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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Tests und im Speziellen
Bindungstests, wie z.B. Antikörper/Hapten-
oder DNA-Wechselwirkungen, wobei die verschiedenen Stärken dieser
Wechselwirkungen und unspezifischer Bindungswechselwirkungen genutzt
werden sowie Markierungen verwendet werden, die auf Magnetfelder
reagieren.
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Beschreibung
der verwandten Gebiete
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Bindungstests,
wie z.B. Immuntests, werden in der Nahrungsmittel-, Medizin- und
Pharmaindustrie weit verbreitet als Diagnosetests für ein breites
Feld von Zielmolekülen
eingesetzt. Seit dieses Prinzip erstmals entwickelt wurde, wurden
viele Bindungstests hergestellt und vertrieben.
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Immuntests
nutzen gewöhnlicherweise
die Bindungsfähigkeiten
von Antikörpern.
Antikörper
sind Proteinmoleküle,
die häufig
als Infektionsbekämpfer
betrachtet werden. Sie bekämpfen
Infektionen, indem sie sich auf eine bestimmte Weise an das infektiöse Material
binden und so einen Komplex bilden. Dies dient als Signal für den Organismus,
diesen Komplex abzustoßen.
Antikörper
können
auch gebildet werden, um sich spezifisch an eine weite Reihe von
Verbindungen zu binden, wie ein Schlüssel in ein Schloss passt.
Andere Moleküle (z.B.
Chelatbildner, Polynucleinsäurestränge, Rezeptoren
wie z.B. Zellrezeptoren), die andere Moleküle erkennen und selektiv binden
können,
können
jedoch eingesetzt werden, um eine weite Reihe von Spezies, wie z.B. Polynucleinsäuren (DNA
oder RNA), Polypeptide, Glykolipide, Hormone, Polymere, Metallionen
und bestimmte niedermolekulare organische Spezies wie eine Reihe
von illegalen Drogen, nachzuweisen. Um in einem Test einsetzbar
zu sein, muss diese Erkennung ein Signal hervorrufen, das makroskopisch
beobachtet werden kann. Das Verfahren, das eingesetzt wird, um eine
solches Signal zu erzeugen, ist eine Art zur Unterscheidung der
verschiedenen Immuntest-Typen.
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Bei
der ursprünglichen
Ausführungsform
eines Immuntests kam Radioaktivität zur Anwendung. Dieser Radioimmuntest
(RIA) ist relativ empfindlich und wird weit verbreitet eingesetzt,
aber die Risiken, Kosten und Einschränkungen in Verbindung mit dem
Umgang mit radioaktiven Materialien machen alternative Immuntests wünschenswert.
In letzter Zeit haben Enzym- und Fluoreszenztests Radiotests ersetzt.
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Einige
Immuntests nutzen magnetisch aktive Markierungen, um chemische Verbindungen
zu erfassen, und assoziieren die Kraft, die durch diese magnetischen
Markierungen in einem Magnetfeld wirkt, mit der Menge des vorhandenen
Analyts. Siehe US-Patente Nr. 5.445.970 und 5.445.971, beide am
29. August 1995 an Rohr ausgegeben.
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Die
Rohr-Patente nutzen magnetisch aktive Perlen, ein extern angelegtes
Magnetfeld und eine Waage zur Überwachung
der durch diese Perlen auf ein chemisch modifiziertes Substrat ausgeübten Kraft.
In einer typischen Ausführungsform
(ein Sandwich-Test) werden sowohl die magnetisch aktiven Perlen
als auch das Substrat so modifiziert, dass sie an ihre Oberfläche gebundene
Antikörper
für den
Analyten aufweisen. Die Antikörper-Antikörper-Wechselwirkungen
zwischen den Perlen und dem Substrat rufen keine spezifischen Bindungswechselwirkungen
hervor, wenngleich es zu etwas nicht spezifischer Adsorption kommen
kann. Wenn ein externes Magnetfeld angelegt wird, trennt das Feld
die Perlen von dem Substrat. Wenn der Analyt in das System eingebracht
wird, bindet er sich an die Perlen und das Substrat in einer Sandwich-Form,
wodurch die Perlen durch eine spezifische Bindungswechselwirkung
an das Substrat gebunden werden. Wenn ein externes Magnetfeld an
dieses System angelegt wird, stößt das Feld
die Perlen ab oder zieht sie an, abhängig von seiner Ausrichtung,
wodurch die durch die Waage gemessene Kraft verändert wird, was die Gegenwart
und (im Prinzip) die Menge des vorhandene Analyts anzeigt.
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Einer
der Nachteile von Rohrs Arbeit ist, dass nur ein integriertes Signal,
das mit dem Verhalten einer großen
Zahl der Perlen, auf die eine Reihe von magnetischen Bedingungen
einwirkt, in Verbindung steht, gemessen wird. Das ist besonders
problema tisch, da die Arbeit der Erfinder gezeigt hat, dass die
Perlen in diesem System auf komplexe Weisen wechselwirken.
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Unter
Bezugnahme auf 1 neigt ein großer Anteil
der Perlen in Rohrs System dazu, einen Klumpen zu bilden, und das
Verhalten dieser verklumpten Perlen ist nicht leicht in einem Modell
nachzubilden. 1 zeigt typische paramagnetische
Perlen auf einem Substrat in einem angelegten Magnetfeld, wie sie
durch ein typisches Lichtmikroskop gesehen werden könnten. Anhand
von 1 ist ersichtlich, dass einige der Perlen sich
zu Strängen
und Clustern aggregieren. In manchen Fällen können sich die Dipole der Perlen
so anordnen, dass ein größeres Magnetmoment
als erwartet entsteht. Rohrs Erfindung berücksichtigt dieses Verhalten
nicht und leidet deshalb an geringer Empfindlichkeit. Ein verlässlicheres
qualitatives und quantitatives System würde das Verhalten der einzelnen
Perlen überwachen
und die Auswirkungen der komplexen Wechselwirkungen, die eine Fehlerquelle
in Rohrs System darstellen, korrigieren oder kompensieren. Zusätzlich dazu
wäre ein
solches System inhärent
präziser,
da jede Perle überwacht
werden könnte.
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Ein
zweiter Nachteil von Rohrs Arbeit ist die unausgesprochene Annahme,
dass Zeit in diesem System keine Variable darstellt. Alle in Rohrs
Patenten offenbarte Tests weisen ein Signal auf, das nur mit der
Konzentration des Analyts assoziiert ist. Die Arbeit der Erfinder
hat gezeigt, dass sich die magnetischen Perlen in einem angelegten
Feld abhängig
von Zeit und Temperatur von dem Substrat dissoziieren und einer
der Boltzmann-Verteilungskurve folgen.
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Ein
verbesserter Bindungstest-Sensor würde die Unterscheidung von
komplexen Bindungswechselwirkungen auf der Ebene der einzelnen Perlen
ermöglichen.
Ein verbesserter Bindungstest-Sensor würde auch zusätzliche
Informationen über
die Gegenwart oder die Abwesenheit einer Bindungswechselwirkung
hinaus liefern, wie z.B. Informationen über die Stärke dieser spezifischen Wechselwirkung.
Als Teil der Entwicklung solcher zusätzlichen Informationen wäre es nützlich, über ein
Verfahren zur Entwicklung von Kraft-Bindungs-Kurven für Target-Analyten
zu verfügen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Dementsprechend
trachtet diese Erfindung danach, eine weite Reihe von Zielspezies
mit einem hohen Empfindlichkeitsgrad nachzuweisen.
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Diese
Erfindung trachtet ebenfalls danach, Zielspezies unter Einsatz eines
Transduktionsmechanismus, der von der Masse der Spezies unabhängig ist,
nachzuweisen.
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Unter
Einsatz dieser Erfindung ist es möglich, zusätzliche Informationen über die
Gegenwart oder Abwesenheit einer Bindungswechselwirkung hinaus zu
erhalten, wie z.B. Informationen über die Stärke dieser spezifischen Wechselwirkung.
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Die
Erfindung kann auch eingesetzt werden, um die Stärke der spezifischen Bindungswechselwirkungen
zu bestimmen.
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Unter
Einsatz der Erfindung können
ebenfalls Kraft-Bindungs-Kurven für eine weite Reihe von Analytspezies
entwickelt werden.
