls verdünnte Bindeschichten erzeugen
Sollen die verdünnten Bindeschichten auf verschiedenen Spots unterschiedliche Bindepartner enthalten, so werden verschiedene Lösungen auf einzelne Spots aufgegeben, die jeweils einen anderen Bindungspartner in einer eine verdünnte Bindeschicht erzeugenden Form enthalten. Stattdessen oder zusatzlich können so auch unterschiedliche "Verdünnungsgrade" der Binde¬ filme auf verschiedenen Spots er :ugt werden, indem z.B. ein unterschiedlicher Anteil an Ver- dunnungsmolekülen in den einzelnen Losungen vorhanden ist, die auf verschiedene Spots auf¬ gegeben werden. Die raumlich getrennte Aufgabe der Reagenzien für verdünnte Binde¬ schichten kann über gebrauchliche Methoden wie Pipettieren, Stempel- oder Drucktechniken, z.B. Ink-Jet, erfolgen. Gegebenenfalls wird überschüssige Lösung wieder entfernt. Diese verdünnten lateralen Bindeschichten sind mikroskopisch homogen, wie zum Beispiel durch Surface Plasmon Microscopy nachweisbar (B Rothenhausler und W Knoll, Surface Plasmon Microscopy, Nature, Vol 332, Seite 615-617 ( 1988) Bei einer Auflosung von 5 μ sind keine Dickenunterschiede meßbar
Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine Bindematrix, die auf jedem Spot eine verdünnte Bindeschicht des gleichen Bindepartners enthalt Jede dieser Bindeschichten kann dann ihrer¬ seits zur Bindung gleicher oder unterschiedlicher Bindungspartner dienen
Hat die verdünnte Bindeschicht auf allen Spots an ihrer Oberflache den gleichen Bindungs¬ partner, dient diese Bindematrix mit einer verdünnten Bindeschicht, die in Form von raumlich getrennten diskreten Bereichen auf dem Tragermaterial über Metallspots aufgebracht ist, nun zum reproduzierbaren und über den Verdunnungsgrad der jeweiligen Bindeschicht einstell¬ baren bzw optimierbaren Aufbringen einer Vielzahl von gleichen oder unterschiedlichen Bin¬ dungspartnern für freie Analyten auf diese diskreten Bereiche und bildet somit die Grundlage für ein Multianalyt-Analyseelement, das die gleichzeitige, genaue qualitative aber auch quanti¬ tative Bestimmung einer Vielzahl von Analyten in einer Probe oder eines Analyten in verschie¬ denen Proben auf engem Raum erlaubt, wobei nur sehr geringe Reagenzmengen benotigt werden und diese Bestimmungen wenig durch unspezifische Bindungen von Blut- oder Serum¬ bestandteilen wie z B Fibrinogen gestört werden Gegenüber konventionellen "Multiparameter"-Analyseelementen wie Mikrotiterplatten ist dabei eine wesentlich höhere Zahl von Analysebereichen möglich Auf einer Flache von 100 cm^ sind bis zu 100 000 Spots möglich, wobei die Herstellung der Bindematrix trotzdem sehr einfach ist
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Analyseelement zur Bestimmung unter¬ schiedlicher freier Reaktanden in einer Probe oder zur Bestimmung eines Reaktanden in ver¬ schiedenen Proben, enthaltend ein flachenfbrmiges Tragermaterial, das parallel zu seiner Ober¬ flache mit einer Vielzahl von raumlich getrennten Bereichen bedeckt ist, auf denen unterschied- iche oder gleiche spezifische Bindungspartner für freie Reaktanden immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß es eine erfindungsgemaße Bindematrix enthalt, an die eine an die Binde¬ partner B 1 oder, bei Vorhandensein eines zusatzlichen Bindepartners B2, eine an B2 spezi- fisch gebundene weitere Bindeschicht enthalt, die an ihrer Oberflache Bindungspartner B3 für zur bestimmende freie Reaktanden oder Analyte enthält.