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Die
Verwendung von magnetisch aktiven Perlen in einem Test ermöglicht die
Unterscheidung der Aktivität
der einzelnen Perlen.
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Die
Verwendung von magnetisch aktiven Perlen in einem Test ermöglicht ebenfalls
die Auswirkungen der komplexen magnetischen Wechselwirkungen zwischen
Clustern von Perlen, die isoliert werden sollen.
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Außerdem können durch
die Verwendung von magnetisch aktiven Perlen in einem Test die Auswirkungen
von Zeit und Temperatur auf die Gesamtheit der Perlen, die an ein
Substrat gebunden sind, d.h. der Boltzmann-Effekt, berücksichtigt
werden.
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Diese
und zusätzliche
Ziele der Erfindung werden durch die im Folgenden beschriebenen
Strukturen und Verfahren erreicht.
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Sensor für eine ausgewählte Zielspezies,
die Folgendes umfasst:
- (a) ein Substrat, das
durch das Binden von Substratmodifikatoren chemisch modifiziert
wurde;
- (b) eine oder mehrere magnetisch aktive Perlen, die durch die
Bindung von Perlenmodifikatoren chemisch modifiziert wurden, wobei
diese Perlenmodifikatoren in Gegenwart der Zielspezies eine Bindungsaffinität für die Substratmodifikatoren
und in Abwesenheit der Zielspezies eine messbar andere Bindungsaffinität für die Substratmodifikatoren
aufweisen;
- (c) eine einstellbare Magnetfeldquelle zur Ausübung einer
Kraft auf die Perlen, die von dem Substrat weg gerichtet ist; und
- (d) ein Bildgebungssystem zur Beobachtung und Zählung der
an das Substrat gebundenen Perlen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Erfindung außerdem
ein System zur Identifizierung von Clustern von Perlen und zur Beseitigung
der Auswirkungen solcher Cluster in den Messungen in Bezug auf den
Zielanalyt.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren für den Nachweis
der Gegenwart ausgewählter Zielspezies,
welches folgende Schritte umfasst:
- (a) das
Modifizieren eines Substrats durch das Binden eines Substratmodifikators;
- (b) das Modifizieren einer oder mehrerer magnetisch aktiver
Perlen durch das Binden von Perlenmodifikatoren, wobei diese Perlenmodifikatoren
in Gegenwart einer Zielspezies eine Bindungsaffinität für die Substratmodifikatoren
und eine messbar andere Bindungsaffinität für die Substratmodifikatoren
in Abwesenheit der Zielspezies aufweisen;
- (c) das Anordnen der Perlen und/oder des Substrats in einer
Lösung,
von der vermutet wird, dass sie die Zielsubstanz enthält;
- (d) das Ermöglichen
von Wechselwirkungen der Perlen mit dem Substrat, wobei die Wechselwirkungen spezifische
und nicht spezifische Bindungen umfassen können;
- (e) das Anlegen eines einheitlichen Magnetfelds auf den Probebereich,
vorzugsweise normal zum Substrat, um die Perlen vom Substrat wegzuziehen;
und
- (f) die Beobachtung der einzelnen Perlen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst dieses Verfahren auch die Schritte des Zählens der Perlen, von denen
beobachtet wurde, dass sie nach, und vorzugsweise auch vor, dem
Zuführen
der Lösung, von
der vermutet wird, dass sie den Zielanalyten enthält, an das
Substrat gebunden waren.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Bestimmung der Stärke
der Wechselwirkung zwischen einer Zielspezies und einer Spezies,
die mit dieser Zielspezies eine spezifische Bindungswechselwirkung
eingeht, umfassend folgende Schritte:
- (a) das
Modifizieren eines Substrats durch Binden eines Substratmodifikators;
- (b) das Modifizieren einer oder mehrerer magnetisch aktiver
Perlen durch Binden von Perlenmodifikatoren, wobei diese Perlenmodifikatoren
eine Bindungsaffinität
für die
Substratmodifikatoren in Gegenwart der Zielspezies und eine messbar
andere Bindungsaffinität
für die
Substratmodifikatoren in Abwesenheit der Zielspezies aufweisen;
- (c) das Anordnen der Perlen und des Substrats in einer Lösung, die
das Zielmolekül
enthält;
- (d) das Ermöglichen
von Wechselwirkungen der Perlen mit dem Substrat;
- (e) das Anlegen eines einheitlichen Magnetfelds auf den Probebereich,
vorzugsweise normal zum Substrat, um die Perlen vom Substrat wegzuziehen;
- (f) das Variieren der Stärke
des Magnetfelds, bis sich Perlen vom Substrat trennen; und
- (g) die Beobachtung der einzelnen Perlen.
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Vorzugsweise
wird die einstellbare Magnetfeldquelle so angepasst, dass sie ein
Feld auf eine oder mehrere magnetisch aktive Perlen anlegt, welches
normal zum Substrat ist. Dann kann die einstellbare Magnetfeldquelle
einen Magnet umfassen, der zur Erzeugung eines axial symmetrischen
Feldgradienten, gewöhnlicherweise
eines vorbestimmten Feldgradienten, dient.
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Die
einstellbare Magnetfeldquelle kann so angepasst werden, dass sie
ein Feld auf eine oder mehrere magnetisch aktive Perlen anlegt,
welches kein Drehmoment auf die Perlen ausübt und worin die Perlen eine Perlendichte
unterhalb eines vorbestimmten Perlendichtegrenzwerts aufweisen,
der zur Aggregation der Perlen führen
würde.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die
Erfindung kann anhand der folgenden Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
und der begleitenden Zeichnungen umfassender verstanden werden,
wobei in den Zeichnungen dieselben Zahlen auch in verschiedenen
Abbildungen dieselben Strukturen oder Elemente darstellen, wobei:
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1 eine
Darstellung von paramagnetischen Perlen in einem einheitlichen Magnetfeld,
auf einem Substrat angeordnet, ist,
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2 eine
schematische Darstellung einer an ein Substrat gebundenen Perle
ist, die die bedeutenden Kräfte
zeigt, die auf die Perle wirken (verwendet mit Erlaubnis von K.-C.
Chang et al., Langmuir 12, 2271–2282, Copyright
American Chemical Society (1996)),
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3 die
Winkelabhängigkeit
der Zug- und Normalkräfte
auf die Perlen darstellt,
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4 eine
schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer Sandwich-Test-Anordnung
ist, die eine Vielzahl von Perlen verwendet,
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5 eine
Kurve der hypothetischen Kraft in Abhängigkeit von der Perlenablösung ist,
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6 das
durch einen oder zwei NdFeB-Magneten erzeugte Magnetfeld in Abhängigkeit
vom Abstand zeigt,
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7 das
durch einen NdFeB-Magneten mit verschiedenen Feldfokussierungskegeln
erzeugte Magnetfeld in Abhängigkeit
vom Abstand zeigt,
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8 die
Ergebnisse eines kompetitiven Biotin-Tests zeigt,
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9 die
Ergebnisse eines direkten Tests in Bezug auf Ovalbumin zeigt.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegende Erfindung beruht darauf, dass die Kraft bestimmt wird,
die erforderlich ist, um markierte Perlen von einem Substrat zu
trennen. Um eine hohe Empfindlichkeit und beständige Ergebnisse sicherzustellen,
ist es wünschenswert,
die Kräfte,
die auf die Perlen wirken, einfach (d.h. einfach analysiert) und
einheitlich (d.h. im Wesentlichen für alle Perlen gleich und von
Durchlauf zu Durchlauf reproduzierbar) zu halten.
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Ein
Aspekt davon ist, dass die Kraft im Probebereich in einem einheitlichen
Winkel, vorzugsweise 90°, zum
Substrat auf die Perlen wirkt. Eine Kraft, die in einem Winkel von
90° zum
Substrat auf die Perle angelegt wird, wird direkt auf den Kontaktpunkt
der Perle mit der Oberfläche
transduziert. Die Wirkung von Tangentialkräften kann durch das Ausführen eines
Kraftausgleichs auf einem sphärischen
Teilchen, das an die Oberfläche
gebunden ist, an einem einzelnen Punkt bestimmt werden (2).
K.-C. Chang et al.
haben in "Influence of
Direction and Type of Applied Force on the Detachment of Macromolecularly-Bound
Particles from Surfaces",
Langmuir 12 (9), 2271–82
(1982), die Wirkung von Tangentialkräften auf ein solches System
analysiert. Die Zugkraft T, die auf eine spezifische molekulare
Wechselwirkung durch eine Tangentialkraft Ft angelegt wird, ist
die Kraftkomponente, die in die Richtung der spezifischen molekularen
Wechselwirkung ausgerichtet ist. Ft = TcosΦ
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Die
Neigung der Perle, Φ,
wird durch die Geometrie des Systems
bestimmt, worin L die Länge des
spezifischen molekularen Wechselwirkungskomplexes ist, h die Oberflächenrauigkeit
der Perle ist und a der Perlenradius ist. Angesichts der Eigenschaften
einer typischen Perle (a = 1.250 nm und h = 5 nm) und eines typischen
Komplexes (L = 10 nm) wird die Wirkung der Tangentialkraft auf eine spezifische
molekulare Wechselwirkung etwa um den Faktor 11 verstärkt. Die
Winkelabhängigkeit
der Zug- und der Normalkräfte,
3,
zeigt die dramatische Wirkung von kleinen Variationen in Bezug auf
die Ausrichtung der Kraft. Dementsprechend ist es ein bevorzugtes
Merkmal der Erfindung, die externe Kraft normal und ohne Drehmoment
auf die Perlen anzulegen.
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Unter
Bezugnahme auf 4, welche eine Sandwich-Test-Anordnung
für die
vorliegende Erfindung zeigt, werden eine oder mehrere Perlen 10 und
ein Substrat 12 in einer Lösung angeordnet. Die Perle 10 wird durch
Moleküle
modifiziert, die hierin als Perlenmodifikatoren 22 bezeichnet
werden, und das Substrat 12 wird durch Moleküle modifiziert,
die hierin als Substratmodifikatoren 23 bezeichnet werden.
Diese beiden Modifikatortypen sind aus jenen Molekülen ausgewählt, die
andere Moleküle
erkennen und selektiv binden können, wie
z.B. Antikörper,
Haptene, Polynucleinsäuren,
Polypeptide, Glykolipide, Hormone, Polymere, Metallionen und bestimmte
niedermolekulare organische Spezies.
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Der
Mechanismus zur Anlegung eines variablen, normalen Felds auf eine
Perle 10 wird hier als ein beweglicher Ringmagnet 24 dargestellt.
Der Ringmagnet erzeugt ein einheitliches B →-Feld, das entlang seiner Achse über Bereiche
in Millimetergröße ausgerichtet
ist. Es wurde festgestellt, dass ein NdFeB-Magnet in Millimeter-Größe ein einheitliches
Feld über
Probebereiche hinweg anlegen kann, das mit der Bildgebung durch ein
Lichtmikroskop übereinstimmt,
wenn der Magnet sorgfältig
zentriert ist. Dieses normale B-Feld wirkt auf die Perle 10,
um eine Normalkraft (F), die auf die Perle 10 wirkt, hervorzurufen,
die dann wiederum Spannung auf die Bindung 14 zwischen
der Perle 10 und dem Substrat 12 ausübt. Da kovalente
Bindungen typischerweise viel stärker
sind als spezifische molekulare Wechselwirkungen (wie z.B. Antikörper-Hapten-Wechselwirkungen),
wird die Stärke
der Bindung 14 zwischen der Perle 10 und dem Substrat 12 durch
die Stärke
dieser spezifischen molekularen Wechselwirkung beschränkt.
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Zusätzlich zu
Ringmagneten können
andere Magnetgeometrien, wie z.B. Scheiben, Stäbe oder flache Formen, eingesetzt
werden, solange das B-Feld in dem beobachteten Bereich die erwünschten
Eigenschaften aufweist. Fokussierkegel mit hoher Permeabilität können zwischen
dem Magneten und dem Substrat so angeordnet werden, dass sie das
Feld so formen, dass das Feld einen höheren Gradienten aufweist.
Da die Kraft, die auf eine paramagnetische Perle wirkt, mit dem
Feldgradienten zusammenhängt
(siehe unten), neigt die Verwendung von solchen Kegeln dazu, die
Kräfte,
die auf die Perlen wirken, zu verstärken.
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Da
die Feldintensität
variiert, wird schlussendlich ein Punkt erreicht, an dem sich die
Perle von dem Substrat trennt, wodurch angezeigt wird, dass die
Kraft des Feldes die Stärke
der nicht spezifischen oder spezifischen molekularen Wechselwirkung übersteigt.
Indem man beobachtet, wann die Perlen sich von dem Substrat trennen,
kann man beobachten, wann dieser Punkt erreicht wird. Es sollte
berücksichtigt
werden, dass der Erfinder beobachtet hat, dass dieser Trennungspunkt
nicht nur von der auf die Bindung zwischen der Perle und dem Substrat
angewandten Kraft abhängt,
sondern auch von dem Beobachtungszeitraum und der Systemtemperatur,
wie untenstehend erläutert
wird.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung umfasst außerdem
ein Mikroskop, typischerweise ein Lichtmikroskop 26, um
die an das Substrat gebundenen und die von dem Substrat getrennten
Perlen darzustellen. Vorzugsweise ist das Mikroskop 26 durch
Verbindungselektronik (oft eine Videokamera umfassend) 27 mit
einem Computer 28 oder einem Videorekorder zur Analyse
der Bilder des Mikroskops ver bunden. Der Vorteil eines Ringmagneten 24 liegt
darin, dass er das Durchlicht in einem Lichtmikroskop nicht beeinflusst.
Jedoch ist es durch die Verwendung eines Reflexionsmikroskops auch
der Einsatz von massiven Magnetgeometrien möglich.
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Vorzugsweise
wird in der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl von modifizierten
Perlen anstatt einer einzelnen modifizierten Perle verwendet. Durch
die große
Zahl der Perlen wird der gesamte Sensorbereich gleichzeitig zum
Probebereich, wodurch Diffusionsbeschränkungen der Empfindlichkeit
des Detektors überwunden
werden können.
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Für diese
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist es wichtig, in der Lage zu sein, einzelne Perlen
(im Unterschied zu Aggregaten) zu identifizieren, die Perlen schnell
und verlässlich
zu zählen
und ihre relative Position auf dem Substrat zu bestimmen. Diese
Positionsinformation ist aus mehreren Gründen vorteilhaft. Bei manchen
Anwendungen kann es beispielsweise vorteilhaft sein, den Substraten
durch das Binden verschiedener Typen von Substratmodifikatoren an
verschiedene Bereiche des Substrats ein Muster zu verleihen. Es
ist bei solchen Anwendungen vorteilhaft, zu identifizieren, wo auf
einem Substrat eine bestimmte Perle gebunden ist. Dementsprechend
sollte das Bildgebungssystem für
die vorliegende Erfindung, umfassend das Mikroskop 26,
den Computer 28 und die Verbindungselektronik 27,
in der Lage sein, die Perlen, die sich von dem Substrat getrennt
haben (oder alternativ dazu die Perlen, die sich nicht von dem Substrat
getrennt haben) zu zählen.
Typischerweise bedeutet das, dass ein digitales Bild ausgehend von
dem Mikroskop (entweder unter direkter Verwendung eines Framegrabbers
oder indirekter Verwendung eines Videorekorders) erstellt wird und
dieses unter Einsatz von Analysealgorithmen auf dem Computer 28 analysiert
wird.
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Zusätzlich dazu
wird vorzugsweise ein Linearmesstisch 40 zum Einspannen
des Substrats verwendet, damit das Mikroskop verschiedene Bereiche
auf dem Substrat reproduzierbar abbilden kann. Außerdem wird vorzugsweise
ein Mikroskop verwendet, dass über
eine Fluoreszenznachweisfähigkeit
verfügt.
Wenn ein Linearmesstisch 40, ein Mikroskop mit Fluoreszenznachweisfähigkeit
und ein Substrat mit verschie denen Substratmodifikatortypen auf
verschiedenen Bereichen des Substrats eingesetzt werden, kann eine
Vorrichtung eingesetzt werden, um eine Vielzahl von verschiedenen
Zielmolekülen
mit großer
Leichtigkeit nachzuweisen (Multiplexing).