Neben der ersten verdünnten Bindeschicht auf jedem Metallspot enthält demnach das erfin- dungsgemaße Multi-Reaktanden- Analyseelement zusatzlich auf jedem Spot eine weitere Bindeschicht gleicher oder unterschiedlicher Bindungspartner B3 für freie Reaktanden. Dabei ist auf jedem Spot nur eine Sorte von Reaktandenbindungspartnern gebunden. Diese Reak- tandenbindungspartner können über eine spezifische Bindungsstelle mit dem Bindungspartner Bl der ersten Bindeschicht gekoppelt sein. Diese spezifischen Bindestellen können zum Beispiel ein Epitop für einen Antikörper der ersten Bindeschicht sein oder auch ein an die Analytbindepartner gebundenes spezifisches Bindemolekül, wie z.B Biotin, das mit dem Bin¬ dungspartner der ersten Bindeschicht, z.B. Streptavidin, spezifisch koppelt.
Als Reaktandenbindungspartner werden spezifische Bindungspartner für freie, sich in Lösung befindende Reaktanden verwendet Dies können Antikörper, Antigene, Haptene oder Nuklein- säurestrange sein.
In einer Ausführungsform dient eine Bindematrix, auf deren Spots sich eine verdünnte Binde¬ schicht eines einheitlichen Bindepartners Bl befindet, direkt zur reproduzierbaren Aufgabe einer weiteren Schicht von Spot zu Spot gleicher oder verschiedener Reaktandenbindungs¬ partner B3, die über eine spezifische Bindungsstelle an Bl binden.
In einer anderen Ausführungsform werden die verdünnten Bindeschichten der einzelnen Spots jeweils durch eine weitere monomolekulare Bindeschicht mit einem einheitlichen Bindepartner B2 belegt. Dabei hat der Bindepartner B2 eine spezifische Bindestelle für Bl. Da diese Bele¬ gung erfindungsgemäß auch auf sehr kleiner Fläche sehr gut reproduzierbar ist, können über¬ raschenderweise die Bindepartner B2 der einzelnen Spots wiederum sehr gut für die reprodu¬ zierbare Belegung einer einstellbaren Menge einer weiteren Bindeschicht mit von Spot zu Spot gleicher oder verschiedener Reaktandenbindungspartner B3 dienen, die dann eine spezifische Bindestelle für B2 haben. Entscheidend für die erfindungsgemaßen Vorteile bei beiden Ausführungsformen ist, daß die Bindematrices auf den Metallspots eine verdünnte Bindeschicht enthalten
Es hat sich dabei überraschenderweise herausgestellt, daß bei Anwesenheit einer verdünnten Bindeschicht auf jedem Spot der erfindungsgemaßen Bindematrix, jeder Spot separat mit einer reproduzierbaren und definierten Menge an Reaktandenbindungspartnem B3 belegt werden kann - sei es direkt oder über eine Bindepartnerzwischenschicht B2 -, ohne daß daruberhinaus unspezifische Bindungen von Probenbestandteilen diese Belegung stören Diese reproduzier¬ bare Belegung wird überraschenderweise auch bei sehr kleinen Abmessungen der Spots erreicht, was auf eine sehr geringe Mikroinhomogenitat der Bindeschichten schließen laßt Dadurch werden Analysenelemente mit einer Vielzahl von Spots mit einer konstanten und homogenen Bindepartner-Belegung jedes Spots auf sehr kleinem Raum ermöglicht Zusatzlich laßt sich die Belegung der verschiedenen Spots mit Reaktandenbindungspartnem überraschen¬ derweise auch über den Verdunnungsgrad der verschiedenen Bindeschichten einfach und reproduzierbar steuern, so daß jeder Bindeschichtenspot individuell bezuglich des nachzu¬ weisenden Reaktanden und bezuglich erforderlicher Sensitivitat zum Nachweis dieses Reak¬ tanden eingestellt werden kann
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Analysen¬ elementes zur multiplen Bestimmung gleicher oder unterschiedlicher freier Reaktanden, da¬ durch gekennzeichnet, die freien Oberflächen der Bindeschichten einer Bindematrix jeweils mit gleichen oder unterschiedlichen Losungen inkubiert werden, die Bindepartner B3 für freie Reaktanden enthalten, wobei die Bindepartner B3 eine spezifische Bindestelle für die Binde¬ partner B 1 oder B2 haben
Das Aufbringen der verschiedenen Bindeschichten mit gleichen oder verschiedenen Bindungs- partnem für freie Reaktanden auf die Bindematrix kann auf verschiedene Weise erfolgen.