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Zusätzlich dazu
ist das Bildgebungssystem für
die vorliegende Erfindung vorzugsweise in der Lage, einzelne Perlen
auf dem Substrat und Cluster von zwei oder mehreren Perlen auf dem
Substrat, basierend auf deren Größen, zu
unterscheiden. Es wurde festgestellt, dass nicht einheitliche Oberflächenchemie
und Magnetfelder der durch Rohr gelehrten Strukturen das folgende,
nicht ideale Verhalten herbeiführen.
Brownsche Bewegung verursacht, dass sich die Perlen auf der Oberfläche bewegen.
Diese Bewegung führt
dazu, dass ein großer
Anteil der Perlen Dimere und Aggregate bildet, wenn die Perlen "klebrig" sind (d.h. dazu
neigen, beieinander zu bleiben, wenn sie einmal zusammengebracht
wurden). Vielkörperwechselwirkungen
in diesen Aggregaten führen
zu einer erhöhten
Magnetisierung der Cluster, wenn das B →-Feld angelegt wird, wodurch
deren Verdrängung
stark beschleunigt wird. Die Bildanalyse ermöglicht es, das Maß der Aggregation
zu bestimmten und deren Auswirkungen zu korrigieren. Es sollte berücksichtigt
werden, dass der Anteil der Perlen als Monomere und Aggregate stark
mit der Menge des Analyts auf der Oberfläche und den nicht spezifischen
Hafteigenschaften der Oberflächen
zusammenhängt;
deshalb kann Aggregation auch eingesetzt werden, um die Analytkonzentration
und die Oberflächeneigenschaften
unabhängig
voneinander zu bestimmen.
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Außerdem haftet
unter allen, außer
den idealsten, Umständen
ein Teil (2–20
%) der Perlen nicht spezifisch an der Oberfläche, auch unter Einwirkung
von starken Kräften
(> 2 pN). Es wurde
beobachtet, dass diese Perlen andere Perlen einfangen, die sich
seitlich in der Lösung
bewegen, und somit strangähnliche
Aggregate bilden. Die Bildanalyse ermöglicht es, diese Aggregate
zu identifizieren und sie nicht in Betracht zu ziehen. Nachweistechniken,
die integrierte Signale messen, können diese Perlen nicht von
spezifisch gebundenen Perlen unterscheiden.
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Nicht
spezifische Haftung zwischen den Perlen und zwischen den Perlen
und dem Substrat scheint anzusteigen, wenn die Perlen mit Proteinen
beladen werden, was darauf hindeutet, dass Protein-Protein-Wechselwirkungen
die Hauptquelle für
diese Haftung sind.
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Es
wurde entdeckt, dass ein handelsübliches
Mikroskop (Axiovert-100-Mikroskop mit einem 63x-Acroplan-Objektiv,
Carl Zeiss, One Zeiss Dr., Thornwood, NY 10594), Elektronik (Schwarz/Weiß-Videosystem VE-1000
CCD72 von DAGE-MTI, Michigan City, IN; PCI-Framegrabber DT 3152
Fidelity, Data Translation, 100 Locke Dr., Marlboro, MA 01752-1192),
Bildanalysesoftware (Image-Pro Version 2.0, Media Cybernetics, 8484 Georgia
Ave., Silver Spring, MD 20910) und Computer (Pentium-66-MHz-Computer mit 1-GB-Festplatte)
die superparamagnetischen Perlen mit einem Durchmesser von 2,6 μm und durch
diese gebildete Cluster verlässlich
identifiziert. Sobald die Cluster identifiziert wurden, können sie
ignoriert werden, d.h. nicht in die weitere Analyse einbezogen werden.
Wenn also die Position der Perlen überwacht wird (d.h. überwacht
wird, ob die Perlen an das Substrat gebunden sind oder nicht), werden
nur einzelne Perlen analysiert, wodurch die Genauigkeit des Detektors
deutlich verbessert wird.
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Außerdem wurde
festgestellt, dass die durch ein solches Mikroskop dargestellten
Perlen in Bezug auf Bewegung überwacht
werden können
und dass sich nicht gebundene Perlen in einem Zeitraum von wenigen Sekunden
bewegen, wodurch es möglich
ist, diese Perlen als nicht gebunden zu identifizieren und sie somit auch
nicht in die weitere Analyse einzubeziehen.
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Die
Stärke
der Haftkraft zwischen den Perlen und der Oberfläche wird durch einige Faktoren
bestimmt, d.h. durch die Stärke
der nicht spezifischen Kräfte,
die Zahl der spezifischen molekularen Wechselwirkungen, durch die
die Perle an die Oberfläche
gebunden ist, und die Art, wie diese Wechselwirkungen belastet werden.
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Es
wurden oberflächenmodifizierende
chemische Zusammensetzungen (untenstehend beschrieben) entwickelt,
die beständig
bei einem Großteil
der Perlen sehr ge ringe nicht spezifische Haftkräfte hervorrufen. Typischerweise
können
80–98
% der Perlen unter Einsatz einer Kraft, die ihrem Gewicht in Wasser
entspricht, d.h. ≈40
Femtonewton (fN) im Fall von M280-Perlen von Dynal, von einer Oberfläche entfernt
werden. Die Anzahl der spezifischen molekularen Wechselwirkungen,
die eine Perle an die Oberfläche
binden, hängen
von der Dichte und der Flexibilität der Liganden und Rezeptoren
an der Perle und der Oberfläche
ab.
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Unter
Verwendung von Hertzscher Kontaktmechanik können die Erfinder die Kontaktfläche einer 2,6-μm-Kugel unter
einer Last von 40 pN unter der Annahme, dass der Elastizitätsmodul
der Materialien 1010 Pa beträgt, abschätzen (K.
L. Johnson, Contact Mechanics, Cambridge University Press, NY, NY
(1985)). Der berechnete Kontaktradius beträgt 0,15 nm, was deutlich geringer
ist als die Größe eines
typischen Liganden oder Rezeptors, weshalb eine einzelne intermolekulare
Wechselwirkung am wahrscheinlichsten ist. Die Tatsache, dass die
Liganden und Rezeptoren durch Polymerlinker an die Oberflächen gebunden
sind, könnte
jedoch das Auftreten multipler intermolekularer Wechselwirkungen
ermöglichen.
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Es
wurde tatsächlich
festgestellt, dass, wenn nicht Schritte zur Abschwächung unternommen
werden, typischerweise, trotz der kleinen Kontaktfläche zwischen
einer flachen Oberfläche
und, z.B., einer Kugel mit 2,6 μm
Durchmesser, mehr als eine spezifische Bindung zwischen einer Perle
und dem Substrat entsteht. Diese Entdeckung basiert auf der Beobachtung,
dass typische Antikörper-funktionalisierte
Kugeln mit einer Kraft von deutlich mehr als 200 pN an einer Antigen-beschichteten
Oberfläche
haften. Man würde
erwarten, dass diese Perlen mit Kräften von weniger als etwa 200
pN an der Oberfläche
haften, wenn sie mit einer einzelnen Antikörper-Antigen-Bindung gebunden
wären,
in Anbetracht der Tatsache, dass eine Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung (eine
der stärksten
in der Natur) nur eine Bindungsstärke von etwa 250 pN aufweist.
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Um
diese Auswirkungen zu mildern, minimieren Fachleute auf dem Gebiet
der Erfindung die Rauigkeit der wechselwirkenden Oberflächen. Insbesondere
ist die Rautiefe des Substrats vorzugsweise ≤ etwa 30 nm. Zusätzlich zu
der Rauigkeit der wechselwirkenden Oberflächen gehören folgende andere Faktoren
zu jenen, die von Fachleuten als solche identifiziert werden, die
die Zahl der molekularen Wechselwirkungen zwischen einer Perle und
einem Substrat beeinflussen können:
(a) die Oberflächendichte
der Antikörper
und Antigene auf diesen Perlen und Substraten, (b) die mechanischen
Eigenschaften der Perlen und Substrate und (c) die sterische Mobilität (Flexibilität) des Polymers,
das eingesetzt wird, um die Antikörper und Antigene an die Oberfläche zu binden.
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Es
wurde festgestellt, dass eine Bindung zwischen einer Perle und einem
Substrat, die spezifische Bindungswechselwirkungen, wie z.B. eine
Antikörper/Hapten-Wechselwirkung, umfasst,
eine Lebensdauer aufweist, die durch die Boltzmannsche Wahrscheinlichkeitskurve
beschrieben werden kann (G.U. Lee et al., Langmuir 10, 354–357 (1994)).
Es wurde entdeckt, dass diese Lebensdauer durch folgende Gleichung
beschrieben werden kann: τ = τ0e–(E–Fxd)/kT worin τ = die Lebensdauer
einer Bindung ist, τ0 = eine Konstante in Zusammenhang mit der
Bindung ist, F = die angewandte Kraft ist, E = die Bindungsenergie
ist, d = der Abstand in Zusammenhang mit der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung
ist und kT = Wärmeenergie
ist. Die Verknüpfung
von Wechselwirkungskraft und dem Zeitraum, in dem die Bindung belastet
wird, hat bedeutende Auswirkungen auf das Verhalten der Perlen bei angewandter
Kraft. In kürzeren
Zeitrahmen erscheint die Bindungsstärke der intermolekularen Wechselwirkung
beispielsweise stärker.
Wenn die Belastungsrate zu gering ist, kann es unmöglich sein,
eine spezifische Bruchkraft von einer nicht spezifischen Kraft zu
unterscheiden.
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Zusätzlich zu
Sandwich-Test-Ausführungsformen
kann die Erfindung auch in anderen Immuntest-Anordnungen praktisch
umgesetzt werden, z.B. Ausführungsformen
in Form eines kompetitiven Tests oder eines Verdrängungstests.
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Bei
einem erfindungsgemäßen kompetitiven
Test wird das Substrat durch das Zielmolekül, oder einen Teil davon, modifiziert,
und die Perlen werden mit einem Molekül modifiziert, das sich spezifisch
an das Zielmolekül
binden kann. Freie Zielmoleküle
konkurrieren mit den an das Substrat gebundenen Zielmolekülen um Bindungstellen
an den Perlen. Wenn eine Perle vollständig durch die Analyt-Zielmolekülen komplexiert
ist, so dass keine freien Bindungstellen für die Bindung an das Substrat
mehr zur Verfügung
stehen, binden sich die Perlen nicht spezifisch an das Substrat.
In dieser Ausführungsform
der Erfindung kann es vorteilhaft sein, die Zahl der Bindungsstellen
an den Perlen zu beschränken.
Noch bevorzugter weisen die Perlen nur eine geringe Zahl von Bindungsstellen
(z.B. ≤ 10)
auf. So reicht eine kleine Anzahl von freien Zielmolekülen, die
mit der Perle in Wechselwirkung treten, aus, um zu verhindern, dass
die Perle mit dem Substrat einen Komplex bildet.
-
Bei
einem erfindungsgemäßen Verdrängungstest
wird das Substrat mit einem Molekül modifiziert, das sich spezifisch
an das Zielmolekül
binden kann, und die Perlen werden mit dem Zielmolekül, oder
einem Teil davon, modifiziert. Wenn die Perlen mit dem Substrat
einen Komplex bilden und die Zielmoleküle in die Lösung eingebracht werden, besteht
eine gewisse Wahrscheinlichkeit, dass ein Zielmolekül eine gebundene
Perle auf dem Substrat verdrängt,
wodurch diese Perle freigesetzt wird und sich von dem Substrat im
angelegten Feld trennen kann. Alternativ dazu kann der Analyt mit
den modifizierten Perlen vorgemischt werden, und die Perlen und
der Analyt können
gemeinsam zu dem Substrat zugesetzt werden.
-
Typischerweise
ist es vorteilhaft, nicht spezifische Adsorption durch das Beschichten
des Substrats mit einem Wirkstoff, der nicht spezifische Haftung
minimiert, zu beschränken.
Es wurde festgestellt, dass herkömmlich
verwendete Blocker, wie z.B. Rinderserum-Albumin (BSA), für die vorliegende
Erfindung weniger zweckdienlich sind, da die physikalisch adsorbierten
BSA-Moleküle
nicht kovalent an die Oberfläche
gebunden sind, durch Moleküle
mit stärkeren
Bindungsaffinitäten
für das
Substrat verdrängt
werden können
und unter bestimmten Bedingungen als Brückenbildner fungieren können. Um
die Vorteile einer beschränkten
nicht spezifischen Adsorption nutzen zu können, sollte ein anderes Verfahren
eingesetzt werden.
-
Es
wurde herausgefunden, dass bestimmte chemisch absorbierte Polymere,
wie z.B. Polyethylenglykol (PEG), die nicht spezifischen Teilchen-Substrat-Haftkräfte durch
die Erzeugung von starken Abstoßungskräften reduziert.
Der Ursprung der Abstoßungskraft
ist weiterhin ein Thema in der wissenschaftlichen Debatte, aber
man nimmt an, dass sie von der ungünstigen entropischen Energie
herrührt,
die erforderlich ist, um das chemisch absorbierte Polymer zu komprimieren
(J. Israelachvili, Intermolecular and Surface Forces, Academic Press,
San Diego (1992)).
-
PEG
ist ein nicht-ionisches, wasserlösliches
Polymer, das durch die Bildung eines Blockcopolymers oder durch
chemische Konjugation auf Oberflächen
aufgepfropft werden kann. Der Erfinder hat ein heterobifunktionelles
PEG, d.h. ein PEG mit zwei verschiedenen chemischen Gruppen an seinen
Enden, mit einem Molekulargewicht von etwa 3400 verwendet, um ein
Bindemittel für
den Test auf die aktive Oberfläche
aufzupfropfen. PEG wurde unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI)
auf Glas- und Kunststoffoberflächen aufgepfropft.
PEI ist ein wasserlösliches,
handelsübliches
Polymer mit einer hohen Dichte von primären und sekundären Aminen.
Es kann mit einem hohen Maß an
Spezifizität
und Effizienz einfach unter Verwendung von Vernetzern, wie z.B.
N-Hydroxysuccinimid, modifiziert werden. Diese Chemie basiert auf
der Arbeit zur Modifikation von Oberflächen zur Minimierung von Proteinadsorption
(Brink et al., Solid surface coated with a hydrophilic biopolymer-repellent
outer layer and method for making such a surface, US-Patent 5.240.994).
-
Arbeitsvorschrift
zur PEG-Oberflächenmodifikation:
- 1. Die Oberfläche wurde unter Verwendung
einer geeigneten Technik, die den Fachleuten auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt ist, gereinigt. Kunststoffoberflächen, die
relativ rein waren, wurden beispielsweise in einem 70:30-Ethanol:Wasser-Gemisch
beschallt.
- 2. Die Polymeroberflächen
wurden unter Verwendung von 4 % KMnO4 in
konzentrierter Schwefelsäure
oxidiert.
- 3. Die Oberflächen
wurden einer 3%igen PEI-(Polymm SNA, BASF, Mount Olive, NJ)Lösung in
50 millimolarem (mM) Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 8,2 zwei
Stunden lang ausgesetzt und zumindest drei Mal mit Wasser gewaschen.
- 4. 10-mg/ml-Lösungen
aus NHS-PEG-Biotin, heterobifunktionellem PEG oder SPA-PEG (Shearwater Polymers,
2304 Spring Branch Road, Huntsville, AL) in Carbonatpufferlösung mit
einem pH-Wert von 8,2 wurden mit den Oberflächen zumindest 12 h lang inkubiert.
- 5. Die Oberflächen
wurden mit Phosphatpuffersalzlösung
(PBS, 100 mM Natriumchlorid, 50 mM Phosphat) gewaschen, und der
Test wurde durchgeführt.