Im einfachsten Falle werden mit einer Pipette auf verschiedene Spots, die jeweils mit einer ersten verdünnten Bindeschicht bedeckt sind und gegebenenfalls mit einer weiteren Binde¬ schicht mit dem Bindepartner B2 bedeckt sind, gleiche oder verschiedene Bindungspartner B3 für freie Reaktanden als Losung aufgebracht Diese Bindungspartner B3 müssen alle eine gemeinsame Bindungsstelle für den einheitlichen Bindepartner B l der ersten verdünnten Binde¬ schicht oder gegebenenfalls den Bindungspartner B2 der zweiten Bindeschicht aufweisen. Bevorzugt sind sie an ein einheitliches Bindemolekül für den Bindungspartner B 1 oder B2 gebunden. Ein Beispiel für Bindungspartner B3 sind unterschiedliche Antikörper, die an Biotin gebunden sind. Auf unterschiedliche Spots, die mit einer verdünnten Biotinbindeschicht und einer daran gebundenen Streptavidinbindephase belegt sind, werden dann unterschiedliche biotinylierte Antikörper aufgebracht, wobei sich diese an die Streptavidinphase binden, da Streptavidin insgesamt 4 Bindungsstellen hat. Man erhält so ein Analysenelement, das auf engstem Raum Felder zur Bindung vieler unterschiedlicher freier Reaktanden besitzt. Diese Reaktandenbindungspartnerschichten bilden eine reproduzierbare Belegung der Bindeschichten der Bindematrix.
Wird auf jedem Spot ein einheitlicher biotinylierter Antikörper des Bindungspartners für ein freies Antigen aufgebracht, können mit dem Analyseelement gleichzeitig eine Vielzahl von Proben gemessen werden, die dieses Antigen zu dem festphasengebundenen Antikörper enthal¬ ten.
Weitere Möglichkeiten zur Aufgabe verschiedener Bindungspartner auf die jeweiligen Spots stellen Drucktechniken oder Stempeltechniken, insbesondere Ink-Jet, oder die Aufgabe mittels einer Mikromultipin-Platte analog zur Aufgabe verschiedener Reagenzien bei Mikrotiter¬ platten, dar. Gegebenenfalls wird überschüssige Lösung wieder entfernt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung min¬ destens zweier Reaktanden oder Analyten in einer Probelösung mittels spezifischer Bindungs¬ reaktionen der Analyten mit festphasengebundenen Analytbindungspartnem auf einem flächen- förmigen Analysenelement, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probenlösung mit einem erfindungsgemäßen Analysenelement kontaktiert und die Anwesenheit oder Menge fest- phasengebundener Analyte in verschiedenen Bereichen des Analysenelementes getrennt bestimmt.
Analyt und festphasengebundener Reaktandenbindungspartner bilden dabei ein spezifisches Bindepaar. Analyte können sein: Antikörper, Antigene, Haptene, Nukleinsäuren, die zumindest teilweise komplementär zu einer festphasengebundenen Nukleinsaure sind, und andere spezi¬ fische Bindungspartner.
Der Nachweis der Bindung des Analyten an den Festphasenbindungspartner wird beispiels¬ weise dadurch ermöglicht, daß der Analyt eine Markierungsgruppe tragt oder durch Bindung mit einem weiteren freien Bindungspartner eine Markierung erhält. Als Markierung kommen die bei Immunoassays oder in der DNA-Diagnostik üblichen Markierungen in Frage Vorteil¬ haft ist insbesondere die Markierung mit einer Direktmarkierung, insbesondere mit einem fluoreszierenden oder lumineszierenden Bestandteil Die dadurch ermöglichte optische Beob¬ achtung der Bindung des Analyten an den Festphasenbindungspartner eines bestimmten Spots erlaubt einen genauen qualitativen oder quantitativen Nachweis dieses Analyten.