-
Zusätzlich zu
der Verwendung als Test kann die erfindungsgemäße Vorrichtung auch verwendet
werden, um die Stärke
der spezifischen Bindungswechselwirkungen zu bestimmen, d.h. die
Natur der Wechselwirkung zwischen einer Zielspezies und einer Spezies,
die mit dieser Zielspezies in eine spezifische Bindungswechselwirkung
tritt, zu bestimmen. Das Substrat kann beispielsweise mit Substratmodifikatoren
modifiziert werden, die aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Polynucleinsäuren, Polypeptiden,
Glykolipiden, Hormonen, Polymeren, Metallionen, Chelatbildnern und
Hormonen ausgewählt
sind, und eine oder mehrere magnetisch aktive Perlen können durch
das Binden von Perlenmodifikatoren modifiziert werden, die aus der
Gruppe bestehend aus Antikörpern,
Polynucleinsäuren,
Polypeptiden, Glykolipiden, Hormonen, Polymeren, Metallionen, Chelatbildnern
und Hormonen ausgewählt
sind, wobei diese Perlenmodifikatoren in Gegenwart der Zielspezies
eine Bindungsaffinität
für die
Substratmodifikatoren und in Abwesenheit der Zielspezies eine messbar
andere Bindungsaffinität
für die
Substratmodifikatoren aufweisen. Die Perlen oder Oberflächen werden
dann in eine Lösung,
die das Zielmolekül
enthält,
getaucht.
-
Die
Perlen können
dann mit dem Substrat in Wechselwirkung treten. Diese Wechselwirkungen
umfassen typischerweise spezifische und nicht spezifische Wechselwirkungen.
Ein Magnetfeld wird an die Perlen angelegt, vorzugsweise normal
zum Substrat, um die Perlen von dem Substrat wegzuziehen. Die Stärke dieses
Felds ist typischerweise zu Beginn zunächst gering und wird dann schrittweise
gesteigert, bis sich die Perlen, oder ein vorbestimmter Anteil der
Perlen, von dem Substrat trennen.
-
5 zeigt
eine Kurve der hypothetischen Kraft in Abhängigkeit von der Perlenablösung bei
einer optimalen Zeit und Temperatur. Anhand von 5 erkennt
man, dass die Trennung der Perlen von dem Substrat in etwa zwei
Phasen erfolgt: Eine erste Phase bei einem schwächeren Feld, die der Ablösung aller
nicht spezifisch gebundenen Perlen entspricht, und eine zweite Phase,
die der Ablösung
der spezifisch gebundenen Perlen entspricht. Die zweite Phase tritt
bei einem stärkeren
Feld ein als die erste Phase und hängt in höchstem Maße von der Rate ab, mit der
die Kraft an die Perlen angelegt wird. Durch das Variieren der Rate,
mit der die Kräfte
an die Perlen angelegt werden, ist es möglich, die drei kritischen
Parameter zu messen, die erforderlich sind, um die spezifische molekulare
Interaktion zu charakterisieren, τ0, E und d. Selbstverständlich kann die Ablösungskurve,
wenn die Perlen-Substrat-Wechselwirkung
komplexer ist (d.h. wenn mehr als ein Wechselwirkungstyp vorliegt),
mehr als zwei Phasen zeigen.
-
Verschiedene
Perlentypen sind für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
-
Paramagnetische
Materialien weisen eine Nettomagnetisierung μ nur in Gegenwart eines angelegten externen
Feldes B → auf. Nicht poröse,
paramagnetische Perlen (gewöhnlicherweise
aus einem imprägnierten Polymer
hergestellt) werden in der Molekularbiologie für Magnetabscheidung eingesetzt,
da sie eine relativ geringe Dichte und keinen Restmagnetismus aufweisen.
Sie können
auch oberflächenfunktionelle
Gruppen (wie z.B. Amine oder Carboxyl) aufweisen, die eingesetzt
werden können,
um Rezeptoren (z.B. Streptavidin, Antikörper oder DNA) kovalent zu
immobilisieren. Siehe V. Lund, R. Schmid, D. Richwood, E. Hornes,
Technical Handbook of the Dynl Co. 16 (22), 10861–10880,
5 Delaware Dr., Lake Success, NY 11042 (1988). Magnetische Perlen
können
verwendet werden, um die Analyten in komplexen Gemischen durch die
Immobilisierung des Analyts auf der Perle gefolgt von der Ab scheidung
der Perlen in einem Magnetfeld zu trennen. Einige Patente und Patentanmeldungen
beschreiben die Verwendung von magnetischen Perlen für Nachweisanwendungen.
-
Die
Kraft, die auf eine kleine paramagnetische Probe in einem nicht
einheitlichen Magnetfeld wirkt, wird durch folgende Formel dargestellt:
worin μ(= χB) die Magnetisierung (d.h.
das magnetische Dipolmoment) der Probe und ∂B/∂x der Magnetfeldgradient ist.
-
Paramagnetische
Perlen sind für
diese Ausführungsform
der Erfindung wünschenswert,
da die Perlen nur dann eine Magnetisierung aufweisen, wenn ein externes
Feld angelegt wird. Deshalb neigen die Perlen nicht dazu, sich zusammenzuballen,
was möglicherweise
ihre Wechselwirkung mit der Zielspezies beeinflussen würde. Ferromagnetische
Perlen können
diese jedoch ersetzen, insbesondere, wenn bestimmte Vorkehrungen
getroffen werden.
-
Ferromagnetische
Materialien weisen eine Nettomagnetisierung μ auf, nachdem sie in einem angelegten
Magnetfeld magnetisiert wurden. Diese Magnetisierung ist permanent,
bis ein Koerzitivfeld angelegt wird oder bis das Material über seine
Curie-Temperatur
hinaus erhitzt wird. Nicht poröse,
ferromagnetische Perlen sind ebenfalls verfügbar. Wie paramagnetische Perlen
können
sie ebenfalls oberflächenfunktionelle
Gruppen aufweisen, die eingesetzt werden können, um Rezeptoren kovalent
zu immobilisieren. Siehe N. Wang, J.P. Butler, D.E. Ingber, Science
260, 1124–1127
(1993).
-
Wenn
jedoch ferromagnetische Perlen verwendet werden, sollten sie im
Allgemeinen entweder (1) oberhalb ihrer Curie-Temperatur gehalten
werden, bis man in situ bereit ist, eine Analyse durchzuführen, oder (2)
nicht in einem magnetisierenden Feld magnetisiert werden, bis man
in situ bereit ist, eine Analyse durchzuführen.
-
Handelsübliche Perlen
mit Durchmessern zwischen etwa 0,2 μm und etwa 200 μm weisen
Oberflächen
auf, die groß genug
sind, um einheitliche Beschichtungen mit hoher Qualität so aufzutragen,
dass sie den Zielen der Erfindung gerecht werden. Solche Perlen
erfahren typischerweise Kräfte
in Größenordnungen,
die ebenfalls den Zielen der Erfindung bei angemessen angelegten
Feldern entsprechen. Glücklicherweise
sind solche Perlen auch mit dem bevorzugten erfindungsgemäßen Lichtmikroskop
sichtbar. Diese Synergie zwischen den Perlen, den Feldern und dem
bevorzugten Lichtmikroskopbetrachtungsmechanismus ist besonders vorteilhaft.
-
Die
physikalischen Eigenschaften von zwei beispielhaften Typen der paramagnetischen
Perlen von Dynal sind untenstehend in einer Liste angeführt. Diese
Perlen weisen eine große,
einheitliche Größe auf,
die sich gut zum Zählen
eignet. Außerdem
ist die Gesamtkraft, die auf diese transduziert werden kann, groß. Derzeit
verkaufen jedoch etwa ein Dutzend Betriebe superparamagnetische
Perlen, die für
biologisches Abtrennen geeignet sind, wie z.B. Bang und Biomag (die
beide kleinere Perlen mit höherer
Magnetisierung herstellen). Eigenschaften
von zwei Typen von Dynal-Perlen:
- 1Die Magnetisierung
basiert auf Messungen, die im Naval Research Laboratory unter Verwendung
eines SQUID-Magnetometers durchgeführt wurden.
-
6 stellt
ein durch einen oder zwei NdFeB-Magneten erzeugtes Magnetfeld in
Abhängigkeit
vom Abstand dar. Die Magneten waren Blöcke aus gesintertem NdFeB mit
einer Größe von 1'' × 1'' × 0,5'', die entlang der kurzen Achse magnetisiert
waren (Magnet Sales & Mfg.
Co., 11248 Playa Ct., Culver City, CA). Es sollte berücksichtigt
werden, dass die Gradienten für
einen und zwei Magnete praktisch identisch sind und dass zwei Magnete
ein leicht stärkeres
Feld als ein Magnet aufweisen.
-
7 zeigt
das Magnetfeld, das durch einen NdFeB-Magneten mit verschiedenen
Feldfokussierungskegeln erzeugt wird, in Abhängigkeit vom Abstand. Es sollte
berücksichtigt
werden, dass die Gradienten für Magnete
mit Feldfokussierungskegeln bei kurzen Distanzen, insbesondere unter
10 mm, deutlich höher
sind als die Gradienten für
einen Magnet ohne Feldfokussierungskegel. Es wurde beobachtet, dass
spitzere Kegel größere Feldgradienten
erzeugen, aber auch den Bereich verkleinern, in dem im Wesentlichen
keine laterale Komponente zu dem Feld vorhanden ist. Für eine bestimmte
Vergrößerung gibt
es demnach einen maximalen Kegelwinkel, der verwendet werden kann,
ohne dass dann deutliche laterale Kräfte beobachtet werden. Größere Betrachtungsfelder
sind jedoch wünschenswert,
um höhere
Perlenzahlen bereitzustellen.
-
Für diese
Perlen gilt für
die Kraft in einem nicht einheitlichen Feld folgende Formel:
worin M die Volumenmagnetisierung
ist, die als Funktion von H in der vorhergehenden Tabelle angeführt ist, und
d der Teilchendurchmesser ist. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung
optimieren die Kraft, die auf die in den erfindungsgemäßen Sensoren
verwendeten Perlen wirkt, indem sie das Magnetfelderzeugungssystem und
das Annäherungssystem,
das das Substrat in die Nähe
des Magnetfelderzeugungssystems bringt, optimieren.
-
Nach
der Beschreibung der Erfindung werden im Folgenden Beispiele zur
Veranschaulichung bestimmter Anwendungen der Erfindung angeführt, umfassend
die beste bekannte praktische Umsetzung der Erfindung. Diese spezifischen
Beispiele sollen den Umfang der in dieser Anmeldung beschriebenen
Erfindung nicht beschränken.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1:
-
Nachweis von
Biotin in einem kompetitiven Test
-
Das
FDA-Verfahren wurde erstmals anhand des Modell-Ligand-Rezeptor-Systems
Streptavidin und Biotin demonstriert. Streptavidin ist ein Protein
mit vier Rezeptorstellen für
Biotin, die sich in zwei Gruppen an den einander gegenüberliegenden
Seiten des Moleküls
befinden. Die Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung wurde ausgewählt, da
sie zu den stärksten
Wechselwirkungen zählt,
die in der Natur vorkommen, d.h. k = 1015 M–1 (M.B.
Savage, Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, Pierce Chemical Co.
(1992)).
-
Biotin
wurde in der Form von biotinyliertem Rinderserum-Albumin (BBSA)
nachgewiesen, d.h. Rinderserum-Albumin, an das ~8 Biotinmoleküle kovalent
durch primäre
Amine gebunden sind. BBSA wurde eher als Biotin eingesetzt, da es
die nicht spezifische Haftung der Perlen an der Oberfläche minimiert.
Variierende Konzentrationen von BBSA wurden mit separaten, aliquoten
Teilen von Streptavidin-funktionalisierten, superparamagnetischen
Perlen (Dynal, Lake Success, NY) inkubiert, die Perlen wurden mit
separaten Biotin-PEG-Mikroskopobjektträgern inkubiert, und eine Kraft
wurde auf die Perlen ausgeübt,
während
ihre relative Position in einem videoverstärkten Lichtmikroskop (wie oben
beschrieben) beobachtet wurde.
-
Bei
einer kritischen Kraft überstieg
die Kraft, die die Perlen von der Oberfläche wegzieht, die nicht spezifische
Haftung und Gravitationskräfte,
und die Perlen, die nicht spezifisch adsorbiert waren, wurden von
der Oberfläche
abgehoben. Die Zahl der Perlen, die spezifisch an der Oberfläche hafteten,
wurde mit dem Videomikroskop gemessen, und die Ergebnisse des Tests
wurden als Anteil der gebundenen Teilchen in 8 dargestellt.
-
Die
Empfindlichkeitsgrenze des Tests beträgt 10 ng/ml BBSA. Diese Empfindlichkeitsgrenze
besteht aufgrund der großen
Oberfläche
und der Streptavidinaktivität
der handelsüblichen
Perlen. Eine totale theoretische Abdeckung der Perlen wird bei 350
ng/ml BBSA erreicht.
-
Das
Verfahren für
den Biotin-Test wird detailliert untenstehend ausgeführt.
- 1. Herstellung der Perlen: 0,15 ml Streptavidin-funktionalisierte
Perlen (M-280, Dynal, Lake Success, NY) wurde drei Mal mit PBS und
0,1%igem Rinderserum-Albumin (BSA) (gemeinsam PBS-BSA) gewaschen und über Nacht
in PBS-BSA inkubiert. Die Perlen wurden von der PBS-BSA-Lösung getrennt
und erneut in 0,4 ml PBS suspendiert. 0,05 ml der Lösung (0,1875
mg Perlen) wurden in 0,4 ml BBSA verschiedener Konzentration in
PBS 2 h lang inkubiert.
- 2. Herstellung der Testzellen: Glasmikroskopobjektträger wurden
mit PEG-Biotin unter Einsatz eines ähnlichen Verfahrens wie dem
oben beschriebenen funktionalisiert, jedoch wurde Silan statt PEI
verwendet, um das Glas mit primären
Aminen zu funktionalisieren (Silanisierung ist eine den Fachleuten
auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Technik und detailliert in
L. A. Chrisey et al., Covalent Attachment of Synthetic DNA to Self-Assembled
Monolayer Films",
Nucleic Acids Research 24, 3031–3039
(1996), beschrieben). Dann wurde ein Kunststoffring mit optischem
Epoxy (Norland Products Inc., New Brunswick, NJ) an den Glasobjektträger geklebt
und mit UV-Licht gehärtet.
Die Oberfläche
wurde mit 0,2 ml PBS-BSA zumindest 1 h lang blockiert und dann mit
PBS abgespült.
- 3. Test: 0,15 ml der Perlen wurden zu den Zellen zugesetzt und
30 min lang inkubiert. Die Zelle wurde dann unter dem Mikroskop
betrachtet, und die Anzahl der Per len in einem Bereich wurden unter
Verwendung der CCD-Kamera, des digitalen Framegrabbers und der oben
beschriebenen Software gezählt.
Die Anzahl der an die Oberfläche
gebundenen Perlen wurde durch das Senken eines ringförmigen Magneten
auf eine vorbestimmte Höhe
oberhalb der Zellen (wie oben beschrieben) und das Zählen der
Anzahl der Perlen bestimmt. Alternativ dazu kann die Kraft und/oder
die Zeit, die erforderlich ist, um die Perlen zu verdrängen, durch
die Annäherung
eines Magneten an die Oberfläche
bestimmt werden, wobei währenddessen
Bilder erfasst werden.
-
Beispiel 2
-
Direkter Nachweis
von Ovalbumin unter Einsatz eines Sandwich-Tests
-
FDA
wurde eingesetzt, um Ovalbumin, einen Modellproteinanalyten, nachzuweisen.
Das zeigt, dass dieser Test auch unter Nutzung von molekularen Erkennungswechselwirkungen,
die schwächer
sind als Streptavidin-Biotin, d.h. als die meisten Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen,
eingesetzt werden kann. Die Empfindlichkeit des Tests beträgt derzeit
100 pg/ml Ovalbumin, was 10-mal besser ist als bei der üblichen
enzymgekoppelten Immunadsorptionsbestimmung (ELISA).
-
In
diesem Test war Ovalbumin zwischen zwei IgG-Antikörpern, die
in Ziegen (Chargen-Nr. 210497-02, NMRI) und Kaninchen (Chargen-Nr.