Um die Bindung der Analyte auf einzelnen Spots nebeneinander und insbesondere auch quanti¬ tativ nachweisen zu können, können bevorzugt ortsauflösende Detektionsmethoden verwendet werden. Eine bevorzugte Methode ist z.B. die konfocale scanning Fluoreszenzmikroskopie. Bei dieser Methode wird auf jedem Spot einzeln der zur Markierung verwendete Fluoreszenz¬ farbstoff mit Hilfe eines Lasers geeigneter Wellenlange zur Fluoreszenz angeregt (scanning). Das emitierte Licht wird mittels empfindlicher Detektoren, wie z.B. integrierender CCD- Cameras aufgezeichnet, und mit geeigneter Bildauswerte-Software quantifiziert. Auch andere, nichtscannende fluoreszenzmikroskopische Methoden sind zur Auswertung gut geeignet. In diesem Fall werden mehrere Spots in einem Bildausschnitt gleichzeitig betrachtet. Die Auswer¬ tung der einzelnen Spots erfolgt dann z.B. hintereinander mit Hilfe geeigneter Bildauswerte- Software.
Eine weitere Messmethode der Bindung eines Analyten an den Festphasenbindungspartner stellen optische, insbesondere reflektionsoptische Techniken dar, bei denen die Zunahme der Schichtdicke einer extrem dünnen Schicht mit dem trägerfixierten Bindungspartner durch Bindung des freien Analyten beobachtet werden kann. Ein Überblick über diese Techniken wird gegeben in Sadowsky: "Review of optical methods in immunosensing", SPIE, Vol. 1954, Optical Testing and Methology II (1988), 413-419. Hier ist keine spezielle Markierung der Analyte nötig. Ein besonders bevorzugtes reflektionsoptisches Verfahren ist der Nachweis der Bindung ver¬ schiedener Analyten in verschiedenen Bereichen des Analysenelementes durch Oberflächen- plasmonenresonanz. Bei diesen Verfahren besteht das Analysenelement aus einem durchsich¬ tigen, dielektrischen Material, auf dem in sehr geringer Schicht eine metallisch leitende Schicht in Spotform aufgebracht ist, welche den Festphasen-Bindungspartner trägt. Solche Analyse¬ elemente werden vielfach auch als optische Immunsensoren bezeichnet. Beispiele für solche optischen Immunsensoren sind in der EP-A 0 1 12 721, EP-A-0 276 142 und in der EP-A-0 254 557 beschrieben
Auch andere ortsauflosende Detektionsmethoden wie z.B elektrochemische Messungen, Leit¬ fähigkeitsanderungen oder Messung von radioaktiver Markierung sind möglich. Zur Analyse einer Probe auf bestimmte Analyte wird die Probe entweder großflächig auf das Analyse¬ element oder separat auf einzelne Spots aufgebracht. Gegebenenfalls werden zusatzlich mar¬ kierte Bindungspartner für die zu bestimmenden Analyte zugegeben. In diesem Fall wird das Analyseelement vor Messung der an die Festphase gebundenen markierten Analyte vorteil¬ hafterweise von freien Markierungsmolekülen freigewaschen.
Das Analysenelement kann auch zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten in verschie¬ denen Proben benutzt werden.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung eines Analyten in verschiedenen Proben mittels spezifischer Bindungsreaktionen des Analyten mit festphasengebundenen Analytbindungspartnem auf einem flächenfόrmigen Analyseelement, dadurch gekennzeichnet, daß man verschiedene Probenlösungen mit verschiedenen Bereichen eines erfindungsgemäßen Analyseelements kontaktiert, wobei in den Bereichen gleiche Analytbindungspartner gebunden sind und die Anwesenheit oder Menge des festphasenge¬ bundenen Analyt in verschiedenen Bereichen getrennt bestimmt.
Die verschiedenen Probelösungen können dabei durch übliche Aufgabetechniken wie Pipettieren, Druck- und Stempeltechniken oder eine Mikromultipinplatte aufgegeben werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Binde- matrixes bzw. Analysenelemente zum gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl von Analyten insbesondere in Immunoassays, beispielsweise für die Allergiediagnostik oder für die DNA Diagnostik, beispielsweise zum Screenen einer Probe auf Polynucleotide mit bestimmten Sequenzen.