210497-01, NMRI) gegen Ovalbumin gezüchtet wurden, gebunden. Diese Antikörper binden
nichtüberlappende
Epitope (Proteinbereiche), und wenn sie gemeinsam verwendet werden, binden
sie Ovalbumin in einer Sandwich-Anordnung. Das Ziegen-IgG wurde
an die Oberfläche
gebunden, indem der Antikörper
zunächst
mit Streptavidin konjugiert wurde und dann auf einer PEG-Biotin-Oberfläche (oben
beschriebene Chemie) immobilisiert wurde. Der Kaninchenantikörper wurde
kovalent mit mit Tosyl funktionalisierten, superparamagnetischen
Perlen konjugiert. Wie der in Beispiel 1 beschriebene Biotin-Test wurde eine Magnetkraft
verwendet, um zwischen spezifisch und nicht spezifisch adsorbierten
Perlen zu unterscheiden. Die Anzahl der spezifisch an der Oberfläche haftenden
Perlen wurde mit dem Videomikroskop bestimmt, und die Ergebnisse
des Tests in Bezug auf den Anteil der gebundenen Teilchen werden
in 9 dargestellt.
-
Die
Verfahren, die für
den direkten Nachweis von Ovalbumin verwendet werden, werden untenstehend detailliert
beschrieben:
- 1. Herstellung der Oberflächen: Der
Test wurde in Mikrotiterplatten mit Polystyrol-Well, die weitgehend für Immuntests
verwendet werden, durchgeführt.
PEG-Biotinfunktionalisierte Mikrotiterplatten wurden unter Verwendung
der oben beschriebenen PEI-Chemie hergestellt.
- 2. Herstellung der Perlen. Eine Suspension der Tosyl-aktivierten
M-280®-Dynal-Perlen wurde unter
Verwendung einer Pipette und durch einminütiges Verwirbeln homogenisiert.
0,25 ml der Perlen wurden unter Einsatz von Magnetabscheidung von
ihrem Speichermedium entfernt. Die Perlen wurden in 0,5 ml 0,1 M
Phosphat-Pufferlösung mit
pH-Wert 7,5 erneut suspendiert. Die Perlen wurden zwei Mal mit Phosphatpufferlösung unter
Einsatz von Magnetabscheidung gewaschen. Die Antikörper-Lösung aus
300 μg Antikörper pro 6 × 108 Perlen (5 μg pro 107 Perlen)
wurde in Phosphatpufferlösung
gelöst.
Der Antikörper
wurde zu den Perlen zugesetzt, während
die Perlen verwirbelt wurden (wobei die Einstellung der Verwirbelungsvorrichtung
auf 4 gehalten wurde) und das Verwirbeln 1 min lang fortgesetzt
wurde. Das Vermischen erfolgte später unter Verwendung eines
Trommelmischers bei Raumtemperatur. Die Röhrchen wurden über Nacht
bei RT unter Mischen inkubiert (16–24 h).
-
Nach
der Inkubation wurden die Röhrchen
1–4 min
lang in den Magneten platziert, und der Überstand wurde entfernt. Die
mit Antikörpern
beschichteten Perlen wurden vier Mal gewaschen: zwei Spülungen in
PBS mit 0,1 % BSA-Pufferlösung
für 5 min,
eine Spülung
in 0,2 M Tris mit pH-Wert 8,5 und 0,1 % BSA für 4 h bei RT, und eine Spülung in
PBS mit BSA für
5 min. Die Perlen wurden in PBS, 0,1 % BSA gelagert.
-
Die
Perlen wurden zwei Mal mit Triton X-100® gewaschen,
um die physikalisch adsorbierten Antikörper zu entfernen. Die Perlen
wurden 5 min mit 0,01 M PBS mit 1 % BSA gewaschen. Die Perlen wurden
5 min lang mit 1 % Triton X-100 gewaschen, wonach sie zwei Mal mit
0,01 M Phosphatpufferlösung,
1 % BSA gewaschen wurden. Die Perlen wurden erneut suspendiert und
in 1 ml 0,01 M PBS mit 1 % BSA gelagert.
- 3.
Test: Die Mikrotiterwells wurden mit Q-Wasser und PBS gewaschen.
Die PBS wurde entfernt, und 200 μl von
1 % BSA in PBS wurden zu den PEG-Biotin-Wells zugesetzt. Die Wells
wurden bei Raumtemperatur 1 h lang inkubiert. Die Perlen wurden
drei Mal mit PBST (PBS mit 0,025 % Tween20®) gewaschen.
100 μl Ziegen-Antikörper wurden
zu Ovalbumin-Streptavidin in einer Konzentration von 1 Mikrogramm/ml
zugesetzt und 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen
wurden dann drei Mal mit PBST gewaschen. 100 μl verschiedener verdünnter Ovalbumin-Lösungen wurden zugesetzt, und
die Perlen wurden 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen
wurden drei Mal mit PBST gewaschen. 100 ml PBS wurden zu den Wells
zugesetzt, und dann wurden 5 μl
des Kaninchenantikörpers
zu den Perlen zugesetzt (100.000 Perlen/Well, im Verhältnis 1:5
in 1 % PBS-BSA verdünnt).
Die Perlen wurden 20 min lang inkubiert. Die Perlen wurden, bevor
und nachdem sie dem Magnet ausgesetzt wurden, gezählt.
-
Beispiel 3
-
Indirekter Nachweis von
Ovalbumin unter Einsatz eines Sandwich-Tests
-
Dieser
Test war dem direkten Test für
Ovalbumin ähnlich,
bei dem Kaninchen- und Ziegenantikörper eingesetzt wurden, um
das Ovalbumin in einer Sandwich-Anordnung einzuschließen. Der
Hauptunterschied war, dass ein Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper direkt
mit den Perlen konjugiert wurde, anstatt dass ein Antikörper gegen
Ovalbumin konjugiert wurde. Das Sandwich kam zustande, indem Ovalbumin
zu den mit Ziegen-Anti-Ovalbumin-Antikörper funktionalisierten Oberflächen zugesetzt
wur de, Kaninchen-Anti-Ovalbumin-Antikörper zu den Oberflächen zugesetzt
wurde und dann die mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper funktionalisierten
Perlen zu der Oberfläche
zugesetzt wurden. Der Vorteil dieses Tests besteht darin, dass seine Empfindlichkeit
derzeit 10 pg/ml Ovalbumin beträgt,
was 100-mal besser ist als ELISA.
-
Die
Verfahren für
den indirekten Nachweis von Ovalbumin werden untenstehend detailliert
beschrieben.
- 1. Herstellung der Oberflächen: PEG-Biotin-funktionalisierte
Mikrotiterplatten wurden unter Verwendung der oben beschriebenen
PEI-Chemie hergestellt.
- 2. Herstellung der Perlen: Wie für den direkten Ovalbumin-Test
beschrieben, nur dass Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG mit den Perlen konjugiert
wird (Antikaninchen-IgG (M + L), affinitätsgereinigt, Vector Laboratories Inc.,
30 Ingold Rd, Burlingame, CA 94010).
- 3. Test: Die Mikrotiterwells wurden ein Mal mit Q-Wasser und
PBS gewaschen. Die PBS wurde entfernt, und 200 μl von 1 % BSA in PBS wurden
zu den PEG-Biotin-Wells
zugesetzt. Die Wells wurden bei Raumtemperatur 1 h lang inkubiert
und drei Mal mit PBST gewaschen. 100 μl Ziegenantikörper wurde
zu dem Ovalbumin-Streptavidin
in einer Konzentration von 1 Mikrogramm/ml zugesetzt und 1 h lang
bei Raumtemperatur inkubiert, wonach drei Wäschen mit PBST folgten. 100 μl von verschiedenen
verdünnten
Ovalbumin-Lösungen
wurden 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Wells wurden erneut
drei Mal mit PBST gewaschen. 100 μl
verschiedener Kaninchen-Anti-Ovalbumin-Antikörper-Verdünnungen wurden zugesetzt, und
die Wells wurden 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert, wonach drei
Wäschen
mit PBST folgten. 100 ml PBS wurden zu den Wells zugesetzt, wonach
5 μl Ziegen-Anti-Kaninchen-Perlen
(100.000 Perlen/Well, verdünnt
in einem Verhältnis
von 1:5 in PBS-BSA) zugesetzt wurden. Die Perlen wurden durch mehrere Male
wiederholtes Pipettieren gut geschert. Die Wells wurden 20 min lang
inkubiert. Die Perlen wurden gezählt,
bevor und nachdem sie dem Magnet ausgesetzt wurden.