Beispiel 1
1. Herstellung der Spots durch Aufdampfen
Auf "Lexan" Polycarbonatfolien (Hersteller: General Electric, Dicke 0,75 mm) mit den Ab¬ messungen 8x8 cm wurden über eine Metallmaske (d= 0,5 mm, Material. Aluminium) in einer Leybold Hochvakkum-Beschichtungsanlage (Univex 450) 36x36 runde Goldspots (insgesamt 1296 Spots) in gleichmaßigen Abstanden aufgedampft. Die Schichtdicke des aufgedampften Goldes betragt 300 nm Der Durchmesser der Spots betragt 1 mm, der Abstand von Spot zu Spot ebenfalls 1 mm nach allen Seiten
2. Beschichtung der Multi-Goldspotplatte mit "verdünnten" Biotinthiol-Bindeschichten
2.1 "Hydrophile" Schicht
2,8 mg (5 x \0~~- m) der Biotin-Thiolverbindung I und 8,7 mg (4,5 x 10~4 m) des Verdünners II wurden in 100 ml 0,05 m Kaliumphosphatpuffer pH 7,25 gelöst. In diese Lösung wurden die frisch beschichteten Polycarbonatfolien getaucht. Nach einer Stunde wurden die Platten ent¬ nommen, 2 x mit Wasser (bidest.) gewaschen und an der Luft getrocknet.
2.2. "Hydrophobe" Schicht
2,94 mg (5xl0-5 m) der Biotin-Thiolverbindung III und 9,2 mg (4,5 x 10"4 m) des Verdünners IV wurden in 100 ml Ethanol p.a. gelöst. In diese Lösung wurden die frisch beschichteten Polycarbonatfolien getaucht. Nach 4 Stunden wurden die Platten entnommen, 2 x mit Ethanol p.a. gewaschen und an der Luft getrocknet.
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IV.
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3. Aufbringen von Streptavidin
Die mit Goldspots und SAM beschichteten Folien wurden 1 Stunde in eine Streptavidinlösung getaucht (Konzentration Streptavidin: 0,5 mg / ml in 0,05 m K-Phosphatpuffer pH 7,2). Die Chips wurden danach mit einer Lösung aus 50 mM K-Phosphat-Puffer pH 7,2, 2% Saccharose, 0,9% NaCl und 0,3% RSA II gewaschen. Die Chips wurden anschließend bei 25°C und 40% Luftfeuchtigkeit 20 Stunden getrocknet.
4. Durchführung eines TSH-Tests
Auf den mit Streptavidin beschichteten Spots wurde ein TSH-Test nach folgendem Schema durchgeführt:
1. Inkubation mit <TSH> MAK 1.20-Bi ( 1 :4) für 45 Minuten, Konzentration des MAK 20 μg/ml, Puffer 20 mM K-Phosphat pH 7,4.
2. Waschen mit bidest. Wasser.
3. 45 Minuten Inkubation mit TSH Standard "Enzymun", Fa. Boehringer GmbH.
4. Waschen mit bidest. Wasser.
5. 30 Minuten Inkubation mit Fluoreszenz-Latex- Antikörper (A8)-Konjugat, 0,05% Fest¬ stoffanteil in 20 mM K-Phosphat Puffer pH 7,4.
6. Waschen mit bidest. Wasser.
7. Messung am konfokalen Floureszenzmikroskop (Fa. Biorad). Ergebnisse
Es wurden zwei Standards ( 10 μU und 2 μU) vermessen. Dabei wurden die folgenden relati¬ ven Intensitäten erhalten:
Figure imgf000022_0001
Graphische Auswertung der Messergebnisse (Anzahl von Pixeln gegen Fluoreszenzintensität) für die hydrophobe verdünnte Bindeschicht siehe Figur 1,2
Beispiel 2
Überprüfung der unspeziflschen Bindung
Die mit Streptavidin beschichteten Spots der verdünnten hydrophoben Bindeschicht aus Beispiel 1 wurden auf über Serumbestandteile vermittelte unspezifische Bindung des Fluoreszenzlatexkonjugats untersucht.
1. Waschen mit bidest. Wasser
2. 45 Minuten Inkubation mit Probe (Standards bzw. Serum)
3. Waschen mit bidest. Wasser
4. 30 Minuten Inkubation mit Fluoreszenz-Latex-Antikörper (A8)-Konjugat
5. Waschen mit bidest. Wasser 6. Messung am konfocalen Fluoreszenzmikroskop
Ergebnisse
Figure imgf000023_0001
Es zeigt sich, daß Serumbestandteile die Messung nicht stören

Claims

Patentansprüche
1 Bindematrix enthaltend ein flachenformiges Tragermaterial, das parallel in horizontaler Richtung zu seiner Oberflache mit einer Vielzahl von raumlich getrennten Bereichen bedeckt ist, die Bindepartner immobilisiert enthalten, die jeweils fähig sind, einen ent¬ sprechenden freien Bindungspartner eines spezifischen Bindungspaares zu binden, dadurch gekennzeichnet, daß die Bereiche gebildet werden aus a) sich nicht berührenden Metallschichtspots, b) über Ankergruppen jeweils an die Metallspots gebundene verdünnte und im wesent¬ lichen lateral homogene Bindeschichten eines Bindepartners B l
2 Bindematrix gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Belegung 0, 1 bis 90% der maximalen Belegung betragt.
3. Bindematrix gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Belegung 0,5 bis 70% der maximalen Belegung betragt.
4. Bindematrix gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Belegung 1 bis 40% der maximalen Belegung beträgt
5. Bindematrix nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Metall¬ schichtspots aus Gold, Silber oder Palladium bestehen und die Ankergruppen Thiol-, Disulfid- oder Phosphingruppen darstellen.
6. Bindematrix nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Anker¬ gruppe mit dem Bindepartner Bl über ein flexibles Spacermolekül verknüpft ist.
7. Bindematrix nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das flexible Spacermolekül mindestens eine Alkylengruppe der Formel (CH2)n enthält, worin n eine natürliche Zahl zwischen 1 und 30 ist.
8. Bindematrix nach Anspmch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Spacermolekül mit zwei oder mehreren Molekülen des Bindepartners verknüpft ist.
9. Bindematrix gemäß Anspmch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich zwischen dem Spacermolekül und dem Bindepartner eine hydrophile Linkergruppe befindet.
10. Bindematrix nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Binde¬ schichten der einzelnen Bereiche neben dem mit Bindepartnern verknüpften Spacer¬ moleküle noch Spacermoleküle enthalten, die mit Ankergruppen versehen sind, aber nicht mit Bindepartnern verknüpft sind.
1 1. Bindematrx gemäß Anspmch 1- 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallspots einen Durchmesser von 0, 1 - 1 mm besitzen.
12. Bindematrix gemäß Anspmch 1-1 1, dadurch gekennzeichnet, daß pro cm^ der Binde¬ matrix zwischen 10 und 100 Metallspots aufgebracht sind.
13. Bindematrix gemäß einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß auf einzelnen Spots unterschiedlich verdünnte Bindeschichten aufgebracht sind.
14. Bindematrix gemäß Anspmch 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß auf einzelnen oder allen Metallspots Bindeschichten mit unterschiedlichen Bindepartnern aufgebracht sind.
15. Bindematrix gemäß Anspmch 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß auf den Metallspots Bindeschichten mit den gleichen Bindepartnern aufgebracht sind.
16. Bindematrix nach Anspmch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindepartner B 1 Biotin oder ein Biotinanalogon ist.
17 Bindematrix nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindepartner B 1 ein oder mehrere verschiedene mit Antikörpern bindefahige Antigene oder Haptene darstellt
18 Bindematπx nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindepartner B l ein oder mehrere verschiedene Polynukleotide darstellt
19 Bindematrix gemäß Anspmch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß an die Binde¬ schichten des Bindepartners B 1 jeweils eine weitere Bindeschicht eines in allen Bereichen gleichen Bindepartners B2 gebunden ist, der fähig ist, freie Bindungspartner eines spezifi¬ schen Bindungspaares zu binden und über eine spezifische Bindestelle an Bl gebunden ist
20 Bindematrix nach Anspmch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindepartner Bl Biotin und der weitere Bindepartner B2 Streptavidin ist
21 Analysenelement zur Bestimmung unterschiedlicher freier Reaktanden in einer Probe oder zur Bestimmung eines Reaktanden in verschiedenen Proben, enthaltend ein flachen- fbrmiges Tragermaterial, das parallel zu seiner Oberflache mit einer Vielzahl von horizon¬ tal raumlich getrennten Bereichen bedeckt ist, auf denen unterschiedliche oder gleiche spezifische Bindungspartner für freie Reaktanden immobilisiert sind, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß es eine Bindematrix gemäß einem der Ansprüche 15, 16, 19 oder 20, an die c) eine an die Bindepartner B 1 oder, bei Vorhandensein eines zusätzlichen Bindepartners B2, eine an B2 spezifisch gebundene weitere Bindeschicht enthält, die an ihrer Oberflache Bindungspartner B3 für zur bestimmende freie Reaktanden enthalt
22. Analyseelement gemäß Anspmch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Binde¬ partner Bl Biotin ist, der eine verdünnte Schicht auf den Metallspots bildet, der Binde¬ partner B2 Streptavidin ist und die Bindungspartner B3 biotinylierte Reaktandenbindungs¬ partner sind
23 Verfahren zur Herstellung einer Bindematrix gemäß den Anspmchen 1 -18, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß a) Metallschichtspots auf die Tragermaterialoberflache in der Weise aufgebracht werden, daß sie sich nicht bemhren b) die freie Oberflache der Metallschichtspots jeweils mit einer Reaktionslösung inkubiert wird, die Moleküle zur Erzeugung einer verdünnten Bindeschicht enthält.
24 Verfahren zur Herstellung einer Bindematrix gemäß Anspmch 19 oder 20, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die verdünnten Bindeschichten einer Bindematrix gemäß Anspmch 15 oder 16 jeweils mit einer Reaktionslosung inkubiert werden, die einen weiteren Binde¬ partner B2 für einen freien Bindungspartner mit einer spezifischen Bindestelle für den Bindepartner B 1 enthalt
25 Verfahren zur Herstellung eines Analysenelementes gemäß Anspmch 21 - 22, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die freien Oberflachen der Bindeschichten einer Bindematrix gemäß einem der Ansprüche 15, 16, 19 oder 20 jeweils mit gleichen oder unterschiedlichen Lösun¬ gen inkubiert werden, die Bindepartner B3 für freie Reaktanden enthalten, wobei die Bindepartner B3 eine spezifische Bindestelle für die Bindepartner B l oder B2 haben.
26. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung verschiedener freier Reaktanden in einer Probenlösung oder eines freien Reaktanden in verschiedenen Probeiösungen mittels spezi¬ fischer Bindungsreaktionen der Reaktanden mit festphasengebundenen Reaktanden¬ bindungspartnem auf einem flächenförmigen Analysenelement, durch Kontaktieren und Bindung der Reaktanden an diskrete, räumlich voneinander getrennte Binde-Bereiche des Analyseelements und Bestimmung der festphasengebundenen Reaktanden in den verschie¬ denen Bereichen getrennt voneinander, dadurch gekennzeichnet, daß ein Analyseelement gemäß Anspmch 21 oder 22 verwendet wird.
27. Verfahren gemäß Anspmch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie erfolgt.
28. Verfahren gemäß Anspmch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung mittels Oberflächenplasmonresonanz erfolgt
29. Verwendung einer Bindematπx gemäß einem der Anspmche 1-20 oder eines Analysen¬ elementes gemäß einem der Anspmche 21-22 zum multiplen Analytnachweis.
30 Verwendung einer Bindematrix gemäß einem der Anspmche 1-20 oder eines Analysen¬ elementes gemäß einem der Anspmche 21-22 für Immunoassays
31 Verwendung einer Bindematrix gemäß einem der Anspmche 1 -20 oder eines Analysen¬ elementes gemäß einem der Anspmche 21 -22 zur DNA-Diagnostik
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